Procédures modérées

48 souris ob/ob, prédisposées à l'obésité et au diabète, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prises de sang hebdomadaires et plusieurs tests de tolérance au glucose et à l'insuline par gavage, avant mise à mort pour prélèvement du foie, du pancréas et d'autres tissus. Le porteur teste des extraits végétaux présentés comme "d'origine 100 % naturel" et n'attend "aucune nuisance" hormis chez les témoins. Il affirme être "contraint" d'utiliser des modèles animaux, l'homéostasie du glucose ne pouvant selon lui s'étudier in vitro.

Objectifs

Les objectifs principaux de la recherche sur le diabète de type 2 sont donc doubles : d’une part de mieux élucider les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les enjeux principaux de la recherche sur le diabète de type 2 sont donc doubles : d’une part de mieux élucider les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Chaque semaine un prélèvement de sang (25microlitres) sera réalisé pour mesurer la glycémie, la triglycéridémie et la cholestérolémie des souris. Deux tests de tolérance au glucose seront réalisés au jour 7 et 21. Au cours de ces tests, deux prélèvements de 20 microlitres de sang pour la mesure d’insuline au temps 0 et 30 minutes. Une mesure de glycémie sera effectuée à partir d’une micro-goutte de sang (1-2 microlitres) au temps 0, 15, 30, 60 et 120 minutes après le gavage oral. Un test de tolérance à l'insuline sera réalisé au jour 25. Au cours de ce test, une mesure de glycémie sera effectuée à partir d’une micro-goutte de sang (1-2 microlitres) au temps t0 t+30, t+60, t+90, t+120, t+150 et t+180 minutes pour évaluer la glycémie.

Impact sur les animaux

Les souris ob/ob développent de l'obésité et du diabète. A l'exception des souris contrôles recevant la solution véhicule. Les autres souris devraient voir leur homéostasie glucidique s'améliorer sans nuisances ou effets indésirables attendus.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issu de la procédure. Afin d'explorer les mécanismes anti-diabétiques de la metformine et des extraits végétaux, nous recolterons le foie, le pancréas le tissu adipeux gonadal, le muscle soléaire et le sang. Des analyses métaboliques,histologiques, biochimiques et transcriptomiques seront réalisées sur ces échantillons.

Remplacement

L’homéostasie glucido-lipidique est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes. Il est donc actuellement impossible d’étudier la physiopathologie du diabète d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Enfin, les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. La cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la mise en place de l’insulino-résistance et du diabète. Il existe deux modèles murins de diabète de choix largement utilisés : les souris Db/Db et Ob/Ob. Ces modèles sont intéressants car ils possèdent les 3 stades de l’évolution du diabète observé chez l’homme : une phase très précoce ou les animaux sont normo-glycémiques et normo-insulinosensibles, une phase de 4 à 6 semaines ou l’insulino-résistance progresse mais est compensée par une sur-production pancréatique d’insuline, une troisième phase définie par une défaillance de la fonction pancréatique et l’établissement du diabète. Les souris seront âgées de 6 semaines au début du protocole. Il n’est pas possible d’obtenir des souris plus jeunes chez Charles River. Nous souhaitons initier le traitement des souris Ob/Ob à un âge très précoce lorsque les souris sont encore normo-glycémiques et normo-insulinosensibles. La littérature montre que l’insulino-résistance s’installe progressivement chez ces souris entre 6 et 10 semaines et les souris sont diabétiques après 12 semaines. Notre hypothèse est que l’apport en extraits végétaux permettra de retarder l’apparition du diabète ou d’en atténuer la sévérité.

634 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vieillies jusqu'à vingt-quatre mois, elles subissent l'implantation chirurgicale d'une puce télémétrique sous la peau, un enregistrement cardiaque avec test de stress, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant deux mois pour tester des molécules. Le porteur indique que ces injections répétées sur des souris âgées peuvent provoquer des douleurs, prises en charge par paliers d'antalgiques jusqu'à l'euthanasie au point limite. Il affirme que les organoïdes et les cardiomyocytes issus de cellules souches ne permettent pas d'étudier l'arythmie sur un cœur entier.

Objectifs

Au cours du vieillissement, on observe dans la population un nombre plus important de maladies du cœur, telles que les arythmies cardiaques, l’ensemble étant grevé d’un coût humain et sociétal majeur. Bien que le lien entre vieillissement et pathologies du système cardiovasculaire soit certainement multifactoriel, de nombreux travaux suggèrent l’implication d’une dysfonction des mitochondries. Ces organites cellulaires possèdent leur propre ADN, l’ADN mitochondrial (ADNmt) et jouent le rôle de centrale énergétique de nos cellules. Au cours du vieillissement, nos tissus contiennent quelques cellules présentant une perte d’activité des mitochondries, du fait de l’accumulation de mutations de l’ADNmt. A l’aide d’un modèle de souris qui accumule ces mutations de l’ADNmt de manière accélérée dans le cœur et les muscles squelettiques, nous avons pu montrer qu’au-delà d’un seuil critique, ces cellules déficientes ont un impact pathologique sur la fonction du cœur, générant des arythmies cardiaques. Le projet que nous souhaitons développer a deux objectifs principaux. Le premier est d’étudier l’influence de ces cellules déficientes en activité mitochondriale sur d’autres maladies cardiaques au cours du vieillissement. Le deuxième est de moduler deux mécanismes de contrôle qualité de l’ADNmt chez ces souris afin de ralentir l’accumulation de mutations de l’ADNmt et donc retarder voire prévenir la survenue de leurs troubles cardiaques, ouvrant ainsi la voie à des approches thérapeutiques qui seront peut-être applicables chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d’apporter de nouvelles connaissances sur l’influence des mitochondries sur le développement de troubles cardiaques au cours du vieillissement, qui sont un véritable problème de santé publique. De plus il devrait permettre de déterminer si l’utilisation de molécules destinées à moduler le contrôle-qualité de l'ADN mitochondrial peut s’avérer bénéfique pour la santé humaine en ce qui concerne les maladies cardiovasculaires, en conduisant à une meilleure santé des mitochondries, et donc en retardant l’apparition de troubles fonctionnels du cœur. Certaines des molécules que nous souhaitons tester sont déjà utilisées dans des études cliniques dans d’autres contextes, et de ce fait, si nous observons un effet positif sur la survenue de troubles cardiaques, l’utilisation de ces molécules pourrait être rapidement transférée à l’homme.

Procédures

Dans une première série d'expériences, les animaux vont subir une chirurgie sous anesthésie et analgésie pour implanter une puce télémétrique sous la peau (durée de l'intervention: 15 minutes) afin de mesurer l'électrocardiogramme (ECG). Sept jours après chirurgie, la mesure de l'ECG sera réalisée 24h en cage, puis 10 minutes pendant un test de stress. Dans une deuxième série d'expériences, les animaux vont subir une injection intrapéritonéale (durée de l'intervention: 1 minute) quotidiennement pendant 2 mois pour tester le potentiel de molécules sur les arythmies cardiaques.

Impact sur les animaux

Pour l’échocardiographie, aucune nuisance n’est à prévoir, les souris étant anesthésiées à l’isoflurane pendant la procédure. Pour la télémétrie, les souris vont subir une chirurgie, sous anesthésie (isoflurane) et analgésie (buprénorphine), placées sur un tapis chauffant (37°) pour éviter l’hypothermie. Un délai de 7 jours entre cette opération et les mesures d’ECG permettra aux souris de récupérer. Pendant cette période, les souris seront controlées deux fois par jour pour jauger une éventuelle douleur liée à l’opération ou une perte de poids. La mesure d’ECG de 24h en cage n’entrainera pas de nuisance. En revanche, les souris seront observées pendant les 10 minutes de test de stress, et seront retirées au moindre signe d’inconfort. Enfin, la répétition d’injections intrapéritonéales des molécules à tester sur 60 jours sur souris âgées (de 16 mois à 18 mois et 22 à 24 mois) pourrait entrainer des douleurs, que nous évaluerons par une grille se score. En cas de douleur légère, du paracetamol sera administré dans l’eau de boisson, en continu. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un anti-douleur plus puissant et à action plus longue sera administré en sous-cutané et du gel en contenant sera placé dans la cage pour la nuit. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera euthanasiée (point limite).

Devenir

Tous les animaux prévus dans le projet (634) seront euthanasiés en fin d'expérience.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car nous voulons étudier l’influence physiologique de cellules déficientes en activité mitochondriale sur la fonction du cœur entier, et les modèles d’organoïdes 3D ou cardiomyocytes issus de cellules souches pluripotentes induites humaines ne permettent pas d’une part d’avoir un taux de mutations de l’ADN mitochondrial suffisant, du fait de l’élimination de ces mutations par contrôle qualité mitochondrial dans ces conditions. De plus, l’analyse de l’ECG par télémétrie requiert une phase de stress qui ne peut être reproduite in vitro. Enfin, la souris K320E-Twinkle est modèle de vieillissement tissulaire unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des mosaïques tissulaires mitochondriales sur ce processus de manière tissu-spécifique.

Réduction

Nous réduisons au minimum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. De plus, seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les échocardiographies et la télémétrie et 192 souris seront utilisées sur deux protocoles expérimentaux. En raison de l'âge avancé des animaux au moment des expérimentations, nous savons par expérience sur notre projet précédent qu'un nombre non négligeable d'animaux doit être euthanasié en raison de points limites. Pour ne pas mettre en péril le projet, tout en restant sur un nombre minimal d'animaux par procédure, nous avons inclus 20% d'animaux en plus pour chaque groupe. Pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, nos expériences solides de ces méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental pour la métabolomique.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la SBEA, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En cas de plaie décelée, du Dermaflon ou du Cothivet sont utilisés pour favoriser la cicatrisation. En cas de douleur légère décelée chez les animaux, du paracetamol sera administré dans l’eau de boisson, en continu. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un anti-douleur plus puissant et à action plus prolongée sera administré en sous-cutané et du gel en contenant sera placé dans la cage pour la nuit. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera euthanasiée (point limite).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines et l’étude du vieillissement pathologique, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies. Dans le présent projet, la souris K320E-Twinkle est modèle de vieillissement tissulaire unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des mosaïques tissulaires mitochondriales sur ce processus de manière tissu-spécifique. Les animaux seront utilisés à des âges tardifs, car le développement des mosaïques mitochondriales dans le cœur est un processus qui prend des mois. Pour déterminer l'âge auquel les expériences seront réalisées, nous nous basons sur de précédentes publications. Nous avions observé les premières mosaïques mitochondriales à 12 mois et des arythmies cardiaques significatives à 18 mois. Ainsi les souris les plus jeunes utilisées le seront à 12 mois, et nous prévoyons des analyses sur des animaux allant jusqu’à 24 mois.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales, un suivi hebdomadaire de la croissance des tumeurs par bioluminescence et une épilation sous anesthésie, avant mise à mort à l'atteinte de points limites ou à six mois. Le porteur relie ce travail aux tumeurs cérébrales de l'enfant et à des protéines d'origine rétrovirale, en attendant des retombées thérapeutiques présentées comme "très prometteuses". Il affirme que le modèle cellulaire in vitro ne reproduit pas le microenvironnement tumoral et qu'une validation sur "organisme entier" est "impérative".

Objectifs

Toutes les cellules de notre organisme partagent le même patrimoine génétique (notre ADN) mais l’expriment de façon différente selon le tissu auxquel elles appartiennent. L’ensemble de mécanismes biologiques impliqués dans cette régulation de l’expression des gènes est regroupé sous le terme « épigénétique ». Les bases moléculaires de ce processus se retrouvent au sein d’une structure très complexe qui permet l’empaquetage et la compaction de nos gènes dans le volume limité du noyau cellulaire. Les acteurs épigénétiques regroupent l'ensemble des facteurs qui contrôlent l’accès à la molécule d’ADN. Les tumeurs cérébrales de l’enfant sont au second rang des cancers pédiatriques par leur fréquence après les leucémies. L’absence de traitement efficace se traduit par une espérance de vie inférieure à 2 ans pour les enfants qui développent ces tumeurs. On retrouve dans 30 % des tumeurs cérébrales de l’enfant une mutation dans un gène qui code pour pour une protéine impliquée dans la régulation épigénétique de l'expression des gènes. Bien que cette mutation ait été directement impliquée dans la tumorigénèse, le mécanisme moléculaire sous-jacent reste à établir. Au cours de l'évolution, notre génome a intégré de nombreuses séquences d'ADN d'origines virales, qui sont en quelques sortes des "cicatrices" d'infections passées de notre espèce par des rétrovirus. Ces séquences rétrovirales constituent une large part de notre ADN. Bien que celles-ci soient épigénétiquement réprimées dans nos cellules dans les conditions physiologiques, elles peuvent être réveillées par des facteurs environnementaux. Cette activation peut ainsi conduire à l’expression de protéines rétrovirales qui peuvent être pathogènes, mais peuvent aussi acquérir une fonction physiologique bénéfique pour l’homme. Nos résultats préliminaires, obtenus in vitro à partir de cellules tumorales en culture, montrent que le facteur épigénétique muté dans les tumeurs cérébrales de l'enfant est nécessaire à l'expression de certaines protéines rétrovirales. Notre objectif est de montrer in vivo chez la souris que ces protéines ont une fonction protectrice qui agit contre la prolifération et la migration des cellules cancéreuses en favorisant le potentiel inflammatoire des cellules cancéreuses et leur interaction avec les cellules immunitaires.

Bénéfices attendus

Nos résultats représentent une piste très prometteuse dans la compréhension du cancer du cerveau chez l'enfant. Par ailleurs, la capacité des cellules cancéreuses à former des métastases, par dissémination à distance de leur site d’apparition, est la principale cause de mortalité chez les patients développant une tumeur solide. Si nous parvenons à montrer que certaines protéines rétrovirales ont une fonction anti-oncogénique, nous ouvrirons la voie au développement de nouvelles thérapies dans la recherche contre le cancer dans sa globalité, qui cibleraient spécifiquement les protéines rétrovirales endogènes.

Procédures

L'ensemble des souris de ce projet (168) subira une injection de cellules tumorales à l'age de 6 semaines (PE1), suivit d'une mesure de la bioluminescence pour suivre la croissance tumorale 1 fois par semaine, pendant 5 semaines (au minimum), 4 mois (au maximum) ou jusqu'à l'apparition d'un des points limites mis en place. Les injections des cellules tumorales se feront par voie intraveineuse ou sous-cutanée dans le flanc de l’animal. Les souris seront anesthésiées par voie gazeuse à l'isoflurane. Lors de l’anesthésie, un gel ophtalmique pourra être appliqué sur l’oeil afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Pour la mesure de bioluminescence, la D-luciferin sera injectée par voie intrapéritonéale. Les injections se feront dans la salle reservée aux souris sauvages. Dix minutes après l’injection l’animal sera placé dans l’imageur bioluminescent pour l’acquisition des images. L’imageur est construit avec système d’anesthésie gazeuse interne qui utilise le gaz isoflurane. Les souris seront épilés car le pelage noir de la souche C57BL/6 atténue l'émission de photons. Pour le processus d'épilation, les souris seront anesthésiées et une crème d'épilation sera appliquée.

Impact sur les animaux

Le seul phénotype dommageable attendu est l'apparition de tumeurs. Les souris seront suivies cliniquement quotidiennement et des points limites appliquées pour éviter toutes souffrances liées au phénotype.

Devenir

Toutes les souris agées de 6 semaines utilisées lors de la PE1 (168) suivront ensuite la PE2. Les souris seront suivies 1 fois par semaine pendant 5 semaines, au minimum, 4 mois au maximum après l'injection, tout le long de la PE2. Toutes les souris de la PE2 (168) seront sacrifiées à l'atteinte des points limites définis dans la PE1 le cas échéant, ou à l'age de 6 mois au plus tard.

Remplacement

Nos résultats préliminaires effectués dans des cellules en culture montrent que les protéines p53 et H3.3 sont nécessaires à l’expression de certaines protéines rétrovirales dans le génome murin. Nous faisons l’hypothèse que ces protéines ont une fonction protectrice qui agit contre la prolifération et la migration des cellules cancéreuses. Les mécanismes épigénétiques étant très dynamiques mais surtout tissus et individus spécifiques, il est impératif de valider l’ensemble de nos conclusions au sein d’un organisme entier. Le modèle de cellules tumorales en culture in vitro ne reproduit pas toutes les étapes de la tumorigenèse in vivo, car il ne tient pas compte du microenvironnement tumoral et donc ne pourra pas apporter le niveau d'information requis. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que par un modèle d'étude in vivo, à savoir dans notre étude, par injection de cellules tumorales dans des souris saines.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, le projet se déroulera en 2 étapes. La première étape (18 souris) sera une étude pilote de la tumorigénicité du modèle cellulaire utilisé qui permettra de mettre au point les meilleurs conditions expérimentales pour le développement des tumeurs (optimisation du nombre de cellules, site d'injections). L'étape 2 permettra de tester l'hypothèse de travail dans les conditions expérimentales définie lors de l'étude pilote, en réduisant le nombre d’animaux au minimum (15 souris utilisées pour chacune des 10 conditions expérimentales) tout en garantissant des résultats statistiquement analysables (tests non-paramétriques de Mann-Whitney U et de Kruskal-Wallis H, pour les comparaisons de 2 groupes ou de plus de 2 groupes, respectivement). Le nombre total de souris expérimentales sera de 168. Par ailleurs, notre étude pourra se développer de manière qualitative si l'expérience s'avère concluante, nous pourrons ainsi prélever les tumeurs primaires et les métastases afin de les étudier par immunohistochimie ou séquençage d'ARN.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale. Toutes les lignées utilisées étant modifiées afin qu’elles expriment de façon constitutive la luciférase, nous mesurerons les différences de croissance tumorale par des techniques non-invasives. Les tumeurs émettront un signal luminescent, qui sera détecté par imagerie afin de monitorer la taille des tumeurs primaires ainsi que la progression métastatique de celles-ci. Nous suivrons quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable, entre 5 semaines et 4 mois après l'injection. Comme point limite, les animaux seront mis à mort en cas de douleur évidente suivant les critères d’arrêt suivants : perte de poids supérieure à 20%, tableau de scoring de la douleur niveau 3 observé*, nécrose des tumeurs, taille des tumeurs atteignant 1 cm3, détection de métastases dissiminées. *Le tableau de scoring évoluera la douleur selon les critères suivants : (1) poids corporel ; (2) apparence physique ; (3) signes cliniques mesurables (température corporelle, fréquence cardiaque et fréquence respiratoire) ; (4) modifications du comportement non provoqué ou (5) après stimulation ; (6) aspect du site d’injection. Un certain nombre de point sera donné à chacune des 6 catégories selon des variables précises. Un score sera attribué en fonction du nombre total de point obtenu.

Choix des espèces

Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité d'utiliser des lignées transgéniques, temps de génération court, génôme connu, outils moléculaires). De plus, nos résultats préliminaires in vitro ont été obtenus dans des lignées cellulaires murines. D'autre part la souris possède 99% d'identité de gènes avec l'homme, et les mécanismes cellulaires à l'oeuvre et impliquant les variantes d'histones dont H3.3 sont conservés. La séquence protéique de H3.3 est 100% identique entre la souris et l'homme. Pour les expériences d’injection, nous avons choisi des fibroblastes embryonnaires de souris pour éviter tout rejet des cellules après injections. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines pour l'injection des cellules tumorales, car il est important pour notyre hypothèse de travail que les souris aient un système immunitaire mature. En outre, l'utilisation de souris adultes mais jeunes permettra un suivit de la croissance tumorale jusqu'à 4 mois après l'injection le cas échéant sans dépasser un age maximum de 6 mois. En effet tous les animaux de cette étude seront mis à mort à l'age de 6 mois au plus tard le cas échéant (si aucun des points limites décrits n'est atteint).

52 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation focale leur est induite par injection stéréotaxique de lysolécithine, modèle de sclérose en plaques, suivie de jusqu'à cinq anesthésies générales par mois, d'amincissements du crâne et de séances d'imagerie par IRM et ultrasons. Une partie des animaux est étudiée éveillés, avec un cadre fixé en permanence au crâne, et le porteur indique que la démyélinisation reste locale sans déficit moteur, les animaux étant tués pour analyse du cerveau. Il affirme que ni les réseaux de neurones ni les organoïdes ne permettent d'évaluer le retentissement d'une démyélinisation focale.

Objectifs

La démyélinisation focale d’un faisceau de matière blanche cérébrale par une injection in situ de lysolecithine est un modèle animal de la sclérose en plaques humaine largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes moléculaires et cellulaires de la démyélinisation et remyélinisation. Cependant l’impact fonctionnel (la connectivité entre différentes aires cérébrales) de cette démyélinisation focale a été quasiment ignoré jusqu’à présent. Ce projet permettra de caractériser cet aspect peu étudié, en mobilisant des approches d’imagerie (IRM, ultrasons) et de comportement.

Bénéfices attendus

Les maladies démyélinisantes du système nerveux central et notamment la sclérose en plaque font parties des maladies invalidantes chez le jeune adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact fonctionnel de la démyélinisation focale par l’utilisation de ce modèle animal. Cet aspect inexploré du modèle animal permettra ensuite de définir de marqueurs fonctionnels qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à un maximum de 5 anesthésies générales sur une période d’un mois. La première sera réalisée au moment de l’injection de la substance démyélinisante (1h), la seconde pour l’examen IRM (30 min) et dans le cas où l’induction du modèle est confirmée, de l’amincissement du crâne (30 min). Une troisième anesthésie sera réalisée au cours de la première session d’imagerie ultrasonore (1h). La quatrième anesthésie sera afin de réaliser le deuxième amincissement du crâne et la dernière pour la deuxième session d’imagerie ultrasonore.

Impact sur les animaux

L’injection de la substance démyélinisante (lysophosphatidylcholine) s’effectue via une chirurgie stéréotaxique et produit une démyélinisation focale limitée au niveau du site d’injection. Cette démyélinisation locale n’entraîne pas de déficit moteur. L’amincissement du crâne est réalisé avant chacune des sessions d’imagerie fUS, afin de maximiser le signal ultrasonore. Une partie des animaux sera étudiée en condition d’éveil et dans ce cas un cadre permettant supportant la sonde ultrasonore sera fixé de manière permanente sur le crâne des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour prélèvement du cerveau et analyse post-mortem.

Remplacement

Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (IRM, ultrasons) permettant d’étudier la connectivité entre aires cérébrales, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Ni les réseaux de neurones, ni les organoïdes cérébraux, ne permettent aujourd’hui d’évaluer le retentissement global (entre aires cérébrales) d’une démyélinisation focale (limitée à un faisceau de matière blanche). De plus, l’utilisation de l’animal vivant permet de relier les données d’imagerie à des performances en tâches comportementales, et ainsi de définir des biomarqueurs fonctionnels qui pourront ensuite être utilisés pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. La sonde ultrasonore est adaptée au rongeur.

Réduction

Chaque animal sera utilisé au cours de plusieurs séances d’imagerie. Ce suivi longitudinal permet de suivre des modifications structurales et fonctionnelle sans avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique. Un nombre minimum de 8 animaux par groupe seront nécessaire afin de permettre une puissance statistique suffisante avec une variabilité de 5 % et obtenir un résultat fiable en procédure 1. Cette estimation est basée sur les travaux les plus récents utilisant cette technique d’imagerie ultrasonore pour sonder la connectivité cérébrale par groupe. Considérant que 20% d’échecs peuvent survenir au moment de l’injection stéréotaxique (nécrose ou démyélinisation trop faible), et 20% au moment de l’amincissement du crâne, un nombre de 12 animaux par groupe, soit un total de 24 animaux sera requis pour la procédure 1. Les procédures 2 et 3 sont conditionnées à la réussite de la procédure 1 et sont envisagées comme des expérimentations pilotes sur un petit nombre d’animaux. Ainsi, pour la procédure 2, qui vise à établir la faisabilité de l’imagerie fUS chez l’animal éveillé, 10 animaux seront nécessaires au maximum. Pour la procédure 3, qui vise à tester d’autres sites d’injections du corps calleux, 6 animaux sont envisagés par site d’injection soit 18 animaux en tout. L’ensemble du projet nécessite 52 rongeurs.

Raffinement

Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés après la chirurgie : perte de poids > 15 % depuis le début de la procédure ; poils très ébouriffés, posture anormale, yeux fermés, immobilité. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique, amincissement du crâne) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (buprénorphine), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques dès l’apparition de signes. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et si nécessaire, l’euthanasie serait effectuée. Les scéances d’imagerie fUS seront réalisé avec une sonde de taille adapté aux crânes des rongueurs. Les expériences chez l’animal éveillé seront précédées par une phase d’habituation afin de minimiser le stress.

Choix des espèces

L’utilisation du rat est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau du rat est proche de celle de l’homme. Le modèle de démyélinisation focale est très bien caractérisé et maîtrisé chez cette espèce. L'imagerie ultrasonore peut être réalisée en condition optimales grâce à une sonde de taille adaptée, et de poids adapté (20g avec le cable) permettant à l'animal éveillé de rester libre de ses mouvements. Rats adultes (6-8 semaines), Crl:CD(SD) Travail sur des animaux adultes ayant un dévéloppement cérébral achevé.

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes dans deux régions profondes du cerveau, puis une restriction alimentaire maintenue à 90 % de leur poids pour les motiver à une tâche de labyrinthe en T récompensée par un granulé de sucre. Le porteur décrit précisément cette tâche de conflit de réponse et indique que la chirurgie et la manipulation quotidienne génèrent stress et douleur, atténués par analgésie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer une tâche comportementale et que l'étude ne peut être menée chez l'humain.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet dans le domaine des Neurosciences Cognitives est de comprendre les mécanismes neuronaux sous-tendant le contrôle de l'action dans le cadre de situations ou des actions impulsives et inappropriées peuvent prendre le pas sur le comportement volontaire d’un sujet, ce qu'on appelle dans le milieu un conflit de réponses. Ce travail repose principalement sur des méthodes électrophysiologiques et comportementales pour comprendre la manière dont les rongeurs peuvent résoudre des tâches de conflit de réponses, et comment différentes régions du striatum participent à ce processus. Le striatum étant une structure profonde du cerveau que l'on sait impliqué de manière importante dans le contrôle de l'action et la motricité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le fonctionnement de deux structures cérébrales, le striatum dorso- médian et le striatum dorso-latéral, ainsi que les processus cognitifs sous-tendant le contrôle de l'action.

Procédures

Les animaux seront soumis à un acte chirurgicale pour implanter des électrodes d'enregistrement intracérébrales. Ils seront également soumis à une tâche comportementale sur un labyrinthe en T, dans laquelle ils apprendront à se diriger vers un des deux bras du T sur la base d'un stimulus instructeur (une lumière indiquant le chemin à suivre), afin d'obtenir une récompense alimentaire (un granulé de sucre). Au total, 20 rats participeront à cette expérience qui devrait durée environ 5 mois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux découlent principalement de - la restriction alimentaire tout le long du protocole comportementale: l'évolution du poids des animaux sera maintenue à une progression mensuelle de 10% tout au long du protocole à partir d'un poids initial correspondant à 90% du poids de l'animal avant le début de la restriction (pour garantir la motivation des animaux à effectuer la tâche comportementale) - la chirurgie: les animaux subiront une chirurgie pour implanter des électrodes au sein des deux structures visées (le striatum dorso- médian et le striatum dorso-latéral) - La manipulation par l'expérimentateur et la tâche comportementale: Les animaux seront manipulés quotidiennement par l'expérimentateur; le stress que cela pourrait générer sera toutefois minimisé par une habituation longue et adaptée aux besoins de chaque animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les cerveaux de tous les animaux seront prélevés pour des analyses histologiques. Ces analyses sont en effet indispensables pour confirmer le bon positionnement des électrodes d'enregistrement dans les structures ciblées. Sans cela, il est impossible de s'assurer que l'activité neuronale enregistrée provient bien des deux structures qui nous intéressent.

Remplacement

La nature même des expériences ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elles reposent sur une tâche comportementale que les animaux effectuent et ne peuvent pas être réalisées à partir de modèles in vitro ou in silico. Ce projet ne peut pas non plus être réalisé chez l’humain car les résolutions spatiale et temporelle étudiées nécessite l’implantation d’électrodes dans des structures cérébrales profondes.

Réduction

Le matériel d’enregistrement électrophysiologique que nous utiliserons (microdescendeurs à haute densité) permettra de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet en maximisant le nombre de neurones enregistrés par animal. En effet, ce système permettant de bouger verticalement la position des éléctrodes prévient la formation d'une cicatrice gliale autour de celles-ci qui pourrait empêcher l'enregistrement de l'activiter neuronale assez rapidement après implantation si le système été fixe. On peut ainsi enregistrer plus de neurones, plus longtemps, entraînant le besoin de moins d'animaux. La méthode d’implantation que nous utiliseront (électrodes placées simultanément dans les deux structures visées chez un même rat, au lieu d'utiliser deux groupes différents, un pour chaque structure) permettra également de réduire ce nombre de 50%.

Raffinement

Avant la chirurgie les rats seront hébergés dans des conditions standards avec de la litière foisonnante et un tube en plastique ou une barrette de bois comme enrichissement. L'hébergement standard prévoie également de garder les animaux en binômes permettant ainsi un enrichissement social de leur environnement. Après la chirurgie les rats implantés seront hébergés individuellement dans des cages rehaussées de 13cm pour qu'ils puissent se redresser sans que l'implant ne gêne leurs mouvements. L'enrichissement matériel de l'environnement sera toujours présent. Durant la procédure chirurgicale, l'anesthésie générale profonde sera assurée par l'association d'un agent volatil (isoflurane) et d'un dérivé morphinique (buprénorphine). La buprénorphine agira également comme un analésique puissant pendant 6h après l'injection, couvrant donc la totalité de la durée de la chirugie et sera également associé à un anti-douleur longue durée (carprophène, 24h d'action) et un analgésique local (lidocaïne) assurant ainsi une couverture analgésique optimale pendant la chirurgie. Durant la phase post-chirurgicale, l'animal aura accés à un complément alimentaire riche en eau et en nutriments (hydrogèle) en plus de sa nourriture standard ad libitum pour faciliter sa rémission. Le suivi de l'état de l'animal dans la phase post-chirurgicale sera fait deux fois par jour durant toutes la période de rémission (7 à 10 jours) et visera à évaluer le niveau de douleur et de détresse du rat. Une prise en charge analgésique sera mise en place si nécessaire. Le dégré sera adapté à l'état de l'animal pour faire disparaître toute manifestation de douleur ou de détresse. Egalement, la procédure comportementale sera précédée d'une période d'habituation à l'expérimentateur et au matériel expérimental (labyrinthe en T) visant à faire disparaître tout stress ou détresse de quelque nature que ce soit liés à la manipulation. Cette période d'habituation pourra être de durée variable en fonction des besoins des animaux. Le niveau de stress étant évalué par l'expérimentateur à chaque manipulation. Finalement, afin de maximiser le confort des animaux durant la tâche comportementale, les tests seront fait dans la pénombre.

Choix des espèces

Le rat présente de grandes capacités à la fois d'exploration de l'espace et de contrôle de l'action. Ses performances dans des labyrinthes spatiaux (tels que le labyrinthe en T) et dans des tâches de planification et de contrôle de l'action sont excellentes. De plus, une vaste littérature existe sur ces sujets, ce qui nous permettra de comparer les résultats que nous obtiendrons en utilisant une procédure comportementale innovante avec ceux déjà existants. Egalement, nos travaux antérieurs ont été réalisés chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats entre eux. Finalement, il s'agira de rats à l'age adulte (3 mois au début de l'expérience). La question scientifique posée ne porte ni sur le développement ni sur le vieillissement des processus cognitifs étudiés. Des animaux jeunes adultes qui devraient avoir des capacités cognitives inchangées tout au long de l'expérience et jusqu'à sa fin sont donc les modèles les plus appropriés.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose pulmonaire leur est induite par la bléomycine, puis elles reçoivent un anticorps par injection quotidienne sous-cutanée pendant quatorze jours et deux injections intrapéritonéales par semaine, avant prélèvement des poumons. Le porteur indique que les souris pourraient développer une détresse respiratoire, mais que la durée courte de l'expérience conduit à les mettre à mort avant l'apparition des symptômes. Il affirme qu'il est impossible d'évaluer l'effet de l'anticorps sur l'ensemble du métabolisme sans recourir à un modèle animal.

Objectifs

Nous souhaitons étudier in vivo l'effet d'anticorps dirigés contre la molécule d'intérêt dans la fibrose pulmonaire dans un modèle murin ainsi que les mécanismes d'action intervenant dans cet effet.

Bénéfices attendus

Nous espérons observer par immunohistochimie une diminution de la fibrose dans les groupes traités avec l'anticorps. Ceci sera mesuré par immunohistochimie.

Procédures

Les animaux recevront une injection quotidienne en sous cutanné pendant 14 jours et une injection IP 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Les animaux traités avec la bléomycine pourraient développer une détresse respiratoire cependant la durée courte de l'expérience (14 jours) fait que les animaux seront mis à mort avant le développement des symptômes physique de la maladie. Cependant le suivi journalier des animaux nous permettra d'euthanasier les animaux qui développeraient une détresse respiratoire précoce.

Devenir

Afin d'évaluer la fibrose pulmonaire par immunohistochimie sur les tissus pulmonaires les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

De part la complexité des intéractions cellulaires et moléculaire il est impossible d'évaluer l'effet de nos anticorps sur l'ensemble du métabolisme sans avoir recours à des modèles animaux. Le modèle de souris a été choisi car nous disposons d'un anticorps ciblant la molécule murine équivalent à notre anticorps ciblant la protéine humaine. Si l'effet bénéfique est observé dans le modèle murin nous pourrons justifier l'intérêt de l'anticorps humains pour la clinique.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit à 100 (25 souris / groupes) ce qui nous permettra d'évaluer de façon statistique l'effet de l'anticorps sur la fibrose pulmonaire. Afin de limiter les variations entre les souris au sein d'un groupe, nous prévoyons 25 animaux par groupe afin d'être sûr d'obtenir des résultats statistiques. Le poids corporel des animaux des différents groupes sera comparé par le test statistique Two Way RM ANOVA et leur survie par Log Rank test. Approche statistique : Nous utiliserons un t Test pour comparer le groupe contrôle avec chaque groupe test

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les jours. Les animaux montrant des signes physiques caractéristiques d’un mal être (une perte de poids supérieure à 20%, la présence de sang dans les matières fécales,l'impossibilité de mouvement ou la voussure sévère du dos) seront euthanasiés. Les conditions d'hébergement et d'enrichissement sont standards à l'espèce, les souris seront par groupe social de 5 maximum par cage, avec des moyens d'enrichissement. Une surveillance quotidienne ainsi qu’un suivi clinique etcomportemental des animaux (poils hérissés, dos voûté, agressivité…) sera réalisé. Tous les animaux traités et ceux des groupes contrôles seront analysés à la fin du protocole afin d’en obtenir un maximum d’information post mortem (analyse cellulaire par cytométrie, immunohistologie, analyse d'expression ARN). Les résultats obtenus permettront de déterminer le potentiel thérapeutique de nos anticorps pour limiter/empêcher la fibrose pulmonaire.

Choix des espèces

Le modèle de souris a été choisi car nous disposons d'un anticorps ciblant la molécule murine équivalent à notre anticorps ciblant la protéine humaine. Si l'effet bénéfique est observé dans le modèle murin nous pourrons justifier l'intérêt de l'anticorps humains pour la clinique. L'âge : les souris commandées seront des souris adultes entre 18-24 mois pour leur poids stable en fin de croissance, cela limitera les différences entre individus. L'espèce : pour la facilité de manipulation (injection des molécules en s/c et ip), de prélèvement et d'analyse d'échantillons, d'évaluation physique (bien être)

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrose leur est induite par injections de collagénase dans le genou, suivies de l'injection d'agents dits sénothérapeutiques et de deux prélèvements sanguins à la queue, avant la mise à mort pour prélever l'articulation. Le porteur indique que l'injection de collagénase peut provoquer une douleur au genou, et attend des bénéfices à long terme, aucun traitement n'existant à ce jour contre l'arthrose. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la sénescence cellulaire dans l'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants.

Objectifs

Comme évoqué précédemment, l’arthrose est la maladie la plus répandue en rhumatologie. Elle consiste en une dégradation progressive du cartilage. Aucun traitement n’est disponible. Il a été montré, dans une récente étude in vitro et in vivo, chez la souris ou sur des prélèvements de patients, que la sénescence cellulaire s’accumule dans le cartilage arthrosique. Cette découverte a permis de proposer une nouvelle approche thérapeutique de l’arthrose en ciblant les cellules sénescentes par injection d’agents dits séno-thérapeutiques. Nous proposons ainsi, dans ce projet, de : 1- établir la présence de cellules sénescentes dans un modèle d’arthrose induite à la collagénase chez les souris jeunes et âgées; 2- de valider l’effet sur la sénescence induite par l’arthrose d’agents séno-thérapeutiques (molécules, anticorps ou cellules) que nous avons identifié au cours d’études in vitro dans le laboratoire.

Bénéfices attendus

Nous attendons des bénéfices à long terme, le but étant de retarder et/ou éliminer l’accumulation des cellules sénescentes articulaires qui entrainent le développement de l’arthrose.

Procédures

Procédures chirurgicales : injection intra-articulaire (2 fois avec la collagénase et 1 fois avec la molécule sénothérapeutique), le temps d'une injection + Prélévement caudal 2 fois.

Impact sur les animaux

L’injection de la collagénase en intra-articulaire peut induire une douleur au niveau du genou.

Devenir

A la fin du projet, les souris seront sacrifiées pour permettre le prélevement de l'articulation du genou.

Remplacement

L’analyse du rôle de la senescence cellulaire et de son traitement sur un modèle d'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n’est donc pas possible de prévoir une méthode substitutive pour répondre à la question scientifique de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé en tenant compte des pertes éventuelles lors des protocoles et en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrose chez la souris et de mise en évidence d'effet significatif sur les paramètres histologiques mesurés en fin d'expérience.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Les injections intraarticulaires se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter au maximum la souffrance et l'angoisse infligé aux animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement.

Choix des espèces

Le modèle murin d'arthrose induite à la collagénase présente l’avantage de reproduire fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’Homme, c'est-à-dire chez le sujet jeune après le trauma articulaire ou chez le sujet âgé par une arthrose spontanée. Les animaux seront utilisés à 2 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à l’arthrose induite. Chez les souris de 18 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à une arthrose spontanée et naturelle. Sur les 2 modèles (jeunes et âgées), on va étudier l’effet de l’élimination de ces cellules sénescentes par des injections articulaires d’agents séno-thérapeutiques

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène cinq jours de suite pour supprimer le gène Pk2 dans les oligodendrocytes, puis sont anesthésiées pour une perfusion terminale du cerveau. Le porteur indique que ces injections répétées sont un facteur de stress douloureux et que la délétion peut entraîner des troubles locomoteurs, voire des crises d'épilepsie. Il relie ce travail fondamental à l'autisme et à la maladie d'Alzheimer chez l'humain, mais affirme qu'aucun modèle in vitro ni informatique ne peut reproduire ces interactions cérébrales.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : (1) créer deux lignées de souris dans lesquelles nous pouvons supprimer spécifiquement le gène Pk2 dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire. (2) étudier l'effet de la délétion de Pk2 sur les cellules de la lignée oligodendrocytaire.

Bénéfices attendus

Ce projet étudiera pour la première fois le rôle du gène de polarité Pk2 spécifiquement dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire. Nos expériences visent à comprendre le rôle de ce gène au niveau cellulaire. Chez l'homme, la déficience de Pk2 a été liée à l'autisme et des altérations de Pk2 ont été observées dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Dans l'autisme, les circuits neuronaux qui sous-tendent certains comportements sont altérés et les oligodendrocytes jouent un rôle dans la stabilisation des circuits neuronaux et la facilitation des connexions neuronales. Notre recherche contribuera donc à évaluer si les oligodendrocytes pourraient être considérés comme une cible putative dans ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront une injection intrapéritonéale de tamoxifène pendant 5 jours consécutifs, après es souris resteront ensuite en vie jusqu'à la fin de la période expérimentale. Pour chaque injection, l’animal sera manipulé par l’expérimentateur entre trente secondes et une minute. L'injection aura lieu pendant ce temps et durera environ 10 à 15 secondes. À la fin de l'expérience, les animaux recevront une injection intrapéritonéale pour induire une anesthésie profonde afin de réaliser une perfusion transcardiaque sous anesthésie. Dans la mesure du possible, les animaux seront anesthésiés par inhalation d'isoflurane à 3 % avant l'injection pour l'anesthésie terminale afin de réduire davantage le stress. L'induction à l'isoflurane prendra environ 3 minutes et l'injection en intrapéritonéal de l’anesthésique prendra 10 secondes. Une anesthésie profonde est obtenue dans les 5 à 10 minutes en fonction de l'induction préalable à l'isoflurane.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale inflige aux animaux des injections intrapéritonéales pendant 5 jours consécutifs. Il s'agit d'un facteur de stress récurrent et d'une procédure qui peut être douloureuse pour les souris. La délétion de Pk2 dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire pourrait avoir un effet négatif sur les souris en entraînant des modifications de l'activité locomotrice et, potentiellement, le knockout pourrait conduire avec une faible probabilité à des crises d'épilepsie.

Devenir

Les souris recevront une injection intrapéritonéale de tamoxifène pour induire une invalidation génique conditionnelle. Les souris resteront ensuite en vie jusqu'à la fin de la période expérimentale. La durée maximale de la période expérimentale est définie comme étant de 8 semaines après la dernière injection (âge maximal de 100 jours ou 14 semaines). Cette période est nécessaire pour s'assurer que la délétion génétique est effective. Après un maximum de 8 semaines, nous serons en mesure d'étudier l'effet cellulaire de l’invalidation génique conditionnelle. À la fin de l'expérience, toutes les souris seront profondément anesthésiées et le cerveau sera préservé par perfusion intracardiaque de fixateur. Une analyse histologique ultérieure sera effectuée au niveau cellulaire. Cette procédure sera effectuée pour tous les animaux afin d'effectuer une analyse biologique et statistique des différentes étapes d'analyse prévues.

Remplacement

Le projet a pour but d'étudier la trajectoire développementale et de signalisation cellulaire de la lignée oligodendrocytaire dans le cerveau murin. La suppression des gènes induite par l'injection de tamoxifène est déterminée par l'âge de développement de l'animal et le stade cellulaire. Cette chronologie complexe ne peut être reproduite in vitro car les voies de signalisation putatives nécessitent des interactions intactes entre les différentes cellules du cerveau. Il n'existe aucun modèle informatique ou "in vitro" capable d'imiter ces processus biologiques tout en respectant la physiologie ; l'utilisation d'animaux est donc nécessaire pour étudier ce mécanisme biologique fondamental.

Réduction

Notre approche expérimentale nous permettra d'aborder les questions expérimentales avec les meilleures expériences possibles. Le nombre d'animaux sera réduit au minimum, tout en permettant des tests statistiques robustes et des expériences contrôle suffisantes. La production de souris sera optimisée en mettant en place un programme d'élevage qui correspond étroitement à la demande et qui est mis à jour tous les 3 mois. Nous élèverons le nombre minimum d'animaux nécessaires pour réaliser les expériences.

Raffinement

L'approche expérimentale est affinée par l'utilisation d'une délétion génétique conditionnelle qui minimise les effets indésirables sur les organes et les cellules non concernés. Ainsi, la délétion du gène Pk2 dans l'oligodendrocyte ne se produit qu'après l'injection d'un modulateur (tamoxifène). Cette injection est effectuée à des moments expérimentaux précis au cours du développement de la souris. Nous mettrons en œuvre les meilleures pratiques pour garantir le bien-être des animaux en ajoutant un enrichissement aux cages, en traitant si nécessaire les douleurs survenues, en limitant tout risque d'infection et en limitant la souffrance des animaux lorsque les objectifs expérimentaux sont atteints.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. Par définition, pour nos études intégrées évaluant l’impact d’une mutation d’un gène sur le cerveau et les troubles du comportement, l'utilisation de techniques in vitro ou d'organismes d'une plus faible sensibilité neurophysiologique (invertébrés par exemple) n'est pas appropriée pour les questions auxquelles nous cherchons à répondre. En outre, la création de modèles animaux est très importante. Par conséquent, nous pensons qu'il n'existe pas de remplacement disponible qui permettrait d'atteindre les objectifs scientifiques du travail proposé. Pour le maintien de l'élevage, nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines ou plus. L’invalidation génique chez les souris expérimentales sera induit à différents moments. Pour supprimer le gène Pk2 dans les cellules précurseurs des oligodendrocytes, des injections de tamoxifène auront lieu entre les jours postnatals 2 et 7 et entre les jours postnatals 28 et 40. Pour le ciblage des oligodendrocytes, les injections de tamoxifène auront lieu entre les jours postnatals 11 et 21 et 28 et 40. Toutes les analyses seront effectuées lorsque les souris seront âgées de 3 semaines à 14,5 semaines. L'analyse à ces différents moments est nécessaire d'un point de vue scientifique car nous analyserons le rôle de la Pk2 dans le développement des cellules de la lignée oligodendrocytaire et dans le maintien des oligodendrocytes chez l'animal adulte.

361 rongeurs, 280 souris et 81 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs du défaut génétique de la maladie de stockage du glycogène de type III, ils reçoivent une injection unique d'un vecteur de thérapie génique à doses croissantes, quatre anesthésies générales, des prélèvements sanguins répétés et des tests de force musculaire, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est de déterminer la dose efficace de cette thérapie génique en développement non clinique, en vue d'une future application chez l'humain. Le porteur affirme que le ciblage simultané de trois tissus n'est pas réalisable in vitro et que les deux espèces sont nécessaires, seul le rat reproduisant l'atteinte cardiaque.

Objectifs

La maladie de stockage du glycogène de type III (ou GSD III pour glycogen storage disease III) est une maladie génétique héréditaire rare causée par des mutations dans le gène AGL (pour amyloglucosidase glucanotransférase) qui fabrique l’enzyme débranchante du glycogène nommée GDE. Cette enzyme joue un rôle essentiel dans la transformation du glycogène, molécule de stockage composée de successions de glucose, en unité élémentaire de glucose dans les muscles et le foie. Dans la pathologie, le glycogène non décomposé s’accumule dans les muscles squelettiques et cardiaque et dans le foie, altérant leurs fonctions. L'apparition de la maladie commence dès la petite enfance et comprend l'hypoglycémie, l'hyperlipidémie (excès de graisses dans le sang) et l’élévation des taux sanguins d'enzymes hépatiques causée par la mort des cellules du foie. Au niveau du foie, les symptômes tardifs peuvent inclure une hépatomégalie (foie anormalement gros), reflétant une affection chronique (cirrhose) et, parfois, des tumeurs hépatiques non cancéreuses. Des maladies du cœur peuvent apparaitre. Les fonctions immunitaires sont altérées. Certaines personnes sont de petite taille. Aucun traitement curatif n'existe à ce jour. Notre étude vise à définir la dose efficace d’un traitement de thérapie génique ayant pour but de réintroduire un gène fonctionnel fabriquant la GDE dans les cellules hépatiques et musculaires. Un vecteur recombinant dérivé d’un virus portant le gène AGL fonctionnel sera injecté à doses croissantes dans des modèles de souris et de rats porteurs du défaut du gène agl et l'effet de la thérapie génique sera évalué au cours du temps au niveau des fonctions musculaires, cardiaques et hépatiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les souris et les rats porteurs du défaut du gène agl devraient permettre de stabiliser ou de diminuer l'accumulation de glycogène au niveau du foie et des muscles squelettiques et cardiaques, ce qui devrait entrainer une régénération des tissus, une amélioration de la masse et de la force musculaire et une amélioration de la fonction cardiaque. Ce projet de développement non clinique devrait permettre de déterminer la dose minimale efficace du traitement sur tous les organes cibles afin d'envisager, dans un second temps, une application clinique pour le traitement de la GSDIII par thérapie génique.

Procédures

Les souris et les rats recevront tous une injection intraveineuse unique de vecteur thérapeutique en début de protocole : chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Pour réaliser l’ensemble des tests et prélèvements, les souris et les rats recevront 4 anesthésies générales par voie intrapéritonéale. Chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Les souris subiront 3 mesures de test fonctionnels de suspension et de test d'agrippement et trois mesures de l'activité électrique musculaire espacées chacune de 2 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les souris subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les souris seront euthanasiées après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques. Les rats subiront 3 mesures d’électrocardiogramme et d’échocardiogramme. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les rats subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats seront euthanasiés après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des périodes de jeûne contrôlé de 4 heures avant les prélèvements sanguins, ce qui pourraient entrainer une sensation de faim, de stress et une hypoglycémie. Ils seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention pour les injections intraveineuses, ce qui pourrait entrainer un stress. Certains actes d’évaluation fonctionnelle seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui pourrait entrainer une confusion de l’animal au réveil en cas de surdosage. Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment du prélèvement d’un petit morceau de queue ou d’oreille (acte réalisé pour l’identification des animaux), au moment des injections intraveineuses du produit thérapeutique, des injections intra-péritonéales d’anesthésique, des injections sous-cutanées d’analgésique, ainsi qu’un moment des prélèvements de sang par voie sous-mandibulaire. Des lésions locales de type inflammatoire accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par la pose d’électrodes transcutanés au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire réalisés sur animal éveillé, notamment si un animal présente des blessures aux griffes ou aux pattes au moment du test. Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte modérée.

Devenir

P1 et P2: Euthanasie. P3: toutes les souris hétérozygotes seront euthanasiées, toutes les souris homozygotes seront utilisées dans la procédure 1, une partie des souris wild-type sera utilisée dans la procédure 1 (14 souris) et le reste des souris wild-type sera euthanasié (56 souris).

Remplacement

Le projet consiste à mesurer l'effet thérapeutique du transfert génétique du gène agl au niveau du foie, du cœur et des différents muscles squelettiques: ce test n'est pas réalisable dans les modèles cellulaires car il est impossible de cibler trois tissus simultanément in vitro et d’étudier la biodistribution relative de notre molécule thérapeutique entre les différents organes cibles. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans notre projet.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à observer une amélioration de la fonction musculaire dans les 2 modèles murins utilisés (souris et rats). Ces calculs permettent de prévoir un effectif de 7 souris et de 8 rats par groupe et par sexe, les deux sexes devant être inclus dans les études de recherche de dose thérapeutique afin de prendre en compte une éventuelle variabilité des effets liée au sexe (soit 14 et 16 individus par groupe pour les souris et les rats, respectivement). Pour les études réalisées sur les souris, 4 doses seront testées en parallèles d’un témoin non traité et d’un groupe de référence d’animaux en bonne santé, et 3 doses seront utilisées pour les études réalisées sur les rats avec les mêmes groupes témoins, soit un total de 84 souris et de 80 rats pour l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Les souris et les rats étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les animaux recevront une injection unique du traitement par veine caudale, et subiront 3 prélèvements de sang au cours des 4 mois du protocole (un avant le traitement et un tous les deux mois). Ces prélèvements seront réalisés au niveau d'une veine du museau sur animaux vigiles maintenus en contention (souris) ou sous anesthésie gazeuse (rats). Les animaux subiront également un prélèvement de sang d’un volume plus important au moment de l’euthanasie, par prélèvement au niveau du sinus rétro-orbital, sous anesthésie générale. Au cours du protocole, tous les animaux seront soumis à différents tests fonctionnels permettant de mesurer l’effet du traitement au niveau des muscles squelettiques (souris et rat) et du cœur (rats seulement). Les tests douloureux seront réalisés soit sous anesthésie gazeuse, soit sous anesthésie générale et un antalgique fort sera administré par voie sous cutanée avant de le réaliser. Le même antalgique sera également administré pendant les 48 heures qui suivront la fin de certains tests. Tous les tests fonctionnels seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés deux fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifique du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur les pathologies génétiques. Le modèle de souris de la GSDIII permet une évaluation fonctionnelle très complète de différents groupes musculaires, mais ne reproduit pas l’atteinte cardiaque des individus affectés par la GSDIII. Le rat est le seul modèle reproduisant cet aspect de la pathologie. L'utilisation des deux modèles de GSDIII permettra de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la pathologie. Les souris et les rats seront de jeunes adultes âgés de 4 mois au moment du traitement et de 8 mois à la fin du protocole. La caractérisation préalable des deux modèles a permis de déterminer que la pathologie sera déjà présente au moment du traitement, ce qui permettra de tester l’effet de réversion de la pathologie, et non pas sa simple prévention. Ce choix permet de se rapprocher au plus juste de la pathologie humaine, qui sera traitée majoritairement après l’apparition des symptômes.

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement modifiées privées de gènes clés du métabolisme sont créées, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés, à des tests de tolérance au glucose après jeûne et à une diète cétogène presque totalement dépourvue de sucres, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est de mesurer les contributions respectives du foie et du rein dans la production des corps cétoniques, avec une visée translationnelle vers l'usage humain de la diète cétogène. Le porteur affirme que l'étude des délétions géniques tissu-spécifiques n'est faisable que sur des souris.

Objectifs

Le projet a pour objectif de déterminer les contributions relatives foie et des reins dans la production des corps cétoniques lors d’une administration d’une diète cétogène. Pour pouvoir déterminer les contributions des deux organes à la foi dans l’anabolisme (synthèse) des corps cétoniques (par les deux organes) et dans le catabolisme (utilisation) par le foie, les enzymes clé pour la synthèse (HMGCS2) et l’utilisation (OXCT1) des corps cétoniques seront deletée dans le foie ou les reins (OXCT1) et dans le rein (SCOT1) pour générer de lignées knock out tissues spécifiques. La génération des lignées de souris constitue le premier objectif du projet. Le deuxième objectif est d’étudies le métabolisme de ces lignées de souries pendant une diète contrôle, enrichie en gras et sucres et cétogène.

Bénéfices attendus

Le projet présenté vise à améliorer les connaissances scientifiques sur le métabolisme des corps cétoniques. Dans les humaines, la diète cétogène est utilisé dans des conditions cliniques particulières come approche nutritionnel reconnu (épilepsie) ou dans des études exploratoires (certains types de cancer, ou comme diète avant une chirurgie bariatrique). Notre projet pourra apporter des nouveaux acquis scientifiques utiles dans ce contexte translationnelle vers l’utilisation de la diète cétogène dans l’homme.

Procédures

L'intervention principale sur les animaux consistera dans des prélèvements sanguins et prélèvement de queue pour génotypage. La prise de la glycémie chaque deux semaines (7 fois pendant le protocole nutritionnel) sera faite à l'état vigil après 6 heures de jeûne. Une ponction de la veine caudale (4-5 microlitres de sang) permettra de mesurer la glycémie au glucomètre. La tolérance au glucose sera évalué à 8 et 16 semaines (2 fois pendant le protocole nutritionnel) à l'état vigil après 6 heures de jeûne, suite à une injection intra-péritonéale de glucose 2mg/g du poids de la souris. Pour cela, des ponctions de la veine caudale (4-5 microlitres de sang) seront effectués à l'extrémité de la queue aux temps 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes, afin de suivre la courbe de la glycémie et de l'insulinémie. L'incision de la queue sera réalisée au temps t0, puis les prélèvements suivants seront effectués par simple grattage du caillot sanguin. Lors des prélèvements d'un fragment minime de queue pour le génotypage l’utilisation d’une crème anesthésiante à la lidocaïne sera envisagée afin de minimiser toute douleur et/ou souffrance associée au prélèvement.

Impact sur les animaux

Par rapport aux données de la littérature sur les souris sauvages (wild-type), les protocoles d’alimentation cétogène présentés dans ce projet ne devraient pas être susceptibles de générer des effets indésirables. Néanmoins, si l’administration de la diète cétogène (presque totalement dépourvue en sucres) devrait générer de la souffrance (inappétence, perte de poids, troubles comportementales), notamment dans les lignées transgéniques, le protocole sera terminé et les souris retournées à la diète standard avant mise à mort. La génération de souris transgéniques pourrait aussi engendrer un phénotype dommageable. Celui-ci pourrait consister dans des effets sur les paramètres métaboliques qui pourraient être manifestes à la naissance tels que hypo or hyperglycémie ou cétoacidose. Pour déceler ces événements, si les nouveaux nés montreront des signes de souffrance, la glycémie et cétonemie seront mesurées avec le kit Nova pro glu/ket qui mesure la glycémie et cétonemie de façon simultanée. Si avérées, ces évènements mèneront à l’arrêt de la génération de la ligne transgénique.

Devenir

Les protocoles se termineront avec une prise de sang retroorbitale (après anesthesie), et mise a mort par dislocation cervicale pour pouvor recuperer differents organes et tissues. La necessité de faire les analyses biochimiques justifie la mise à mort et recuperation de ces tissus et organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l’analyse des effets des diètes au niveau de l’organisme et, d’un point de vue mécanistique, l’étude des Knock-outs tissue-spécifiques pour les gènes Oxct-1 et HMGCS2 ne peut être faisable que sur des souris.

Réduction

Notre stratégie de réduction, tout en restant dans de limites imposée par la nécessité d’obtenir une puissance statistique satisfaisant, nous permet d’avancer une demande d’utilisation de 256 souris au maximal.

Raffinement

Dans ce projet nous essayerons de raffiner et optimiser les procédures expérimentation pour réduire au maximum l’inconfort et les stress subie par les animaux. En plus, les protocoles ont été prévus de façon d’obtenir le plus d’informations possible de chaque animal en imposant, en même temps, le "moindre coût" en terme de mal être des animaux. Le raffinement dans le protocole expérimentale s’applique tout au long de la vie des animaux, et en particulier pendant la durée des protocoles nutritionnels. Pour satisfaire les conditions de raffinement, nous planifierons les protocoles de façon à éviter des perturbations susceptibles de procurer le stress de l’animal. De plus, les recours à l’anesthésie/analgésie est prévu pour les prises de sang et nous utiliserons des procédures d’euthanasie appropriées (dislocation cervicale) et sous anesthésie. Ces procédures de raffinements nous permettront aussi de générer des résultats de meilleure qualité et d’exploiter au mieux les résultats obtenus lors de l’expérimentation.

Choix des espèces

Comme notre projet est à l’interface entre le métabolisme et la signalisation cellulaire, le recours au model murin nous permettra i) dans les études nutritionnelles sur les souris wild-type d’obtenir des données nouvelles et originales dans le contexte de la grande quantité de littérature décrivant les effets d’une diète obésogène sur les souris et ii) en ce que concerne les études mécanistiques en utilisant les modèles KO, tissue-spécifiques, d'éclaircir les métabolisme des corps cétoniques et des effets bénéfiques potentielles de la diète cétogène. L’intervention nutritionnelle (diète contrôle, hypercalorique, cétogène) débutera chez des souris âgées de 5 semaines et se poursuivra pendant 16 semaines consécutives. Il est important que le protocole nutritionnel débute peu de temps après le sevrage pour maximiser les effets métaboliques. La présence de troubles métaboliques (hyperglycémie, intolérance au glucose …) chez la souris sous diète hypercalorique/hyperglycémique après 8 semaines de régime est connue, permettant de valider les potentiels effets bénéfiques d'une diète cétogène administée après les 8 semaines de diète hypercalorique/hyperglycémique. A la fin du protocole, les souris seront âgées de 21 semaines.