Procédures modérées

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une maladie d'Alzheimer, elles reçoivent cinq injections intraveineuses espacées de deux semaines et subissent quatre tests comportementaux dont la nature n'est pas précisée, pour étudier le rôle des lymphocytes B. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable puisque les animaux sont tués avant six mois, âge où la forme grave apparaît. Il présente au conditionnel de futures stratégies thérapeutiques et justifie le recours à un "organisme vertébré" par les explorations comportementales.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle des lymphocytes B dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections par voie intraveineuse (5 injections espacées de deux semaines) et des tests comportementaux (au nombre de 4).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucun effets indésirables sur les animaux car les animaux développeront une maladie modérée. Dans ce modèle bien caractérisé, les souris développent une maladie grave à l'age de 12 mois et donc bien après la période de leur utilisation dans notre étude. Tous les animaux seront euthanasiés à l'age de six mois maximum. En revanche, les animaux pourront développer des effets indésirables au cours des injections et des contraintes liées aux test comportementaux. Nous avons alors établi des points limites afin de limiter au maximum ces éffets indésirables.

Devenir

Les animaux que nous utilisons développent spontanément une maladie grave à l'age de 12 mois. Tous les animaux seront donc utilisés et euthanasiés au plus tard à l'age de 6 mois. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale profonde préalable (mélange de Kétamine 180 mg/kg et de Xylazine 10 mg/kg en injection intrapéritonéale sous un volume de 0,01ml/g du poids de la souris). Cette méthode d'euthanasie respecte la réglementation européenne.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle des cellules B dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de six semaines seront utilisées.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées en cage individuelle pendant plus de quatre semaines, elles reçoivent un régime riche en fructose et trois injections intrapéritonéales, puis subissent un test du labyrinthe en croix surélevé et un test de nage forcée pour mesurer anxiété et dépression. Le porteur reconnaît un stress modéré lié à l'isolement, aux injections et à la nature même des tests. Il présente ce projet comme "essentiel" et affirme l'impossibilité de modéliser hors de l'animal le lien entre microbiote, cerveau et comportement.

Objectifs

Pendant des milliers d'années, les humains ont consommé moins de 5 g de fructose par jour. Au 19ieme et 20ieme siècles la baisse du prix du sucre et la conversion industrielle du glucose en sirops de maïs à haute teneur en fructose à l'échelle mondiale a entraîné une augmentation drastique de la consommation de sucre ce qui a multiplié par un facteur 40 la consommation de fructose. Cependant plus de 50% de la population adulte et 80% des enfants de moins de 5 ans ne peuvent pas absorber complètement une charge de 25 g de fructose, alors que l'apport quotidien moyen est de 50-80 g. Ainsi, les changements dans les habitudes alimentaires ont créé des conditions de malabsorption du fructose. Or le fructose apparait de plus en plus comme un facteur de risque pour le développement de troubles fonctionnels cérébraux (apparition de troubles cognitifs, émotionnels et troubles du comportement alimentaire). Cependant les mécanismes liant fructose et troubles de l’humeur demeurent inconnus. Nous avons montré que la consommation excessive de fructose de par la malabsorption à laquelle elle est associée entraîne de profondes modifications du microbiote intestinal et de la production d’une molécule par l’intestin, la cholécystokinine, qui participe à la régulation de l’ingéré alimentaire. Or le microbiote intestinal est de plus en plus reconnu comme étant impliqué dans les troubles de l’humeur et du comportement alimentaire. Nous émettons l’hypothèse que des modifications du métabolisme du microbiote induites par l'ingestion de fructose pourraient donc participer indirectement au développement de troubles de l'humeur et à la modification du comportement alimentaire. Nous émettons également l'hypothèse que ces changements de comportement sont en lien avec l'habilité de ce microbiote à activer la production de cholécystokinine. Ces 2 hypothèses seront testées dans ce projet. Pour cela deux modèles de souris génétiquement modifiées présentant une malabsorption du fructose ainsi que des souris ne présentant pas cette altération seront utilisées. Le projet comprend une procédure permettant d’évaluer l’ingéré alimentaire ainsi que l’état état d’anxiété et de dépression en réponse à une malabsorption du fructose et en présence ou pas d’inhibiteur pharmacologique de la cholécystokinine. Les souris recevront un régime contenant 20% ou pas du tout de fructose pendant 3 semaines et 5 jours.

Bénéfices attendus

L'impact d'une alimentation déséquilibrée sur les fonctions cérébrales est une préoccupation de santé publique. La surconsommation de fructose a été pointée par l'Anses comme potentiellement nocive. Jusqu'à présent, la plupart des études se sont concentrées sur l'impact négatif de la surconsommation de fructose sur le syndrome métabolique. Des études épidémiologiques suggèrent que les régimes enrichis en fructose favorisent le dévelopement de comportements de type anxieux ou dépressif. Récemment le rôle du microbiote dans ce type de comportement a été décrit. Compte tenu de nos données préliminaires il apparait plus que probable que dans le contexte de l'ingestion excessive de fructose (et donc de sa malabsorption), le microbiote participe à ses effets déléteres notamment sur les troubles de l'humeur. Ce projet est essentiel à la compréhension des mécanismes de régulation du stress et de l'anxiété par le fructose.

Procédures

Les animaux recevront un régime riche en fructose susceptible de diminuer leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Les animaux vigiles recevront 3 injections intra péritonéales durant l'ensemble de la procédures (quelques secondes par injection). L'ensemble des animaux seront soumis à 2 tests comportementaux (un test du labyrinthe en croix surélevé de 5 minutes et un test de nage forcée de 6 minutes) afin de mesurer leur niveau d'anxiété et de dépression.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle pendant 4 semaines et 5 jours ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux malabsorbant le fructose réduisent de 5 à 10% leur ingéré alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition à un régime contenant 20% de fructose. Le poids et l'ingéré de ces animaux sera surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. Les animaux soumis aux tests d'anxiété et dépression subiront un stress modéré lié à la nature même des tests. Ce stress durera le temps du test (5 minutes pour le labyrinthe en croix et 6 minutes pour la nage forcée). L'injection IP pratiquée par un expérimentateur expérimenté constitue un stress modéré notamment dû à la contention. Ce stress est cependant très limité dans le temps (quelques secondes seulement). Aucune douleur n'est attendue durant le protocole.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthansié à la fin de la procédure

Remplacement

le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les liens entre composition du microbiote, cerveau et comportement alimentaire/comportement d'anxiété-depression.

Réduction

Afin de réduire de nombre d'animaux nous proposons dans cette étude d'étudier le comportement alimentaire et le comportement d'anxiété et de dépression sur les memes animaux. Un nombre de 20 animaux par groupe a été calculé afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80% ) compte-tenu de la variabilité connue des paramètres.

Raffinement

L’ensemble des animaux bénéficiera d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abris en propylène rouge.Les animaux seront surveillés quotidiennement (surveillance visuelle plus suivi de l'ingéré alimentaire et du gain de poids). Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau excel quotidiennement. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considéré comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont d'une lignée C57Bl6 car on dispose dans cette lignée de souris génétiquement modifiées permettant l'étude des mécanismes de régulation du comportement lié à la malabsorption du fructose (un sucre majeur de notre alimentation). Ce modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies liées à l’alimentation et nous avons une expertise propre sur ces modèles animaux. Des animaux adultes sont utilisés, comme dans nos études préliminaires, car le microbiote est stable à ce stade.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un ou deux gavages et au maximum une injection intrapéritonéale pour être infectées par la bactérie Clostridioides difficile, afin de tester des anticorps censés bloquer la colonisation intestinale. Le porteur qualifie le gavage d'"acte réflexe sans douleur" et affirme un "niveau de sévérité quasi nul", alors que la gravité déclarée reste modérée. Les souris sont tuées par dislocation cervicale à J4, J7 et J15 pour dénombrer les bactéries.

Objectifs

Clostridioides difficile, bactérie Gram positif anaérobie et sporulée, appartient au microbiote intestinal humain et représente la première cause de diarrhées infectieuses nosocomiales de l'adulte au décours d’un traitement antibiotique. Le succès d’une infection à C. difficile va dépendre pour une grande part de la capacité de ce pathogène à se multiplier et à coloniser le tractus intestinal de l’hôte. L’environnement du contenu intestinal qui fait suite à une dysbiose est complexe et ne peut être mimé in vitro que très partiellement. De plus, il a été montré que l’expression de certains facteurs de virulence comme les toxines ou certaines protéines de surface dépendait de la présence de métabolites connus pour varier au cours de la dysbiose. Le but de ce projet est d’étudier in vivo les potentialités prophylactiques et thérapeutiques d’anticorps ciblant des protéines de surface du C. difficile, démontrés par la littérature comme ayant un rôle majeur dans le processus de colonisation. Le pouvoir de colonisation de différentes souches de C. difficile sera évalué, en présence et en l’absence des anticorps monoclonaux.

Bénéfices attendus

Il est attendu une protection des anticorps monoclonaux anti-protéines de surface dans l’infection à C. difficile (ICD). Cette protection peut se traduire sous forme d’une baisse de la colonisation, d’une capacité des souris à éliminer plus rapidement la bactérie et/ou à développer de moindres symptômes de cette infection. Le modèle murin d’ICD est un modèle récapitulant l’infection chez l’homme et permettra ainsi –si les résultats sont concluants- de préparer les essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage (1 à 2 fois) ainsi qu’à au maximum 1 injection IP.

Impact sur les animaux

Le niveau de sévérité est quasi nul car les souris ne sont pas sensibles aux infections à C. difficile. Il faut noter qu’il peut apparaître une légère diarrhée après 2 jours d’infection mais généralement les souris se rétablissent vite. Par ailleurs le gavage est un acte reflexe qui est sans douleur pour la souris et sera pratiqué par des personnes expérimentées avec des sondes flexibles. La dose unique d’injection est de 100 µl et l’inoculation sera réalisée par les techniciens animaliers qui ont une haute pratique de cette procédure. Par ailleurs nous avons observés lors de nos précédentes expériences que deux gavages successifs n’ont pas d’incidence sur le bien-être des animaux. Les embouts utilisés pour ces injections ne sont pas pointus, ils n’entraînent aucun dommage au tractus digestif de l’animal et le gavage se fait par un mécanisme réflexe de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale selon la procédure approuvée par le CEEA sous la référence n°10.

Remplacement

Nous avons déjà commencé à évaluer nos anticorps sur des modèles in vitro. Plusieurs tests ont et sont développés tels qu’un test d’inhibition d’adhérence sur des cellules en plaques où nous incubons dans un premier temps les anticorps avec les bactéries avant de les mettre sur des tapis cellulaires de cellules Caco-2. Après lavage, nous évaluons le nombre de C. difficile ayant adhérés par dénombrement sur gélose ou quantification par qPCR- et dans une puce microfluidique, ainsi qu’un test permettant de regarder la formation de biofilm en présence des anticorps. Le premier test a montré une inhibition d’adhérence aux cellules par les anticorps. Le second test est encore en cours de développement. Enfin, la formation de biofilm est inhibée en présence des anticorps. Le biofilm formé par C. difficile étant un facteur de colonisation et de résistance, nous devrions voir une moindre colonisation in vivo et/ou une élimination plus rapide des bactéries par les souris. Nous avons également mis en évidence une activation des neutrophiles en présence de bactéries recouvertes de nos anticorps et une phagocytose augmentée lorsque les anticorps sont présents. Ces premiers résultats sont encourageants mais ces modèles ne sont pas toujours adaptés pour évaluer le potentiel des anticorps et restent trop simples (lignées cellulaires, absence de microbiote). N’existant à ce jour pas de modèle in vitro ou in silico capable de reproduire la complexité du processus infectieux, des modèles in vivo sont nécessaires pour en conclure sur une activité prophylactique ou thérapeutique des anticorps et ce avant d’amorcer une nouvelle phase de développement clinique.

Réduction

Chaque essai nécessitera 12 animaux soit 36 animaux par expérience. Lors d’un essai, plusieurs anticorps seront testés afin de diminuer le nombre de groupes contrôles. C’est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Un nombre inférieur d’animaux pourrait conduire à une expérience non interprétable en cas de décès accidentel d’un individu au cours de l’expérience. Ce nombre d'animaux est calculé au plus juste en fonction de notre expérience antérieure pour garantir la qualité statistique des données et minimiser le nombre de répétitions. À la suite de la quantification des bactéries présentes dans les fèces comme dans le ceacum dans les différents groupes expérimentaux, un test statistique approprié de type ANOVA nous permettra d’évaluer les différences entre les groupes.

Raffinement

Les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson et du coton est toujours présent dans les cages. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel. Les animaux ne sont pas isolés afin de maintenir une certaine sociabilité. Le gavage sera pratiqué par des personnes expérimentées avec des sondes flexibles. Les embouts utilisés pour ces injections ne sont pas pointus, ils n’entraînent aucun dommage au tractus digestif de l’animal et le gavage se fait par un mécanisme réflexe de l’animal. A J4, J7 et J15 jours après le gavage, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour après inoculation de l’agent pathogène. Afin de suivre l’état général des souris, nous appliquerons les critères indiqués par la grille de « Body Condition Scoring » (Guidelines for Assessing the Health and Condition of Mice. Charmaine J. Foltz and Mollie Ullman-Cullere. Lab Animal. April 1999. Vol 28, No. 4, pps. 28-32.) ainsi qu’une échelle de scoring: a) Changement de poids corporel : 0=Normal, 1=Perte de poids 20%, b) Apparence physique: 0= Normale, 1=Manque de toilettage, 2=Poil ébouriffé, yeux plissés ou bridés, 3=Poil très ébouriffé, posture anormale, c) Comportement : 0=Normal, 1=Changement mineurs, 2= Anormal : mobilité réduite, inactif, 3=Très agité ou immobile, automutilation. Au score maximum de 3 atteint dans un sous-groupe ou un score final de 6 atteint dans la somme des sous-groupes, les animaux seront euthanasiés. Lors d’une infection des souris par C. difficile, il apparaît parfois une légère diarrhée après 2 jours d’infection mais les souris se rétablissent le jour d’après. Afin d’éviter toute déshydratation, des Dietgel seront mis dans les cages dès l’administration de la bactérie. Dans le cas bien improbable où une déshydratation serait observée, une réhydratation avec du sérum physiologique par voie sous-cutanée pourra être pratiquée. Dans l’éventualité où des animaux seraient durablement malades (score décrit ci-dessus), ils seront mis à mort pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle souris est le modèle de colonisation de C. difficile largement utilisé dans de nombreux travaux in vivo (à l’inverse du modèle hamster utilisé comme modèle de virulence). Nous privilégions cette espèce et ce d’autant plus que des souris axéniques sont disponibles dans notre animalerie. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement proche de celui de l’homme, avec la présence de villosités au niveau de l’intestin grêle et de cryptes dans le colon. Aucun autre modèle animal inférieur ne possède une structure aussi similaire, qui semble intervenir dans les interactions entre C. difficile et l’hôte lors de la phase d’implantation et de colonisation. Les animaux seront des adultes âgés de 7 semaines afin d’obtenir des résultats homogènes, ce qui pourrait ne pas être le cas avec des animaux à un stade de développement plus précoce, ou bien avec des animaux plus âgés, le microbiote n’étant pas stable pour de jeunes individus, et la diversité restreintes pour des individus âgés. De plus, et pour pouvoir comparer nos résultats avec d’autres travaux, nous conserverons cet age.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections intrapéritonéales de traitements par contention à l'état vigile, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine, pour étudier comment restaurer l'efficacité de la chimiothérapie dans des cancers du sein et colorectaux. Les points limites prévoient la mise à mort quand la tumeur atteint 250 mm², en cas de diarrhée prolongée, de perte de poids supérieure à 20 % ou d'automutilation. Le porteur affirme que la question "ne peut être abordée qu'in vivo" et revendique un usage de 540 souris respectueux du bien-être des animaux non-humains.

Objectifs

Les dernières années ont vu l'émergence du concept de l'activation du système immunitaire contre le cancer, qui à son tour détermine le succès à long terme des traitements anticancéreux. Nous allons étudier comment compenser la perte de fonction du gène Fpr1 pour restaurer l’efficacité de la chimiothérapie in vivo. Les modèles expérimentaux in vivo sont les seuls moyens d’approche possibles car la réponse immunitaire n’a pas lieu dans les modèles in vitro ou ex vivo. Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-cancéreux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-carcéraux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal. Nous préconisions que l’accomplissement de ce projet fournira des connaissances sur la régulation de la réponse immunitaire aux cancers pour la mise en place de stratégies thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux seront soumis a : - L’injection de cellules tumorales en sous cutané sur l’animal anesthésié par inhalation d’isofluorane - L’injection des traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis a : - Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie - L’injection de traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine Ces différentes manipulations pouvant entrainer du stress chez l’animal, tout sera mis en œuvre pour le limiter. Notamment, l’injection de cellules tumorales sera faite sous anesthésie sur le dos de l’animal afin de réduire les phénomènes de gêne que peut engendrer la croissance tumorale. Les injections de traitements et le suivi de la croissance tumorale seront effectuées par contention de l’animal vigile, technique parfaitement maitrisée par les expérimentateurs dans le but de limiter l’exposition des souris à des anesthésiques.

Devenir

Les souris seront euthanasiées dès l’atteinte des points limites suivants : lorsque les tumeurs atteindront 250 mm2, en cas de diarrhée prolongée (>4 jours); en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial; comportement général anormale (prostration, auto-mutilation, perte de fourrure).

Remplacement

La question scientifique ne peut être abordée qu’in vivo car il n’est pas possible d’étudier l’implication du système immunitaire sur le développement du cancer dans des systèmes in vitro.

Réduction

Nous souhaiterons effectuer cette étude sur un total de 540 souris pour permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Notamment, les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Le modèle choisit est très bien documenté dans la littérature et les protocoles solidement établies au sein de notre laboratoire, permettant ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous utiliserons des souris transgéniques viables, fertiles, de taille normale et ne présentent pas d'anomalies physiques ou comportementales. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et/ou tunnels en cartons). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées dans cette étude. Afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une cécité est provoquée en sept jours par injection de méthylnitrosourée, qui détruit les photorécepteurs, puis les souris subissent deux tests comportementaux visuels dont la nature n'est pas précisée et une électrorétinographie sous anesthésie, pour comparer des animaux sauvages et des animaux dépourvus de la protéine FMRP. En s'appuyant sur la littérature, le porteur affirme que cette perte rapide de la vue n'engendre ni anxiété ni signe de souffrance. Il décrit le modèle animal comme "indispensable" et renvoie une éventuelle thérapie génique chez l'homme au conditionnel.

Objectifs

Parmi les troubles de la vision, les maladies rétiniennes sont une cause importante de morbidité oculaire et de déficiences visuelles. Des études de population ont rapporté une prévalence des troubles rétiniens, en particulier des troubles de la dégénérescence rétinienne (DR), allant de 5,35 % à 21,02 % chez les personnes âgées de 40 ans et plus. La dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie pigmentaire sont les manifestations pathologiques les plus courantes de la DR qui conduisent à une cécité irréversible. Ces pathologies visuelles sont dues à l'apoptose des cellules neurales de la rétine ou des tissus de soutien adjacents, principalement en raison de dommages oxydatifs cumulatifs et prolongés. Bien que les manifestations cliniques de ces maladies aient été entièrement élucidées, il est clair que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents restent à comprendre. Très récemment, un nouveau régulateur pivot de l'apoptose et de la réponse au stress oxydatif a été mis en évidence dans le tissu cérébral : la protéine FMR (FMRP). Dans la rétine, cette protéine est également connue pour être directement associée à des déficits fonctionnels rétiniens. Notre projet vise donc à mieux étudier le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR. L'identification de nouveaux acteurs dans le processus de dégénérescence de la rétine nous permettra de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles stratégies de prévention pour une meilleure prise en charge des patients. Actuellement il n’existe aucun traitement curatif de ces pathologies. Sur la base de ces résultats récents et de l'implication bien connue des mécanismes de stress oxydatif et d'apoptose dans la dégénérescence rétinienne, notre projet vise à mieux caractériser le rôle de la FMRP dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne. La question est de mettre en évidence le rôle de FMRP, dans un modèle murin validé de DR, en comparant les résultats de souris sauvages (WT) versus des souris n'exprimant pas FMRP (KO FMR1).

Bénéfices attendus

Notre stratégie expérimentale (utilisation conjointe des souris KO FMR1 et d’un modèle validé de DR) vise à mieux comprendre le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR, et donc de caractériser si FMRP est une bonne cible thérapeutique dans les DR. Des stratégies ciblées de thérapie génique pourront être envisageables chez l'homme sur la base de ces travaux.

Procédures

1/ Injection i.p (traitement unique), 2/Manipulation pour analyses comportementales (2 tests - 30 minutes) dans le but de caractériser les conséquences de la DR sur des comportements "visuels", et 3/Anesthésie pour l'étude de la fonction rétinienne (ElectroRétinoGraphie ou ERG) (anesthésie unique - 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle « MNU ou MethylNitrosoUrea» de DR utilisé est extrêmement utilisé et validé dans la littérature. Ce modèle va induire une mort spécifique des cellules de la rétine (photorécepteurs), entrainant une perte rapide (7 jours) de la vision chez la souris. Cette perte de la vision est similaire à celle retrouvée chez les patients atteints de DR. Une étude récente utilisant un modèle similaire de DR induite par le MNU a montré l’absence de comportement anxieux ou de souffrance 1 à 2 semaines après injection d et, ceux malgré la perte rapide des paramètres visuels (acuité etc…). Ainsi, dans notre schéma expérimental, la perte rapide de vision n’engendre pas de comportements anxieux ou manifestation comportementale de souffrance (douleur, prostration, hyperactivité etc..).

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort en fin de la procédure, et ce par dislocation cervicale. Ainsi, à chaque temps expérimental (Jour 1, 2, 3, 5 et 7 post-traitement), un lot d’animaux sera mis à mort directement après l'étude de la fonction rétinienne et ce, encore sous anesthésie.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de la DR ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. Dans le cadre de ce projet s’intéressant au rôle de FMRP dans les DR, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires au niveau de la rétine (neurones et cellules gliales). Bien que les expériences in vitro sur cultures cellulaires soient utilisées (lignées cellulaires de cellules rétiniennes : cellules de Müller), aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et la communication cellulaire entre les différents acteurs de la DR.

Réduction

Notre objectif est d’obtenir une bonne robustesse de l’analyse statistique tout en réduisant le nombre d’animaux par lot. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour ce projet in vivo, il y a 5 temps expérimentaux (Jour 1, 2, 3, 5 et 7) avec 8 souris traitées et 8 souris non traitées par génotype (WT et KO FMR1) et par temps soit 32 x 5 = 160 souris au total. A chaque temps expérimental, l’ensemble des animaux seront analysés en comportement et fonction rétinienne (ERG). Puis la moitié des animaux sera mise à mort pour l’étude histologie (prélèvement des yeux) et l’autre moitié sera mise à mort pour les analyses de biologie moléculaire (prélèvement de rétines). Chaque expérience sera répétée trois fois pour une reproductibilité des résultats soit 480 souris au maximum pour 3 ans. Ainsi, nous obtiendrons pour chaque paramètre testé (comportement et ERG) 24 points expérimentaux par temps et par génotype ce qui est un minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats.

Raffinement

Une surveillance et une manipulation quotidiennes des animaux seront effectuées pendant la période d’acclimatation (15 jours) et d’expérimentation. Ces manipulations permettront de limiter le stress de l’animal lors du traitement (injection unique i.p). Par ailleurs, selon les données de la littérature, les animaux traités ne présenteront pas de phénotype autre que la perte de la vision. Les animaux seront hébergés en cage à cap standard au nombre maximum de 5 souris par cage. Nous disposerons dans les cages dès le début de l'expérience, des boules de coton compactées comme enrichissement du milieu. Par ailleurs, l’état général des animaux sera évalué quotidiennement durant toute la durée de l’expérience pour détecter tous signes éventuels de souffrance (3 points limites mis en place). On ne s’attend pas à avoir d’atteinte du point limite dans notre étude. Néanmoins une grille de score quotidienne sera tenue durant le temps d’expérimentation. Les animaux seront mis à mort s’ils présentent des signes de souffrance.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires rétiniennes et leurs conséquences comportementales. Pour notre projet, l’utilisation de la souris est primordiale puis que le couple structure/fonction de sa rétine comme le processus de la DR sont proches de ceux observés chez l’homme. De même, l’existence d’un modèle murin KO FMR1 (disponible au laboratoire) va faciliter l’étude du rôle de FMRP dans la DR.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intramusculaires ou intraveineuses de formulations d'ARN messager, puis une injection intrapéritonéale d'un substrat luminescent avant plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer six nanoparticules lipidiques et trois structures d'ARNm destinées à des vaccins anticancer et à la régénération tissulaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement fiable n'est disponible et que le recours à l'animal est "indispensable" pour tenir compte des interactions avec l'"organisme". Les souris sont tuées à la fin pour quantifier l'ARN dans les organes.

Objectifs

Le projet consiste en l'augmentation de l'efficacité de la vaccination anticancer par ARN et dans l’augmentation de l’efficacité de nos stratégies de régénération tissulaire à base d’ARNm. Nous voulons comparer différentes formulations et différentes structures d’ARNm. Les fins thérapeutiques sont la vaccination ARNm et la régénération tissulaire. Il n'existe pas de système permettant de modéliser l'interaction croisée des formulations d’ARNm de différentes structures avec l’organisme. De tels résultats ne peuvent pas être obtenus par des expériences in cellulo. C’est pour cette raison que l’utilisation de modèle animaux est indispensable pour évaluer l’impact des différentes formulations et structures d’ARNm sur la traduction des ARNm in vivo. Dans ce projet, nous allons tester des LNP :6 types de nanoparticules lipidiques (LNP) ainsi que 3 différentes structures d’ARNm pour maximiser l’expression de l’ARNm in vivo. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner pour chaque formulation la structure d’ARNm entraînant la plus forte expression in vivo après injection intramusculaire ou intraveineuse.

Procédures

Les souris vont recevoir des injections intramusculaires ou intraveineuses de formulations ARNm. Les souris recevront par voie intrapéritonéale le substrat de la luciférase avant imagerie à 6h, 24h et 48h. Les souris seront anesthésiées sous isofluorane (2%) durant les injections intramusculaire ou intraveineuse des formulations ainsi que durant l'injection intrapéritonéale du substrat de la luciférase.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à une douleur suite à l’injection des formulations mis à part la douleur induite lors de l'injection liée à l'aiguille. Nous prendrons en compte la douleur générée ar les injections intramusculaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour quantifier l'ARNm dans les organes où le signal a été détecté.

Remplacement

L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.

Réduction

l’effectif des souris mis en oeuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive, le suivi longitudinal permettra de diminuer le nombre d'animaux

Raffinement

les méthodes utilisées seront mises en oeuvre par du personnel formé (niveau chirurgie) et les points limites sont validés par le comité éthique local. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive chez la souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et de régénération tissulaire. Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage de formulations et de structures ARNm. Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.

24 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de deux tumeurs sous la peau, une injection intraveineuse d'une sonde fluorescente et une injection intratumorale d'un candidat médicament anticancéreux ciblant le récepteur TLR3, suivies de séances d'imagerie sous anesthésie à 24, 48 et 72 heures. Le porteur affirme avoir déjà vérifié l'absence de toxicité et l'efficacité aux mêmes doses, et présente l'étude comme une preuve de concept destinée à préparer un essai clinique chez l'homme. Sur le remplacement, il conclut que "seul un modèle animal" permet d'observer l'apoptose dans un "organisme" complet.

Objectifs

=> RATIONNEL : Le TLR3 est un récepteur de l'immunité permettant au corps de se protéger des infections virales. Le concept du TLR3 comme cible anticancéreuse existe depuis près de 30 ans, même si son mécanisme exact n’est connu que depuis peu. L’activation de ce récepteur entraine une mort programmée, appelée apoptose, spécifique des cellules cancéreuses (pas des cellules normales), ainsi qu’une inflammation locale ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes d’action induit une autovaccination à long terme contre la tumeur. Une nouvelle famille d’activateurs de ce récepteur a récemment été découverte (dont le candidat médicament de cette étude), homogène, actif, spécifique et très peu toxique. => BUT DU PROJET : L’objectif de cette étude est d’utiliser une sonde fluorescente afin de suivre le mécanisme d’apoptose cellulaire induit après administration du candidat médicament en injection locale, ainsi que sa spécificité pour les cellules tumorales exprimant le récepteur TLR3, in-vivo. Ce mécanisme sera regardé dans la souris par une analyse non invasive par imagerie de fluorescence sur tous les organes. Cette analyse quantitative au cours du temps sera effectuée grâce à un outil innovant de tomographie de fluorescence. Pour analyser la spécificité de l’apoptose des cellules tumorale exprimant le TLR3 (et non sur les organes ou tissus sains), induite par le candidat médicament, ce dernier sera injecté dans deux tumeurs (flanc-droit / flanc-gauche), avec les modèles exprimant le TLR3 sur un flanc et celui ne l’exprimant pas sur le flanc opposé. Chacune de ces tumeurs sera traitée par injection locale du candidat médicament à des doses connues comme efficaces dans ces modèles. Une injection a temps unique du candidat médicament sera effectuée, afin de suivre ses effets dans le temps. La sonde fluorescente marquant spécifiquement les cellules apoptotiques sera utilisée par injection intraveineuse 2h avant le premier point de cinétique, pour un signal durant jusqu’à 3 jours post-injection. Les analyses de fluorescence quantitatives sur l'ensemble du corps de l'animal (en 3D), seront effectuées sur animaux vivants sous anesthésie gazeuse respectivement à 24h, 48h et 72h après traitement. Afin de dissocier l’effet d'inflammation de l’effet d’apoptose induit par le candidat médicament, les souris utilisées ne posséderont pas de système immunitaire.

Bénéfices attendus

Cette étude, comprenant une seule procédure, permettra de déterminer le mécanisme d’action d’apoptose spécifique des tissus cancéreux du candidat médicament dans un modèle physiologique complet et d’en apprécier la spécificité par rapport aux organes et tissus sains. Il s’agit d’une étude de recherche translationnelle, de preuve de concept et prospective, permettant de poser les bases d’une étude clinique (dans des conditions d’injection locales), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Procédures

Trois injections sont prévues dans cette expérience : 1/ La greffe tumorale bilatérale sous-cutanée (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris 2/ L’injection de la sonde fluorescente en intraveineuse (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. 3/ Le traitement en injection intratumorale et sous-cutané péri-tumorale (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. A ceci, s’ajoute l’analyse de la fluorescence sur l'ensemble des organes et tissus des souris, qui est un acte non invasif et non douloureux, mais qui nécessite cependant l’immobilité complète de l’animal par une anesthésie sous isoflurane et une contention empêchant tout mouvement.

Impact sur les animaux

# Des effets indésirables pour les animaux pourraient venir des modèles ou des traitements en eux-mêmes => L'absence de toxicité et l’efficacité du candidat médicament ont déjà été analysée sur ces mêmes modèles aux doses utilisées dans cette expérience avec d’excellents résultats. # Les actes d’injection (sonde fluorescente et candidat médicament) induisent une douleur ainsi qu’un stress => une anesthésie gazeuse sera effectuée lors de ces actes. # L’analyse de fluorescence n’est pas un acte douloureux, cependant il nécessite l’immobilité complète de l’animalsous anesthésie gazeuse et une contention empêchant tout mouvement. # La croissance tumorale (pouvant durer env 2 à 3 semaines) peut induire de nombreux effets indésirables (nécrose, perte de poids, mobilité réduite, stress, comportement anormal…). => ici les tumeurs seront analysées à une très faible taille, ce qui devrait limiter la majorité de ces effets indésirables. Cependant, une grille de score basée sur nos expériences précédentes nous permettra d’anticiper toute souffrance des animaux. De plus, la moindre plaie interférant avec les mesures de fluorescence, aucune souris ayant des plaies ou signes de nécroses ne sera incluse dans ces expériences.

Devenir

Tous les animaux ne pouvant pas rentrer en analyse (absence de croissance tumorale, présence de plaies interférant avec l’analyse ou autre critère éthique), seront mis à mort. Tous les animaux analysés seront mis à mort après la dernière analyse. En effet, aucun de ces animaux ne pourra être réutilisé. Cette mise à mort s’effectuera par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Remplacement

Seul un modèle animal permettra d’analyser des phénomènes d’apoptose indésirables au niveau des organes et tissus sains. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de ce mécanisme d’action ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique complexe et physiologique est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique « first in human » (dans des conditions d’injection locale), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Réduction

Cette étude est menée dans un but prospectif. Ainsi l’utilisation de 5 souris par groupe et par modèle est considérée comme suffisant pour une validation de preuve de concept. Il est à noter que la greffe des deux tumeurs différentes (sur les deux flancs de la même souris), permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires à cette étude sans compromettre les résultats scientifiques. Cette expérience s’effectue sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps par des techniques douces d’imagerie, ce qui évite d’avoir à procéder à des actes chirurgicaux lourds ainsi qu’à des mises à mort de grands nombres d’animaux par des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soit une réduction du nombre des animaux pour répondre à la question posée.

Raffinement

La mise en place d’une grille de score et d’une fréquence de surveillance des animaux adaptée à l’étude, permettra d'éviter toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera effectuée deux fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal, du poids corporel et du volume tumoral. Les souris seront greffées sur chaque flanc en injection sous anesthésie gazeuse. Il est à noter que les deux modèles de tumeurs ont des comportements et temps de croissance très similaire. La très petite taille des tumeurs attendue dans cette étude devrait permettre à la fois une bonne analyse de la fluorescence ainsi qu’une souffrance et une gêne physique minimale pour l’animal. Cette expérience s’effectue par imagerie de fluorescence sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps, ce qui évite d’avoir à procéder à de nombreux actes chirurgicaux et mises à mort d’animaux, avec des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soi un Raffinement des méthodes pour répondre à la question posée. L’imagerie par fluorescence est une analyse « douce », non invasive et non douloureuse mais nécessitant l’immobilité de la souris pendant l’acquisition des données. Pour réaliser une analyse, l'animal est donc placé sous anesthésie gazeuse et est ensuite placé dans une cassette de contention pour éviter tout mouvement. Cette dernière est ensuite glissée dans la chambre noire de l’appareil. L’acquisition dure environ 5 minutes. De l’air chauffé circule dans l’appareil et permet de maintenir la température de l’animal. Ce temps court d’analyse, permet à l’animal une récupération rapide et autorise de répéter les acquisitions selon la cinétique décidée. Les animaux sont ensuite placés sur un plateau chauffant avec une lumière chauffante pour qu'ils se réveillent rapidement dans de bonnes conditions.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques permettant de démontrer dans un modèle vivant que les organes et/ou tissus normaux ne sont pas touchés par ces mécanismes d’action pouvant induire une toxicité du candidat médicament. En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé. Qui plus est, il existe aussi de nombreux outils (souris sans système immunitaire, appareillage de fluorescence adapté...), qui permettent d'étudier précisément les différents mécanismes d’action de thérapies chez cette espèce. Une souche de souris sans système immunitaire sera utilisée pour analyser uniquement l’effet d’apoptose indépendamment des mécanismes du candidat médicament sur le système immunitaire qui pourraient interférer. De plus, s'agissant d'une souche de souris sans poils, l'acquisition de fluorescence s'en trouvera facilitée. Des souris sans système immunitaire de 7 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris sont physiologiquement adultes (ce qui est nécessaire dans notre étude en terme d’assimilation, maturation des organes...) etc.

6 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, conservés vivants et réaffectés ensuite à des travaux pratiques d'enseignement. Sous anesthésie générale, on leur crée des plaies cutanées sur les membres, avec deux biopsies et un séjour de deux mois au box. Le porteur indique que les désagréments tiennent aux plaies et au confinement prolongé, compensé par des promenades, et attend un pansement utilisable en clinique. Il affirme que la cicatrisation ne peut être reproduite sur cultures de cellules et qu'il faut travailler sur "l'espèce cible", le cheval ayant un métabolisme cicatriciel spécifique.

Objectifs

1. Diminuer le temps médian normal de cicatrisation par seconde intention de la peau (0.09 mm/jour, 42 jours pour une plaie de 2.5x2.5 cm) du cheval grâce à l’utilisation d’un pansement collé par rapport à une plaie non traitée pour diminuer le temps de convalescence et le coût global du traitement dans l’espèce concernée. 2. Améliorer la cicatrisation par seconde intention d’une plaie de membre chez le cheval traité par pansement collé en diminuant l’incidence de production d’un tissu de granulation exubérant.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce produit qu'il soit utilisé rapidement en clinique, pour faciliter la cicatrisation des plaies distales, pour lesquelles, actuellement, nous n'avons pas de traitement.

Procédures

Les chevaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste à créer des plaies cutanée de petite taille au niveau distal des membres thoraciques. Ils seront ensuite conservés au box pendant 2 mois pour la cicatrisation. L'intervention dure moins d'une heure. Lors de la chirurgie on réalise une biopsie cutanée. Après 60 jours, on réalise une seconde biopsie, sur le tissu cicatriciel, sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les animaux vont soubir deux types de désagréments : - les plaies cutanées l- le séjour prolongé de 2 mois en box

Devenir

Au terme de la cicatrisation cutanée, les chevaux pourront être conservés. Après un temps de repos, ils serviront en pédagogie, en participant à des travaux pratiques peu invasifs.

Remplacement

La cicatrisation cutanée dépend de l'état de propreté de la peau, de la qualité de l'irrigation qui garantit la nutrition et de l'immobilité. Toutes ces conditions sont difficiles à reproduire avec des cultures de kératinocytes. Il faut pouvoir travailler avec l'espèce cible parce que le cheval a un métabolisme de cicatrisation très spécifique.

Réduction

Nous travaillons avec un nombre d'animaux qui a été réduit au maximum parce que nous utilisons chaque cheval pour réaliser 2 plaies sur chaque membre. Ceci donne deux lots de 12 plaies, un lot traité avec le traitement expérimental et un lot traité avec la méthode classiquement reconnue. Les temps médians de cicatrisation sont évalués pour les deux groupes.

Raffinement

Les plaies seront maintenues propres. En cas de douleur manifeste, les chevaux recevront des anti-inflammatoires non stéroïdiens. Les chevaux seront promenés régulièrement pour compenser l'ennui de la vie au box.

Choix des espèces

Nous testons le produit de cicatrisation afin de savoir s'il accèlère la cicatrisation chez les Chevaux, c'est pourquoi nous travaillons avec cette espèce, dont le métabolisme cicatriciel est très spécifique. Nous ne pouvons pas utiliser le poneys, dont le métabolisme est très différent. Adultes, pour avoir des animaux qui ont un métabolisme adapté