Procédures modérées

1000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec des trypanosomes, prélevés chaque jour d'une goutte de sang à la queue puis exsanguinés sous anesthésie, une partie des souris étant exposée aux piqûres de mouches tsé-tsé pour étudier la transmission. Le porteur indique que l'infection peut rendre les animaux moribonds ou prostrés, le poil hérissé, et décrit des points limites déclenchant une euthanasie précoce. Il affirme que ces souches parasitaires ne peuvent pas être maintenues in vitro et que l'hôte vivant reste nécessaire pour tester molécules et vaccins.

Objectifs

L’objectif de ce projet est donc d’amplifier des souches sanguicoles de trypanosomes (Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma evansi, Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax) conservées en azote liquide, par passage sur souris et rats afin de a) produire des souches en quantité massive pour production d’antigènes parasitaires nécessaires aux tests de dépistage type ELISA et pour des études de caractérisation du protéome, du transcriptome et du secrétome des trypanosomes dans l’objectif de développer de nouvelles molécules afin de proposer des tests diagnostiques plus sensibles et spécifiques, b) réaliser des stabilats cryoconservés de trypanosomes pour entretien de notre cryothèque, c) réaliser des repas sanguins infectants de glossines (sur souris balb/c et génétiquement modifiées) pour étudier les modalités de la transmission vectorielle des trypanosomoses africaines humaine et animale, d) tester des molécules candidates afin de mettre au point un traitement contre les trypanosomes humaine et animale et d’étudier l’efficacité de certaines d’entre elles pour développer un vaccin anti-maladie. e) évaluer l’importance de la localisation des parasites dans le derme au cours de l’infection en fonction de l’espèce de trypanosome et valider sa valeur diagnostique.

Bénéfices attendus

Notre unité de recherche développe des approches multidisciplinaires visant à améliorer la compréhension des mécanismes infectieux dans les maladies induites par des protozoaires parasites de la famille des trypanosomatidae (les trypanosomes). Ces maladies transmises par des vecteurs (glossines essentiellement) sévissent dans des zones rurales pauvres des pays africains et constituent un obstacle majeur à l’installation humaine et au développement de l’élevage et de l’agriculture avec un fort impact socio-économique pour des populations déjà fortement appauvries. Des moyens de lutte existent, basés sur la lutte anti-vectorielle et l’utilisation d’outils diagnostiques et de traitements curatifs, mais bien qu’utilisés de façon raisonnée et intégrée, ils montrent de plus en plus leurs limites (chimiorésistances développées par les populations d’insectes et les parasites par exemple). Nos travaux s’inscrivent dans un souci d’amélioration des outils diagnostiques existants (amélioration et développement de tests de dépistages), d’identification de molécules ayant une action curative ou préventive, de mise au point d’un vaccin efficace pour protéger les populations humaines et animales et enfin, d’amélioration des outils de la lutte anti-vectorielle.

Procédures

Injections et prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. 40 rats et 300 souris seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes (dans certains cas une immunosuppression sera, au préalable, réalisée par injection), un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 210 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum, une anesthésie par injection d’un mélange anesthésique sera ensuite réalisée suivi d’un repas de glossines de 10 minutes. 240 souris seront immunisées trois fois à deux semaines d’intervalle, puis seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 mois maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 30 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, 90 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes et une fois avec la molécule à tester et 30 souris seront inoculées une fois avec la molécule à tester. Sur ces 150 souris un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement pendant 10 jours. 60 rats seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé avant l’inoculation et quotidiennement pendant 10 jours, un prélèvement de peau à 2 endroits différents sera réalisé deux fois à J4 et J10 après l’inoculation.

Impact sur les animaux

Les animaux infectés voient une parasitémie se développer dans leur sang, les nuisances vont de l'asymptomatisme à un changement d’apparence physique tel que le poil hérissé pendant plus de 3 jours, avec un aspect général moribond ou un état de prostration. Les inoculations peuvent provoquer du stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des souris et rats seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récolter les parasites ou le sérum des animaux.

Remplacement

Les souches parasitaires que nous utilisons ne peuvent pas être maintenues in vitro, elles sont extracellulaires et se développent dans le sang de leur hôte, voire dans le derme. Ils entretiennent avec l’organisme hôte des relations étroites de nature cellulaires et chimiques nécessaires à leur développement et il nous est impossible de les reconstituer en utilisant des milieux artificiels même complémentés. De même, les mécanismes de transmission à la glossine nécessitent également l’utilisation du modèle animal. Les « tests de molécules à visées thérapeutiques et vaccinales », bien que nous mettions en place des tests in vitro et ex vivo visant à étudier leurs effets sur les cellules de l’hôte, nécessitent l’hôte pour avoir une vue d’ensemble des mécanismes complexes mis en jeu lors d’une infection. La mise en évidence de parasites dans le derme ne peut se vérifier que par le mode in vivo.

Réduction

Les animaux utilisés sont reduits au strict minimum.

Raffinement

L'espériencce des utilisateurs a permis la définition de points limites qui permettent grâce au suivi quotidien des animaux et de leur parasitémie, de procéder à l'euthanasie précoce d'un animal qui commence à présenter des signes de malêtre.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des espèces classiquement utilisées pour la multiplication des souches de trypanosomes africains. Elles développent une infection comprise entre 3 et 10 jours post-infection en moyenne en fonction de la souche parasitaire utilisée. Le cas échéant, des souris génétiquement modifiées pourront être utilisées pour l’étude des interactions hôtes/pathogènes/vecteur. Les rats sont utilisés lorsque la quantité de parasites à produire est plus importante (cas de la production d’antigènes parasitaires). Des souris et des rats adultes seront utilisés afin d’optimiser la quantité de parasites à produire ou de sérum à récolter.

Six cochons femelles de 20 à 25 kg vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque animal reçoit six incisions d'au moins huit centimètres sur le thorax pour comparer deux colles chirurgicales, avec de la buprénorphine en cas de douleur au réveil. Le porteur indique que les tissus sont prélevés après euthanasie pour analyser la cicatrisation. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'inflammation et la cicatrisation d'une plaie et qu'il est "indispensable de recourir à l'animal entier".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer la réponse inflammatoire locale ainsi que le processus de cicatrisation d'une plaie aprés l'application de deux colles chirurgicales différentes utilisées pour des sutures cutannées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont de suturer des plaies superficielles de façon simple et atraumatique. Les colles chirurgicale favorisent l'hémostase locale, renforcent les sutures et assurent l'adhésion tissulaire.

Procédures

Dans ce projet, six porcs femelles de 20-25 kg seront incluses. Aprés une période d'acclimatation d'une semaine, les animaux seront anesthésiés de manière générale ( "pig cocktail" 0.1 mg/kg). Six plaies superficielles seront faites au niveau de la zone thoracique de chaque animal. Les plaies seront des incisions linéaires, verticales, 3 à gauche et 3 à droite d'au moins 8 cm de longueur.La durée d'intervention sera inferieure à une heure par animal. La manipulation des animaux et la réalisation des plaies seront faites par un personnel expérimenté et formé conformément à la réglementation en vigueur. En cas de douleur suite à la réalisation des plaies, lors du réveil des animaux suite à l'anesthésie générale, il sera possible d'administrer de la Buprénorphine (0.1 mg/kg) en intra musculaire toutes les 6 à 8 h si nécessaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont les problèmes de cicatrisation. Apparition d'hématome, ou infection au niveau de la plaie.

Devenir

A la fin de cette procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour prélever les site d'application pour l'analyse des tissus

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire une réponse à l'inflammation ou un processus de cicatrisation au niveau d'une plaie, il est indispensable de recourir à l'animal entier. L'animal ne peut pas être remplacé.

Réduction

Six animaux sont prévus dans ce projet. C'est le nombre minimal d'animaux requis par les textes reglementaires pour avoir des résultats interprétables et significatifs.

Raffinement

Les animaux seront hégergés individuellement à partir de l'acclimatation jusqu'à la fin de la phase animale. Cet hébergement en individuel est nécéssaire pendant l'acclimatation à cause du risque de bagarre car il faut éviter le contact entre les animaux (chevauchement) ce qui pourrait fausser les résultats de l'étude. Une attention particulière sera portée aux animaux pour avoir un enrichissement du milieu adapté pour éviter l'ennui: contact visuel et olfactif entre congénères, surface suffisante de l'hébergement, présence de jouets... Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place permettant l'observation générale des animaux.

Choix des espèces

La réponse de l'inflammation et le processus de cicatrisation entre l'espèce porcine et humaine sont trés proche et quasi similaire. Espèce de choix pour ce type d'étude. Jeune adulte Entre 8 -10 semaines Poids entre 20-25 kilos Le collagène dermique et le contenu élastique de la peau du porc sont équivalents à l’homme.

600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier des syndromes d'hypercroissance liés au gène PIK3CA. Une partie est gavée pendant deux mois avec un inhibiteur, d'autres reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules mutées, plusieurs lignées génétiquement modifiées étant entretenues en parallèle. Le porteur indique que les souris de maintien de lignée restent en vie, celles des procédures étant tuées pour exploration anatomique et histologique. Il affirme que ces syndromes ne peuvent pas s'étudier in vitro, hors de leur environnement, et que la souris est le seul animal chez qui la protéine PIK3CA a été mutée.

Objectifs

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Nous souhaitons maintenant : 1-Étudier l’effet de la mutation PIK3CA dans chaque tissu de l’organisme (graisse, muscle, os, vaisseaux lymphatiques, vaisseaux artériels, vaisseaux veineux et les nerfs) en utilisant des modèles génétiques appropriés. 2- Tester l’efficacité d'un inhibiteur dans chacune des conditions. 3- Comprendre la physiopathologie de ces syndromes.

Bénéfices attendus

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Identification des tissus sensibles à une inhibition pharmacologique.

Procédures

Au cours de la procédure 2, un gavage sera effectué par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souples et non traumatisante pour l’animal. Au cours de la procédure 3, des cellules de différents types de tissus portant une mutation PI3KCA seront injectées en sous cutanée chez des souris immunodéficientes. Cette injection sera réalisée par un technicien expérimenté, chez des souris anesthesiées et un injectant le plus petit volume possible.

Impact sur les animaux

1-Le gavage quotidien qui débutera à la semaine 6 de vie et sera effectué pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. 2- Injection sous cutanée de cellules mutées PIK3CA chez des souris immunodéficientes (une injection unique).Nous n'attendons aucun effet indésirable lié au gavage ou à l'injection sous cutanée.

Devenir

Procédure 1: maintien de lignée, donc souris maintenues en vie Prodédures 2 et 3: animaux sacrifiés pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur lces syndromes d'hypercroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus avec des modèles murins peuvent tout au mieux être complétés par des expériences in vitro.

Réduction

La taille des groupes utilisés (n-25), minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Ce protocole est peu invasif puisque le gavage sera réalisé sur des souris mises dans des conditons de calme, par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par du BYL719. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Aucun prélevement ne sera effectué chez les souris. A priori l'inhibiteur de PIK3CA devrait améliorer le phénotype des souris. Nous injecterons également 1 million de cellules en sous cutanée chez des souris. Ces injections seront réalisées chez des souris anesthésiées (injection intrapéritonéale de Kétamine (128 mg/kg)/Xylazine (6,4 mg/kg)), par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul).

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). La souris est le seul animal pour lequel la protéine PIK3CA a été mutée Jeunes souris de 6 semaines car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.

172 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de gliome humain est greffée dans leur cerveau, suivie par imagerie de bioluminescence, puis un composé est injecté dans le cerveau et un anticancéreux administré par gavage, pour tenter de lever la résistance des glioblastomes au témozolomide. Le porteur invoque le secret d'un brevet pour ne pas décrire le composé et rapporte une sensibilisation de 45 % obtenue in vitro. Les souris sont tuées par perfusion de formol dans le cœur pour l'analyse histologique du cerveau.

Objectifs

Le glioblastome multiforme (GBM) est une tumeur cérébrale, à croissance rapide et dont le pronostic vital est mauvais puisque seulement 2% des patients survivent au-delà de 2 ans après le diagnostic. Les tumeurs sont constituées de multiples types cellulaires plus ou moins différenciés, parmi lesquels les rares cellules souches sont responsables de la résistance aux traitements anticancéreux et de la récurrence tumorale. La première phase du traitement consiste en une exérèse chirurgicale suivie de cycles répétés de radiothérapie et de chimiothérapie par prise orale de témozolomide (TMZ) permettant de ralentir la repousse tumorale. Le TMZ est l’anticancéreux le plus efficace à ce jour cependant les cellules cancéreuses deviennent résistantes au TMZ au fur et à mesure du traitement. Il n’existe pas d’alternative efficace au TMZ. Toute avancée permettant d’identifier des cibles moléculaires et cellulaires visant à réduire la capacité des cellules tumorales à résister au TMZ sera donc bénéfique pour les patients. Nous proposons d’utiliser un composé qui cible une molécule endogène des tumeurs cérébrales. Nous avons montré in vitro que ce composé et la stratégie utilisée permettaient de sensibiliser jusqu’à 45 % les cellules de gliomes à l’anticancéreux TMZ. Notre stratégie faisant l’objet d’un dépôt de brevet, nous ne pouvons pas donner plus de détail à l’heure actuelle car la plus stricte confidentialité est de rigueur. Nos données obtenues in vitro sur les lignées cellulaires de gliomes U251, U87 et T98G sont très encourageantes et nous proposons maintenant d’évaluer in vivo la capacité de notre traitement à sensibiliser les tumeurs au TMZ. Pour cela, le développement de tumeurs orthotopiques de gliomes, générées par injection de cellules tumorales humaines dans le cerveau de souris immunodéficientes est nécessaire (procédure expérimentale 1). Le développement tumoral sera suivi par imagerie de bioluminescence (procédure expérimentale 2) et le composé administré en intracérébroventriculaire (ICV) dès détection de la tumeur (procédure expérimentale 3). Les souris seront ensuite traitées par gavage avec le TMZ (procédure expérimentale 4) et suivies chaque semaine en bioluminescence pour mesurer le développement tumoral (procédure expérimentale 2). Lorsque les points limites seront atteints, les souris seront sacrifiées par perfusion intracardiaque de formol à 10 % (procédure expérimentale 5) et les cerveaux récoltés pour analyse histologique.

Bénéfices attendus

Le témozolomide (TMZ) est l’anticancéreux le plus efficace à ce jour pour traiter le glioblastome multiforme (GBM), cependant les cellules cancéreuses deviennent résistantes au TMZ au fur et à mesure du traitement. Il n’existe pas d’alternative efficace au TMZ. Toute avancée permettant d’identifier des cibles moléculaires et cellulaires visant à réduire la capacité des cellules tumorales à résister au TMZ sera donc bénéfique pour les patients. Nous proposons d’utiliser un composé qui cible une molécule endogène des tumeurs cérébrales. Nous avons montré in vitro que ce composé et la stratégie utilisée permettaient de sensibiliser jusqu’à 45 % les cellules de gliomes à l’anticancéreux TMZ.

Procédures

- implantation de tumeurs en intracérébrale (15 minutes par souris, 1 seule fois) ; - imagerie bioluminescente (10 minutes par souris,1 fois par semaine durant toute la pousse tumorale) ; - injection intracérébrale (10 minutes par souris, 1 seule fois lorsque la tumeur est bien établie) ; - gavage des souris (1 minute par souris, 1 fois par jour un semaine sur 2)

Impact sur les animaux

- Changement de l'état corporel (poids, pelage, écoulement oculaire/nasal) ; - Changement de comportement (posture, mobilité, automutilation) ; Comme décrit dans les points limites des procédures, ces effets indésirables sont cotés et l'animal est mis à mort s'il montre des signes de soufrances.

Devenir

Les animaux de chaques tâches sont gardés en vie à la fin des procédures 1, 2, 3 et 4 afin de pouvoir participer à la procédure suivante. Les animaux sont mis à mot à la fin de la procédure 5 car des analyses histologiques sont effectuées sur les cerveaux de chaque animal par la suite.

Remplacement

Nous avons montré in vitro sur des cellules de gliomes humains que le composé et notre stratégie sont efficaces. Nous continuons actuellement in vitro sur ces cellules toutes les études nécessaires à la caractérisation fine des mécanismes à l’origine de cette sensibilisation. Afin de déterminer si le traitement pourrait être utilisé chez l’Homme, il est nécessaire de le tester dans un organisme vivant. La souris NUDE est une souris mutante athymique qui présente une défaillance des lymphocytes T. La souris NUDE développe des tumeurs après greffe orthotopique de 200 000 cellules de U251. La souris NOD/SCID présente une défaillance des lymphocytes T et B et développe plus facilement des tumeurs à partir de petites quantités (1000) de cellules souches issues d’un gliome humain. Ces deux modèles murins sont immunodéficients ce qui limite le rejet des greffons de cellules de gliomes humains.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés afin d’obtenir des résultats significativement exploitables et valides.

Raffinement

Le composé et la stratégie ont été testés in vitro sur des cultures cellulaires. Ces expériences nous ont permis de déterminer des doses efficaces qui seront injectées in vivo. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63) . Les souris utilisées seront des souris mutantes NMRI NUDE et NOD SCID. L’immunodéficience de ces souris permet le développement sans rejet des xénogreffes de cellules de gliomes humains. Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. Dans ce but, des points limites spécifiques à chaque expérimentation seront clairement établis afin de prendre les mesures nécessaires au soulagement ou à l'arrêt de de la souffrance de l'animal. De plus toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effecturées sous anesthésie gazeuse, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation (utilisation d'analgésique).

Choix des espèces

Les souris utilisées seront des souris mutantes NUDE et NOD/SCID. La souris Nude est athymique et présente une défaillance des lymphocytes T. La souris NOD/SCID présente une défaillance des lymphocytes T et B. Ces propriétés rendent les souris immunodéficientes ce qui limite le rejet des greffons de cellules de gliomes humains. Les animaux seront utilisés "à l'âge adulte" c'est à dire à partir de l'âge de 2 mois, les glioblastomes étant des tumeurs survenant à l'âge adulte.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une instillation dans la trachée ou une exposition d'une heure en chambre d'aérosolisation pour reproduire une pneumonie à Tropheryma whipplei, l'agent de la maladie de Whipple. Le porteur indique que tout animal saignant ou respirant anormalement après l'instillation sera tué, et prévoit un analgésique en cas de signes de douleur. Les souris sont tuées pour prélever les organes et mesurer l'atteinte pulmonaire.

Objectifs

Tropheryma whipplei est l’agent de la maladie de Whipple, une maladie chronique systémique caractérisée par un syndrome de malabsoprtion, de la fièvre et des douleurs abdominales. Un certain nombre de données suggèrent que chez l’homme, l’infection résulte d’une transmission oro-fecale ou oro-orale. Les avancées en épidémiologique et techniques diagnostiques ont montré que T. whipplei étaient en fait responsable d’un large spectre d’infections et qu’à côté des infections chroniques, systémiques ou localisées, il existait des infections aigues et même un portage asymptomatique. Ainsi, il a été rapporté que chez l’homme, T. whipplei était un agent de gastroentérite, probablement au cours de la primo-infection. Des travaux de notre équipe avait alors montré qu’en infectant des souris par voie orale, on retrouvait T. whipplei dans les selles de manière transitoire et qu’elle induit une diarrhee passagere. Par ailleurs, nous avions également pu montrer qu’une lesion intestinale epitheliale prolongeait le portage de T. whipplei, aggravait de manière non significative la gastroenterite et permettait la colonisation de la muqueuse intestinale et une séro-conversion.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la mise en place et la physiopathologie des pneumonies à T. whipplei. Il permettra également de développer des outils diagnostiques et éventuellement pronostiques de telles infections.

Procédures

Dans la procédure 1, les animaux seront soumis à une instillation intra-trachéale. Le tube flexible relié à une seringue à insuline sera inséré à 0.5-1 cm dans la trachée et la solution sera injectée (volume inférieur à 50 microlitres). Afin d'éviter que l'instillat ne s'échappe de la trachée, le tube sera maintenu en place 5 sec. Il sera retiré et la souris sera maintenue en position pendant au moins 30 secondes. Pour la procédure 2, les animaux seront exposés dans la chambre d'aérolisation pendant une heure.

Impact sur les animaux

En cas de signes de douleur, de souffrance ou d’angoisse suite à l’instillation intra-trachéale, un analgésique (buprénorphine) sera injecté en sous-cutané, à raison de 0.2 mg/kg de poids corporel en sous cutané. Les effets indésirables directs de la procédure 1 seraient une mauvaise instillation intratrachéale. Ainsi, tout animal qui saigne, qui présente une respiration anormale après récupération de l'anesthésie sera euthanasié.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, les organes seront prélevés pour être analysés et évaluer l'impact de la pneumonie.

Remplacement

Il est nécessaire de tester nos observations dans un modèle de souris afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques de la pneumonie induite par T. whipplei et de comprendre les mécanismes sous-jacents dans le but de fournir des pistes diagnostiques et thérapeutiques dans la prise en charge des patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit grâce à la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal. De plus, de par notre expérience (effets modérés de l’infection à T. whipplei), nous avons déterminer le nombre de souris nécessaires à notre étude pour observer une différence statistique significative entre les groupes (p < 0.05) avec une puissance au moins supérieure à 80%.

Raffinement

La mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel ainsi que le suivi quotidien de l’état de santé des animaux permettront le raffinement de ce projet. Ainsi, tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en envisageant l’utilisation d’antalgiques. Dès lors qu’un animal aura atteint un point limite, la souris sera euthanasiée dans le but de réduire toute douleur, souffrance et angoisse. Les animaux seront hébergés en groupe de cinq maximum, dans des cages équipées afin d’offrir un environnement enrichi et approprié.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 8 semaines seront utilisées.

4200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une administration unique d'un candidat médicament, le plus souvent par gavage, avant un test d'activité locomotrice, puis un prélèvement de sang et de cerveau. Le porteur reconnaît des effets indésirables possibles comme des crampes abdominales ou une sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il décrit le recours à l'animal comme "nécessaire", faute de méthode alternative pour ces mesures sur le système nerveux.

Objectifs

Lors du développement d’un candidat médicament, il peut être pertinent d’évaluer si celui-ci peut induire des effets sur le niveau d’activité générale, l’activité locomotrice globale ainsi que les habitudes d’exploration chez la souris. La modification de l’activité locomotrice peut entraîner des biais pour l’évaluation correcte du candidat médicament dans certaines thématiques. Pour exemple, une diminution de l’activité locomotrice peut entraîner un comportement de type anxiolytique (une diminution de nombre de billes enfouies dans le test d’enfouissement de billes). Il est donc important de vérifier avant toute caractérisation des effets d’un candidat médicament dans ce type de modèle. L’objectif de ce projet sera d’étudier, chez la souris, l’effet d’un candidat médicament dans le test de mesure de l’activité locomotrice spontanée.

Bénéfices attendus

Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ce modèle animal peut être utile pour identifier les potentiels effets indésirables de nouveaux candidats médicaments sur l’activité locomotrice afin d’éviter de biaiser son développement.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaitre. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant, par exemple si le produit administré est destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou si sa biodisponibilité nécessite un autre mode d’administration, les voies intrapéritonéale, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour étudier les effets potentiels induits (fonction motrice, l'exploration, l'anxiété, l'hyperactivité ou la sédation) par des médicaments candidats sur le SNC. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne et d'erreur standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Les lignées utilisées sont : la souris Swiss et la C57Bl/6J De 5 à 10 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.

6 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs veines saphènes sont traitées par ultrasons focalisés de haute intensité sous anesthésie générale, avec un suivi échographique sur un à deux mois, pour évaluer une technique destinée à traiter les varices avant un premier essai chez l'homme. Le porteur rapporte des brûlures observées lors d'essais précédents, qu'il dit avoir corrigées par un refroidissement de la peau. Les brebis sont tuées après un ou deux mois pour prélever leurs veines.

Objectifs

Les objectifs de ce projet concernant le traitement HIFU en mode thermique sont : - de vérifier sa sécurité, en terme d'évaluation des effets tissulaires locaux; - de vérifier son efficacité, en terme d'occlusion veineuse. Il précède une première étude chez l'homme.

Bénéfices attendus

Les varices (dilatation anormale d'une veine) sont présentes chez 25% de la population des pays industrialisés et représentent un coût sociétal de ressources médicales pour ces pays. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives cette maladie. La technique nouvellement développée et étudiée dans ce projet pourrait permettre d'obtenir d'aussi bons résultats que les autres techniques tout en diminuant les risques associés. Elle permettrait donc de continuer à améliorer le traitement de cette maladie.

Procédures

Les veines saphènes, situées sur la face interne des membres postérieurs des brebis, sont traitées par HIFU, ou par radiofréquence pour une veine de la première brebis. La veille du traitement, la zone à traiter est marquée et des mesures sont effectuées par échographie. Le traitement se fait sous anesthésie générale avec une anesthésie péri-veineuse de la zone à traiter. Un suivi échographique a ensuite lieu sept jours, quatorze jours puis un mois après le traitement. Si nécessaire, les animaux sont sédatés pour cet examen. Au bout d’un mois quatre brebis sont mises à mort pour prélever leurs veines saphènes dans le but de les analyser. Les deux dernières brebis ont une nouvelle échographie deux mois après le traitement avant d’être aussi mises à mort pour le prélèvement des veines traitées. Pendant la première semaine post-traitement la zone traitée est inspectée quotidiennement afin de détecter d’éventuelles lésions dues au traitement.

Impact sur les animaux

Dans les essais précédent des brûlures ont pu être observées au niveau des sites traités. Ce problème a été résolu par l'ajout d'un système déjà validé de refroidissement de la peau au niveau de la sonde.

Devenir

Les six brebis du projet seront mises à mort à la fin de l'étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiterles points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant.

Réduction

Une étude de preuve de concept sur des veines d'oreilles de lapin, ainsi qu'une étude de faisabilité sur trois brebis ont déjà été réalisées. Elles ont permis de déterminer les meilleurs conditions d'utilisation du traitement par HIFU et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires dans la présente étude. De plus, le traitement est appliqué sur les deux veines saphènes des animaux, ce qui permet d'utiliser deux fois moins d'animaux pour obtenir le même nombre d'échantillons.

Raffinement

Les ovins étant des animaux grégaires, les brebis sont logées en groupe, sur une litière de paille afin de les occuper et auront accès à de l'eau et du foin ad libitum pour respecter leur fonctionnement de ruminents. De plus, le personnel animalier observe régulièrement le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels sont immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. Durant l’administration du traitement, les brebis sont placées sous anesthésie générale avec une association médicamenteuse permettant d’obtenir un effet anesthésique et analgésique. Afin d’éviter le dessèchement de leur cornée, une pommade ophtalmique est appliquée dans leurs yeux. Enfin, durant les examens angiologique, si les animaux présentent des signes de stress ou d’agitation, ils sont sédatés ou anesthésiés selon l'avis du vétérinaire.

Choix des espèces

Le mouton est recommandé dans la norme ISO 10993, partie 6 (2016) comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié poour évaluer l'occlusion veineuse. Une fois rasés, ces animaux possèdent également une peau proche de celle de l'Homme ce qui permettra aux ultrasons d'atteindre la veine sans une trop forte absorption de ceux-ci. En outre, la faisabilité a été évaluée par le promoteur qui a pris les mesures des veines saphène du mouton. Les animaux seront adultes, car c'est à ce stade que l'anatomie de leurs veines saphènes est comparable à l'humain. De plus, l'étude durant plus de deux mois pour certains animaux, il n'est pas possible d'utiliser des animaux en croissance dont le développement pourrait interférer avec les effet du traitement.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après huit semaines de traitement par une molécule dans l'eau de boisson, elles reçoivent une injection de notexine, un venin, dans un muscle de la patte, ce qui provoque une blessure musculaire et une boiterie. Le porteur indique administrer un analgésique et présente cette étude comme le prolongement fonctionnel de travaux antérieurs sur la régénération musculaire. Les souris sont tuées quatorze jours après la blessure pour analyser le muscle isolé.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’analyser d'un point de vue fonctionnel (fonction contractile) les effets d'une molécule d'intérêt, le X309, sur la régénération musculaire après blessure musculaire chez un animal sain.

Bénéfices attendus

Des études antérieures ont montré, d'un point de vue moléculaire et histologique, les effets bénéfiques du X309 sur la prolifération de cellules souches et sur la régénération musculaire après blessure chez un animal sain. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer l'impact fonctionnel de ces effets sur les capacités contractiles du muscle isolé. Ainsi, la mise en évidence potentielle d'un gain de fonction, associée à l'amélioration moléculaire et histologique du tissu musculaire, renforcera l'intérêt thérapeutique de cette molécule dans le cas de dégénérescence musculaire.

Procédures

Les souris seront placées sous traitement X309 par eau de boisson à partir de 6 semaines d'âge jusqu'à 14 semaines d'âge soit 8 semaines de traitement. A 12 semaines d'âge, tous les animaux de cette étude seront soumis à une injection de notexine dans le muscle tibialis anterior de la patte postérieure gauche, à l'origine d'une blessure musculaire. Cette opération sera effectuée une seule fois par animal, l'intervention dure en moyenne 10 minutes, et sera effectuée sous anethésie gazeuse (isoflurane) et après une injection d'antalgique (Buprénorphine).

Impact sur les animaux

Ce modèle de lésion musculaire suite à l'injection intramusculaire de notexine est reconnue sans toxicité systémique. Néanmoins, la blessure musculaire peut entrainer de l'inconfort, avec une perte de fonction du muscle engendrant une boiterie.

Devenir

L'exploration des propriétés contractiles sur muscle isolé, 14 jours après l'induction de la blessure musculaire, nécessite l'euthanasie préalable des animaux.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucun modèle alternatif non animal pour évaluer les effets délétères d'une lésion musculaire sur la fonction contractile d'un muscle isolé et donc les bénéfices éventuels de traitement pharmacologique sur ces atteintes. Aussi, le modèle de lésion musculaire induite chez les rongeurs par injection intramusculaire de notexine est bien documenté dans la littérature scientifique et est un modèle d'étude reconnu.

Réduction

Le nombre d’animaux estimé dans ce protocole est suffisant pour justifier d’une pertinence scientifique, et est réduit au maximum tout en tenant compte de la validité statistique, des contraintes du modèle et des approches expérimentales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon la règlementation en vigueur. Le modèle de lésion musculaire suite à l'injection intramusculaire de notexine est reconnu sans toxicité systémique. cependant, la blessure musculaire peut entrainer une douleur et de l'inconfort, avec une perte de fonction du muscle engendrant une boiterie. Aussi, un antalgique (buprénorphine) sera administré par voie intra-péritonéale avant l'injection de notexine. Dans les jours suivants l'opération, les animaux seront également observés 2 fois par jour, et si un inconfort est observé une nouvelle injection de buprénorphine sera effectuée. Des granulés de nourriture seront également disposés dans la cage pour éviter aux souris d'avoir à s'accrocher aux grilles, afin de limiter aux maximum les conséquences de la perte de fonction musculair

Choix des espèces

le modèle de lésion musculaire induite chez les souris par injection intramusculaire de notexine est bien documenté dans la littérature scientifique et est un modèle d'étude reconnu. Les animaux seront traitées de 6 semaines d'âge à 14 semaines d'âge, et la lésion musculaire par injection de notexine sera induite à 12 semaines d'âge. Ce projet a pour objectif de compléter une étude ayant mis en évidence les effets du X309 sur la régénation musculaire d'un point de vue histologique et moléculaire. Le modèle animal, la durée du traitement, les stades de lésion et d'exploration sont donc identiques à ceux de cette précédente étude.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection virale et l'implantation d'une fibre optique dans le cerveau sous anesthésie, puis des séances de stimulation magnétique transcrânienne et d'inhibition optogénétique, dans un modèle de dépression, pour identifier les circuits impliqués dans l'effet du traitement. Le porteur affirme à plusieurs reprises un "impact faible" voire nul sur le bien-être des animaux non-humains, malgré la chirurgie cérébrale et le modèle de dépression. Les souris sont tuées par perfusion dans le cœur pour vérifier le placement des fibres.

Objectifs

Les troubles dépressifs sont la principale cause d’invalidité dans le monde. Cependant l’efficacité des antidépresseurs est insuffisante chez un grand nombre de patients, ce qui nécessite une meilleure caractérisation des mécanismes neurobiologiques de la maladie ainsi que l’investigation de thérapies alternatives. La stimulation cérébrale magnétique transcrânienne répétée (rTMS) permet de modifier durablement l’activité cérébrale d’une région corticale ciblée via l’application d’une série d’impulsions magnétiques. Ses mécanismes d’action restent peu connus. L’objectif du projet est dans un premier temps de caractériser les effets de la rTMS par photométrie de fibre dans le cerveau de la souris (technique expliquée dans le déroulé du projet). Cette technique permet de suivre en direct l’activité d’une population neuronale à l’échelle d’une région cérébrale. La région d’intérêt à stimuler est le cortex préfrontal médian (mPFC), car il a été montré dans notre équipe que la rTMS du mPFC permet l’amélioration de certains phénotypes dépressifs dans un modèle murin de dépression. Cependant, le rayon d’action de la sonde que nous utilisons pour la rTMS n’a pas été décrit systématiquement in vivo, d’où la nécessité de caractériser la rTMS avec une technique permettant de suivre en direct les modifications de l’activité neuronale. Dans un second temps, l’objectif sera de caractériser plus en détail l’effet thérapeutique des stimulations. Une fois que nous aurons mieux caractérisé la stimulation et ciblé avec plus de précision le mPFC par rTMS, nous allons investiguer quelle projection du mPFC est impliquée dans l’amélioration des phénotypes dépressifs après rTMS. En particulier, le mPFC projette directement vers l’amygdale et le striatum ventral, et indirectement vers l’hippocampe. Ces trois régions et le mPFC étant dérégulées dans la dépression, il est important de déterminer le rôle de chacune de ces projections dans la réponse thérapeutique à la rTMS. Pour cela, nous allons d’abord caractériser la connectivité fonctionnelle au repos 3 jours après la fin d’un traitement de 5 jours consécutifs de rTMS du mPFC. En s’appuyant sur ces résultats, nous allons ensuite étudier l’impact d’une inhibition optogénétique des projections du mPFC vers l’amygdale, l’hippocampe, et le striatum ventral. L’inhibition de ces projections une à une pendant le traitement par rTMS nous permettra d’identifier quelle(s) projection(s) est impliquée dans la réponse thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra permettre une meilleure utilisation de la stimulation magnétique dans les modèles précliniques de maladies neuropsychiatriques murins grâce à une caractérisation plus détaillée de la seule sonde disponible pour les rongeurs (initialement mise au point pour le modèle rat). En se basant sur ce meilleur contrôle de la stimulation, cette étude pourra permettre d’identifier la (ou les) projection du mPFC ayant un effet dans le rétablissement des phénotypes anxieux et/ou dépressifs. Cela est important pour mieux comprendre les effets de la rTMS chez l’homme et l’animal, mais aussi pour développer de potentielles approches thérapeutiques plus spécifiques dans une approche translationnelle.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des injections virales et à l’implantation de fibre optique sous anesthésie générale (isoflurane), l’intervention durant environ 90 min. Une seconde intevention sous anesthésie générale est la rTMS, qui n’est pas invasive et consiste à placer la sonde magnétique à proximité du crâne de l’animal. 640 animaux au total suivront cette procédure, qui dure environ 10 min et est répétée sur 5 jours consécutifs. Une dernièree intervention sous anesthésie générale également est l’inhibition de l’activité neuronale par optogénétique, qui se fera pendant la rTMS (sur la même durée, 10min) via la fibre optique préalablement implantée et connetée à générateur délivrant des pulses de lumière (10Hz, 10ms) sur une durée de 500ms pendant 20s.

Impact sur les animaux

Peu d’effets indésirables sont à prévoir dans le projet. Le modèle de dépression que nous envisageons d’utiliser a un impact faible sur le bienêtre des animaux. La rTMS n’a pas d’impact sur le bien-être. La chirurgie permettant l’injection du vecteur viral puis l’implantation de la fibre optique pour la photométrie et l’optogénétique a un impact léger sur le bienêtre animal, les animaux récupérant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) étant faibles : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sans encombre sur l’animal mobile et éveillé sans gêne majeure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à morts lors de la perfusion intracardiaque . Cette procédure est nécessaire pour la caractérisation histologique de l’expression des vecteurs viraux et du placement des fibres optiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la rTMS nécessite également l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les effectifs sont optimisés, les analyses tissulaires nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=20 sujets par groupe expérimental en tenant compte du taux de succès des chirurgies évalué à ~70%). De plus, la rationalisation des procédures permet d’optimiser l’utilisation des échantillons cérébraux prélevés. Les phases de mise au point des chirurgies (étapes 1) et 2) dans la description du projet) font partie de cette optimisation afin de réduire le nombre d’animaux dans les étapes ultérieures, et seront arrêtées une fois la technique mise au point.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux recevront un traitement analgésique avant, juste après et 24 à 48h suivant l’intervention, puis si nécessaire un traitement antibiotique. Chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation d’un modèle de dépression et de neurostimulation, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les animaux seront adultes (âgés d’environ 8 semaines ou plus) au début de l’étude. Justification : il s’agit de comprendre ces phénomènes dans un cerveau adulte (8 semaines correspondant au début de l’âge adulte chez la souris.

480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, deux trous sont percés dans leur crâne pour y tester des membranes censées améliorer la régénération osseuse, avec deux contrôles au microscanner sous anesthésie à deux et quatre semaines. Le porteur compare la contrainte à celle d'une "simple fracture" et rapporte une perte de poids et un arrêt du toilettage de quelques jours. Il présente au conditionnel des dispositifs médicaux innovants et décrit le modèle animal comme un "préalable impératif".

Objectifs

Les traumatismes et les interventions chirurgicales peuvent engendrer des blessures au niveau de l'os qui sont plus ou moins facile à soigner. Actuellement, la greffe osseuse est majoritairement utilisée pour réparer l'os lésé. Cette technique à cependant des limites : la nécessité de procéder à deux opérations (prélèvement puis greffe), la faible quantité d’os disponible et les possibles complications post-opératoires et séquelles pour le patient. La régénération osseuse guidée est une technique chirurgicale qui utilise des membranes. Ces membranes ont un rôle barrière, elles séparent l'os à réparer de la peau ou des muqueuses, ce qui permet d'obtenir une cicatrisation osseuse de qualité. De nombreuses membranes sont actuellement commercialisées. Leurs principales limites sont le risque de contamination lors de la chirurgie et une réparation osseuse insuffisante du à leur manque de rigidité . C’est pourquoi la recherche est active pour développer des membranes avec de meilleures propriétés dans le but d’étendre leurs indications. Ce projet de recherche a pour objectif d’étudier l’efficacité de nouvelles membranes permettant une cicatriation osseuse de meilleure qualité et/ou en plus grande quantité. Les études préliminaires effectués dans notre laboratoire ont permis de sélectionner des membranes qui permettraient de réduire le risque de contamination et un gain osseux plus important. L'absence de toxicité a également été testée. L’utilisation d’un modèle animal est un préalable impératif pour envisager une application chez l'homme. Il n'existe pas de méthodes alternatives pouvant remplacer à ce jour l'expérimentation animale pour l'étude de la régénération osseuse. Le modèle animal choisi consiste à la réalisation de 2 trous circulaires au niveau de la surface externe du crâne. Il s’agit d’un modèle très souvent employé pour valider l'intérêt clinique de nouveaux matériaux utilisés en orthopédie et en dentisterie. Les objectifs de ce projet sont d'évaluer la tolérance de membranes à base de polymères ainsi que leur potentiel de réparation osseuse .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet d'expérmentation animal chez le rat sont à court terme : 1) la vérification de la bonne tolérance biologique et tissulaire de nos membranes, 2) une cicatrisation osseuse améliorée, 3) une dégradation des membranes implantées permettant l'optention d'une qualité osseuse biologique et mécanique optimale. Les bénéfices attendus à long terme sont de pouvoir proposer aux patients des dispositifs médicaux innovants doués de propriétés cicatrisantes, ossifiantes, antibactériennes et mécaniques améliorées par rapport aux dispositifs médicaux actuellement disponibles. Ces améliorations permettraient d'élargir les indications d'utilisation des membranes actuellement commercialisées.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste à réaliser 2 défauts osseux sur le sommet du crâne. La durée de la procédure chirurgicale n'excèdera pas 30 minutes. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera pratiqué. Des examens radiologiques par microscanner seront réalisés à 2 temps intermédiaires (2ème et 4ème semaine) dans le respect des bonnes pratiques en matière de radioprotection. La durée de ces examens d'imagerie médicale dureront au maximum 12 minutes et seront réalisés sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux.

Impact sur les animaux

Les principales nuissances que nous avons préalablement observés sur ce modèle expérimental chez le rat sont une absence de toilettage durant 2 à 3 jours et une rupture des sutures (très rarement observé). Un nettoyage de la plaie à l'aide d'un antiseptique est pratiqué afin de limiter le risque de contamination microbienne. Les effets indésirables mineurs rapportés sont une perte de poids modérée (au maximum de 5% du poids initial de l'animal) durant la première semaine pour la moitié des animaux et une récupération du poids durant la 2ème semaine opératoire puis un gain de poids régulier durant toute le reste de la durée de l'étude. Les effets indésirables graves théoriques sont un saignement abondant suite à un traumatisme non contrôlé des vaisseaux sanguins lors de la chirurgie et la possible survenue d'une crise cardiaque durant l'anesthésie.

Devenir

A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront anesthésiés puis à mise à mort afin de pouvoir procéder aux prélèvements tissulaires sans souffrance.

Remplacement

Les études réalisées préalablement dans notre laboratoire sur des cultures de cellules nous ont permis de sélectionner des matériaux non toxiques et susceptibles de favoriser la cicatrisation et la repousse osseuse. Cependant, ces premiers résultats prometteurs doivent être vérifiés par une implantation dans un organisme vivant avant la réalisation des premiers essais chez l'homme. Il n'existe pas à ce jour de modèle informatique permettant de reproduire ou de prédire la réaction d'un organisme vis-à vis d'un matériau implanté avec certitude.

Réduction

Un test statistique adapté a été utilisé pour calculer le nombre nécessaire de rats pour répondre aux objectifs de ce projet. Pour chaque groupe et temps final, un nombre de 10 rats par lot est nécessaire, avec un nombre total maximal de 480 rats demandés.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie les rats subiront une phase d’acclimatation de 14 jours aux conditions d’hébergement du laboratoire. Les animaux seront hébergés dans des cages plastiques adaptées à la taille des animaux avec un nombre de 2 à 3 animaux par cage afin de maintenir les interactions sociales. La nourriture et l’eau seront mises à disposition en continue. Les litières des animaux sont enrichies d'objets en carton afin qu'ils puissent se constituer un nid. Les cages seront changées toutes les semaines. Durant l'étude, les animaux seront observés au moins 1 fois par jour. Nous avons accumulé une expérience sur ce modèle pour dire que la souffrance des animaux durant la période périopératoire ne devrait pas dépasser un niveau de contrainte équivalente au traitement d'une simple fracture. Le risque d'infection et de douleur postopératoire sera anticipé par la prise d'antibiotique et de medicament antidouleur. Une grille d'évaluation de l'état général de l'animal, son apparence et son comportement, révélateurs du niveau de douleur ressentie sera tenue 2 fois par jour pendant les premiers jours postopératoires, puis 1 fois par jour pendant la deuxième semaine, puis 1 fois par semaine à partir de la 3ème semaine postopératoire. En cas d'altération de l'état général de l'animal ou d'une douleur sévère non contrôlable, la mise à mort de l'animal sera anticipée.

Choix des espèces

Le modèle choisi est considéré comme un modèle de référence pour l'étude des matériaux destinés à la régénération osseuse. De nombreuses espèces animales ont été utilisées dans ce modèle de défauts osseux, notamment chez les rongeurs. Ce modèle est particulièrement bien décrit et validé chez le rat adulte. Le gabarit de l’animal par rapport à la souris permet une technique chirurgicale reproductible. Le choix du rat adulte permettra de cribler différents matériaux ou membranes avant de passer à des animaux plus grands en cas de résultats encourageants. De plus, ce modèle d’expérimentation animale dans cette espèce n’entraine pas de souffrances importantes selon nos expériences antérieures. Plusieurs souches de rats ont été utilisées dans la littérature, notamment les rats Wistar. L’animalerie dispose de l’agrément pour l’espèce et la souche choisie.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène puis d'un inhibiteur, un gavage à l'huile d'olive et des prélèvements sanguins à la queue toutes les heures pendant quatre heures, avant une exposition au froid à 6 °C durant quatre heures avec mesure de température rectale, pour étudier la résistance à l'obésité liée à l'absence de cavéoline-1 hépatique. Le porteur qualifie ces procédures de "légères" tout en déclarant une gravité modérée. Il présente au conditionnel de futures thérapies contre le diabète et l'obésité et décrit le maintien de la physiologie de l'"organisme" comme "nécessaire".

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La production de glucose par le foie favorise le développement du diabète de type 2 et l'obésité. Nous avons récemment identifié dans le foie une voie de production de glucose impliquant des vésicules. L'absence de cette voie vésiculaire spécifiquement dans le foie protège de l’hyperglycémie et de la prise de poids induite par un régime riche en graisses et en sucre. L’objectif de ce projet de recherche fondamentale est donc de déterminer si une diminution de l’absorption des lipides ou une augmentation de la thermogenèse sont impliquées dans cette protection.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices de ce projet sont de déterminer les mécanismes de régulation de la production de glucose par le foie et leurs conséquences sur le métabolisme énergétique. A long terme, cette caractérisation permettrait de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre du diabète et/ou de l'obésité.

Procédures

A l’âge de 8 semaines, les animaux subiront une injection péritonéale journalière de tamoxifène pendant 5 jours (douleurs légères). A l’âge de 25 semaines, les animaux subiront une injection intrapéritonéale (douleurs légères) d'inhibiteur de la clairance des triglycérides sanguins puis un gavage (douleurs légère) avec de l'huile d'olive. Des prélèvements sanguins à la queue (douleurs légères) seront effectués toutes les heures durant 4 heures (environ 20µL à chaque prise soit moins de 200µl au total). A l’âge de 27 semaines, les animaux seront soumis à une température de 6°C pendant 4h. En effet, une augmentation de la thermogenèse n’est pas observable à neutralité thermique, les souris doivent être exposées à de faibles températures pour stimuler ce processus. La température rectale sera mesurée avant et après chaque exposition au froid.

Impact sur les animaux

Les injections de tamoxifène induisent une modification génique, conduisant à la réduction la production hépatique de glucose, sans effet délétère sur la glycémie des animaux. Les effets de l’inhibiteur de la clairance des triglycérides sont transitoires et n’impactent ni le poids, ni la prise alimentaire, ni le bien-être des animaux. Toutes ces procédures légères réalisées une seule fois n'auront pas d'impact à long terme sur les 160 souris étudiées. La procédure est toutefois qualifiée de sévérité modérée.

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin du protocole selon une méthode autorisée par la législation afin de prélever les tissus pour étudier les mécanismes impliqués.

Remplacement

Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la fonction étudiée (la production de glucose par le foie) a des impacts sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. Conserver la physiologie de l'organisme est nécessaire pour comprendre les mécanismes régulant la production de glucose hépatique et leurs impacts sur la physiologie. Les études de ce projet seront donc réalisées in vivo dans des modèles de souris transgéniques ciblant des modifications géniques spécifiques au foie.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept. Afin de pouvoir faire une analyse statistique, des groupes de 10 souris seront analysés. Au total, ce projet nécessitera 160 souris mâles et femelles transgéniques et contrôles.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées par groupe en milieu enrichi pour favoriser la nidation (coton de nidation, bois à ronger) et contrôlé, seront observés quotidiennement et pesés régulièrement pour suivre leur prise de poids. Lors du gavage (parfaitement maîtrisée par les personnes en charge de l’expérimentation animale), la sonde sera préalablement trempée dans une solution d’eau sucrée pour favoriser la déglutition de l’animal. Pendant l’exposition au froid, les souris seront libres de leur mouvement et auront un accès libre à la nourriture et à l’eau. Ce projet sera réalisé chez la souris, dont les régulations métaboliques sont plus semblables à l’homme que les vertébrés inférieurs. La lignée murine choisie est sensible au développement du diabète et des maladies métaboliques et permet de comparer les résultats des souris contrôles avec nos lignées transgéniques utilisées sur le même fond génétique. Le diabète de type 2 se déclarant principalement chez l’adulte, l’étude sera réalisée sur des souris adultes. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole ou lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet selon les méthodes autorisées par la législation.

Choix des espèces

Les études portant sur le rôle de la production hépatique de glucose sur le métabolisme glucidique et énergétique réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme, tels que les rongeurs. Nous souhaitons utiliser dans nos expériences des souris C57BL/6J. Cette lignée murine a été choisie pour pouvoir comparer les résultats avec nos lignées transgéniques utilisées sur le même fond génétique et car c’est une souche sensible au développement du diabète et des maladies métaboliques. De plus, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles. Dans ce projet, nous étudierons la production hépatique de glucose à l’âge adulte car les maladies métaboliques étudiées (obésité, diabète) se développement avec l’âge dans notre modèle comme chez l’homme.