Procédures modérées

26 jeunes chevaux vont être utilisés, gardés vivants et rendus à l'élevage à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poulain subit un sevrage imposé à six mois et deux examens IRM à dix mois d'intervalle, pour mesurer les effets du sevrage précoce sur le développement social et cérébral. Le porteur reconnaît que le sevrage imposé induit "potentiellement du stress" mais décrit un hébergement en groupe qu'il présente comme supérieur à la pratique courante en box individuel. Il affirme que le recours au cheval domestique est "nécessaire" car le projet porte sur l'élevage même de cette espèce.

Objectifs

Le sevrage est souvent réalisé atour 6 mois dans la pratique (voir encore plus tôt) pour plusieurs raisons. Tout d’abord, il s’agit d’une pratique qui est répétée par habitude car étant traditionnelle et majoritaire. Elle est donc peu questionnée. Ensuite, elle permettrait de remettre plus rapidement la jument à la reproduction et de limiter la fatigue physique liée à la lactation. De plus, certaines personnes considèrent que retirer la mère permet de réorienter l’attention du poulain vers l’humain, et donc de faciliter son entrainement. Enfin, l’hébergement en box individuel est encore très répandu et est donc incompatible avec le maintien d’une vie sociale – y compris avec la mère – des jeunes animaux. Les bienfaits d’un sevrage plus tardif sont encore peu connus alors qu’il existe un fort contraste entre ce sevrage imposé à 6 mois et ce qui est observé en conditions libres (sevrage très progressif de 9 mois jusqu'à parfois 2-3 ans) . Nos résultats permettront de déterminer si 1/ le sevrage imposé influence le développement social, cognitif et/ou cérébral des poulains, 2/ si de tels effets se maintiennent dans le temps ou si au contraire les poulains compensent cet évènement perturbateur sur le long terme lorsqu’ils sont élevés dans un milieu social par ailleurs riche, et 3/ si le sevrage impact à long-terme le bien-être, la personnalité et la maniabilité des jeunes chevaux. Si nos résultats montrent qu’un sevrage réalisé à cet âge et dans ces conditions a des conséquences néfastes durables, alors ils ouvriront la voie à une nouvelle étude où nous pourrons tester d’autres âges de sevrage (e.g. 7 ou 8 mois) pour trouver le meilleur compromis à recommander pour la pratique. Le suivi longitudinal du groupe « sevrage spontané » nous aidera à cibler la période idéale. S’il s’avère que le sevrage pratiqué dans les conditions de l’étude n’induit pas des déficits sociaux, cognitifs et/ou cérébraux durables, ni n’altère durablement le bien-être ou la relation à l’humain, alors les recommandations pourront se concentrer sur la manière de faciliter ce type de sevrage et ne nécessiteront pas nécessairement de tester d’autres âges. Dans tous les cas, des recommandations concrètes sur la gestion des poulains pourront être faites. De manière plus globale, cette étude ouvrira la voie à cette thématique sur l’optimisation de l’élevage des jeunes afin de garantir un développement idéal et adapté aux conditions domestiques.

Bénéfices attendus

Meilleure caractérisation de l'impact du sevrage équin et apport de connaissances en matière de bien-être animal.

Procédures

Tous les animaux seront utilisés pour des scans IRM à deux reprises (10 mois d’intervalle) pour évaluer les aspects développementaux

Impact sur les animaux

Potentiellement du stress lors du sevrage imposé.

Devenir

Tous les animaux retourneront en élevage après la procédure.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du cheval domestique est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage de cette espèce. De plus, nous avons besoin d’un modèle animal qui présente un développement assez long et pour lequel nous avons déjà les bases quant à l’étude de son comportement et de sa neurobiologie.

Réduction

Pour une étude basée sur un approche IRM, notre effectif est plutôt important (N=2x12 poulains). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les groupes expérimentaux, voire entre les individus. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce (i.e. herbivore social). Les conditions de vie du groupe « sevrage imposé » (i.e. traitement avec l’impact supposé le plus négatif) correspondent en fait à la réalité observée dans la pratique, voire mieux puisque nos animaux ne seront pas maintenus en isolement social alors que l’hébergement en box individuel est encore courant au sein de la filière. Enfin, les animaux ne seront pas sacrifiés à la fin de protocole. La taille de nos effectifs (12 individus par traitement expérimental) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques. Si les conditions ne permettent pas d’utiliser des tests paramétriques, alors nous utiliserons des tests non-paramétriques du type tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, si la variabilité inter-individuelle intra-groupe le permet. Dans le cas où une différence de 15% est observée entre les deux groupes expérimentaux pour un paramètre donné, avec des écart-types de 12% autour de la moyenne et un seuil de 0,05, nous obtiendrions une puissance de test de 87% pour un test t de student et 83% avec un test de Mann Withney (outils AnaStats).

Raffinement

Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. En tant qu’espèce sociale, ils bénéficieront d’un maintien en groupe social. Ils seront hébergés en pâture ou en stabulation (grand box collectif), selon les conditions météorologiques. Des objets d’enrichissement seront présents en stabulation (ex. brosse électrique, bois à ronger…). Leur alimentation sera principalement composée de fourrage et d’herbage afin qu’ils aient la possibilité en continu de s’alimenter avec une alimentation riche en fibres. L’hébergement collectif leur donnera également une liberté de mouvement et un budget d’activité a priori conformes à ce qui attendu en conditions libres. Ainsi, l’ensemble de ces conditions de vie que nous proposons sont au-delà des conditions standards généralement observées dans la pratique, où l’hébergement en box individuel est très répandu (ce qui induit donc un isolement social et une restriction de l’activité locomotrice importante).

Choix des espèces

L’utilisation du cheval domestique est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage de cette espèce. De plus, nous avons besoin d’un modèle animal qui présente un développement assez long et pour lequel nous avons déjà les bases quant à l’étude de son comportement et de sa neurobiologie. Notre équipe possède cette expertise sur le modèle équin. Nous utiliserons des poulains à partir de l’âge de 6 mois, c’est-à-dire l’âge du sevrage tel qu’il est pratiqué sur le terrain et qui correspond à la période de vie qui nous intéresse. Les animaux seront ensuite suivi durant 1 an.

186 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chocs électriques pour induire un état de stress post-traumatique, sont hébergées seules pendant toute la procédure puis reçoivent des stimulations ultrasonores transcrâniennes évaluées par des tests comportementaux, avant une perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur reconnaît que l'isolement, reproduit pour coller à un modèle existant, "risque d'induire un stress supplémentaire prolongé", et que ses résultats précédents n'avaient pas reproduit un vrai modèle de stress post-traumatique. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est disponible, le modèle reposant sur l'observation du comportement de l'animal vivant.

Objectifs

Ce projet a été évalué sous le numéro L'État de Stress Post-Traumatique (ESPT ou PTSD, pour Post-Traumatic Stress Disorder, APA 1994) est une pathologie psychiatrique qui touche 8 à 12% de la population générale qui survient après l'expérience d'un événement traumatique pouvant être létal, causer une blessure grave ou menacer l'intégrité physique. Les bases neuroanatomiques et physiopathologiques sont bien établies. Elles font état d'une altération du système limbique (qui comprend notamment hippocampe et amygdale) avec une suractivation de l'amygdale et une sous-activation du cortex préfrontal. Cet état dysfonctionnel entraîne des troubles cognitifs et émotionnels (notamment un déficit dans l'extinction du conditionnement de peur) caractéristiques des symptômes du PTSD. La symptomatologie du PTSD se définit alors par un syndrome de reviviscence traumatique, un évitement et émoussement affectif et une activation neurovégétative. L’efficacité des thérapies pharmacologiques (antidépresseurs) ou psycho-cognitive utilisée pour le traitement de la pathologie est cependant relative et limitée. L'amélioration de l'arsenal thérapeutique représente donc un enjeu de santé publique majeur. Ces dernières années, les techniques de neurostimulation sont en train d’émerger. Au laboratoire, nous avons mis au point le traitement par Stimulation Transcrânienne Ultrasonore répétée (rTUS) du cortex infralimbique dans le traitement de la dépression. C’est une technique qui offre l’avantage d’être non-invasive. Employé dans le cadre du traitement du PTSD, cette option thérapeutique n'en est qu'à ses prémices. Le but de cette étude porte sur les effets de la rTUS sur la physiopathologie du PTSD et de comparer ces effets à ceux d’un traitement chronique avec un antidépresseur. Avenant : Le premier objectif sera donc d’obtenir un modèle murin de PTSD robuste et montrant différents aspects de la symptomatologie du PTSD. Après obtention du modèle murin de PTSD, l’efficacité thérapeutique de la rTUS sur le comportement des animaux sera évaluée. Les cerveaux seront prélevés pour d’ultérieures études mécanistiques.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, nous allons raffiner le modèle de Trouble de Stress Post-Traumatique. Il est impératif, pour des études sur des maladies psychiatriques en préclinique, d’avoir un modèle robuste reproductible et permettant de représenter différents symptômes de la maladie. Dans un second temps, nous reproduirons des résultats déjà démontré au laboratoire : l’activation neuronale induite par la stimulation ultrasonore. Cette approche à l’avantage d’être non invasive, plus focale et permettant d’aller stimuler des régions plus profondes que d’autres méthodes de neurostimulation. Cependant, cette technique n’a pas encore été testée en tant qu’approche thérapeutique dans un modèle préclinique de PTSD. Notre étude permettrait donc de mettre en évidence l’efficacité de l’activation répétée du cortex infralimbique dans notre modèle. A l’aide des différents tests comportementaux, nous pourront confirmer les effets thérapeutiques à long terme de la stimulation transcrânienne ultrasonore répétée ainsi que l’absence d’effets délétères sur le cerveau lié à la répétition de la stimulation.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux seront soumis à des chocs électriques d’intensité modérée et de durée variable puis l’effet de ces chocs sera évalué par des tests comportementaux. Puis avec l'appui ce ces premiers résultats obtenus, nous réaliserons l’étude proprement dite impliquant la génération d’un stress, l’application d’ondes ultrasonores, des tests comportementaux pour évaluer les effets du stress et du traitement par stimulation ultrasonore. L’étude se poursuivra par une analyse immunohistochimique des cerveaux, une perfusion intracardiaque nous permettra de prélever les cerveaux pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Le PTSD est caractérisé selon les critères du DSM-5 par une persistance de différents symptômes envahissants sur une durée de plus d’un mois. Lors de la mise au point du modèle, nous serons donc tenus de montrer la persistance de différents symptômes sur le long terme. Il a de plus été montré à plusieurs reprises, au laboratoire comme dans d’autres études, que la mobilité des souris ayant subis le traumatisme était réduite lors de l’exploration dans différents contexte comparé à des souris n’ayant pas subis de traumatisme et ce plusieurs jours à plusieurs semaines après. De plus le souris montrerons des comportements de peur associé au contexte traumatique encore un mois après le conditionnement. Toutefois, les souris ne devraient pas montrer de perte de poids importante lié à l’induction du PTSD ni des signes de mal-être dans la cage d’hébergement. Enfin le modèle de PTSD a montré son efficacité chez la souris C57BL6N dans plusieurs études ultérieures. Dans ces études, les souris étaient hébergées seules au moins 14 jours avant le début des expérimentations. Nous hébergerons donc les souris en cages isolées afin de reproduire le modèle de PTSD et d’obtenir la même symptomatologie mais ceci risque d’induire un stress supplémentaire prolongé.

Devenir

Les animaux destinée à la mise au point du projet seront euthanasiés soit par injection léthale soit par asphyxie au CO2. Les souris étant isolées pour l’ensemble de la procédure afin de reproduire un modèle de PTSD existant et ayant été validée dans différentes études, il ne sera pas possible de les regrouper à la suite de cette procédure. En effet des souris regroupées après isolement deviennent agressives et tendent à se battre violemment. Les animaux ayant terminé l’expérimentation finale seront ensuite sacrifié pour prélever les cerveaux afin de réaliser l’étude immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le PTSD chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.

Réduction

Avenant : Afin de pouvoir étudier les effets d’une stimulation transcrânienne ultrasonore répétée et de se demander si cela peut être utilisée comme traitement contre le syndrome de Stress post-traumatique (PTSD), il est nécessaire d’avoir un modèle animal stable, reproductible et permettant de représenter différents symptômes de la maladie. Nos derniers résultats ont montré une ré-expérience de la peur lors de la réexposition au contexte, phénomène aussi visible lors d’un apprentissage de peur non traumatique, mais n’ont pas permis de reproduire les résultats obtenus dans d’autres études et permettant de parler de modèle de PTSD (l’évitement, la généralisation et sensibilisation de la peur, l’anxiété…). Nous avions pourtant un nombre d’animaux plus important que celui prévu pour les expériences finales. Il nous parait donc nécessaire de refaire des tests préliminaires pour valider le modèle avant de poursuivre l’étude. Nous serions de plus assurés d’avoir un protocole modélisant au mieux le PTSD. Enfin, les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=15 sujets par groupe). Les souris seront uniquement mâles, afin d’éviter les variations comportementales provoquées par le cycle menstruel de la femelle et ainsi réduire le nombre total d’animaux.

Raffinement

Le stress traumatique appliqué aux animaux, deux chocs électriques de 2sec à 1.5 mA dans un contexte inconnu, peut être qualifié de moyen, en raison de sa brièveté. Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur. Tous les animaux seront hébergés ensemble, stressés et non stressés, avec enrichissement du milieu (cabanes, smarthome® et tubes). Les expérimentateurs sont experts dans la préhension/contention des souris et sont soucieux d’éviter tout stress lors de la réalisation des procédures. Les injections quotidiennes d’antidépresseur ont été remplacées par un traitement dans l’eau de boisson. Pendant la stimulation rTUS, les animaux sont sous anesthésie gazeuse, ils sont placés sur une couverture chauffante pour éviter toute hypothermie et leurs cornées sont protégées de la déshydratation par un gel.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, par l’obtention de résultats pertinents avec cette même approche méthodologique ainsi que par l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs. En effet, la zone ciblée dans cette étude (cortex infralimbique) existe chez l’Homme (pour ce qui est du cortex moteur) ou alors sont des équivalents fonctionnels de zones existant chez l’Homme (le cortex infralimbique est un équivalent fonctionnel du cortex cingulaire antérieur subgénual BA 25 chez l’Homme). Les souris C57/BL6 seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intraveineuse d'un conjugué anticorps-médicament puis huit prélèvements de sang sur vingt-et-un jours sous anesthésie, pour mesurer la durée de présence de la molécule anticancéreuse dans le sang. Le porteur indique que les organes seront prélevés après la mise à mort afin d'éviter une seconde expérience de biodistribution. Il justifie le choix du rat plutôt que de la souris par la "nécessité" de prélèvements répétés et par son statut de modèle "obligatoire" pour les études réglementaires.

Objectifs

Les modèles animaux permettent l’étude des effets positifs et négatifs de drogues anticancéreuses à l’échelle de l’organisme. Ces études précliniques sur l’animal permettent la validation de thérapies anticancéreuses plus efficaces et moins toxiques pour le traitement des patients. Les études proposées visent à determiner la durée de présence dans le sang de l'animal (pharmacocinétique) qui est étroitement corrélé avec son activité anti-cancéreuse. L'étude proposée vise à évaluer la pharmacocinétique de conjugués anticorps-médicaments innovant développés pour le traitement de cancers solides ne possédant à ce jour aucun traitement de thérapie ciblée. Connaître ce paramètre pour un composé permet de déterminer sa fenêtre d'efficacité et donc de déterminer la dose à utiliser. L'étude proposée porte sur différents variants d'un conjugué anticorps-médicament dont l'anticorps est validé par la FDA (Food and Drug Administration) et dont le médicament est un dérivé de molécule approuvé par la FDA. Ces conjugués anticorps-médicament sont en développement pre-clinique et l'étude vise à séléctionner le composé possédant le meilleur profile pharmacocinétique afin de le qualifier pour un développement pré-clinique plus poussé dans l'objectif de l'évaluer en clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra d’étudier l’influence de l’agent masquant sur le profil pharmacocinétique du conjugué anticorps-médicament formulé en fonction de sa taille et de la molécule cytotoxique attachée. Ces études sont essentielles pour la sélection du ou des ADC (antibody-drug conjugate, conjugué anticorps-médicament) ayant la meilleure fenêtre thérapeutique, et de sélectionner le candidat médicament pour les études précliniques réglementaires avant une première administration chez l’homme.

Procédures

- une seule injection de molécule thérapeutique dans la veine caudale. -prélèvement de sang dans la veine saphène. 8 prélèvements au total sur une durée de 21 jours. Les prélèvements sont effectués sur des animaux anesthésiés avec un anesthésie/analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

- La dose administrée dans cette étude étant significativement plus faible que la dose maximum tolérée et les traitement étant stables en circulation, pas de nuisance concernant la perte de poids n'est attendue. - Injection unique d’un composé thérapeutique dans la veine caudale (degré de gravité modérée). - Prélèvement sanguins dans la veine saphène (degré de gravité modérée). Les prélèvements se font dans la veine saphène, superficielle, et n’entraîneront pas de difficultés locomotrices. - Douleur caudale si inflammation du point de prélèvement, 2h maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. L'ensemble des organes seront prélevés et conservés pour des études de biodistribution. En effet, l'étude ci-présente vise à déterminer le profile pharmacocinétique des composés, cependant un même schéma d'étude peut être effectué pour réaliser une étude de biodistribution. Le prélèvement des organes évitera donc de devoir réaliser une expérience similaire.

Remplacement

Cette étude vise à déterminer la durée de présence de nouvelles molécules dans le sang d’un organisme vivant, nécessitant ainsi l’utilisation d’un modèle animal. Des études in vitro ont été faites en amont afin de sélectionner uniquement les molécules ayant le plus grand intérêt thérapeutique pour les études in vivo.

Réduction

Le choix du rat versus la souris permet d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux pour pouvoir réaliser des prélèvements sanguins répétés. Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 10 rats par groupes. Dans une démarche de réduction, l'ensemble des organes seront prélevés et congelés pour d'éventuelles analyses de biodistribution.

Raffinement

Avant le début des procédures, les rats seront habitués aux expérimentateurs des études, afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur stress et leur détresse. Des points limites adaptés comme une surveillance quotidienne, des pesées régulières, un traitement antalgique, ont été définis pour détecter et minimiser toute souffrance, toute douleur et tout stress des animaux.

Choix des espèces

Le choix du rat pour l'étude pharmacocinétique (PK) s’explique par plusieurs raisons, la nécessité de prélèvements sanguins répétés justifie le choix du Rat par la règle des 3R. Une étude chez la souris nécessiterait de multiplier le nombre d’animaux pour réaliser les prélèvements dans des conditions éthiques. De plus, les prélèvements répétés en 48h peuvent être faits avec une seule piqure initiale, les autres se faisant par prélèvement de la goutte de sang qui se forme lorsque l’on gratte le sang séché. Par ailleurs, le Rat est un des modèles obligatoires pour les études de PK règlementaires, il est donc justifié de réaliser ces études chez le Rat plutôt que la Souris. Pour cette procédure, nous avons besoin d’utiliser des rats de 6 semaines pour avoir un poids idéal de 200g des rats au moment du traitement.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses mammaires, puis des traitements par gavage et injections pendant trois semaines et des séances répétées d'imagerie sous anesthésie, pour évaluer un agent de contraste et des immunothérapies ciblant les macrophages tumoraux. Le porteur décrit les examens d'imagerie comme non douloureux mais reconnaît que les animaux porteurs de tumeurs peuvent subir des effets délétères en fin d'étude. Il affirme qu'un modèle in vivo est "nécessaire" car ces processus seraient "trop complexes pour être reproduits artificiellement in vitro".

Objectifs

Au sein des tumeurs, les cellules cancéreuses sont associées à un micro-environnement d'une très grande hétérogénéité inter- et intra-tumorale. Ce micro-environnement, composé de protéines formant une matrice extracellulaire, de cellules endothéliales formant un réseau vasculaire, de cellules fibroblastiques de soutien, et de cellules de l’inflammation. Le microenvironnement tumoral prend une part active dans le développement cancéreux. En particulier, les tumeurs sont infiltrées de macrophages, cellules de l’immunité innée, que la tumeur «reprogramme » afin qu’ils soutiennent sa croissance et l’aident à résister aux traitements. La présence de macrophages tumoraux dans certains cancers, comme le cancer du sein, est le signe de tumeurs agressives et est associée à une plus courte espérance de vie. La possibilité de quantifier la présence des macrophages tumoraux et de visualiser leur répartition par imagerie médicale représenterait donc une avancée majeure pour le diagnostic des tumeurs, et pour le pronostic des prises en charges thérapeutiques. Par ailleurs, certaines molécules chimiques peuvent « transformer » les macrophages pro-tumoraux en macrophages cytotoxiques luttant contre les cellules cancéreuses. Ils représentent ainsi une cible thérapeutique innovante. Au cours de ce projet, nous proposons (1) de mettre en place des modèles murins de cancer du sein, pour (2) évaluer le tilmanocept, un agent de contraste d’imagerie médicale permettant de visualiser les macrophages pro-tumoraux, et (3) évaluer par imagerie non invasive multimodale des thérapies ciblant l’immunité anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Le cancer du sein figure toujours en tête des cancers les plus meurtriers chez les femmes, à l’échelle mondiale comme en France. En particulier, les cancers du sein triple négatifs, non hormono-dépendants, généralement diagnostiqués chez les femmes de moins de 40 ans, représentent toujours un défi thérapeutique. Pour y répondre tout en limitant les effets secondaires des traitements, de nouvelles approches thérapeutiques ciblant non seulement les cellules cancéreuses mais aussi leur micro-environnement sont désormais à l’étude. Ce projet permettra de mieux comprendre et d'évaluer une approche d'immunothérapie innovante dans le cadre des cancers du sein. Par ailleurs, le développement d'un agent de contraste d’imagerie nucléaire médicale spécifique des macrophages pro-tumoraux est important pour mieux caractériser les cancers et suivre plus finement les traitements d'immunothérapie. Au delà des cancers, cet agent de contraste d'imagerie pourrait également être utile dans les événements cardiovasculaires, les troubles métaboliques et autres pathologies, où les macrophages jouent également un rôle essentiel dans l'évolution de la maladie.

Procédures

Sauf pour les souris transgéniques PyMT, la mise en place des modèles cancéreux nécessite l'injection de cellules cancéreuses (une unique injection de 100 µL en sous cutané dans le flanc des souris nude et le coussinet adipeux mammaire des souris BalbC). Cette intervention de cinq minutes environ se fera sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Nous aurons quatre groupes de traitement (contrôle, inhibiteur du CSF1, anti-PD1 et combinaison). Ces molécules sont déjà autorisées en clinique pour d'autres types de tumeurs. L'inhibiteur du CSF1 sera administré par gavage 3 fois par semaine pendant 3 semaines (500 μL pour une souris de 25 g). Le groupe contrôle recevra la solution de dilution (10% de DMSO et 90% d'huile d'olive). L’anticorps anti–PD-1 sera injecté par voie intra-péritonéale 2 fois par semaine pendant 3 semaines (50 μL pour une souris de 25 g). Le groupe contrôle recevra du sérum physiologique. Ces administrations se feront chez l'animal vigile et durent de 1 à 2 minutes. Les procédures d'imagerie (2 fois par semaines pendant 4 semaines) sont réalisées sur animaux anesthésiés. Il s'agit de procédures non invasives et non douleureuses. Les animaux sont anesthésiés (1 à 2h ) uniquement pour ne pas qu'ils ne bougent. Avant l'examen de TEP-TDM-US, soit une fois par semaine pendant 4 semaines les glycémies de tous les animaux seront prises sur les animaux anesthésiés par ponction de la veine caudale. Cette mesure se fait à l'aide d'un glucomètre commercial (Accu-chek Performa) associé à des bandelletes et ne nécessite qu'une gouttelette de sang de quelque microlitres.

Impact sur les animaux

La procédure potentiellement douloureuse de ce projet est l'injection de cellules cancéreuses en sous cutané dans le flanc ou dans le coussinet adipeux mammaire. Elles seront réalisées sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie réalisés ensuite sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. L'inhibiteur du CSF1 (pexidartinib) et l'anticorps anti–PD-1 sont autorisés en clinique. Il n'a pas été décrit dans la littérature d'effets secondaires nuisibles chez la souris aux doses et à la durée de traitement retenues dans ce projet. Un contrôle attentif de l'état général des souris sera cependant mis en place. Les animaux inclus dans l'étude seront, par contre, porteurs de tumeurs, ce qui peut amener en fin d'étude à des effets délétaires dûs à la présence des lésions cancéreuses. Les animaux seront donc surveillés avec attention.

Devenir

A la fin de l’étude, au bout de trois semaines de traitement et le lendemain de la dernière acquisition d’imagerie, chaque animal de ce lot sera mis à mort par dislocation cervicale après sédation à l'isoflurane. L'euthanasie des animaux permettra d'éviter toute souffrance inutile à ces animaux porteurs de tumeurs, ainsi que le prélèvement des tumeurs pour valider les suivis par imagerie non invasive avec des analyses ex vivo.

Remplacement

Les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal. Ce projet ayant pour but d'étudier le microenvironnement tumoral et les interactions au sein de la tumeur entre les cellules cancéreuses et différents types de cellules de l'inflammation, il est nécessaire d'utiliser un modèle in vivo, ces processus étant trop complexes pour être reproduits artificiellement in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide du logiciel disponible sur le site MF-Calc de calcul statistique pour l'expérimentation animale de l'Université de Lyon de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisant statistiquement pour conclure sur l'efficacité anti-cancéreuse de nos approches thérapeutiques et diagnostisques. La méthode d'imagerie étant non invasive et non douloureuse, les animaux pourront être suivis au cours du temps et les paramètres étudiés seront mesurés plusieurs semaines d'affilée chez le même animal.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux sont réalisées sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie au centre du projet sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé pour les études en cancérologie, et nous permettra de comparer nos résultats à ceux présentés dans la littérature. Les appareils d'imagerie dont nous disposons sont adaptés spécialement à l'étude des rongeurs. Nous utiliserons 3 espèces de souris de façon à obtenir quatre modèles de cancer du sein présentant des caractéristiques génotypiques et phénotypiques différentes. Les souris nude, immunodéficientes pour les lymphocytes T mais possédant des cellules de l’immunité innée et des lymphocytes B fonctionnels nous permettrons l'étude de cellules humaines. Elles permettront d'obtenir un modèle simplifié pour étudier le rôle des macrophages dans la croissance tumorale et notre capacité à suivre l'effet de leur repolarisation par imagerie. Afin de pouvoir étudier également l'interaction des macrophages et des lymphocytes T, le développement d'un modèle immunocompétent, les souris BAlbC allogreffées avec des cellules cancéreuses murines, est nécessaire. Enfin les souris transgéniques PyMT représentent un modèle plus complexe de développement cancéreux. Adulte de 6 semaines car c’est l’âge ou les animaux sont de jeunes adultes ayant atteints la maturité, ce qui permet de s’affranchir des problèmes liés à l’âge. C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.

192 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les poissons sont exposés par bain à la bactérie Aeromonas salmonicida et subissent deux prises de sang sous anesthésie, pour mettre au point une infection expérimentale par balnéation et déterminer la dose létale médiane. Le porteur indique que l'infection peut provoquer un mal-être allant de l'inconfort à la douleur, les poissons moribonds étant retirés et tués par surdosage d'anesthésique. Il justifie le recours aux animaux en affirmant que l'évaluation d'un antibiotique ou d'un vaccin "ne peut se faire que sur animaux vivants".

Objectifs

Le projet FEAMP Medic'eau vise à optimiser les données posologiques des antibiotiques et les conditions d'administration des vaccins utilisés en aquaculture afin d'améliorer leur efficacité et de réduire l'usage d'antibiotiques en élevage aquacole

Bénéfices attendus

Nous maitrisons actuellement les infections expérimentales à A. salmonicida chez la Truite arc en ciel par administration par voie intra-musculaire. Cependant, ces modalités d'infection sont éloignées des modalités naturelles

Procédures

Prises de sang sur animaux anesthésiés. Prélèvement deux fois (T0 et Tfinal) de 200 µl de sang. exposition à une infection bactérienne

Impact sur les animaux

Les manifestations cliniques de l'infection expérimentale peut entrainer du mal être chez le poisson allant de l'inconfort à la douleur;

Devenir

L'euthanasie des poissons est prévu en fin de protocole, pour des raisons notamment sanitaire (impossibilité de relacher ou réutiliser des poissons potentiellement infectés par A. salmonicida)

Remplacement

L'objectif du projet Medic'eau étant d'évaluer l'efficacité d'un traitement antibiotique et/ou de la vaccination contre la furonculose, cela ne peut se faire que sur animaux vivants.

Réduction

l'objectif du protocole est de mettre au point le challenge infectieux par balnéation permettant de déterminer la DL 50. Afin de vérifier que les poissons survivants ont bien été infectés, une analyse immunologique sérique sera effectuée sur chacun des poissons. Du fait de la variabilité individuelle importante de certains paramètres immunitaires, les modèles statistiques avec un risque alpha de 0,05 et une puissance de test de 95% préconisent des lots de 10 poissons nécessaires/restant en fin d'expérimentation

Raffinement

Les animaux seront observés 2 fois par jour durant toute le durée du protocole (4 semaines). Les points limites sont d'une part les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène 1 cm2) seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés par surdosage d'anesthésique.

Choix des espèces

La truite arc en Ciel est l'hôte naturel d'Aeromonas salmonicida Les truites utilisées pèseront environ 200g. La furonculose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage (alevins, portion -200-250g- et grosse truite > 1kg). Sur le terrain les problématiques sont plus importante chez les truites pesant plus de 1 kg car elles arrivent en fin de production. Du fait du matériel de la station aquacole (taille des bassins), il ne nous est pas possible d'élever des truites arc en ciel de cette taille (> 1 Kg) en nombre suffisant et pour permettre l'aquisition de résultats répétables. L'étude sur des poissons de poids de 200 g est un bon compromis entre le poids et le nombre de poissons pouvant rentrer dans l'étude. A ce poids (200g) les animaux sont considérés comme physiologiquement proche des animaux d'un poids plus élevé > 1 Kg (hors période de gamétogènèse). Les truites utilisées seront des femelles triploides, ne rentrant pas en gamétogènèse, et représentant le type de truite arc en ciel le plus élévée en aquaculture.

264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit cinq injections intrapéritonéales, subit une incision de 2,5 cm dans le muscle de la patte et un prélèvement de 100 mg créant une perte musculaire d'environ 20%, avant qu'un hydrogel expérimental ne soit déposé dans la plaie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne peut se substituer aux animaux et qu'un modèle physiologique est "nécessaire" pour valider la preuve de concept. Les retombées annoncées pour des personnes blessées, militaires et accidentés, restent renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat étant de caractériser les hydrogels sur la cicatrisation.

Objectifs

L’ingénierie tissulaire se base sur l’utilisation de biomatériaux reproduisant la matrice extracellulaire native en fournissant un support aux cellules et à la formation de nouveaux tissus. Les biomatériaux peuvent orienter les phénotypes cellulaires et guider la régénération de tissus fonctionnels à travers des propriétés mécaniques modulables. Ils sont donc de plus en plus étudiés comme nouvelle stratégie de régénération des tissus et organes lésés. Parmi ces biomatériaux, les hydrogels, sont des réseaux tridimensionnels de polymères hydrophiles. Leurs capacités d’hydratation et leurs propriétés mécaniques ajustables en font des biomatériaux attractifs. Si l’utilisation potentielle d’hydrogels comme supports de la régénération musculaire est étudiée de façon croissante, des difficultés persistent en regard de la qualité et fonctionnalité du tissu formé. De fait, peu d’études montrent l’obtention d’un muscle fonctionnel – permettant la contraction – suite à une plaie volumétrique. La régénération du muscle est basée sur la prolifération et la différentiation de cellules souches musculaire qui une fois activées par l’inflammation liée à la création de la plaie, peuvent coloniser la plaie et reconstruire les fibres musculaires endommagées. La bonne cicatrisation repose sur une coordination efficace de tous les acteurs cellulaires impliqués afin de retrouver l’homéostasie du tissu. Les plaies profondes graves entraînant une perte musculaire volumétrique significative provoque donc une altération fonctionnelle permanente et handicapante. Les conséquences pour les personnes affectées (militaires, accidentés, victimes) sont très importantes et il n’existe actuellement aucune solution clinique permettant de restaurer la fonctionnalité des tissus lésés. C’est dans ce contexte que ce projet s’intéresse à la régénération structurelle et fonctionnelle du muscle squelettique en cas de lésion en utilisant des hydrogels injectable et poreux innovants.

Bénéfices attendus

Cette approche permettra d’identifier des biomatériaux à utiliser à des fins biomédicales. Une fois implantés au niveau du tissu musculaire lésé, nous déterminerons si ces hydrogels sont capables de mimer l’environnement cellulaire, améliorant ainsi la réparation fonctionnelle des tissus et organes, en particulier le tissu musculaire.

Procédures

5 injections intrapéritonéales (traitement anti-douleur et anesthésie), sous anesthésie; incision de 2.5 cm dans le muscle qui loge le tibia et prelevement de 100mg de muscle et enfin traiter cette plaie à l'aide des hydrogels à tester.

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation réalisée pourra entraîner des douleurs localisées au niveau de la zone d’implantation et une plaie volumétrique d’environ 20% pourra potentiellement créer dans un 1er temps (la 1ere semaine) une gêne pour marcher/se déplacer. Les dommages de types lésions musculaires sont souvent accompagnés d’une inflammation passagère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser la zone d'implantation de l’hydrogel.

Remplacement

Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour la réalisation de ce projet car la régénération du muscle repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et les systèmes immunitaires et vasculaires ainsi que sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de la biocompatibilité des hydrogels pour les cellules musculaires ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle physiologique complexe est nécessaire pour permettre d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Réduction

Cette étude est menée dans un but prospectif. Ainsi l’utilisation de 7 rats par groupe et par temps est considérée comme suffisant pour une validation de preuve de concept. Elle constitue en soi une réduction du nombre des animaux pour répondre à la question posée. La présence dans les 2 premiers bras de la procédure d'étapes d'évaluations décisionnelles engageant la poursuite de la procédure, nous permettra aussi de réduire le plus possible le nombre d’animaux.

Raffinement

Avant le début de chaque procédure, les animaux suivront une période d’acclimatation d’au moins une semaine. Les animaux seront observés et pesés quotidiennement pendant 1 semaine suivant la procédure expérimentale. La mise en place d’une grille de score (incluant la mobilité de l’animal, sa prostration ainsi que son niveau d’interaction sociale) et d’une fréquence de surveillance des animaux adaptée à l’étude, permettra d'éviter toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera effectuée au moins 4 fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal et du poids corporel deux fois par semaine Une attention particulière sera portée au comportement moteur, l’activité, l’accès à la nourriture et à l’eau et à l’intégrité du pansement. Suite à la procédure de chirurgie, les animaux seront surveillés régulièrement (4 fois par semaine) afin d’identifier l’apparition de troubles du comportement pouvant traduire une douleur ou un stress néfaste. Les fils de suture non résorbables seront retirés au bout de trois semaines tandis que l’intégrité du pansement sera monitorée à chaque observation. Si un animal a retiré son pansement, la plaie sera désinfectée et un nouveau pansement mis en place. Les cages seront enrichies avec de la nourriture humide au cours de la première semaine post-opératoire, pour prendre en compte les difficultés éventuelles de mobilité. Leur ajout sera constamment ré-évalué au cours de la surveillance dans les semaines suivantes. De même, des analgésiques locaux seront appliqués aux abords de la plaie chirurgicale juste avant la suture et en cas de signe de douleur et/ou si le pansement a été retiré (lidocaïne 5mg/kg, 1-2 ml).

Choix des espèces

Etude basée sur un modèle de perte volumétrique musculaire standardisée chez le rat [1]. De plus, pour cette étude, il est nécessaire d’avoir un muscle permettant la mise en place d’un défaut pouvant accueillir un volume d’au moins 100µL pour que le système d’injection soit opérant (tests déjà réalisés sur rats mis à mort pour la standardisation de la procédure). [1]X. Wu, B. T. Corona, X. Chen, and T. J. Walters, “A Standardized Rat Model of Volumetric Muscle Loss Injury for the Development of Tissue Engineering Therapies,” Biores. Open Access, vol. 1, no. 6, pp. 280–290, 2012. L’objectif du travail étant d’observer l’effet de biomatériaux dans les processus de cicatrisation, les rats utilisés dans le cadre de ce protocole seront âgés de 2 mois (Jeunes adultes) en début de protocole. Sexuellement mature pour les males (65-110jours) Sprague Dawley or Wistar (ceux qui sont préconisés pour aspect chirurgicaux). Les temps d’implantations ont été choisis pour caractérisation du tissu à 3 moments clés de la cicatrisation : - 3 semaines : fin de l’inflammation aigue et différentiation des cellules satellites en cours - 6 semaines : possibilité de quantification du nombre de fibres musculaires au sein de l’hydrogel - 3 mois : Validation du bon remodelage de la plaie.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, une autre un cancer colorectal chimiquement induit provoquant colite, diarrhée et saignements, pour étudier le rôle du gène Fpr1 dans la réponse à la chimiothérapie. Le porteur prévoit une mise à mort dès qu'une tumeur atteint 225 mm² ou qu'une souris perd plus de 20 % de son poids, et affirme que la réponse immunitaire au cancer ne peut s'étudier qu'in vivo. Les retombées annoncées pour les patients atteints de cancer du sein ou colorectal restent situées en amont de toute application.

Objectifs

Les dernières années ont vu l'émergence du concept de l'activation du système immunitaire contre le cancer, qui à son tour détermine le succès à long terme des traitements anticancéreux. Nous allons étudier comment compenser la perte de fonction du gène Fpr1 pour restaurer l’efficacité de la chimiothérapie in vivo. Les modèles expérimentaux in vivo sont les seuls moyens d’approche possibles car la réponse immunitaire n’a pas lieu dans les modèles in vitro ou ex vivo. Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-cancéreux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-carcéraux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal. Nous préconisions que l’accomplissement de ce projet fournira des connaissances sur la régulation de la réponse immunitaire aux cancers pour la mise en place de stratégies thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux seront soumis a : - Procédure 1 : L’injection de cellules tumorales en sous cutané sur l’animal anesthésié par inhalation d’isofluorane L’injection des traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile - Procédure 2 : Un suivi du poids de l’animal vigile à l'aide d'un récipient posé sur une balance L’induction de cancer colorectal par l’injection des traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile et l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson en 3 cycles de 4 jours. Ce modèle aura pour conséquence l’induction d’une colite.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis a : - Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie - L’injection des traitements cités par voie intrapéritonéale par contention de l’animal vigile. Certains de ces traitements entrainent une altération de l’état de l’animal : perte de poids (inférieure à 20%) ainsi qu’une diarrhée passagère et d’éventuels saignements dans les feces. - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine - Un suivi du poids sur l’animal vigile à l'aide d’une balance selon le planning décrit Ces différentes manipulations pouvant entrainer du stress chez l’animal, tout sera mis en œuvre pour le limiter. Notamment, l’injection de cellules tumorales sera faite sous anesthésie sur le dos de l’animal afin de réduire les phénomènes de gêne que peut engendrer la croissance tumorale. Les injections de traitements et le suivi de la croissance tumorale pseront effectuées par contention de l’animal vigile, technique parfaitement maitrisée par les expérimentateurs dans le but de limiter l’exposition des souris à des anesthésiques.

Devenir

Les souris seront euthanasiées dès l’atteinte des points limites suivants : lorsque les tumeurs atteindront 225 mm2, en cas de diarrhée prolongée (>4 jours); en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial; comportement général anormal (prostration, auto-mutilation, perte de fourrure) ou à la fin de l’expérience 80 jours après l’injection d’AOM, l’euthanasie étant requise pour les analyses post-mortem.

Remplacement

La question scientifique ne peut être abordée qu’in vivo car il n’est pas possible d’étudier l’implication du système immunitaire sur le développement du cancer dans des systèmes in vitro.

Réduction

Nous souhaiterons effectuer cette étude sur un total de 540 souris pour permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Notamment, les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si nous constatons que notre hypothèse n’est pas confirmée par nos résultats expérimentaux. Le modèle choisit est très bien documenté, permettant ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous utiliserons des souris transgéniques viables, fertiles, de taille normale et ne présentent pas d'anomalies physiques ou comportementales. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et/ou tunnels en cartons). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées dans cette étude. afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation. Les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Nous utilisons principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce.

30 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie orale ou intranasale, pesés chaque jour, puis tués par prélèvement sanguin intracardiaque sous anesthésie pour autopsie, afin de valider la voie orale d'infection en vue d'un futur essai de probiotiques contre le Covid-19. Le porteur annonce une perte de poids limitée à 5-8 % et une absence de signes cliniques, en s'appuyant sur ses expériences antérieures. Ce projet est présenté comme une étape préliminaire de calage du modèle avant l'étude principale.

Objectifs

Le présent projet vise à valider la voie orale comme voie d'infection par le SARS-CoV2 chez le hamster. Ce projet représente un travail préliminaire à un autre projet dont l'objectif sera de caractériser l'efficacité de bifidobactéries (groupe de bactéries vivant à l'état naturel dans les intestins) dans la lutte contre les infections au SARS-CoV2, grâce à leur potentiel pouvoir d'inhibition de la fixation du virus SARS-CoV2 sur ses cellules cibles. Des expérimentations in-vitro sont actuellement en cours pour valider cette hypothèse. En cas de succès, et pour valider cette approche in-vivo, il sera nécessaire que les bifidobactéries testées se retrouvent sur le site d’infection virale. N’étant pas administrables par voie intra-nasale, il sera donc nécessaire d’administrer les bifidobacteries et le virus SARS-CoV2 par voie orale. En préalable, il est donc nécessaire de valider cette voie d’infection du SARS-CoV2 sur le modèle hamster qui sera utilisé.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la voie orale d'infection chez le hamster syrien et de valider la dose infectante choisie. Différents paramètres seront étudiés : - courbe de poids - quantification du virus dans une sélection d'organes d'intérêt (Appareil respiratoire supérieur, rate, poumons) par culture cellulaire et quantification de matériel génétique - lésions pulmonaires par immunohistologie - séroconversion. Ces paramètres serviront de référence lors des expérimentations visant à évaluer le pouvoir des souches probiotiques à prévenir le Covid-19.

Procédures

Groupe témoin + groupe infecté par voie orale : les 18 animaux seront infectés à J0, par voie orale sans anesthésie, avec 200µl de virus à la dose de 10^5 TCID50. Groupe témoin infection i.n: Les 12 hamsters seront soumis à une légère anesthésie gazeuse (isoflurane 5%) afin de leur admnistrer à J0 (à l'aide d'une micropipette) par voie intranasale 40µL de virus à la dose de 10^5 TCID50 (soit 20µl par narine). Les animaux seront manipulés quotidiennement pour une pesée. L'ensemble des animaux seront anesthésiés (J+4 ou J+7) à l'isoflurane puis par injection de kétamine/xylazine afin de réaliser une prise de sang intracardiaque terminale avant autopsie.

Impact sur les animaux

Hormis une perte de poids des hamsters limitée à 5-8% (données issues de nos précédentes expériences), et dont le pic est attendu à J+6, les hamsters ne développent pas de signes cliniques lorsqu'ils sont infectés. A partir de J+6, les hamsters regagnent du poids

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort afin de réaliser une autopsie et une collecte d'organes/sang pour étudier la pathogénie du SARS-CoV2.

Remplacement

Des experimentations préliminaires in-vitro sont encours pour démontrer l'activité anti-protéase in-vitro sur des cellules caco2. Néanmoins, l'évaluation de la pathogénocité d'un virus (multiplication virale, distribution, lésions associées) ne peut se faire in-vitro et nécessite de passer par le modèle animal.

Réduction

le nombre d'animaux par groupe a été fixé à 12 afin d'avoir 6 animaux par point de mise à mort (J+4 et J+7) qui est le minimum généralement requis pour obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs . Seul Le groupe témoin ne comporte que 6 animaux, tous mis à mort à J+7 (pas de sacrifice à J+4).

Raffinement

Ces hamsters seront hébergés en cage de 2 à 3 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.

35 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont maintenus par restriction alimentaire à 90 % de leur poids pour les inciter à rapporter de la nourriture à leur nid pendant un mois d'apprentissage, avant mise à mort et prélèvement du cerveau pour un marquage du gène c-fos, afin d'identifier les régions cérébrales de l'intégration des trajets. Le porteur héberge individuellement une partie des rats et prévoit un retour à l'alimentation libre au-delà de 15 % de perte de poids. Il présente ce projet fondamental comme une remise en question possible de l'hypothèse de la carte cognitive dans la navigation.

Objectifs

La navigation spatiale chez les mammifères repose sur la perception et le traitement de multiples informations sensorielles dont la source peut être environnementale (informations allothétiques : visuelles, olfactives, auditives) ou interne à l'animal (informations idiothétiques générées par le déplacement: vestibulaires, tactiles, proprioceptives, etc.). La conjonction de ces informations va permettre à l’animal de mettre en œuvre des stratégies spatiales variées lui procurant une flexibilité comportementale. L'importance des informations idiothétiques et le rôle des régions cérébrales dans le traitement de ces informations ont longtemps été sous-estimés et restent méconnus. Des travaux comportementaux ont montré que les mammifères sont capables au cours de leur déplacement de revenir à un lieu de référence, par exemple leur "nid", en n'utilisant que des informations idiothétiques. Cette capacité est appelée intégration des trajets car elle repose sur l'intégration par le système vestibulaire des accélérations linéaires et angulaires lors du mouvement ce qui aboutit au calcul et à la mise à jour d'un vecteur pointant sur le lieu de retour. Dans une série d’études lésionnelles, nous avons montré que l'intégration des trajets implique plusieurs régions du cerveau, comme le cortex pariétal et le cortex entorhinal. Dans le cortex entorhinal, une population neuronale (les "cellules-grilles") pourrait être le centre de l’intégration des trajets du cerveau. Cette hypothèse est séduisante mais le cortex entorhinal n'est certainement pas la seule région du cerveau impliquée. Le traitement des informations idiothétiques dans le cerveau implique un réseau nerveux étendu mais notre connaissance des contours de ce réseau reste très lacunaire. L'objectif du projet est d'identifier l'ensemble des régions impliquées dans ce réseau en faisant un marquage de l'expression du gène d'expression précoce c-fos au cours d'une tâche d'intégration des trajets. Nous faisons l’hypothèse que la tâche implique une activation rapide du gène c-fos et donc une synthèse de proteines c-fos en particulier dans les structures sollicitées par le processus d’intégration des trajets.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront d'identifier les structures cérébrales impliquées spécifiquement dans la mise en œuvre de l'intégration de trajet. Ces résultats nous permettront également de tester l'hypothèse selon laquelle l'intégration de trajet peut se faire à partir d'un autre point de l'environnement que celui à partir duquel l'animal initie son trajet. Ce dernier résultat, s'il est confirmé, nous permettrait de remettre en question le recours quasi-systématique à une hypothèse alternative (existence d'une carte cognitive) pour expliquer les comportements de navigation complexes observés chez les animaux (humains compris).

Procédures

Procédure comportementale : Apprentissage d'une tâche d'integration des trajets. Procédure se déroulant sur un mois environ à raison de 2 essais de durée variable (mais n'excédant pas 5 minutes chacun) par jour et par animal.

Impact sur les animaux

Afin d'assurer un contrôle individuel de la prise alimentaire, les animaux des groupes 1, 2 et 4 seront hébergés individuellement. Cette mesure particulière d'hébergement sera maintenue durant une période la plus courte possible et les rats ainsi isolés pourront avoir des contacts visuels, auditifs et olfactifs avec leurs congénères. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort (n=35) par injection d'euthanasiant (Pentobarbital sodique, 200 mg/kg, IP, soit 0.5 mL/kg d'EUTHASOL VET. SOLUTION INJECTABLE) après sédation profonde (Médétomidine, 500 μg/kg, IP, soit 0.5 mL/kg pour le DOMITOR). La mise à mort permet le prélèvement des cerveaux afin de réaliser le marquage de l'expression du gène d'expression c-fos par immunohistochimie. La quantification de ce marquage est l'objectif de l'étude car il permettra d'identifier les structures nerveuses impliquées dans l'intégration des trajets.

Remplacement

La nature même des expériences proposées dans ce projet ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, ces expériences reposent sur l'exploration de l'environnement effectuée par les animaux en réponse à diverses manipulations environnementales et ne peuvent être réalisées à partir de modèles in vitro, in silico ou ex vivo. Ces expériences, du fait du caractère invasif des procédures de collecte des données (prélèvement du cerveau afin de révéler le marquage de certaines structures nerveuses), ne peuvent pas non plus être conduites chez le sujet humain.

Réduction

Cette étude nécessitera un total de 35 rats. Deux groupes expérimentaux et deux groupes contrôles sont indispensables pour permettre de conclure sur l'implication des structures dans les processus ciblés : Un groupe expérimental (n=8) entraîné dans la tâche d'intégration des trajets, un groupe contrôle (n=8) entraîné dans une tâche spatiale ne nécessitant pas l'intégration des trajets, un groupe contrôle (n=6) ne réalisant aucune tâche (explorant librement l'environnement pendant 3 mn) et un deuxième groupe expérimental (n=8) entraîné dans une tâche alternative d'intégration de trajet. Enfin, 5 animaux sont ajoutés au total pour pallier d'éventuels problèmes de marquage immunohistochimique (aux alentours de 15%). Le nombre d'animaux dans ces groupes permet de tenir compte de la variabilité individuelle inhérente aux études comportementales et d'obtenir des résultats fiables. L'analyse des résultats comportementaux reposera essentiellement sur l'utilisation de tests statistiques de proportion (type Chi 2). En ce qui concerne l'analyse des résultats issus des marquages immunohistochimiques, plusieurs scenari sont envisagés. Si la normalité des distributions n'est pas avérée, nous utiliserons des tests statistiques non-paramétriques tels que le test de Kruskal-Wallis. Si la normalité des distributions est avérée mais pas l'homogénéité des variances, nous utiliserons l'ANOVA à un facteur de Welch (associé au test post-hoc de Games-Howell). Si la normalité et l'homogénéité sont avérées, nous aurons recours à un test ANOVA à un facteur (associé au test post-hoc de Tukey). Ce plan d'analyse statistique nous permettra d'exploiter les données quelque soit l'ampleur de la variabilité inter-individuelle tout en conservant des effectifs d'animaux réduits.

Raffinement

La tâche comportementale repose essentiellement sur le comportement spontané des rongeurs à explorer un environnement et à récupérer un morceau de nourriture pour le ramener dans son nid et le consommer. L'animal apprend à faire cette tâche sans contrainte externe ce qui réduit considérablement son état de stress. L'hébergement des animaux s'effectue dans le respect des protocoles d'enrichissement validés par la Structure de Bien-Etre Animal de notre établissement d'expérimentation. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle animal privilégié pour les études sur la navigation spatiale du fait de ses excellentes capacités d'orientation spatiale. Nous avons montré que ces animaux sont capables de réaliser la tâche d'intégration des trajets dans sa version classique (Groupe 1). L'étude de l'activation des réseaux de structures nerveuses au cours d'un comportement de déplacement dans l'environnement ne peut pas être réalisé en utilisant des procédures in vitro, ex vivo ou in silico. Les animaux seront des rats adultes agés de 4 mois. Les capacités d'apprentissage chez ces animaux de cet âge sont optimales.

250 souris "humanisées" vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur une centaine de jours, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des cellules sanguines humaines et des anticorps monoclonaux, pour tester lesquels renforcent la réaction du greffon contre la tumeur. Le porteur prévoit une mise à mort dès qu'une tumeur atteint 2 000 mm³ ou qu'une souris perd 20 % de son poids, et décrit des tumeurs pouvant s'ulcérer et se nécroser. Il justifie le recours à ces souris immunodéficientes, seules à accepter des cellules humaines, comme une alternative aux primates en recherche préclinique.

Objectifs

En transplantation, l'effet greffon contre la tumeur a été observé après une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Le greffon contient des cellules lymphocyte T du donneur qui peuvent être bénéfiques pour le receveur en éliminant les cellules malignes résiduelles. Dans le but d'évaluer le potentiel thérapeutique d'anticorps monoclonaux sur l'effet greffon contre la tumeur nous testons in vivo plusieurs candidats médicamenteux dans un modèle de greffe contre la tumeur chez la souris immunodifficiente. Ces anticorps monoclonaux ont été générés et validés in vitro mais les études in vivo sont indispensables pour pouvoir envisager des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus à l’issue de cette étude, permettront de : - Comparer les résultats in vivo aux data in vitro - Déterminer le potentiel thérapeutique des anticorps testés sur les réponses immunes dans le contexte de cette maladie - Comprendre les différents mécanismes d’action mis en place - Valider et sélectionner pré-cliniquement la meilleure molécule avant d’envisager les tests cliniques

Procédures

- Rasage des souris la veille de l’injection des cellules tumorales, cette action s’effectuera sur animal vigile (2min/animal)- Injection des cellules tumorales en sous-cutanée (sur toute les souris) sous anesthésie gazeuse (10min/animal), 8 jours avant le début de protocole - une fois que les tumeurs sont détectables par palpation injection des cellules sanguine humaines en intraveineuse sur animal vigile (hormis le groupe de tumeur seul) 5min/animal - Injection des traitements en intra-péritonéal sur animal vigile (1min/animal) en fonction des groupes, deux fois par semaine - Prélèvement sanguin (100µl de sang,) tous les deux semaines sur toutes les souris (10min/souris)sous anesthésie gazeuse - Euthanasie sous anesthésie général et dislocation cervical de toutes les souris. A préciser que la durée totale de l'expérience est de 100 jours, chaque intervention sera réalisées à part dans un instant t. A noter que l’utilisatrice est une personne expérimentée en procédure animale, ce qui réduira les temps d’intervention et par conséquence moins de stress et d’angoisse animal

Impact sur les animaux

Ce modèle murin de GvT consistera à injecter des cellules tumorales en sous-cutanée, ce qui engendre quelques paramètres à surveiller régulièrement qui concerne la masse tumorale et l’animal lui-même. *La masse tumorale : les cellules seront injectées localement en sous-cutanée, la tumeur prendra de volume au fur à mesure, une surveillance quotidienne sera appliquée pour vérifier si la tumeur pousse ou pas en mesurant la longueur et la hauteur pour calculer le volume ? ; si elle envahie les tissus voisins en palpant la masse tout en cherchant les contours et des éventuelles adhérences avec le tissu cutané ? si elle s’ulcère, une ulcération de la tumeur sera visible l’œil nu, la tumeur sera rouge et présente un point de nécrose, à noter que le flanc de l’animal sera toujours rasé pour faciliter l’observation. *Le poids : une perte de poids est un signe d’un mal-être, souffrance ou douleur ; le poids sera suivi 2-3 fois par semaine, une perte supérieure ou égale à 20% est considéré comme point limite qui oblige l’euthanasie de l’animale. *Comportement : le comportement d’un animal souffrant d’un mal-être sera modifié, une baisse d’activité, une voussure de dos, pelage ébouriffé, froidure et pâleur des extrémités… tous ces critères indiquent une douleur. L’animale sera soulagé par une l’administration de l’anti-douleur adéquat et disponible dans notre laboratoire. A savoir que les animaux qui souffrent de manière chronique vont être suivis avec une attention particulière non seulement pour soulager leur souffrance, mais aussi parce qu’ils nécessitent une gestion et un mode de vie particuliers (manipulation délicate, accès facile à l’eau et à la nourriture, réduire le nombre de souris dans la cage, administration d’anti-douleur Ci-dessous une liste des points limites qui déterminera l’euthanasie de l’animal La masse tumorale : • L’évolution de la croissance tumorale est un des paramètres clés de cette étude, mais la masse tumorale ne doit pas interférer les fonctions normales de l’animale ni induire une souffrance pour son déplacement. Un volume tumoral supérieur ou égal à 2000mm3 est un point limite. • Une ulcération/infection à l’emplacement de la tumeur • Un envahissement des tissus voisin par la tumeur localisée La perte de poids • Une perte supérieure ou égale 20 % du poids du corps d’un animal normal (en tenant compte de la masse tumorale) Comportement anormale • Une détresse, un mal-être

Devenir

Mise à mort

Remplacement

Des études fonctionnelles ont été réalisées in vitro à partir de cellules humaines, les résultats sont prometteurs mais sont limités par l’absence du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire et ne peuvent remplacer les études in vivo. Il est donc nécessaire de tester l’efficacité immuno-régulatrice des molécules d’intérêt dans un modèle in vivo proche de l’Homme. Une alternative solide à l’utilisation de primates en recherche préclinique est le modèle de souris dites « humanisées ».

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est réduit à 25, nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Les souris seront divisées en 10 groupes (25 souris/groupe). Le groupe témoin recevra un isotype contrôle ou PBS, les autres groupes seront traités avec les différents anticorps test. Le nombre de groupes a été réfléchi afin d’avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Le nombre total des animaux est de 250.

Raffinement

Afin de respecter le bien-être animal, au début de protocole les souris seront réparties par groupe de 3-5 souris par cage, avec des moyens d’enrichissement (frisottis, dôme et tunnel). Une surveillance quotidienne des animaux en protocole, pour déceler une douleurs, souffrance ou mal-être. Les animaux souffrants d’une douleur seront séparés des autres (étant donné qu’il existe toujours un animal dominant dans une cage, qui empêche l’animale faible d’accéder à la nourriture ou l’eau. En séparant les animaux faibles dans des cages offre une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Une administration d’analgésique buprénorphine 0.05mg/kg en sous cutané deux fois par jour pour tout animale souffrant, à noter que en cas de point limite (souffrance qui ne sera pas gérable par anti-douleur) l’animale sera euthanasié. Les différents points limites, une perte de poids de 20%, un volume tumoral de 2000mm3 ou montrant des signes physiques caractéristiques d’un mal-être seront euthanasiés (inhalation d'isoflurane suivie par une dislocation cervicale).

Choix des espèces

Les propriétés immuno-régulatrices de l’anticorps ne peuvent être testées que dans un modèle primate ou humanisé. Nous avons choisi les souris NOD/SCID/Il2R gamma-/- déficientes en cellules immunes car elles permettent l'acceptation de cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules et tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire. Ces souris sont issues de l'animalerie Charles River et sont reproduites au sein notre animalerie. A noter également que cette espèce animale présente une facilité de reproduction, d'hébergement et de manipulation.

152 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont vaccinés par voie intramusculaire ou orale puis infectés par la bactérie Campylobacter, avant mise à mort et prélèvement d'organes, pour optimiser un vaccin destiné à réduire la contamination humaine par la volaille. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable, décrivant Campylobacter comme une bactérie commensale asymptomatique du poulet, et présente ce dernier comme la "seule espèce adaptée" faute d'organoïdes reproduisant l'immunité aviaire. Les poussins sont élevés jusqu'à 42 jours, âge d'abattage des poulets de chair, puis tués pour l'étude.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le développement d’une stratégie de lutte vis-à-vis de la bactérie Campylobacter jejuni dans la filière avicole par la vaccination. Lors d’essais précédents, nous avions montré qu’un vaccin candidat basé sur la protéine appelée « YP437 » donnait des résultats prometteurs en terme d’induction d’anticorps sériques ou de protection vis-à-vis de l’infection bactérienne. Cependant, le protocole vaccinal doit maintenant être amélioré pour être plus efficace. Les objectifs visés par ce projet sont d’évaluer des pistes d’amélioration de la stratégie vaccinale : (1) Evaluer l’efficacité vaccinale du candidat vaccin sous sa forme protéique (vaccination et rappel vaccinal sous forme de protéines). En effet, cette combinaison n’avait pas été évaluée lors des essais précédents qui utilisait une primo-vaccination sous forme d’ADN et un rappel vaccinal sous forme protéique. Or, d’après notre expérience avec d’autres antigènes vaccinaux, la valence vaccin protéique est impliquée dans l’induction d’une réponse immunitaire sérique. (2) Evaluer l’impact de la fréquence (répétitions) des doses administrées du candidat vaccin. L’administration de plusieurs rappels vaccinaux pourrait augmenter l’amplitude des réponses immunitaires protectrices. (3) Evaluer l’impact de la voie d’inoculation en administrant le vaccin candidat par la voie orale (administration mucosale). En effet, lors des essais précédents, seule la voie intramusculaire a été testée. Or, d’après certains résultats précédents, l’induction de réponse immunitaire mucosale a été retrouvée chez des poulets partiellement protégés. La voie orale pourrait donc être intéressante pour stimuler la voie mucosale qui pourrait avoir un rôle sur la réduction de la charge caecale en Campylobacter. (4) Suivre tout un panel de réponses immunitaires dont les anticorps spécifiques circulants et mucosaux (anti-YP437), la réponse cellulaire et la composition du microbiote intestinal en réponse au vaccin en présence de Campylobacter. En effet, lors des essais précédents, seuls les paramètres de l’immunité systémique et mucosale ont été mesurés. Toutefois, il est possible que les efficacités vaccinales soient liées aux réponses humorales spécifiques, à l’immunité mucosale intestinale, à l’immunité cellulaire et/ou à la composition du microbiote intestinal qui pourrait interagir avec Campylobacter, et/ou le vaccin et/ou le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce suivi devrait nous donner des indications sur ce qui est important selon différents paramètres testés (fréquence et voie d’inoculation, nature du vaccin) pour induire une réponse immunitaire protectrice contre Campylobacter chez le poulet en étudiant les interactions système immunitaire/microbiote et de Campylobacter au sein des intestins du poulet suite à la vaccination. L’étude de la voie orale permettra d’apporter des réponses sur la stimulation de la voie mucosale et d’être plus adapté à la vaccination de terrain dans les élevages. Le concept est innovant car l’adjuvant utilisé pour la voie orale n’a encore jamais été testé chez des poulets de chair.

Procédures

Plusieurs lots seront vaccinés par voie intramusculaire ou orale et infectés par Campylobacter par voie orale. Les prélèvements d’organes (caecum, rate et bourse de Fabricius) et de fluides (sang et bile) auront lieu après mises à mort des animaux. Au total, 7 lots de poulets de chair (souche Ross 308) seront utilisés. Lot 1: Vaccinés par la protéine YP 437 deux fois aux jours 5 et 12 par voie intramusculaire et infecté par Campylobacter au jour 19. Lot 2: Témoin placebo du lot 1 Lot 3: Vaccinés par la protéine YP 437 quatre fois au jours 5, 12, 19 et 28 en intramusculaire et infecté par Campylobacter au jour 19. Lot 4: Témoin placebo du lot 3 Lot 5: Vaccinés par la protéine YP 437 deux fois au jours 5 et 12 par voie orale et infecté par Campylobacter au jour 19. Lot 6: Témoin placebo du lot 5 Lot 7: Témoin challenge (non vacciné mais infecté par Campylobacter). Les poulets des lots 1 à 4 seront inoculés par voie intramusculaire. Les lots 1 et 3 seront inoculés avec le vaccin contenant la protéine YP 437 émulsionnée dans un adjuvant alors que les lots 2 et 4 seront inoculés avec un placebo (PBS + adjuvant). Les poulets du lot 5 seront inoculés avec le vaccin contenant la protéine YP 437 émulsionnée dans un adjuvant par voie orale alors que les poulets du lot 6 seront inoculés également par voie orale mais avec un placebo (PBS + adjuvant). Les lots 5 et 6 seront au total vaccinés 4 fois alors que les lots 1 à 4 seront au total vaccinés 2 fois. Le lot 7 ne sera pas vacciné. Tous les poulets seront infectés par voie orale par Campylobacter au jour 19. L’essai se déroulera comme suit: J1 : Naissance et mise en place des poussins au sein des animaleries et mise à mort de 5 poussins pour prélèvements de vésicules vittelines afin de vérifier le statut indemne en Campylobacter. J5 : Première vaccination pour tous les lots sauf le 7. J12 : Deuxième vaccination pour tous les lots sauf le 7. J19 : Infection avec Campylobacter par voie orale sur tous les animaux et mise à mort de 5 animaux par lot pour prélèvements de fluides et d’organes. Troisième vaccination pour les lots 5 et 6. J22 : Récolte de fientes à même le sol afin de vérifier la colonisation en Campylobacter suite à l’infection des poulets 3 jours avant. J28 : Quatrième vaccination pour les lots 5 et 6. J42 : Fin de l’essai, mise à mort de 16 animaux par lot pour prélèvements de fluides et d’organes. Au total, 152 animaux seront utilisés pour cette procédure.

Impact sur les animaux

Le vaccin protéique a déjà été utilisé lors d’expérimentations précédentes chez les poulets de chair, et aucune réaction indésirable n’a été décelée suite à la vaccination. L’adjuvant utilisé par voie intramusculaire a déjà été utilisé et n’a pas provoqué d’effets indésirables. L’adjuvant utilisé par voie orale n’a jamais été inoculé chez le poulet mais il a déjà été testé chez d’autres modèles animaux (bovin, porcin, poisson, murin) sans effets indésirables. Par ailleurs, Campylobacter est considérée comme une bactérie commensale des poulets, et à ce titre est asymptomatique. En outre, la souche utilisée a déjà fait l’objet de plusieurs essais in vivo et aucun effet indésirable n’a été observé. Il n’est donc attendu à ce qu’aucun effet indésirable ne survienne tout au long de l’essai.

Devenir

Les prélèvements d’organes et fluides seront réalisés après la mise à mort de l’animal. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

La volaille et notamment le poulet de chair représente la source majeure de campylobactériose pour l’homme. Campylobacter fait partie de la flore naturelle des poulets qui le portent de manière asymptomatique. La colonisation intervient entre la seconde et troisième semaine après l’éclosion. Le but de cette étude ici est de contribuer au développement de vaccins contre cette bactérie chez le poulet afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Campylobacter. La mise en place de la protection vaccinale contre Campylobacter fait intervenir à la fois le système immunitaire composé de différentes cellules et le microbiote intestinal. En l’absence de lignée cellulaire (population de cellules ayant une capacité de se diviser et donc de se multiplier) ou d’organoïdes (modèle d'un organe) pouvant mimer le système immunitaire aviaire et les interactions Campylobacter-microbiote-système immunitaire, aucune stratégie alternative visant à évaluer l’immunogénicité d’un vaccin inoculé aux poulets ou l’impact de la vaccination sur le microbiote n’est disponible. Le poulet est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure.

Réduction

Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Au jour 19 (avant infection par Campylobacter per os), 5 poulets par lot seront mis à mort pour avoir un nombre d’animaux par lot minimal pour appliquer les tests statistiques fiables pour les paramètres étudiés. Au jour 42, en raison de la variabilité interindividuelle importante du dénombrement de Campylobacter, il est nécessaire d’avoir à minima 15 animaux par lot afin de comparer les charges caecales en Campylobacter, reflétant l’efficacité vaccinale. Des tests de comparaison de moyennes seront effectués pour analyser les résultats des différents lots à chaque date de prélèvement. Des tests paramétriques (Student ou Anova) seront utilisés lorsque les critères de normalité et d’homogénéité des variances seront réunis. Sinon des tests non paramétriques (Kolgomorov-Smirnov ou Kruskall Wallis) seront utilisés.

Raffinement

Dans nos expériences précédentes, avec le vaccin à base des protéines YP437, aucun symptôme ou effet indésirable n’a été détecté chez les animaux étudiés (avec deux injections de vaccin). Le protocole a été établi pour limiter au maximum le nombre de manipulation par animal. Néanmoins, afin de pouvoir bien évaluer l’immunogénicité du vaccin et la preuve du concept, il apparait opportun, dans deux groupes, de réaliser 3 rappels vaccinaux au lieu d’un seul. Pour ces animaux, comme pour l’ensemble des animaux par ailleurs, le personnel expérimenté apportera la même attention à chaque injection pour éviter/limiter les inconforts au moment de l’injection. D’après notre expérience, les vaccins se diffusent très bien en intramusculaire et une garde au niveau de l’aiguille rattachée à la seringue peut être ajoutée pour que l’aiguille soit bien positionnée et bien adaptée à la dimension de la cuisse du poulet. L’adjuvant utilisé par voie intramusculaire a déjà été utilisé et n’a pas provoqué d’effets indésirables. L’adjuvant utilisé par voie orale n’a jamais été inoculé chez le poulet mais il a déjà été testé chez d’autres modèles animaux (bovin, porcin, poisson, murin) sans effets indésirables. Afin de limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux, les prélèvements de sang auront lieu lors de la saignée à la veine jugulaire après mise à mort des animaux. Par ailleurs, Campylobacter est considérée comme une bactérie commensale des poulets, et, à ce titre, l’infection est asymptomatique. En outre, la souche utilisée a déjà fait l’objet de plusieurs essais in vivo et aucun effet indésirable n’a été observé. Aucun effet indésirable n’est donc attendu au cours de cet essai. Néanmoins, les animaux seront observés quotidiennement. Si toutefois, une altération de l’état de santé était observée quelle que soit la raison, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites suivants : blessure grave, prostration, absence de réaction après sollicitation (absence de réponse à des stimuli tactiles et visuels), anorexie ou impossibilité de s’abreuver ou de s’alimenter.

Choix des espèces

Campylobacter fait partie de la flore naturelle des poulets qui le porte de manière asymptomatique. La colonisation de cette flore intervient entre la seconde et troisième semaine après l’éclosion. Le but des études ici est de contribuer au développement de vaccins contre cette bactérie chez le poulet afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Campylobacter. Le poulet est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 42 jours. Le but est de suivre les réponses immunitaires et l’influence du microbiote avant au jour 19 et suite à l’infection par Campylobacter au jour 42, âge moyen testé lors des précédents essais et cohérent avec l’âge d’abattage des poulets de chairs pour la consommation.