Procédures modérées

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hépatite aiguë leur est induite par injection de concanavaline A, puis leur sang est prélevé par voie rétro-orbitale avant une mise à mort par dislocation cervicale, pour tester des molécules inhibitrices de la mort cellulaire programmée. Le porteur qualifie la dose de concanavaline A de "sans danger" en s'appuyant sur l'absence de mortalité rapportée, alors que la procédure vise précisément à déclencher une atteinte hépatique aiguë. Il affirme que la culture d'hépatocytes ne suffit pas et que cette étude préclinique est une étape "indispensable" avant des essais chez l'homme.

Objectifs

Le foie est un organe vital assurant des fonctions essentielles de détoxification et de stockage. Tout dysfonctionnement de cet organe majeur a des conséquences graves sur la santé, allant jusqu’à engager le pronostic vital. A ce jour, il n’existe pas de réelles solutions thérapeutiques, hormis chirurgicales, pour traiter les insuffisances hépatiques aigues. Notre projet vise à réaliser des essais précliniques de molécules candidates pour réduire l’hépatite aigue induite par la concanavaline A

Bénéfices attendus

Ce projet devrait aboutir à la mise en place de nouveaux traitements des hépatites auto-immunes basés sur l'utilisation de nouvelles petites molécules inhibitrices de nécrose régulée.

Procédures

Le dépôt d'un gel anexthésiant (Xylocaïne 2%) au coin de l'oeil avant le prélèvement de sang par voie rétro-orbitale permet de limiter la douleur. Le prélèvement de sang réalisé par un expérimentateur expérimenté est rapide et la souris est immédiatement euthanasiée par dislocation des cervicales.

Impact sur les animaux

La dose de Concanavalin A de 10 mg/kg est reconnue comme sans danger pour les souris C57Bl6/J (aucune mortalité à 12 h ou 18 h de traitement, Ye T et al., Cell Physiol Biochem 2018, 46 : 1241-1251).

Devenir

Tous les animaux (768) sont gardés en vie après la procédure "Traitement par les inhibiteurs et la concanavalin A". Tous les animaux (768) sont mis à mort après la procédure "Prélèvement du sang par voie rétro-orbitale".

Remplacement

S’il est vrai que certaines questions peuvent être abordées grâce à la culture d’hépatocytes, celles posées dans notre projet nécessitent une étude à l’échelle systémique. En effet, les processus de mort que nous cherchons à étudier mettent en jeu les différents types cellulaires du foie, des cellules circulantes et même d’autres organes comme la rate. Ce sont donc des processus complexes non modélisables in vitro. Enfin, cette étude préclinique est une étape pré-requise indispensable avant de futures études cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre de souris engagées dans ces expériences a été réduit au minimum pour permettre une validation des résultats statistiques.

Raffinement

L'étude a été raffinée au mieux en privilégiant un traitement de courte durée permettant à la fois la mesure des paramètres d'évaluation de l'hépatite et limitant le développement de douleurs et malaises induits par le traitement. Enfin, nous avons anticipé l'étude de tous les organes pertinents (2) qui permettront une étude complète de la pathologie et des molécules pour un maximum d'informations.

Choix des espèces

Cette espèce permet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de petites molécules chimiques pour la prévention et/ou thérapie de la pathologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (au moins 8 semaines d’âge et poids corporel supérieur à 20 g) pour avoir des animaux avec une fonction hépatique normale et pour étudier une pathologie qui affecte surtout les adultes.

410 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 150 reproductrices euthanasiées à six mois et 260 produites transférées vers un autre projet déjà autorisé. Cette demande porte sur le seul élevage d'une lignée à phénotype dommageable, dont les individus développent des plaies dorsales et une perte de poil à partir de six mois, sans autre intervention. La souffrance déclarée tient donc à la lignée génétiquement modifiée elle-même, produite pour étudier le rôle de l'enzyme KDM6B dans le diabète de type 2. Le porteur affirme que la souris est le "modèle de référence" de l'obésité et du diabète et qu'aucune méthode sans animaux vivants ne peut remplacer ces procédures.

Objectifs

L’inflammation est reconnue comme un déterminant majeur de la mise en place du diabète de type 2 (DT2) et de ses complications cardiovasculaires. L’inflammation est notamment conduite par une activation de certaines cellules du système immunitaire (monocytes circulants et des macrophages tissulaires). La susceptibilité à développer un diabète de type-2 et de souffrir des complications cardiovasculaires semble être également associée à des facteurs environnementaux. Des études récentes suggèrent que ces facteurs environnementaux se traduisent par une modification de l’expression des gènes (notamment inflammatoires) par des mécanismes dit épigénétiques (modification de l’expression d’un gène sans modification de sa séquence génétique). L’enzyme KDM6B (Histone Lysine Demethylase 6B) est impliquée dans ses modifications épigénétiques. L'objectif du projet est de définir les conséquences de l'invalidation de KDM6B spécifiquement au niveau des macrophages, sur l’inflammation et l’homéostasie glucidique chez des souris.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait démontrer l'importance des modifications épigénétiques dans la mise en place et le développement du diabète de type 2 et dans ses complications. Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir les conséquences de l'invalidation de KDM6B spécifiquement au niveau des macrophages, sur l’inflammation et l’homéostasie glucidique chez des souris. A terme, moduler l'activité de KDM6B pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique pour contrôler l'inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type 2.

Procédures

Cette demande d'autorisation de projet est uniquement une demande pour l'élevage d'une lignée à phénotype dommageable. En effet, les souris KDM6b MKO et WT peuvent développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Avant l'âge de 6 mois, les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable. Les animaux ne subirront pas d'intervention.

Impact sur les animaux

La lignée murine KDM6B MKO est une lignée à phénotype dommageable. En effet, les souris KDM6b MKO et WT peuvent développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Avant l'âge de 6 mois, les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable.

Devenir

Les 150 animaux en accouplement seront euthanasiés à l'age de 6 mois. Les animaux produits par les accouplements seront utilisés pour créer les groupes expérimentaux d'un autre projet déjà autorisé.

Remplacement

Afin de prouver l'implication de la protéine KDM6B, dans le développement du diabète de type-2, la stratégie d'invalidation génique dans des cellules spécifiques comme les macrophages a été utilisée. Ces souris sont actuellement disponibles. De plus, la souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit à son maximum. 150 souris seront placées en accouplement : à raison de 5 accouplements en parallèle à renouveler tous les 6 mois durant 5 ans : 3 souris (1 mâles + 2 femelles) x 5 accouplements x 10 semestres = 150. 260 animaux seront produits afin d'être utilisés dans un autre projet déjà autorisé.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés et ont un accès ad libitum a la nourriture. Les conditions de température et d'hygromètrie sont controlées et monitorées tous les jours. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Pour s’assurer du « bien être » des souris, elles bénéficieront de coton et de « maisons » en carton afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance journalière. Les points suivants seront considérés comme points limites : 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : ulcères, tumeurs, fractures... 4. Apparition de plaies/lésions au niveau du dos.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques utilisés ont déjà été validés chez la souris. Les souris sont faciles à manipuler et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Les animaux seront mis en accouplement à partir de l'age de 56 jours qui est l'age de maturité sexuelle des souris.

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique de la moelle épinière avec lésion de la myéline, pour certaines une castration ou une ovariectomie, puis quatre semaines de surveillance avant le prélèvement de leur moelle épinière. Le porteur étudie le rôle du récepteur CXCR4 dans la réparation de la myéline par la testostérone, en vue de la sclérose en plaques, et affirme que les souris récupèrent vite sans séquelles. Il indique avoir mené des cultures cellulaires mais conclut que la complexité des processus "nécessite l'utilisation d'animaux".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d’identifier le rôle du récepteur de chimiokine CXCR4 dans l’effet de la testostérone et de son récepteur (AR) dans la réparation de la myéline lésée chez la souris. Les résultas obtenus auront une retombée sur la thérapie de la maldei de la sclérose en plaques.

Bénéfices attendus

A terme, ce travail permettra de confirmer ou infirmer l’implication du récepteur CXCR4 dans les effets remyélinisants de la testostérone et son AR. Le gain de fonction du CXCR4, à travers les souris WHIM, nous permettra de déterminer si on pouvait ou non rétablir le phénotype des souris. En effet, nous déterminerons si la surexpression du CXCR4 permet ou non la remyélinisation sans ajout d’implants de testostérone chez des souris castrées. Ce travail permettra de valider l’efficacité des protocoles proposés dans la réparation de la myéline des souris malades et il apportera des informations importantes sur les moyens d’optimiser le traitement de ces pathologies démyélinisantes chez les patients.

Procédures

la chirurgie par stéreotaxie sur la moelle épinière de tous les animaux sera faite une seule fois. Les animaux seront gardés dans l'animalerie pendant 4 semaines, sous surveillance, avant de les euthanasier et de leur prélever la moelle épinère. et leurs états surveillés

Impact sur les animaux

D’après nos expériences précédentes, déjà publiées, les animaux récupèrent vite après la chirurgie. ils ne gardent pas de séquelles.

Devenir

tous les animaux seront euthanasiés pour l'utilisation de leurs moelles épinères afin d'analyser le nombre d'oligodendrocytes et le marquage de la myéline dans les zones lésées.

Remplacement

Des expériences de cultures de cellules ont été réalisées, mais la complexité des processus regardés nécessite l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit à 8 par point expérimental, le minimum requis lors de nos travaux précédents de façon à mettre en évidence des différences statistiques. Nous utiliserons 336 souris en 5 ans. De même, si les résultats obtenus en utilisant les souris CXCR4GFAP/CreLoxp de la procédure N°1 montrent que les astrocytes sont indispensables pour l’effet de la testostérone sur la réparation de la myéline, nous ne réaliserons pas la procédure N°2. Ainsi, les souris CXCR4nestin/CreLoxp ne seront pas utilisées, ce qui réduirait le nombre de souris à seulement 240.

Raffinement

les animaux seront hébergés par groupe de 5 animaux par cage dans des conditions optimales d’hébergement (nourriture et eau disponible à volonté). La méthodologie expérimentale est optimisée pour utiliser le strict nécessaire d’animaux. Pendant la chirurgie, un tapis chauffant sera utilisé pour l’animal, sous anesthésie générale. A la fin de l’opération, l’animal sera traité par antalgiques et la surveillance post-opératoire sera assurée quotidiennement. Si des points-limites, préalablement établis, seront atteints, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Nous utilisons l'animal le plus utilisé par les chercheurs, la souris C57BL/6, pour leur facilité d’hébergement et d’élevage (rapidité de reproduction et nombre de souris par portée). Ces animaux constituent un excellent modèle pour l’étude des pathologies neurodégénératives. Leur génome est très bien connu, ce qui permet de les "modifier génétiquement". Cet avantage nous permet d’utiliser des souris transgéniques et des souris sauvages du même fond génétique dans nos études expérimentales. Nous utiliserons des souris transgéniques, dépourvues du CXCR4 dans toutes leurs cellules neurales (souris CXCR4Nestine-Cre-Loxp) et des souris dépourvues du CXCR4 spécifiquement dans les cellules astrocytaires GFAP (souris CXCR4GFAP-Cre-Loxp). Ces souris seront produites dans notre laboratoire après accouplement des souris CXCR4-Loxp et les souris Nestine-Cre pour les premières et avec les souris GFAP-Cre pour les secondes. Les souris WHIM seront produites et élevées par nos collaborateurs à Clamart, France. Pour les études in vivo, nous appliquerons les conditions publiées par notre équipe, à savoir des souris âgées de 8 semaines (souris jeunes adultes) pour la castration et l’ovariectomie et des souris de 10 à 12 semaines (souris adultes) pour la lésion LPC Bielecki B et al., 2016, PMID: 27930320). Notre projet d’étude de la démyélinisation et la remyélinisation in vivo mimerait les processus pathologiques accompagnant la maladie de la sclérose en plaques chez l’homme adulte.

3 singes vervets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants pour un projet ultérieur. Chaque singe subit sous anesthésie une chirurgie abdominale pour la pose d'un implant de télémétrie et une cathétérisation de l'artère fémorale, avec des risques d'infection, d'hémorragie et de complications vasculaires. Le porteur présente l'ensemble comme une opération "de raffinement" destinée à équiper les animaux avant une recherche à venir. Il indique que la nécessité scientifique de cette recherche relève de l'utilisateur final et a été validée en amont, sans la détailler ici.

Objectifs

Le projet consiste en la pose d’implant de télémétrie sur 3 Chlorocebus sabaeus. Ce projet est une phase de pré-etude afin de préparer les animaux à un projet de recherche ultérieur dans un but de raffinement. La pose d’implant de télémétrie permet le suivi en temps réel et en continu des paramètres vitaux des animaux (température corporelle, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, pression artérielle). Cela permet d’obtenir des données physiologiques continues sans stresser les animaux (pas de contention); de plus, cela permet des mesures en temps réel à distance, afin d’être le plus prédictif possible d’un changement d’état physiologique de l’animal et une intervention rapide du personnel si nécessaire (atteinte de point-limite….)

Bénéfices attendus

La pose d’implant de télémétrie permet le suivi en temps réel et en continu des paramètres vitaux des animaux (température corporelle, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, pression artérielle). Ce projet est réalisé en amont d’un projet de recherche pour lequel il est important de pouvoir monitorer les animaux en continu. Dans le cadre des 3Rs, cela permet de raffiner la procédure avec l’obtention de données physiologiques continues sans stresser les animaux, et en étant plus prédictif « en direct » sur toute modification de l’état de l’animal pour une intervention plus rapide en cas d’atteinte de points-limites (monitoring avec système d’alerte possible).

Procédures

Le projet consiste en la réalisation, sous anesthésie générale et analgésie, d’une chirurgie abdominale pour la pose d’un implant intra-abdominal et une cathérisation vasculaire de l’artère fémorale sur 3 animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux devant subir une chirurgie, les effets probables sur les animaux seront ceux inhérents à une telle intervention : - de la douleur per et post-opératoire. Cela peut entrainer secondairement une baisse de l’activité et une diminution de l’appétit transitoire pendant quelques jours après la chirurgie. De plus, inhérent à toute intervention de ce type, les risques possibles sont : - risque anésthésique, - risque d’infection, - risque hémorragique per-opératoire, - risque vasculaire sur le membre postérieur cathétérisé.

Devenir

Ce projet ne contient qu’une procédure. Tous les animaux sont gardés en vie en fin de procédure. Projet s’inscrivant comme phase de préparation des animaux en vue d’un projet ultérieur.

Remplacement

Ce projet se déroule dans le cadre de la préparation d’animaux pour fournir des animaux équipés en télémétrie comme phase de pré-étude pour la réalisation d’étude ultérieure. La nécessité scientifique de l’utilisation d’animaux est faite en amont par les utilisateurs des animaux ; leur projet de recherche est déclaré et agréé par les autorités compétentes selon la règlementation en vigueur.

Réduction

Ce projet a lieu dans le cadre d’une mise au point de technique de raffinement, elle est réalisée sur seulement 3 animaux afin d’évaluer / confirmer son intérêt scientifique et de raffinement pour cette étude. Les conclusions pourront en plus servir pour appliquer les principes de Réduction et de Raffinement à d’autres projets futurs.

Raffinement

La réalisation de ce projet s’inscrit pleinement dans un objectif de raffinement puisqu’elle a pour objectif de permettre un meilleur monitoring d’animaux per-étude (acquisition de mesures physiologiques sans intervention sur les animaux) et de pouvoir intervenir le plus tôt possible en anticipant les modifications physiologiques et notamment l’atteinte de points-limites précoces (système d’alerte lors d’atteinte de paramètres limites). Considérant la procédure elle-même, dans le but de limiter les nuisances aux animaux: - La douleur liée à l'intervention chirurgicale sera gérée par une anesthésie et une analgésie per et post-opératoire adaptées. - le risque infectieux sera limité par une asepsie rigoureuse et une antibiothérapie prophylactique per et post-opératoire. - Le risque anesthésique sera limité par le fait que le protocle a été bien adapté en amont et que le monitoring sera fait par un vétérinaire formé. - Les risques hémorragiques et vasculaires seront limités par le fait que la chirurgie est réalisée par un.e chirurgien.ne expérimenté.e dans la technique.

Choix des espèces

Ce projet est une phase « pré-étude » en vue de fournir des animaux équipés en télémétrie pour un projet de recherche ultérieur. Le Singe vert est une espèce phylogéniquement proche de l’homme et particulièrement sensible au virus considéré dans ce projet. La pertinence de l’utilisation du C.aethiops et du stade juvénile pour le projet de recherche a été établie en amont par l’utilisateur final lors de son agrément du projet lui-même.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques développent une sclérose latérale amyotrophique évolutive, avec troubles de la démarche, perte de force musculaire et perte de poids, reçoivent une injection tous les deux jours pendant plus de trois mois, et subissent des tests de locomotion ainsi qu'un test d'évitement par choc électrique aux pattes. Le porteur indique avoir d'abord travaillé sur la drosophile puis sur des larves de poissons zèbres avant de recourir à la souris. Il affirme que les modèles murins "ne peuvent pas être remplacés" en vue d'un développement clinique.

Objectifs

notre objectif est de valider une cible thérapeutique pour lutter contre la sclérose latérale amyotrophique. Notre étude permettra d'identifier des molécules capables de réduire les défauts locomoteurs et les atteintes cellulaires liés à cette maladie

Bénéfices attendus

Valider une cible thérapeutique et identifier un/des agents thérapeutiques pour lutter contre la sclérose latérale amyotrophique

Procédures

Tous les animaux (n=768) recoivent une injection intrapéritonéale tous les deux jours. L'impact sur le comportement est évalué du 21ème jour au 124ème jour. Les tissus nerveux des animaux sont analysés post-mortem

Impact sur les animaux

Les souris utilisées présentent un phenotype pathologique avec un décours différent suivant le sexe . Les mâles ont un phénotype plus rapide et prononcé. A 30 jours : apparition des trouble de la démarche et de l'équilibre. A 60 jours : aggravation des défauts de locomotion (diminution de la force musculaire). A 90 jours : début de la perte de poids (mâles). A 120 jours : perte de poids (femelles et mâles).Comme les souris montrent des déficit au niveau intestinal, elles auront accès à de la nourriture en gelée dès le 30ème jour pour limiter la perte de poids. La nuisance liée à l'injection en intrapéritonéale tous les 2 jours est minimisée en alternant le côté d'injection. Les tests de locomotion utilisés provoquent très peu d'effet indésirable. Pour le test d'évitement, les animaux reçoivent un faible choc électrique aversif par les pattes et on note leur réaction. Les chocs sont limités en intensité et en durée de façon à limiter la nuisance aux animaux. Toute variation importante de la sensibilité aux chocs conduit à l'arrêt de la procédure. Ce test ne sera pratiqué qu'une seule fois à la fin du projet

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre l'étude des mécanismes d'action de la thérapie

Remplacement

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie complexe se traduisant par une perte progressive des neurones de la moelle épinière et du cortex moteur. Elle se traduit par une diminution progressive des capacités motrices. Pour minimiser l'utilisation d'animaux vertébrés, nous avons dans un premier temps démontrer chez la drosophile que l'activation d'un récepteur est une cible thérapeutique d'intérêt. Pour identifier 3 nouveaux activateurs de ce récepteur avec un fort potentiel thérapeutique, une série d'activateurs sera d'abord testée sur des larves de poissons zèbres de 5 jours. Ensuite pour valider les 3 meilleurs activateurs candidats, nous avons besoin d'un modèle vertébré proche de la maladie avec une perte de neurones moteurs de la moelle épinière et des déficits progressive de locomotion. Les modèles murins sont les plus adaptés à ce type d'étude et ne peuvent pas être remplacés par d'autres modèles en vue d'un futur développement clinique.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécéssaire, on se base sur les études antérieures utilisant la même stratégie thérapeutique et les mêmes tests comportementaux pour d'autres maladies neurodégénératives. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par un logiciel de statistique.

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance, l'environnement des animaux sera enrichi avec des copeaux de cartons qui permettront aux animaux de se cacher et constituer un abri. Les animaux seront également manipulés toutes les semaines afin de réduire le stress que peut engendrer un expérimentateur lors d'une procédure expérimentale. Afin de réduire la difficulté des souris transgéniques pour s'alimenter, elles auront accès à de la nourriture en gelée dès le 30 ème jour. Afin de contrôler le bien-être des animaux, les souris seront pesées deux fois par semaine dès la naissance. Une feuille de bien-être, avec les points limites sera complétée par l'expérimentateur lorsque tout comportement suspect (plaie, lésions cutanés, agressivité, stéréotypie, apathie, convulsions, ...) sera remarqué. Dès lors une grille d'évaluation sera complétée tous les jours pour le suivi de l'animal. Si une souris présentait un score de souffrance trop élevé sur la grille d'évaluation, elle sera immédiatement euthanasiée par l'expérimentateur qualifié après en avoir averti le chef de projet et le vétérinaire.

Choix des espèces

La lignée de souris transgéniques utilisée a fait l'objet de nombreuses publications et son phénotype est donc bien caractérisé. L'utilisation de ces animaux est indispensable à l'élaboration de thérapies efficaces car ils représentent un des modèles les plus pertinents de la sclérose latérale amyotrophique. Ces souris présentent une altération progressive de leurs performances motrices et mnésiques comme observée dans cette pathologie : A 30 jours : apparition des premiers défauts de locomotion A 90 jours : début de la perte significative des neurones moteurs A 120 jours : aggravation des symptômes

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Citrobacter rodentium pour reproduire un syndrome de l'intestin irritable, reçoivent un gavage de probiotiques, puis subissent un labyrinthe en croix surélevé, un test de nage forcée et une distension colorectale avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur décrit une hypersensibilité colique et un comportement de type anxieux persistant jusqu'à la fin des expériences. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur des animaux et que les modèles cellulaires in vitro ne sont pas envisageables.

Objectifs

L’hypersensibilité colique et les douleurs abdominales sont les principaux symptômes du SII. La prise en charge de ces douleurs en clinique est actuellement limitée. En effet, le manque d’efficacité des traitements disponibles rend le développement de nouveaux outils pharmacologiques nécessaire. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes de ces douleurs afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, puis de tester de nouveaux médicaments agissant sur ces nouvelles cibles. La complexité de cette pathologie faisant intervenir plusieurs organes rend impossible l’utilisation in vitro d’un modèle cellulaire. Ainsi, afin de tester de nouvelles molécules dans des conditions mimant ces pathologies, il est indispensable de développer un modèle animal présentant des origines communes à ce qui est observé chez le patient et permettant donc de reproduire ces pathologies douloureuses. Le protocole s’orientera sur les mécanismes périphériques impliqués dans l’initiation et/ou le développement d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique sur des modèles animaux de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux. En effet, parmi les différents facteurs étiologiques suspectés dans la physiopathologie de ces atteintes intestinales, il a été observé, chez des patients présentant de sévères douleurs abdominales, des facteurs communs tels qu’un dérèglement du système immunitaire ou des modifications de la composition du microbiote intestinal pouvant être l’origine d’une micro-inflammation locale et/ou d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique. L’objectif de ce projet sera donc de clarifier le lien entre un désordre microbien, immunitaire et/ou inflammatoire à bas bruit et le développement d’une HSVC afin de proposer de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement de la douleur viscérale d’origine colique.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs associées au syndrôme de l'intestin irritable afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec des services de gastroentérologie . L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au syndrome de l'intestin irritable et, in fine, à soulager les patients douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.

Procédures

Prélèvement de fèces à J3, 7, 10 et 16 post infection sur chaque souris pour évaluer l’état de colonisation du tractus digestif. Suite à cela, les souris recevront un traitement par gavage orale à base de bactéries probiotiques entre J16 et J23. A J21, les souris subiront un premier test comportementale (5 min par souris sur l'ensemble des souris) pour évaluer l'état d'anxiété des souris (Labyrinthe en croix surélevé) puis à J23 un second test comportementale (5 min par souris sur l'ensemble des souris) pour évaluer l'état de dépression des souris (test de la nage forcée). Enfin, à J24, les souris subiront un dernier test (40 min par souris sur l'ensemble des souris), le test de distension colorectale, afin d'évaluer leur sensibilité colique avant d'être mis à mort à la suite de ce test de distension colorectale.

Impact sur les animaux

Une perte de poids (au maximum, 5% du poids initial) peut être observée chez certains animaux durant la phase d’infection et notamment au pic d’infection (7 jours post-infection), mais ce phénomène est temporaire et naturellement résolu avec l’élimination du pathogène (16 jours post-infection). Ensuite, cette infection par C. rodentium induira chez les animaux les symptômes associés au SII-PI à savoir une hypersensibilité colique et un comportement de type anxieux en phase post-infectieuse (16 jours post-infection) et jusqu’à la fin des expérimentations prévues (24 jours post-infection).

Devenir

A l'issu de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort par overdose d'isoflurane suivi par une dislocation cervicale afin de réaliser des prélèvements d'organes.

Remplacement

Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.

Réduction

Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.

Raffinement

Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette ainsi que du coton.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. De plus, la spécificité d’espèce de la souche bactérienne pathogène utilisée rend ce modèle encore plus approprié. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont nourris avec des protéines issues de levure et de bactérie, soumis à des prélèvements sanguins caudaux puis à une ponction intracardiaque sous anesthésie, avant le prélèvement de leurs contenus intestinaux et de leurs organes, pour évaluer l'intérêt nutritionnel de ces protéines pour l'alimentation humaine. Le porteur signale que ces aliments peuvent contenir des acides nucléiques potentiellement néfastes pour les reins. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative validée in vitro" pour mesurer la digestibilité des acides aminés, mesurable seulement chez l'animal ou chez l'humain.

Objectifs

Face à l’accroissement de plus en plus rapide de la population, aux enjeux liés au changement climatique et à l’urbanisation croissante, sécuriser l’offre alimentaire constitue un défi majeur pour le secteur agricole. Une augmentation considérable des besoins de ressources en protéines est inévitable. Les ressources végétales et animales nécessitent la mobilisation de grandes surfaces agricoles et sont dépendantes des conditions climatiques et de la saisonnalité. La recherche de sources protéiques alternatives est ainsi en plein essor et les Protéines d’Organismes Unicellulaires (POU) représentent actuellement une filière en développement. Les microorganismes sont des ressources intéressantes à exploiter, de par leur vitesse de croissance, leur capacité d’accumulation et la possibilité de moduler leur métabolisme et leur composition en fonction des conditions d’environnement. Dans ce contexte, le projet Nutripou va produire des POU issues de bactérie et de levure à partir de procédés de culture, d’extraction et de purification optimisés afin d’obtenir des POU dont la composition nutritionnelle est adaptée à l’alimentation humaine. Les objectifs de l’étude animale que nous souhaitons mener sont : i- d’évaluer la qualité nutritionnelle de POU issues de levure et de bactérie et présentant des degrés de purification différents (procédures expérimentales 1 et 2) et ii- d’évaluer les effets métaboliques et physiopathologiques de l’ingestion durant 3 mois de ces mêmes POU (procédure expérimentale 3) chez le rat.

Bénéfices attendus

Les données de qualité nutritionnelle des POU de levure et de bactérie et les effets de leur ingestion obtenues dans notre étude permettront d’appréhender l’intérêt de cette nouvelle ressource en protéines. La caractérisation nutritionnelle permettra de valoriser ou d’envisager des pistes d’amélioration de la production des POU et elles pourront éventuellement venir compléter le catalogue des ressources alternatives en protéines permettant de faire face à la demande mondiale croissante.

Procédures

Dans les procédures 1 et 2, les animaux seront hébergés en cage individuelle en permanence. Dans la procédure 3, ils seront hébergés à 2 par cages et placés uniquement 3 fois 24h dans des cages individuelles pour la collecte des urines. Lors des procédures 2 et 3, avant l’euthanasie des animaux et pour collecter une quantité suffisante de sang, une ponction intracardiaque sera réalisée après anesthésie gazeuse profonde de l’animal. Lors de la procédure 3, des prélèvements sanguins sur la veine latérale de la queue seront réalisés sur les rats vigiles. Trois prélèvements seront réalisés (au début, à mi-parcours et à la fin de la procédure) et la durée de chaque prélèvement ne dépassera pas 5 minutes

Impact sur les animaux

Lors des procédures 1 et 2, il sera nécessaire d’héberger les animaux en cages individuelles car nous devrons suivre précisément la prise alimentaire de chaque rat (procédure 1) et les habituer à l’ingestion d’un repas-test (procédure 1). Lors de la procédure 3, les animaux seront hébergés à 2 par cage. La prise alimentaire n’étant pas le paramètre principal évalué lors de cette procédure, il est envisageable de diminuer la précision de cette mesure pour cette procédure. Les animaux seront placés en cage individuelle uniquement lors du recueil des urines, soit 3 fois une journée sur l’ensemble de la procédure. Les prélèvements sanguins de la procédure 3 sont susceptibles d’induire de la douleur. Les prélèvements se feront au niveau d’une veine latérale de la queue par un expérimentateur entraîné et les volumes prélevés seront modérés et ne dépasseront pas 15% du volume de sang des rats. Bien que la production des POU utilisées dans cette étude sera optimisée pour réduire les quantités d’acides nucléiques, les régimes à base de POU sont susceptibles de contenir des quantités faibles d’acides nucléiques pouvant être potentiellement néfastes pour la santé des rats. Les expérimentateurs seront donc particulièrement vigilant lors du suivi de l’état de santé globale des animaux. L’ingestion d’acides nucléiques pourrait avoir un effet sur le rein et l’excrétion des urines sera particulièrement observée.

Devenir

Procédure 1: Les 40 rats seront réutilisés pour la procédure 2. Procédure 2: les 40 rats seront euthanasiés afin de collecter les digestats des différents compartiments intestinaux et évaluer la digestibilité de POU. Procédure 3: les 40 rats seront euthanasiés afin de prélever les organes et tissus permettant d'évaluer les effets de l'ingestion de POU sur des marqueurs inflammatoires et histologiques.

Remplacement

A l’heure actuelle il n’existe pas de méthode alternative validée in vitro pour déterminer la digestibilité de l’azote et des acides aminés des protéines. Les méthodes de digestion in vitro ne permettent pas en l’état actuel des connaissances d’obtenir des données représentatives de la digestibilité in vivo des acides aminés alimentaires. Ces mesures ne peuvent être réalisées que chez l’animal et chez l’homme. Néanmoins, les études de digestibilité des acides aminés nécessitent à l’heure actuelle l’accès aux contenus intestinaux au niveau iléal et sont très invasives chez l’homme. En outre, afin d’étudier l’innocuité de ces nouvelles sources de protéines alimentaires à moyen terme, et en particulier les effets de taux d’acides nucléiques non négligeables, il est nécessaire d’évaluer les effets sur différents marqueurs inflammatoires, métaboliques, du statut osseux, etc. et cela ne peut se faire que chez l’animal en ayant accès à l’ensemble des tissus et organes.

Réduction

A partir des données déjà publiées sur le sujet et dans des conditions expérimentales comparables, le nombre minimum d’animaux requis pour atteindre une puissance statistique suffisante et garantir l'exploitation des résultats est de 8 rats par groupe.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel dans les procédures 1 et 2, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles seront enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque ainsi que des billes. Des regroupements dans des cages collectives (5 rats/cage) seront effectués une fois par semaine lors de ces 2 procédures. La capacité d’accueil de la cage de regroupement sera adaptée au nombre et au poids des rats et les animaux seront identifiés par un numéro inscrit au marqueur sur leur queue. Pour la procédure 3, les animaux seront hébergés à 2 par cage. Néanmoins, les animaux passeront 3 fois 24h en cage métabolique individuelle afin de collecter les urines. Ces cages seront également en plexiglas et enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque ainsi que des billes. Afin de réduire la douleur lors des prises de sang au niveau d’une veine latérale caudale réalisées en procédure 3, les prélèvements se feront par un expérimentateur entraîné. Les volumes prélevés seront modérés (2mL/prélèvement, 3 prélèvements à J0, J45 et J90) et ne dépasseront pas 15% du volume de sang des rats. Les animaux seront habitués à la contention dans un tissu lors des pesées afin de réduire le stress généré lors de la contention pour réaliser la prise de sang et un analgésique sera appliqué sur la queue quelques minutes avant le prélèvement pour réduire les douleurs. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Si une perte de poids de plus de 20% sans cause apparente et sans récupération, des diarrhées sans cause apparente ou des difficultés à uriner ou une modification de l’aspect des urines sont détectées grâce au suivi rapproché de chaque animal, il sera sorti du protocole expérimental et euthanasié si son état de santé ne s’améliore pas rapidement.

Choix des espèces

Le régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’Homme pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. De plus, le rat est une espèce de référence pour les études nutritionnelles. Procédure 1 : Rats âgés de 3 semaines. L’évaluation du CEP est une procédure standardisée qui se réalise chez de jeunes rats pour rendre compte de la capacité de la protéine à soutenir la croissance. Procédure 2 : Rats issus de la procédure 1. Ils seront alors âgés de 8 semaines. Les études de digestibilité sont habituellement réalisées sur des rats de cet âge. C’est une fenêtre d’âge de référence utilisée dans la plupart des études quand il s’agit de normaliser les conditions d’expérimentations dans lesquelles l’âge de l’individu n’est pas l’objet de la recherche. Procédure 3 : Rats adultes âgés de 8 semaines. C’est une fenêtre d’âge de référence utilisée dans la plupart des études quand il s’agit de normaliser les conditions d’expérimentations dans lesquelles l’âge de l’individu n’est pas l’objet de la recherche.