Procédures modérées

652 souris du modèle mdx de la myopathie de Duchenne vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'ocytocine ou de prednisolone trois jours par semaine pendant cinq semaines à cinq mois, puis passent une batterie de tests comportementaux nommés, labyrinthe en croix surélevé, test clair-obscur, open-field, interaction sociale et contention. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des injections et justifie le recours à l'animal par l'interaction entre plusieurs organes. L'ocytocine étant déjà approuvée par la FDA, le porteur présente son passage en clinique comme facilité, au conditionnel.

Objectifs

En l'absence de traitement, la corticothérapie est le seul traitement palliatif actuellement utilisé pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Le corticothérapie (prédnisolone) présente des avantages modestes sur le maintien de la force musculaire et présente également des effets secondaires indésirables comme le développement de l'anxiété, de la dépression et paradoxalement d'une faiblesse musculaire, sur le long terme. L'ocytocine (OT) est connue pour ses effets bénéfiques sur la fonction cardiaque, la régénération musculaire et dans le comportement social. En utilisant le modèle murin mdx, modèle classique de la maladie de Duchenne, le projet évaluera si la combinaison de l'OT avec la corticothérapie peut améliorer la fonction musculaire squelettique, cardiaque ainsi que le comportement social.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont que l'OT seule ou en combinaison avec la prédisone/prédnisolone pourrait constituer un traitement dans la maladie de Duchenne. En effet, les résultats obtenus fourniront des indications sur l'intérêt de combiner les 2 traitements, notamment sur le niveau d'OT des souris traitées dans les différentes conditions. Étant donné que l'OT est un médicament approuvé par la U.S. Food and Drug Administration (FDA), la faisabilité d'une application clinique rapide est forte.

Procédures

Les animaux seront injectés 3 jours par semaine avec de l'OT ou de la prédnisolone. Le traitement durera soit 5 semaines soit 5 mois selon les groupes. Des évaluations fonctionnelles non invasives de la force musculaire (newtonmètre), de la fonction cardiaque (échocardiographie) et respiratoire (plésthysmographie) seront réalisées. Une série de tests comportementaux sera réalisée une fois après 5 semaines de traitement et après 6 mois de traitement. Les tests sont les suivants : Les délais entre tests sont de 24h, avec la succession suivante : 1. Plus maze (durée 5 min) 2. Clair/obscur (durée 5 min) 3. Open-field (durée 15 min) 4. Interaction sociale (durée 5 min) 5. Réponse à un stress léger par contention (durée 5-6 min)

Impact sur les animaux

Il n'y a pas de nuisance ou d'effet indésirable attendus suite à l'injection d'ocytocine ou de prednisolone. Néanmoins, les animaux seront surveillés pour évaluer une possible réaction inflammatoire au site d'injection. Le stress, dû à des contentions répétées des animaux, sera également surveillé. Les animaux impliqués dans les tests d'évaluations musculaire fonctionnelles et comportementales(tests d'anxiété et d' interaction sociales) sont dans des situations soit non anxiogènes ou très peu, n’impliquant pas de stress ou inconfort majeur, cependant, les animaux seront surveillés quotidiennement.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour le prélevement des tissus (muscles, coeur et cerveau) pour des analyses biochimiques et histologiques post-mortem.

Remplacement

Le but du projet est d'explorer le rôle de l'OT thérapeutique dans la maladie de Duchenne. Dans ce contexte, afin de déceler les processus physio-pathologiques impliqués, il est nécessaire d'utiliser des animaux car les mécanismes de dégénérescence musculaire impliquent l'intéraction entre plusieurs types cellulaires et organes différents. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiopathologiques et ne serait donc pas pertinent pour la mise au point d'un traitement thérapeutique.

Réduction

Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, nous avons calculé la taille de chaque groupe d'échantillon nécessaire pour une analyse statistique.

Raffinement

Les animaux d'une même fratrie sont regroupés dans une cage. Les cages sont enrichies avec un tunnel et une maison en carton. Nous utilisons une grille de suivie et des points limites ont été déterminés en fonction des paramètres observés pour évaluer la souffrance, la détresse et l’inconfort des animaux. Selon les procédures la surveillance est effectuée par les animaliers et/ou par deux chercheurs statutaires ayant suivi la formation Expérimentation Animale. Les animaux sont observés et pesés trois fois par semaine avant chaque injection. S'il apparait que les animaux ont des difficultés pour se nourrir une supplémentation avec du dietgel , nourriture et eau au sol sera envisagé.

Choix des espèces

La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieurs (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standardisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiopathologique. De plus, la souris mdx est le modèle le plus reconnu pour étudier la maladie de Duchenne. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 6 semaines, âge où la dégénérescence musculaire reste très faible et permet ainsi d'évaluer le potentiel thérapeutique de molécules sur une période de traitement allant de 6 semaines à 5-6 mois, période où la dégénérescence musculaire cardiaque apparaît.

27 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des antibiotiques par voie orale puis intraveineuse et subit jusqu'à trente prises de sang, maintenu sur le dos dans une gouttière, pour comparer la pharmacocinétique de trois molécules administrées sous forme d'organogels. Le porteur indique que les animaux ne pourront pas retourner dans le circuit de consommation, les formulations testées n'ayant pas d'autorisation de mise sur le marché. Le projet vise l'élevage porcin et la réduction de la charge de travail des éleveurs autant qu'un objectif sanitaire.

Objectifs

Actuellement, les antibiotiques sont administrés en élevage de porcs soit via des administrations intramusculaires, soit via un traitement par l'eau de boisson. Les administrations intramusculaires permettent un traitement individualisé avec un contrôle de la dose administrée, mais elles ne permettent pas un traitement rapide d'un grand lot d'animaux. A l'inverse, les traitements via l'eau de boisson permettent de traiter un grand nombre d'animaux très rapidement. Cependant, à cause de la faible solubilité et/ou stabilité de certains antibiotiques dans l'eau, et à cause de la variabilité dans le comportement d'abreuvement des porcs, la dose est peu contrôlée. Cela peut alors conduire à une surexposition ou à une sous-exposition de certains animaux, et à l'émergence de résistances aux antibiotiques. Un des objectifs du projet PigPills est de mettre au point une nouvelle formulation d'antibiotiques (organogels) qui permettrait une administration rapide des traitements à un grand nombre d'animaux par voie orale tout en contrôlant la dose administrée à chaque porc. Pour ce projet, trois antibiotiques ont été selectionnés : l'amoxicilline, la tylosine et la tilmicosine. Ils font partie des antibiotiques les plus utilisés en élevage de porcs en post-sevrage et permettent de cibler des antibiotiques peu (amoxicilline) ou assez (tylosine, tilmicosine) solubles et/ou stables dans l'eau, ainsi qu'avec des caractéristiques pharmacocinétiques a priori différentes (temps de demi-vie d'élimination très court pour l'amoxicilline et très long pour la tilmicosine). Pour répondre aux objectifs du projet et déterminer s'il est possible d'utiliser nos organogels pour traiter efficacement les porcs, il est nécessaire tout d’abord de comparer les concentrations sanguines obtenues lors de l’administration de ces organogels, d’une administration par voie orale dans de l’eau (pour mimer les administrations via l’eau de boisson) ou sous forme de poudre sans dispersion dans l'organogel (voie orale de référence). Une administration intraveineuse sera également réalisée pour l'amoxicilline et la tylosine pour comparer cette voie de référence aux voies orales. L'administration intraveineuse ne sera pas faite pour la tilmicosine car elle est létale chez le porc.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de proposer une solution alternative aux traitements antibiotiques via l'eau de boisson en élevage de porcs. Le fait d'utiliser les organogels (qui pourront être distribués individuellement et automatiquement aux porcs lorsqu'ils sont détectés au niveau du distributeur d'aliment) permettra de distribuer une dose contrôlée aux porcs, indépendamment du comportement d'abreuvement et en réduisant la charge de travail pour l'éleveur (en comparaison des traitements par voie intramusculaire). Le bénéfice final sera une réduction de la sous-exposition des animaux, un des facteurs de l'émergence de résistances aux antibiotiques en élevage. Ce bénéfice servira autant les animaux (augmentation de l'efficacité du traitement antibiotique) que l'Homme (diminution de la résistance aux antibiotiques au niveau de produits de consommation humaine et diminution du transfert de résistances à l'Homme).

Procédures

1. Administration par voie orale, trois fois, maximum 1 min; 2. Administration intraveineuse pour 18 animaux / 27, une fois, entre 1 et 5 min après sédation par administration intramusculaire d'anesthésiques (30 sec-1 min pour l'intramsuculaire); 3. Contention des animaux sur le dos dans une grouttière, à chaque prise de sang, au maximum entre 30 sec-1min entre contention et prise de sang; 4. Prises de sang, entre 8 et 10/semaine avec 1 à 2 semaines de pause, soit au maximum 30 prises de sang sur la totalité du projet, au maximum 30 sec-1min entre contention et réalisation de la prise de sang; 5. Mise à mort après sédation.

Impact sur les animaux

Les traitements antibiotiques administrés par voie orale sont des formulations utilisées en élevage par voie orale. Il n'y aura pas d'effet indésirable pour les porcs et ces administrations sont des interventions de très courte durée non douloureuses. Pour ce qui est des administrations intraveineuses, nous avons déjà administré l'amoxicilline à des porcs sans noter d'effet indésirable. Nous n'avons cependant pas d'information pour la tylosine, cette molécule sera donc administrée sous forme d'une intraveineuse lente, comme ce qui est prévu dans la formulation vétérinaire pour les bovins, afin de réduire le risque d'effets indésirables. La nuisance induite par les administrations intraveineuses sera réduite à une douleur modérée et de courte durée car elle sera précédée d'une sédation (administration intramusculaire et pose de cathéter sous sédation afin de réduire le stress et la douleur des animaux et de réduire le temps de pose du cathéter (animal qui ne bouge pas, pas de perte de sang par sursaut de l'animal lors de la pose, ...)). Nous ne prélèverons pas plus de 8.2 % du volume sanguin au maximum sur 4 semaines au minimum, les prises de sang engendrant une douleur modérée de courte durée.

Devenir

Les porcs seront mis à mort à la fin du projet. Il n'est en effet pas de possible de prévoir leur retour dans le circuit de consommation humaine du fait des administrations des organogels et des intraveineuses (formulations non vétérinaires, sans autorisation de mise sur le marché).

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet car le devenir d'un médicament dans un organisme (pharmacocinétique) n'est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes (absorption, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale...).

Réduction

Il n'est pas possible d'administrer les trois antibiotiques sur les mêmes porcs car il serait nécessaire de faire un trop grand nombre de prises de sang par animal. De plus, cela nécessiterait de garder les animaux pendant 14 semaines pour réaliser 3 à 4 administrations * 3 antibiotiques avec 1 à 2 semaines de pause entre chaque cinétique. La très rapide croissance des porcs ne permettrait pas d'extrapoler les données aux porcelets en post-sevrage qui sont ciblés par le projet. Le nombre d'animaux nécessaire pour observer une différence sur le devenir des antibiotiques après administration par voie orale avec les différentes formulations a été déterminé par un test de puissance à partir de données préliminaires obtenues sur un des antibiotiques, l'amoxicilline. Pour réduire ce nombre, pour chaque antibiotique, les administrations seront faites selon un plan en cross-over 3x3 (les porcs reçoivent les traitements séquentiellement dans un ordre différent) afin de n'utiliser que 9 porcs par lot au lieu de 21 porcs minimum si un plan en parralèle (les porcs reçoivent tous les mêmes traitements en même temps) était utilisé.

Raffinement

Les porcs seront hébergés en groupe et nourris à volonté. Les boxs de chaque lot seront équipés de balles à mâcher suspendues à des chaînes en inox et de ballons. Les animaux seront observés au moins une fois par jour, y compris les weekend et les jours fériés. Pour limiter leur stress et faciliter les administrations par voie orale (favoriser la prise spontanée et se passer d'un gavage), iIs seront entrainés à la manipulation avant la réalisation du projet. Ils recevront alors du sirop de cassis comme récompense via des seringues pour mimer les traitements dans l'eau et des chamallows comme récompense pour mimer les traitements solides. La nouvelle formulation développée sera appétente pour faciliter la prise par les animaux. Les manipulations réalisées sur les animaux ne devraient pas engendrées de douleur ou stress majeur pour l'animal mais des points limites ont été fixés pour permettre le traitement des animaux en cas de réaction allergique aux traitements ou de formation d'un hématome lors des prises de sang. La mise en place des traitements sera décidée conjointement entre le responsable de l'expérimentation et le vétérinaire référent de l'Etablissement Utilisateur.

Choix des espèces

Le porc est l'espèce cible pour laquelle nous souhaitons améliorer les traitements antibiotiques en élevage. Porcelets (mâles et femelles) en post-sevrage car c'est le stade de développement ciblé pour les traitement antibiotiques en élevage.

516 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est rasé, reçoit le produit sur la peau ou par injection intramusculaire, puis subit une dizaine de mesures électriques du muscle sous anesthésie et une trentaine de mesures de l'écartement des doigts de la patte. Le projet compare des produits commerciaux, désignés comme "nos produits", aux traitements de référence de la dystonie et de la spasticité. Le porteur indique que la réutilisation des animaux a été tentée sans succès et affirme que les modèles cellulaires restent débattus.

Objectifs

Cette étude a pour objectif de démontrer l’efficacité et les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Dans cette étude, le produit sera administré localement aux rats, sur la peau d’un membre postérieur (application topique au niveau du tibialis cranialis). Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (FTP-501) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide, et d’autres offrent un effet durable par exemple (le cas du premier Lead FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.

Procédures

Rasage : 1 fois : 30 sec/animal Administration composée : 1 fois : 1min / animal et maintient avec un pansement pendant 2h ; Mesure CMAP (avec anesthesie) : environ 10 fois : 15 min / animal = 150 min /animal (1h30) Mesure DAS : environ 30 fois : 10 sec / animal = 300 sec / animal (5 min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues ici sont : Partie administration des composés : Stress dû au rasage de la patte des animaux, administration des composés par voie sous-cutanée ou intra-musculaire, légère gêne suite au pansement occlusif sur la patte. Partie observation : Stress dû aux lectures DAS (Digit Abduction Score = score de l'écartement des doigts de la patte) et au différentes anesthésies pour les mesures de CMAP (Coumpound Measurement Activity Potentiel = mesure de l'activité élétrique du muscle).

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. Nous avons testé cette possibilité lors du premier projet, malheureusement sans succès. Il est possible que les animaux ayant subi une série d’expériences (suivi d’une période de repos) se soient accoutumés au test DAS, et répondent différemment des animaux naïfs ; le poids plus important des animaux ré-utilisés peut également impacter négativement la réponse au test DAS.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de co-culture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Les test DAS et CMAP nous permettent au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.

Réduction

Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’administration des composés (ici topique et intra-musculaire.) est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Les administrations de nos composés en topique sous pansement occlusif ne seront réalisées qu’une seule fois sur un temps assez restreint (2h). Pour toutes les mesures de CMAP, les animaux seront anesthésiés environ 10 fois pour chaque animal (aux temps 2h, 4h, 8h, 24h, 48h, J7, 14J, 21J, 28J (et tous les 7 jours jusqu’au retour du signal au signal de départ)

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Les tests DAS et CMAP chez le rongeur, déjà éprouvés lors de notre étude princeps, sont au contraire des tests reconnus pour leurs pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles (Bien que faciles à manipuler, nous avons remarqué au cours de l’étude princeps que la prise de poids des animaux ne facilitait pas la stimulation et la lecture du DAS (animal difficile à stimuler, et peu enclin à exhiber un réflexe). Or il est largement admis que les mâles prennent plus de poids que les femelles. De plus, nos molécules ont été administrés en i.m (pour tester leurs efficacités dans notre étude princeps) et que nous n’avons remarqué aucune différence (entre mâles et femelles) de réponse pharmacologique. De plus, pour les molécules testées ici leur pharmacocinétique est connue (soit dans la littérature, soit testé dans notre laboratoire), et aucune différence significative n’est observée entre les deux sexes. Afin de diminuer notre variabilité de mesure, nous sommes donc contraints de nous limiter aux animaux femelles) âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés subissent une amputation de la première phalange pour génotypage, puis les animaux reçoivent des injections de tamoxifène et une injection de cardiotoxine qui détruit le muscle, dont on étudie ensuite la régénération sous glucocorticoïdes. Le porteur affirme que le recours à un "organisme entier" est nécessaire parce que cellules immunitaires et hormones interviennent dans la régénération, et indique n'attendre aucun effet secondaire majeur. Les bénéfices thérapeutiques évoqués restent une compréhension des mécanismes, sans application décrite à court terme.

Objectifs

Dans le cadre d’une blessure les glucocorticoïdes comme la cortisone peuvent être prescris pour leurs effets anti-inflammatoires efficaces mais dont la prise prolongée peut induire une perte de la masse musculaire. Les études sur les effets des glucocorticoïdes réalisées in vitro sur des cellules en culture montrent des résultats souvent contradictoires. Ainsi, malgré cette utilisation courante le mode d’action précis grâce auquel les glucocorticoïdes produisent leurs effets bénéfiques comme délétères sont encore mal connus. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la dégénérescence et la régénération musculaire via certain type de cellule immunitaire. Cette étude permettra aussi de mieux décrire, in vivo, le lien entre une partie du système immunitaire et les cellules souches du muscle. Enfin, grâce à ce projet nous espérons pouvoir identifier le meilleur moment pour administrer les traitements aux glucocorticoïdes en évitant les effets secondaires indésirables.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques de régénération musculaire. Ce projet permettra aussi de décrire les effets induits par des traitements aux glucocorticoïdes. Nous pourrons ainsi disséquer les conséquences d’un potentiel dysfonctionnement du système immunitaire sur les processus d’inflammation mais aussi les conséquences sur la réparation des fibres musculaires. En comprenant les cibles et le rôle précis des glucocorticoïdes des traitements pourront être développer pour cibler un type cellulaire en particulier et être administrés au moment adéquat.

Procédures

Les animaux issus des croisements sont identifiés par tatouage au doigt ou amputation de la première phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Tatouage et biopsie sont alors non douloureux. La phalangéctomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis principalement des injections de différents types ne nécessitant pas de contention de plus de 30 secondes. Une première vague d’injection de tamoxifène, permettant l’invalidation du récepteur des glucocorticoïdes, sera réalisée une fois par jour pendant 5 jours. Ensuite, l’induction de la lésion musculaire se fera sur des animaux endormis à l’aide d’un gaz à savoir l’isoflurane. Les animaux endormis recevront une injection unique de cardiotoxine dans chacun des tibias. Une fois l’animal endormi cette procédure dure environ 1,5 minute. Durant la régénération musculaire, les traitements par glucocorticoïdes seront réalisés grâce à une injection par jour sur une période allant de 1 à 7 jours maximum. L’injection unique d’une molécule, pour visualiser la prolifération cellulaire, sera réalisée par injection sur des animaux vigiles deux heures avant leur mise à mort. Le prélèvement de sang sera réalisé via l’artère temporo-mandibulaire sur des animaux vigiles juste avant leur mise à mort et représentera 25% de leur volume corporel. Enfin, pour l’anesthésie létale les animaux vigiles seront injectés avec un mélange de xylazine/kétamine afin de subir une chirurgie. Cette dernière consiste à réaliser une perfusion de paraformaldéhyde intracardiaque cœur afin que le système circulatoire permette au fixateur d’atteindre tous les organes. Cette technique permet de fixer et préserver les tissus de manière homogène.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. La phalangéctomie et le tatouage sont des techniques d'identification utilisées depuis plusieurs décénies dans le laboratoire et ne présentent pas d'effets secondaires majeurs. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant. En effet, 7 jours de traitement aux glucocorticoïdes ne provoquent normalement pas d’atrophie musculaire. Ainsi, nous n’attendons pas d’effets secondaires majeurs causés les molécules injectées. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

A l'issue de la procédure tous les animaux expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes et synthétiques (dexaméthasone) sur la régénération musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, lors de la régénération musculaire, les cellules du système immunitaire provenant de la circulation sanguine sont impliquées mais aussi d’autres facteurs comme les hormones. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un animal entier afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte (exemple : niveaux d’hormones circulantes). Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production d’un nombre assez important d’individu, contribuant à la production de résultats significatifs.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire sur la régénération musculaire ont mené à une bonne connaissance du modèle ainsi que des traitements à réalisés. Ainsi, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement et disposons de protocoles précis pour chaque expérimentation. Par ailleurs, les deux pattes des souris seront systématiquement utilisées afin de réduire de moitié le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Néanmoins, si l’un des animaux atteint un point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort par afin d'éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, après injection, les souris seront attentivement suivies. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …). De plus, le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’administration du composé induisant un dommage musculaire. Enfin, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement pouvant entrainer des effets secondaires délétères sur les animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront des mâles entre 10 et 15 semaines pour éviter les variations causées par la puberté. La régénération musculaire se faisant en plusieurs étapes, nous effectuerons une cinétique. Dans un premier temps, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la dégénérescence musculaire et l’inflammation en analysant les souris à 1, 3 et 5 jours après injection de la cardiotoxine. Puis, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la régénération musculaire et les mécanismes anti-inflammatoire en analysant les animaux à 7, 14, 28 et 60 jours après l’injection de la cardiotoxine. Un groupe d’animaux sera également analysé en l’absence de traitement à la cardiotoxine, constituant ainsi le jour 0. Pour la majorité des expérimentations nous utiliserons les souris de la lignée constitutive ne nécessitant pas d’injection au tamoxifène. Néanmoins, si nous observons des phénotypes sur ces souris, nous voudrions exclure une cause développementale c’est pour cela qu’il nous sera indispensable d’utiliser une seconde lignée inductible. Il est difficile à cette étape de prévoir à quel stade nous utiliserons ces souris car cela dépendra du phénotype des souris issues de la lignée constitutive.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est irradié puis reçoit une injection intrafémorale décrite comme douloureuse, et une partie est transplantée avec des cellules souches hématopoïétiques humaines, avant euthanasie pour quantifier la prise de greffe. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit ce processus in vitro et que la transplantation chez l'animal est le "seul outil" disponible. Les retombées annoncées pour les patients greffés de moelle osseuse sont renvoyées au conditionnel et au long terme.

Objectifs

L’utilisation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) suscite un fort intérêt médical du fait de leur potentiel de régénération et de différenciation. Elles sont présentes dans la moelle osseuse et sont à l’origine des cellules sanguines. Elles sont utilisées au cours des transplantations hématopoïétiques dans le but de traiter les patients atteints de leucémies ou de maladies génétiques affectant les cellules du sang (leucocytes, globules rouges, plaquettes). L’une des limites de la greffe cependant, provient de la faible proportion de CSH capables de migrer vers les niches hématopoïétiques localisées dans la moelle osseuse et de s’y implanter. La grande majorité des CSHs est en réalité perdue ou détruite avant d’atteindre la moelle osseuse. Ainsi, une proportion importante des greffons, notamment ceux issus des sangs de cordons ombilicaux présentant de faibles quantités de CSHs, ne peut pas être utilisée pour la greffe. Une solution permettant d’augmenter le nombre de greffons disponibles consiste à augmenter la proportion des CSHs « utiles », c’est à dire capables de s’implanter dans la moelle osseuse. Cette amélioration permettrait en outre de limiter les risques d’échec de greffe chez les patients transplantés. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est d’évaluer l’effet de l’injection de molécules impliquées dans le guidage des cellules vers les niches hématopoïétiques médullaires, en association ou non avec des complexes stabilisateurs, préalablement à l’injection des CSHs, sur l’efficacité de l’implantation des CSHs humaines dans la moelle osseuse. Les expériences de transplantations seront réalisées dans un modèle de souris n’ayant pas de système immunitaire, ne rejetant donc pas la greffe de cellules humaines.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait d’établir la preuve de concept que l’injection de molécules (sélectionnées sur la base de leur effet sur les CSHs) augmente la prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques (CSHs) lors d’expérience de transplantation. A terme, ces résultats concourront à l’optimisation des protocoles de transplantation de cellules hématopoïétiques chez l’humain, dans le but d’augmenter les chances de réussite thérapeutique et le nombre de patients pouvant bénéficier d’une greffe de moelle osseuse.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe (entre 3min environs et 5 min environ selon la lignée de souris) et à l’injection intrafémorale d’une molécule sélectionnée sur la base de son activité sur les CSHs. Cette injection qui dure quelques minutes sera réalisée sous anesthésie (1h environ) avec une prise en charge analgésique. Certains animaux seront également transplantés avec des CSHs humaines par voie intra veineuse. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes est réalisée sous anesthésie et analgésie. Ces procédures permettront de tester 5 molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs

Impact sur les animaux

L’injection dans l’os est douloureuse. Elle sera effectuée sous anesthésie et sera accompagnée d’une prise en charge analgésique. Les animaux seront irradiés pour permettre la prise de greffe. L’irradiation non létale des souris n’est pas sensée provoquer de douleur ou d’altération majeur de leur santé. Une perte de poids peut être observée dans de rare cas mais elle est transitoire (une semaine environ). Seule une infection potentielle peut s’avérer dangereuse mais elle est limité au maximum grâce au maintien des animaux dans un environnement stérile et à un traitement antibiotique durant 1 mois dans l’eau de boisson.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier, dans la moelle et dans le sang, la concentration de la molécule étudiée pour les études de pharmacocinétique ainsi que la proportion de CSH humaines présente dans la moelle des souris pour les expériences de transplantation.

Remplacement

La prise de la greffe au cours des transplantations de CSH est un phénomène complexe et il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de mimer ce processus in vitro. Le passage par une expérience de transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs à se loger au niveau de la moelle osseuse et ainsi d’identifier des molécules capables d’améliorer cette étape.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, nous déterminerons sur un petit nombre de souris les conditions expérimentales optimales de transplantation en fonction de chaque molécule testée. L’effet de cinq molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs sera évalué. Notre expérience ainsi que la littérature dans le domaine nous montrent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe et par expérience est de 6 animaux afin que nous puissions rendre des résultats statistiquement significatifs sur le plan hématologique. Nos expériences préliminaires par étapes successives nous permettront d’optimiser les paramètres expérimentaux et de vérifier que ce nombre d’animaux est valide lorsque l’on combine injection intra-fémorale d’une molécule à tester et injection intra-veineuse de cellules hématopoïétiques.

Raffinement

Pour limiter au maximum l’impact sur le bien-être des animaux, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Par ailleurs, une prise en charge analgésique sera effectuée si besoin au site de l’injection intra-fémorale. Enfin une surveillance accrue sera réalisée entre le moment de l’irradiation et l’euthanasie de l’animal afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'humain. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de CSHs. Souris jeunes adultes (10-12 semaines) afin d’être dans des conditions dans lesquelles la prise de greffe est optimale.

2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires puis une infection nasale par le virus Influenza sous anesthésie, avant des traitements de chimiothérapie ou d'immunothérapie, la croissance tumorale pouvant provoquer détresse respiratoire et perte de mobilité. Le porteur affirme qu'il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et justifie le choix de la souris parce que "toutes les études similaires sont menées chez cet animal". Les bénéfices avancés pour les patients atteints de cancer du poumon restent une meilleure connaissance des facteurs de résistance aux traitements.

Objectifs

Nous souhaitons caractériser l’impact d’un virus respiratoire sur la progression tumorale de cellules tumorales pulmonaires et comprendre les mécanismes mise en oeuvre lors de la reconnaissance virale. Pour ce faire, nous utiliserons des lignées cellulaires présentant ou non des adaptateurs moléculaires impliqués dans le processus de reconnaissance du virus respiratoire Influenza A. Nous nous interessons également à la réponse aux différents traitements.

Bénéfices attendus

Les traitements actuellement préconisées dans le cadre d'un cancer pulmonaire sont la radiothérapie ou la chimiothérapie et éventuellement en association avec l'immunothérapie ou thérapie ciblée. Cependant, il est nécessaire de poursuivre des recherches pour mieux connaître les facteurs pouvant impacter la progression tumorale et la résistance au traitements. C'est pourquoi, nous souhaiterions déterminer le rôle des adaptateurs ou récepteurs de la reconnaissance virale en combinaison avec de la chimiothérapie ou immunothérapie.

Procédures

Pour l'ensemble des procédures, la durée de l'expérience est de 1 mois. Les animaux recevront une injection de cellules tumorale (2250 animaux) par voie intraveineuse avec au préalable une anesthésie générale. La durée de l'acte est de quelques secondes à une minute. De plus, avant l'infection respiratoire, les souris sont anesthésiées à l'aide de cette même préparation puis l'infection par voie nasale (2250 animaux) peut avoir lieu. Le temps nécessaire une infection est de 20 minutes maximum. Nous testerons également la résistance aux médicaments et la voie d'administration du traitement (chimiothérapie ou anti-monoclonal) est une injection intra-veineuse (1800 animaux) et l'acte prend moins de 10 secondes. Les souris recevront une anesthesie gazause. Lors des traitements par chimiothérapie : deux à 5 injections sont prévues pour les sels de platine. Enfin, lors du traitement par immunothérapie, 5 injections d'anticorps seront réalisées. De plus, lors de l'imagerie du petit animal, nous utilisons un anesthesique gazeux pendant 10 min (2250 animaux).

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse peut causer une douleur ou un inconfort d’où l’utilisation d’une anesthésie injectable. Les souris peuvent souffrir de faim ou de soif lors d’une infection virale et lors d’une croissance rapide de la tumeur instillée, l’animal peut présenter des signes de souffrances, d’une détresse respiratoire et une diminution de la mobilité de l’animal. De plus, les effets indésirables liés à l’infection virale peuvent être multiples. Lorsque nous procédons à une infection virale par voie nasale, il est nécessaire d’endormir les souris à l’aide d’une anesthésie injectable pouvant entrainer une hypothermie. Enfin, l’administration de médicaments se fait par voie intra-veineuse Et, l’animal recevra une anesthésie gazeuse pour limiter toute souffrance, et ensuite, l’injection intra-veineuse peut être entrepris.

Devenir

Les souris sont euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les poumons dans le but d’analyser par des techniques multiparamétriques, l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral et la réponse virale.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. En effet, les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de progression tumorale et l’infiltrat immunitaire dans sa globalité

Réduction

Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous avons établi 15 souris/groupe. Nous utiliserons un pied à coulisse pour mesurer le volume tumoral aux cours du temps et des techniques d'imagerie non invasive pour l’apparition des métastases. Le nombre d’animaux impliqué dans l’étude est de 2250. Nous utiliserons un test statistique permettant de comparer les moyennes des souris instillées par rapport aux contrôles.

Raffinement

Raffiner, la méthodologie utilisée, ce qui implique la notion de points limites, si des signes de souffrances sont visibles. De plus, les animaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne et seront gardés en groupes de 5 et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris. Notre stratégie d’observation consiste en une surveillance quotidienne par les animaliers d’une part et nous assurons en plus une surveillance suivi d’un contrôle 3 fois par semaine dès que les souris ont été infectée par injection intra-nasale avec recherche de signes d’altération de l’état général (souris recroquevillée, amaigrissement (3 pesées hebdomadaires) et de difficultés respiratoires. Lors des injections de cellules tumorales pulmonaires et au moment de l’infection intra-nasale, les animaux seront sous anesthesie générale. Afin d'éviter que les animaux ne soient en hypothermie, nous les plaçons sur un tapis à 37°C. En cas de signe de souffrance les souris seront euthanasiées. Nous utiliserons une anesthesie gazeuse afin d’observer l’apparition des tumeurs par une technique d’imagerie pour éviter d’euthanasier l’animale. Nous utiliserons également de l’anesthesie gazeuse lors des injections intra-veineuses.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour conduire nos expériences avec avant tout dans un souci d’intégration de nos recherches dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Il s’agit d’une espèce pour laquelle notre animalerie est parfaitement adaptée, qui se manipule facilement. Nous utilisons des souris C57Bl/6 albinos qui est une lignée de souris dont la mutation provient d’une mutation spontanée dans la lignée C57Bl/6. Cette lignée est couramment utilisée pour les expériences de bioluminescence. Les animaux commerciaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature.

5 321 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de quelques jours reçoivent une injection de chimiothérapie, des mâles subissent une vasectomie et des femelles une réimplantation d'embryon, pour évaluer l'effet des traitements sur le sperme et l'embryon. Le porteur décrit des douleurs postopératoires, des infections de plaie et une perte de poids possibles, et prévoit l'euthanasie avant prélèvement du tissu testiculaire ou des ovocytes. Il affirme que la spermatogenèse in vitro complète n'est réalisable que chez la souris et présente comme "indispensable" la recherche d'épi-mutations transmissibles.

Objectifs

Ce projet permet d’évaluer, chez un modèle murin, l’impact des traitements de chimiothérapie sur l’intégrité du tissu testiculaire, sur la capacité des spermatogonies à se différencier in vitro et sur la qualité des gamètes produits. L’architecture de la chromatine ainsi que l’expression des transcrits dans les spermatozoïdes provenant de souris traitées par chimiothérapie sera évalué par une approche de sc-ATAC-seq et de sc-RNA-seq. Avant d’établir ce projet, une étude bibliographique a été réalisée au préalable. Aucune étude n’a évalué l’impact des agents de chimiothérapie sur (i) l’épigénome et la chromatine spermatique et (ii) le développement et l’épigénome de l’embryon précoce. Il apparait donc indispensable de rechercher la présence d’éventuelles épi-mutations dans le noyau des spermatozoïdes produits in vivo ou in vitro et d’évaluer les risques de transmission transgénérationnelle de ces altérations, qui pourraient être à l’origine de défauts du développement embryonnaire ou d’anomalies congénitales.

Bénéfices attendus

Il est nécessaire d’évaluer l’impact des traitements de chimiothérapie sur l’intégrité du tissu testiculaire, sur la capacité des spermatogonies à se différencier in vitro et sur la qualité des gamètes produits avant d’envisager une application chez les patients guéris de LAL mais devenus stériles. Les échantillons humains étant rares et précieux, nous utiliserons du tissu testiculaire murin pour attendre les objectifs du projet.

Procédures

Injections de molécules de chimiothérapie (et sérum physiologique) en intra-péritonéales sur souricaux de 3,5 jpp. 1 injection d'1 seule dose par animal. Acte nécessitant 2 minutes maximum par souriceau. Procédure chirurgicale : vasectomie de souris mâles. 1 acte chirurgical par animal (avec vasectomie bilatérale ; permettant de générer des mâles castrés, utiles pour l'obtention de femelles pseudo-gestantes). Acte nécessitant une procédure de 10-15 minutes par souris. Procédure chirurgicale : réimplantation d’embryon chez des femelles pseudo-gestantes au niveau de l'infundibulum. 1 acte chirurgical par animal. Acte nécessitant une procédure de 20-25 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Stress lié à l’injection de molécules de chimiothérapie, nuisances liées à l'acte chirurgical et stress lié à la mise à mort. La chirurgie peut entrainer des nuisances telles qu’une infection au niveau de la plaie, notamment suite à une déhiscence (séparation de bords de la plaie) ; des saignements ; une douleur, souvent au niveau de la cicatrice ou un état de fatigue. Lors de la croissance de l’animal, le principal critère sera la perte de poids par rapport à la moyenne du groupe témoin. Ce paramètre intègre non seulement l’éventuelle perte de poids de l’animal, mais aussi le différentiel de gain de poids, pathologique pour les souriceaux et très jeunes souris. Peu après les injections, des diarrhées (spécialement si le signe est prolongé plusieurs jours) seront également considérés comme des points limites. Pour des animaux plus âgés, la perte de poids par rapport au poids initial ou au poids le plus élevé de l’animal sera considérée comme anormale. Enfin, des points critiques classiques tels qu’un poil hérissé, un dos rond, un abdomen distendu, une léthargie ou tout signe clinique jugé par un technicien expérimenté comme indiquant un état moribond sévère seront considérés comme des points limites. Afin de pouvoir suivre le poids des animaux dans le temps, les souriceaux de 3,5 jpp seront marqués avec un stylo chirurgicale en attendant qu'il soit assez grand pour qu'une pose de puces au transpondeur soit possible pour poursuivre le suivie des souris à l'âge adulte.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas vivre après prélèvement chirurgical du tissu testiculaire sans traitement hormonal de substitution, ils seront euthanasiés en amont du prélèvement. Les femelles subissant un prélèvement de leurs ovocytes (post-stimulation ovarienne) seront euthanasiées en amont du prélèvement.

Remplacement

La technique de spermatogenèse in vitro complète permettant la génération de spermatozoïdes à partir de cellules souches germinales mâles (les spermatogonies) ne peut s'effectuer qu'à partir de tissus testiculaires vivants. La culture organotypique en interphase gaz-liquide d'explants testiculaires de souris permet d'obtenir des cellules haploïdes utilisables dans ce projet. Des techniques similaires se basant sur des organoïdes ou des cultures en 2D et 3D sont à l'étude mais (i) ces techniques ne sont pas encore au point et ne permettent pas d'obtenir des résultats similaires à ceux de la culture organotypique et (ii) elles utilisent des cellules issues de tissus testiculaire prépubères également.

Réduction

Nous utiliserons des tests paramétriques permettant d’obtenir des résultats exploitables à partir d’un petit nombre d’animaux. Nous limiterons ainsi le nombre de réplicas à n=6 souris par expériences. Tous les souriceaux mâles de chaque portée seront utilisés, quelle que soit la taille de la portée. Les tissus qui ne sont pas exploités le jour du prélèvement seront cryopréservés pour une mise en culture ultérieure. Le nombre d’animaux estimé sera revu à la baisse si nous nous apercevons qu’une molécule de chimiothérapie est trop délétère pour l’animal.

Raffinement

Les souris seront obtenues via reproductions au sein de notre Service de Ressources Biologiques ; limitant le stress lié à d’éventuels transports. Les souriceaux seront conservés auprès de leur mère jusqu’au prélèvement tissulaires à 6,5 jpp afin de ne pas perturber leur développement. Les animaux utilisés comme contrôles ou in vivo seront sevrés au bout de quatre à cinq semaines afin de limiter le nombre de souris par cage. Les animaux qui subiront un acte chirurgical seront anesthésiés avec un système d'anesthésie gazeuse diffusant 5% d’isoflurane dans un mélange protoxyde d’azote/oxygène (70%/30%) puis maintenu sous anesthésie avec 2% d’isofluorane. Vingt minutes avant l’opération, une injection de buprénorphine sera réalisée (Buprécare® 0.5 mg/kg ; IP) afin d’atténuer/limiter les douleurs de l’animal. Deux minutes avant incision, de la lidocaïne en gel sera appliquée pour atténuer la douleur. Des « points limites » (ou critère d’arrêt anticipé) seront observés quotidiennement, notamment sur les animaux post-chirurgie. Enfin, les données obtenues lors de ces expérimentations seront exploitées au mieux afin de donner des résultats scientifiquement exploitables de par la bonne prise en charge des animaux.

Choix des espèces

Actuellement, la spermatogenèse in vitro complète par culture organotypique en interphase gaz-liquide n’est réalisable que chez la souris. Nous réaliserons les injections des différents traitements à 3,5 jpp. Nous travaillerons à partir de tissu testiculaire pré pubère issu de souris mâles de 6,5 jpp de façon à pouvoir mettre en culture le tissu avant le début de la première vague de spermatogenèse. Les souris âgées de 6,5 et 36,5 jpp seront utilisées comme contrôles in vivo pour permettre la comparaison avec les tissus testiculaires en culture in vitro d’âges correspondants (tissus prélevés à 6,5 jpp + 30 jours de culture). Les femelles donneuses d’ovocytes seront utilisées à l’âge de 5 à 9 semaines (période à laquelle les souris répondent le mieux aux traitements hormonales de stimulation ovarienne). Les mâles donneurs de spermatozoïdes testiculaires seront utilisés comme témoin à l’âge de 36,5 jpp (âge correspondant aux tissus testiculaires après 30 jours de cultures). Les mâles donneurs de tissus testiculaires seront utilisés à l’âge de 6,5 jpp, de façon à ce que les tissus testiculaires pré pubères soient mis en culture avant le début de la première vague de spermatogenèse qui commence à 8 jpp. Les mâles vasectomisés seront utilisés dès leur puberté (environ 5 semaines). Les femelles Black Swiss pseudo-gestantes seront utilisées dès leur puberté (environ 7 semaines). Nous utiliserons des femelles Black-Swiss afin de s’assurer que l’embryon obtenu est bien le résultat de l’ICSI réalisée au préalable. L’ICSI sera réalisée à partir d’un ovocyte d’un spermatozoïde de souris CD-1 (blanche) afin d’obtenir un embryon qui sera par la suite implanté dans une souris Black Swiss (noire). Lors de la césarienne, si le souriceau obtenu est blanc, cela nous permettra de valider notre ICSI.

390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau pour une infection virale, avec ou sans implantation de fibres optiques, puis un isolement de quatre à cinq semaines et un test de peur conditionnée. Le porteur décrit un stress lié à l'isolement social et à la contention, et prévoit l'euthanasie pour des analyses d'électrophysiologie et d'histologie. Il affirme qu'aucune approche in silico ou en culture cellulaire ne peut se substituer à l'animal entier pour étudier la mémoire chez les mammifères.

Objectifs

La mémorisation des évènements passés nous permet de mieux réagir aux situations présentes. Elle permet notamment d’éviter les dangers et d’assurer la survie des individus, mais est également au cœur des phénomènes d’apprentissages. Sans surprise, les mécanismes fondamentaux de la mémoire sont théorisés et étudiés depuis plusieurs décennies par les neuroscientifiques, mais c’est seulement récemment que la démonstration expérimentale des conséquences physiologiques de l’expérience vécue et de sa rétention - la mémoire - sur le cerveau a été rendue possible par des approches optogénétiques. Il a notamment été montré que des groupes de neurones – les cellules constituant le cerveau et briques élémentaires de la cognition – dispersés dans diverses régions cérébrales étaient nécessaires et suffisants pour permettre l’encodage et le rappel de la mémoire. Ces groupes de neurones constituent l’engramme. L’objectif global de notre projet et de comprendre les processus d'encodage et de stockage de la mémoire, chez les mammifères en utilisant des outils de dernière génération permettant d’identifier et de manipuler les cellules de l’engramme. Nous voulons étudier les mécanismes cellulaires et synaptiques de la formation des cellules de l'engramme dans le cortex préfrontal du cerveau, une structure corticale impliquée dans les fonctions cognitives supérieures. Dans ce projet, Nous souhaitons valider les conditions d’utilisation de deux nouveaux outils moléculaires CaMPARI2 et Cal-light, afin de les utiliser pour cibler et manipuler les cellules de l'engramme dans le cortex préfrontal afin de pouvoir déchiffrer les mécanismes de la mémoire.

Bénéfices attendus

Notre objectif est la compréhension des mécanismes fondamentaux de la mémoire. Néanmoins, leur bonne connaissance nous permettra à terme de mieux comprendre les pathologies qui sont associées à des troubles de la mémoire, comme les maladies neurodégénératives - Alzheimer, Parkinson – ainsi que les pathologies génétiques liées aux déficits cognitifs.

Procédures

L’ensemble des animaux subiront une chirurgie pour infection virale (30min) avec ou sans implantation de fibres optiques (1h30). La pose d’implant et le test comportemental nécessite que les animaux soient placés en hébergement individuel pour une durée de 4-5 semaines suite à la chirurgie pour éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères.

Impact sur les animaux

Les étapes de la chirurgie entrainant des effets indésirables sur les animaux :stress,douleurs post-opératoires. L’animal subit également un stress lié a la restriction de comportement social suite à l'isolement des animaux après la chirugie et le stress physique lié à des contentions et à la tache comportementale de peur conditionnée.

Devenir

L'ensemble des animaux est euthanasié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des expériences d'électrophysiologie in vitro ou des études histologiques.

Remplacement

En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. L’utilisation de tests statistiques pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.

Raffinement

Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée (2/jours) dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux.Des critères de bien être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie est réalisée sous anesthésie .Un contrôle de la respiration et de l’absence de reflexe est vérifié faite par pression de pâte arrière afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal. sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable en sous cutané d’un anesthésique local. L’injection en sous cutané des analgésiques en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une seconde injection d'analgésique est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 4-6 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous cutanée une injection quotidienne d’un anti inflammatoire non stéroïdien, jusqu’à disparition des signes de mal être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 16 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.

30 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinq lots, ils sont inoculés par voie nasale avec trois nouvelles souches du virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin ou une souche de référence, puis subissent quatorze écouvillonnages nasaux et prises de sang. Le porteur indique attendre une fièvre transitoire et une baisse d'appétit, peut-être des troubles respiratoires, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour un examen des lésions. Il affirme que le modèle in vitro sur macrophages ne suffit pas et que le recours au porc reste "obligatoire" pour évaluer la pathogénicité des souches.

Objectifs

Le Syndrome Dysgénésique et Respiratoire Porcin (SDRP) est une maladie virale spécifique des porcins. L’infection par le virus du SDRP (SDRPV) induit des troubles de la reproduction chez les femelles gestantes, et des problèmes respiratoires et des retards de croissance chez les porcelets qui s’accompagnent d’une dégradation du bien-être des animaux. En raison de sa capacité à réduire les défenses immunitaires de son hôte, ce virus favorise les co-infections virales et bactériennes au niveau respiratoire chez les porcs en croissance. Ainsi, les animaux des élevages infectés par le SDRPV sont plus souvent malades et consomment plus d’antibiotiques. La lutte contre le SDRP en élevage fait appel essentiellement à la vaccination à l’aide de vaccins vivants qui ont démontré leur efficacité pour limiter les troubles de la reproduction et respiratoires. Cependant, sur le terrain, des difficultés à contrôler la transmission virale à l’aide de ces vaccins sont souvent rencontrées. Ainsi, depuis plusieurs années, des recherches sont menées pour évaluer les modes de propagation des souches SDRPV présentes dans les élevages de porcs et cherche à identifier les facteurs qui pourraient diminuer l’efficacité vaccinale. Pour cela, un modèle expérimental d’infection de porcelets exempts d’organismes pathogènes spécifiés (EOPS) a été développé mais la souche de référence utilisée induit très peu de clinique chez ces animaux : aucun symptome respiratoire, peu de fièvre et quelques retards de croissance individuels, qu’on ne retrouve pas toujours à l’échelle du groupe. De même, à l'autopsie, des lésions pulmonaires sont rarement observées. Ceci constitue une limite du modèle, réduisant la démonstration d’efficacité vaccinale aux seuls paramètres virologiques. C’est pourquoi l’objectif de cette étude est d’évaluer, chez des porcelets EOPS, l'infection par 3 souches de SDRPV plus récentes, en comparaison de celle par la souche de référence habituelle, afin d’identifier une nouvelle souche permettant de faire évoluer le modèle vers une manifestation de la maladie plus marquée.

Bénéfices attendus

Si au moins une des 3 nouvelles souches de SDRPV évaluées dans ce projet permet d’observer davantage de signes cliniques et/ou une multiplication virale plus importante qu’avec la souche de référence, les résultats de cette étude nous permettront de la remplacer dans le modèle d’infection SDRPV. Celui-ci deviendrait alors plus pertinent pour évaluer l'efficacité des vaccins.

Procédures

Les animaux (n total = 30) recevront à J0 par voie intranasale du SDRPV (4 lots de 6 porcs : « SDRPV A », « SDRPV B », « SDRPV C » et « SDRPV REF ») ou du milieu de culture (lot Témoin) ; une inoculation intranasale prend moins de 30 secondes par animal. Les animaux (n total = 30) seront soumis à 14 écouvillonnages nasaux et prises de sang sur animal vigile ; ces prélèvements ne durent que quelques secondes.

Impact sur les animaux

L’inoculation de la souche de référence de SDRPV par voie intranasale induit un stress pour l’animal au moment de l’inoculation mais peu de signes cliniques apparaissent par la suite, se résumant généralement à une fièvre transitoire et modérée accompagnée d’une légère baisse d’appétit. Avec les nouvelles souches, il serait possible d’observer ces signes de façon un peu plus marquée, éventuellement accompagnés de quelques troubles respiratoires. Selon la gravité des symptômes, un suivi rapproché des animaux sera mis en place.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’évaluer la présence de lésions induites par l’infection des différentes souches de SDRPV et de quantifier le virus présent dans différents tissus prélevés lors de l’examen nécroscopique.

Remplacement

Le modèle d’infection in vitro des macrophages alvéolaires porcins par le SDRPV peut permettre de comparer les cinétiques de réplication de différentes souches virales. Ainsi la vitesse de multiplication d’une souche in vitro peut présenter un lien avec son niveau de virulence. Néanmoins, pour évaluer la pathogénicité des souches de virus du SDRP, le recours au modèle porc reste obligatoire.

Réduction

Afin de réduire le nombre de groupes et donc d’animaux à utiliser, une étude préliminaire in vitro de comparaison des cinétiques de réplication (sur macrophages alvéolaires porcins) a été réalisée pour 5 nouvelles souches en parallèle de la souche de référence. Cette étude permettra de pré-sélectionner les 3 souches avec les cinétiques de réplication les plus rapides qui seront évaluées in vivo. Pour répondre aux objectifs de l’étude in vivo, il est nécessaire d’inclure 5 lots d’animaux, 3 lots inoculés par chacune des 3 souches SDRPV à évaluer, 1 lot témoin positif, inoculé avec la souche SDRPV de référence, qui sera notre base de comparaison, et 1 lot témoin négatif, inoculé avec du milieu de culture. Tous les lots comporteront 6 animaux chacun de façon à avoir des données statistiques fiables.

Raffinement

Chaque lot sera logé dans une animalerie différente contenant 2 parcs hébergeant chacun 3 porcs. Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Enfin, les porcs auront à leur disposition des matériaux manipulables qui seront renouvelés au cours de l’expérimentation. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. Si les animaux manifestent des signes cliniques graves (atteinte d’un point limite), ils seront mis à mort après concertation avec les personnes responsables de la mise en œuvre du projet.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du SDRPV Les animaux seront sevrés à 4 semaines d’âge et inoculés à 6 semaines d’âge. Cet âge correspond à la période de post-sevrage, à un moment transitoire où le système immunitaire devient mature, période propice aux infections SDRPV.

108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une cavité est creusée dans leurs molaires puis laissée ouverte 24 heures pour déclencher une inflammation de la pulpe dentaire, avant l'application d'un hydrogel expérimental. Le porteur reconnaît une douleur buccale et une gêne pour s'alimenter, et prévoit l'euthanasie de groupes de six animaux à 24 et 72 heures pour récupérer les molaires. Il affirme que les expériences in vitro ne reproduisent pas les interactions cellulaires complexes de l'inflammation et que le recours au rongeur reste "nécessaire" pour valider le biomatériau.

Objectifs

La carie dentaire touche environ 98% de la population en Europe. La dent représente un environnement spécialisé où la pulpe dentaire est un tissu conjonctif mou entouré d'une barrière minérale dure faite de dentine et d'émail. Lors d’une carie, les micro-organismes pénètrent l’émail et la dentine et déclenchent ensuite une réponse inflammatoire/immunitaire dans la pulpe dentaire (pulpite). Cette pulpite peut entraîner des douleurs dentaires très aiguës (la forme la plus répandue de douleur orofaciales). Le traitement des dents en pulpite est encore controversé. Le traitement « classique » canalaire radiculaire présente un bon taux de succès (85%) : il consiste après mise en forme et désinfection à l’aide d’une solution d’hypochlorite de sodium 2,5% à obturer de manière tridimensionnelle l’intégralité de l’endodonte avec un ciment et de la gutta percha (polymère naturel). Cependant, les dents traitées sont plus cassantes que les dents non traitées ; il y a une perte des capacités de cicatrisation, et un risque de dissémination bactérienne dans l'organisme subsiste toujours après traitement radiculaire. Une approche alternative consiste à retirer uniquement la partie enflammée de la pulpe pour maintenir et préserver son potentiel de guérison. Les avantages de ces thérapeutiques sont : le maintien des mécanismes de défense, la perception de la douleur comme système d'alerte, la cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients. Malgré ces avantages évidents, cette approche alternative est encore peu pratiquée notamment parce que le résultat est difficilement prévisible en raison de l'état inflammatoire du tissu pulpaire restant. En effet, l'inflammation pulpaire est souvent trop importante et entraîne une nécrose pulpaire. L'originalité de ce projet est de contrôler la réponse immunitaire qui est le principal facteur de succès.

Bénéfices attendus

Ce modèle nous permettra d’induire une inflammation dans un système global ce qui n’est malheureusement pas possible avec les expérimentations in vitro. Nous pourrons alors évaluer l’effet anti-inflammatoire de ces nouveaux hydrogels d'acide hyaluronique à base de nanoémulsion chargée en lipoxine A4 (LXA4). Les nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des LXA4, qui améliorent la résolution de l’inflammation pourraient avoir un meilleur rapport bénéfice/risque. A court terme ce protocole nous permettra de répondre à plusieurs questions. Tout d’abord, nous pourrons choisir une formulation d’hydrogel, la plus efficace pour favoriser la résolution de l’inflammation. Nous pourrons également valider l’effet de la LXA4 in vivo dans un système complexe et non seulement in vitro sur les macrophages. Notre proposition peut également être avantageuse par rapport à d'autres systèmes d'administration de médicaments qui ont des effets immunotoxiques indésirables potentiels. A plus long terme, ce protocole marquera une avancée dans l’élaboration d’un système complexe permettant de relarguer des molécules anti-inflammatoires telles que la LXA4 de manière contrôlée dans le temps. En clinique, l’objectif final sera d’apporter une alternative supérieure en termes de cicatrisation et de régénération des tissus concernés dans le cadre des pulpites (maintien des mécanismes de défense, perception de la douleur comme système d'alerte, cicatrisation et la régénération des tissus, l'achèvement de la formation des racines chez les jeunes patients). Bien que notre perspective se concentre sur le domaine de la dentisterie, l'utilisation de notre proposition thérapeutique pourrait être déployée afin de traiter de multiples maladies inflammatoires et/ou des défauts osseux.

Procédures

Le jour de la procédure, les rats seront anesthésiés. L’ouverture buccale sera maintenue par instrument dentaire. Pour induire l’inflammation, nous formerons une cavité à l'aide d'instruments dentaires sur les molaires, la cavité formée sera rincée au sérum physiologique avant d’être laissée à l’air libre durant 24h. Après 24h d’exposition, la cavité sera de nouveau rincée au sérum physiologique pour éliminer tous débris éventuels puis nous viendrons injecter dans la cavité la proposition thérapeutique (ou bien les solutions contrôles) à l’aide d’une seringue, le volume sera adapté à chaque cavité de manière à la remplir. La cavité sera ensuite refermée avec un biomatériau utilisé en dentisterie. Pour chaque groupe, 6 rats seront euthanasiés à 24h et 6 autres à 72h. Nous récupérerons les maxillaires de manière aseptique afin de procéder aux différentes analyses.

Impact sur les animaux

Ce modèle entraine une inflammation « contrôlée » et limitée du tissu pulpaire. Ce protocole de classe modérée pourrait conduire à : - Une douleur au niveau buccal après avoir exposé le tissu pulpaire à l’environnement oral - Une gêne pour s’alimenter (normalement pendant 24h) liée aux dents laissées ouvertes. Le design de l’étude permet de conserver un coté sans atteinte dentaire permettant une alimentation normale. Nous resterons bien évidemment très attentifs sur tout comportement anormal des animaux de manière à soulager leur douleur si celle-ci venait à apparaître.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort afin de pouvoir récupérer les molaires traitées et controlatérales (qui serviront de témoins).

Remplacement

Cette étude prend en compte la règle des 3R. Les expériences in vitro ne permettent malheureusement pas de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs cellulaires (macrophages, neutrophiles, monocytes…) et les différents systèmes (immunitaires, vasculaires…). Il est donc nécessaire de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors de la réponse inflammatoire. L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux chargés en termes de biocompatibilité, et bioactivité. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les formulations d’hydrogels ont été testées et sélectionnées en amont pour leur biocompatibilité et leur caractère anti-inflammatoire in vitro. Le nombre de 6 animaux par groupe est calculé à partir d’un test de puissance statistique pour une différence significative de 20%, un écart-type de 10% et un risque consenti de 5%.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse, les animaux seront manipulés plusieurs jours avant l’expérimentation dans un but d’habituation et leur environnement sera enrichi par alpha dri. Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage. Nous raffinerons également en réduisant les douleurs via : - 1. Une anesthésie réalisée localement avant toute procédure sur la dent. - 2. Des antalgiques en post opératoire. Les rats seront observés et pesées quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérimentation. Par ailleurs, des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en oeuvre lors de l’atteinte de ces points limites ont été décrites. De plus, pour faciliter la prise alimentaire, l’alimentation des rats sera posée sur le sol de manière à être plus accessible. Enfin, les analyses menées sur chaque animal seront complètes. Les molaires traitées et les molaires controlatérales seront prélevées pour effectuer des analyses complètes afin d'exploiter le tissu extrait dans sa totalité.

Choix des espèces

Notre choix se base donc sur l’étude de la bibliographie. Notre projet fondé sur une approche translationnelle est un préalable nécessaire à un développement préclinique sur d'autres espèces plus proches de l'Homme. Ce modèle est bien maitrisé dans notre laboratoire. Le modèle de carie induite sur la molaire de rat est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude des biomatériaux et/ou la réponse immunitaire de la pulpe dentaire tout particulièrement pour l’approche moléculaire, histologique et imagerie 3D. Nous avons choisi d’utiliser uniquement des mâles. Il existe des différences liées au sexe dans la prévalence des lésions carieuses chez l’Homme. Ces différences sont dépendantes d’un grand nombre de variables (milieu socio-économique, accès à l’éducation, accès aux soins). En revanche ces différences n’ont jamais été démontré dans des modèles animaux de caries dentaires. La réponse immunitaire est capitale dans la cicatrisation et il peut y avoir des différences de réponse entre mâles et femelles. Nous prévoyons d’utiliser que des mâles pour justement éliminer ce biais et cela correspond de plus à des publications qui nous ont servi de références pour l’élaboration du protocole. Les animaux reçus auront 7 semaines, ils auront une semaine d’acclimatation dans l’animalerie avant le début du protocole. Les rats auront donc 8 semaines au début du protocole et presque 9 semaines à la fin du protocole. Ce choix correspond à notre volonté de travailler sur de jeunes adultes afin d’éviter les effets liés à la sénescence, de plus cela correspond aux protocoles standards retrouvés dans la littérature concernant ce modèle d’inflammation de la pulpe dentaire.