Procédures modérées

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un gène de l'autophagie est invalidé, puis les animaux passent des tests d'interaction sociale et d'ultrasons avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie ou une dislocation cervicale. Le porteur indique que les nuisances tiennent à une période d'isolement, au stress des tests et aux contentions. Il affirme que l'étude d'un défaut d'autophagie sur le comportement "ne peut se faire autrement" qu'in vivo, la retombée contre les troubles du neurodéveloppement restant renvoyée au long terme.

Objectifs

Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autre les capacités d’interaction sociale et d’ultravocalisations, à différents âges, chez des souris pour lesquelles un gène de l’autophagie a été invalidé. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs. Ils sont ensuite soumis à un protocole de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).

Impact sur les animaux

A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans la procédure du présent projet, les animaux subissent des tests non invasifs de comportement, jusqu’à la perfusion intracardiaque (n = 120), pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place ou jusqu’à l’euthanasie par dislocation cervicale (n = 120). Des nuisances et effets indésirables classés comme modérés sont attendus, en lien avec notamment la mise en place d’une période d’isolement pour les animaux, le stress induit par les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques.

Devenir

La procédure décrite dans ce projet sera réalisée sur des souris. C’est une procédure modérée qui concerne les 120 animaux issus de la lignée (animaux résidents) et les 120 animaux naïfs (visiteurs WT). L’ensemble des animaux sera euthanasié en fin de procédure.

Remplacement

L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 240 souris. Le nombre d’animaux est réduit en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. D'une manière générale, conçu les lots sont conçus pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans la procédure expérimentale (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur. Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 240 souris.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie).

360 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prises de sang à la jugulaire ou à la queue, des mises à jeun de vingt-quatre heures et des prélèvements de fèces, pour tester des stratégies nutritionnelles face au stress thermique. Le porteur reconnaît que les porcs "sont susceptibles de souffrir de la chaleur", enjeu même de l'étude. Il indique qu'à l'issue de chaque essai les animaux entrent dans le circuit de commercialisation, l'objectif déclaré étant de maintenir leur croissance en cas de fortes températures.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la réponse zootechnique et physiologique des porcs en engraissement de 25 à 120 kg à des pratiques alimentaires et nutritionnelles ciblées lorsqu’ils sont soumis à un stress thermique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise en marché d'une ou plusieurs solutions nutritionnelles ou additifs afin d'éviter les dommages causés aux cellules comme ceux liés à l'inflammation et au stress oxydatif et de maintenir voire d'améliorer la croissance des porcs lorsqu'ils sont soumis à de fortes températures.

Procédures

Au maximum, 2 séries de maximum 3 prises de sang par ponction à une veine jugulaire ou à la région caudale pourront être réalisées sur les porcs impliqués dans cette procédure. Les prises de sang seront espacées d'au moins 30 minutes et les séries de 3 prises de sang seront espacées d'au moins 7 jours. La première prise de sang de chaque série pourra être successive à une mise à jeun de 24 heures maximum. Deux mises à jeun de 24 heures pourront donc avoir lieu par procédure expérimentale (=1 essai). Par ailleurs, des mesures répétées de glycémie ou d'hémoglobinémie (5 en 4 heures environ) à l'aide d'un Accue Check ou d'un HemoCue pourront être faites sur les porcs deux fois maximum par application de la procédure expérimentale (=1 essai). La deuxième série de mesures répétées aura lieu au minimum 7 jours après la première. Pour réaliser ces mesures, une goutte de sang sera prélevée grâce à une piqûre réalisée à l'oreille ou à la queue à l'aide d'une aiguille. Les porcs de cette procédure pourront être concernés par les séries de prise de sang et/ou les prélèvements par goutte de sang à l'oreille. De plus, de 0 à 3 prélèvements de fèces pourront avoir lieu pendant la période expérimentale. La récolte des fèces se fait par légère pression sur l’abdomen du porc ou par légère stimulation rectale. Les prélèvements de fèces seront réalisés directement dans la case soit, sans contention particulière, soit à l'aide d'une cordelette placée autour du groin et fixée à l'extrémité d'un bâton avec lequel l'animalier serre le nez des animaux. Les prélèvements pourraient également avoir lieu en plaçant les animaux dans une cage balance (au moment de leur pesée ou non). De plus, afin de faciliter le déroulement des prises de sang et de limiter le stress ressenti, les animaux seront immobilisés à l'aide d'une cordelette placée autour du groin et fixée à l'extrémité d'un bâton avec lequel l'animalier serre le nez des animaux. Les prises de sang seront effectuées à l’extérieur de la case. Les prises de sang et de fèces sont réalisées sur 15 porcs par traitement expérimental au maximum, sachant qu’il y a au maximum 4 traitements expérimentaux par procédure (=1 essai). Ce chiffre peut être revu à la baisse selon l’objectif de l’essai et la variabilité du critère analysé. Les prélèvements de fèces et de sang sont réalisés sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les porcs sont susceptibles de souffrir de la chaleur comme lors de périodes estivales.

Devenir

A la fin de chaque essai, les animaux seront mis à mort et entreront dans le circuit de commercialisation pour la plupart, sauf ceux ayant reçu un additif non autorisé dans l’Union européenne. Ces derniers partiront à l’équarrissage.

Remplacement

L'objectif du projet est de mettre en place des stratégies novatrices afin de limiter l’effet négatif du stress thermique sur le bien-être et les performances de croissance des porcs en engraissement. L'effet d'une solution nutritionnelle ou d'un changement de conditions environnementales sur les performances de croissance des porcs est la résultante d'une série de mécanismes et régulations physiologiques (digestives, métaboliques, endocrinologiques) interagissant entre elles. La complexité de ces interactions ne permet donc pas d'utiliser des modèles alternatifs comme la modélisation ou la mise en place d'études in vitro. Par ailleurs, l'évaluation des paramètres d’intérêt du projet (croissance, ingéré volontaire d'aliment, ....) ne peut être réalisée que sur des animaux vivants.

Réduction

Grâce à la collecte individuelle des données sur les animaux, le nombre de répétitions (ici l'individu) nécessaire à la mise en évidence de différences significatives entre plusieurs traitements est réduit. La méthode de calcul de « la puissance statistique du test » prenant en compte une valeur seuil de significativité de 5%, une différence de 8% entre les traitements et un coefficient de variation de 8.5% donne un nombre minimal de répétitions de 18 individus par traitement expérimental avec un maximum de 4 traitements expérimentaux par essai. Par contre, si la différence à détecter est de 2% avec un coefficient de variation de 3%, alors le nombre minimal de répétitions est de 35 individus par traitement expérimental avec un maximum de 2 traitements expérimentaux par essai. Ce test est robuste et est couramment utilisé pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire à la mise en évidence d'une différence significative entre deux groupes dans un essai. Les essais seront réalisés sur des animaux homogènes (poids vif, sexe et origine génétique) et en bonne santé afin de réduire la variabilité individuelle en début d’essai. Dans le cas de paramètres hématologiques ou fécaux, les prélèvements ne seront réalisés que sur une partie des effectifs jugés nécessaires et suffisants au regard des éléments disponibles (bibliographie et expérience interne). Le nombre d’animaux sera ainsi ajusté, en essayant de le diminuer au maximum. La distribution des données sera évaluée selon qu’elles se situent, ou non, dans l’intervalle moyenne ± 2 écarts-types afin d’identifier les données aberrantes. Après élimination des données aberrantes, les données zootechniques seront soumises à des analyses de variance (ANOVA) avec le traitement expérimental en effet fixe. La mortalité sera évaluée selon le test Chi-2. Le niveau de significativité est fixé à P

Raffinement

L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’établissement utilisateur. Si un porc présente des signes de stress, des difficultés à supporter la chaleur, ou des douleurs (boiteries, blessures…), alors il sera écarté de l’étude. Des points limites stricts et définis à l’avance sont appliqués tout au long du projet. De plus, le nombre de tentatives de collectes d'échantillons biologiques sera limité et la manipulation des animaux sera restreinte afin de réduire la souffrance ou le stress appliqué à ces animaux. Par ailleurs, ce projet sera réalisé en condition « élevage » pour que les réponses observées soient directement transposables sur le terrain, ce qui implique une densité de 1,06 m²/porc lorsqu’il y en a 9 par case au lieu de 1,35 m²/porc comme le prévoit la réglementation expérimentation animale. Les cases seront enrichies avec des balles suspendues et des disques en fibres de bois. Des interactions sociales entre les animaux seront possibles car les porcs seront logés par case de 8 ou 9 individus.

Choix des espèces

L'espèce choisie pour la réalisation du projet est le porc car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) étudiés dans le cadre de ce projet sont hautement spécifiques de l'espèce porcine. Les animaux pèseront entre 25 et 120 kg. Cela correspond à la période d’engraissement, période à laquelle les porcs peuvent le plus souffrir des fortes températures.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux modèles pathologiques sont induits, puis les animaux subissent des mesures de sensibilité avant une mise à mort par surdose d'isoflurane et dislocation cervicale pour prélèvement de tissus. Le résumé annonce l'étude de la rosacée oculaire, mais ses justifications glissent vers le syndrome de l'intestin irritable et une infection à C. rodentium, sans que le protocole soit détaillé. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de travailler sur des animaux" et qu'il n'existe "pas d'autre alternative".

Objectifs

La rosacée est une maladie commune de la peau, inflammatoire et chronique, avec une variété de manifestations cliniques telles que l’érythème centro-facial, les papules et les pustules, ainsi qu’une atteinte oculaire. Il s’agit d’une pathologie fluctuante, avec une alternance de poussées et de rémissions. Plusieurs facteurs exacerbant la pathologie ont été décrits, comme l’alcool, l’exposition au soleil, le sport, la nourriture épicée, le stress, les émotions et les changements de température.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs et d'inflammation associées à la rosacée occulaire afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec des services de gastroentérologie. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.

Procédures

Suite à l'induction des 2 modèles (procédures 1 et 2), l'ensemble des animaux subiront les procédures 3 et 4 une seule fois et une semaine après l'induction du modèle.

Impact sur les animaux

Les animaux seront mis à mort par une overdose d’isoflurane puis dislocation cervicale. Ceci concernera les animaux en fin d'expérimentation mais aussi si un animal présente au moins 1 des points limites décrits par la suite.

Devenir

Pour l'ensemble des procédures, les animaux seront maintenus en vie. A l’issue de la procédure 4 (mesure de la sensibilité mécanique), les animaux seront mis à mort pour effectuer différents prélèvements de tissus.

Remplacement

Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.

Réduction

Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.

Raffinement

Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.

132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte dans l'artère caudale des cellules de cancer du sein humain, une partie recevant en plus un gavage quotidien d'inhibiteurs, pour étudier le rôle de certains lipides dans les métastases osseuses. Le porteur indique que ces métastases provoquent chez l'humain des douleurs liées à la dégradation de l'os, et prévoit d'arrêter les procédures à sept jours, avant tout point limite. Il affirme que ce phénomène "ne peut pas être apprécié" par des tests in vitro, les retombées annoncées pour les patientes restant lointaines.

Objectifs

Le cancer du sein est une tumeur maligne qui peut se propager dans tout l'organisme : on dit alors que la tumeur a métastasé. Les cellules de cancer du sein migrent préférentiellement à l’os, ou elles vont être responsables d’une destruction massive de l’os. Celles-ci génèrent de grandes douleurs et des fractures pathologiques et peut même engager le pronostic vital des patientes. A l’heure actuelle, les métastases osseuses sont incurables et les traitements sont donnés uniquement pour améliorer la qualité de vie des patients. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par le biais desquels les métastases dérivant d’un cancer du sein se forment afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les leucotriènes sont des lipides biologiques produits naturellement par les leucocytes dans des conditions inflammations. Il a été observé récemment que les cellules cancéreuses sont elles-mêmes capables de produire ces lipides car elles possèdent les enzymes nécessaires. Cependant, le rôle des leucotriènes produits par les cellules cancéreuses dans la formation des métastases osseuses n’est absolument pas connu. Notre projet vise à comprendre comment ces leucotriènes peuvent contribuer à la formation des métastases osseuses des cancer du sein.

Bénéfices attendus

A terme ce projet apportera des informations indispensables pour limiter la rechute métastatique à l’os des cancers du sein et d’améliorer la survie des patients.

Procédures

Une suspension de cellules cancéreuses sera injectée dans l’artère caudale des souris. Pour cela les souris seront anesthésiées sous isoflurane, maintenues à 37°C et un gel anesthésiant de lidocaïne sera placé sur le dos des souris. Les animaux recevront une seule injection de cellules cancéreuses pour les procédures 1 et 2. Dans le cas de la procédure 2 les animaux recevront un traitement quotidien par gavage d’une solution pharmacologique d’inhibiteurs des enzymes de la voie de synthèse des leucotriènes. La durée des procédures 1 et 2 est de 7 jours.

Impact sur les animaux

La formation de métastases osseuses a pour caractéristique chez l’homme d’induire des douleurs. On sait que ces douleurs sont dues à la dégradation de l’os. Dans le but de réduire la douleur des animaux toutes les procédures seront arrêtées 7 jours après l’injection des cellules tumorales où aucune dégradation osseuse n’est détectable et où aucun point limite n’est atteint. La quantification des métastases osseuses sera réalisée par histologie post-mortem.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir évaluer post-mortem in vitro le nombre de cellules métastastiques ayant colonisé les os longs.

Remplacement

L’influence que peuvent avoir les enzymes clés de la synthèse des leucotriènes sur des phénomènes tumoraux tels que la migration, la colonisation et l’ancrage osseux lors de la formation des métastases ne peut pas être appréciée par des tests in vitro. L’utilisation d’une lignée cellulaire d’origine humaine du sein que nous avons préalablement testée in vitro pour sa capacité à être invasive nous permettra de reproduire chez la souris le plus fidèlement possible la situation pathologique du cancer du sein chez la femme.

Réduction

La procédure n°2 ne sera réalisée que si la procédure n°1 donne les résultats attendus. La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’une analyse de puissance réalisée avec le logiciel BiostaTGV. Sur les 3 ans de réalisation du projet, un nombre total de 132 souris sera nécessaire

Raffinement

Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (maison rouge, coton) renouvelé une fois par semaine. Afin de permettre l’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, les souris seront placées en stabulation durant deux semaines au sein de l’animalerie d’accueil sous surveillance journalière. Tous les protocoles d’injection des cellules tumorales seront réalisés sur des souris anesthésiées au moment des injections. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des principaux signes physiologiques, comportementaux et de l’apparence de l’animal. Les animaux seront pris en charge au premier signe d’inconfort.

Choix des espèces

La souris Balb/c nude est couramment utilisée en oncologie. Ces souris présentant une déficience du système immunitaire nos conditions d’hébergement dans un local à air contrôlé sont adaptées à cette spécificité des animaux. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. Nous utiliserons des souris femelles car notre étude porte sur le cancer du sein.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-rétiniennes de gènes, passent des tests de vision, une imagerie du fond d'œil et un électrorétinogramme sous anesthésie, avant une mise à mort et un prélèvement de la rétine. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires, et que l'anesthésie répétée peut entraîner une hypothermie. Il affirme que ce modèle "ne peut pas être remplacé" par la culture cellulaire ou les organoïdes, les retombées pour les patients atteints de rétinite pigmentaire restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Notre objectif est d'étudier le bénéfice thérapeutique de la combinaison de deux gènes dans la dégénérescence rétinienne. Les deux gènes ont pour fonction de protéger la rétine. Les souris qui ont perdu les deux gènes ont montré des déficits visuels marqués. Des expériences cellulaires ont également confirmé que les produits codés par les deux gènes peuvent prolonger la durée de survie des cellules rétiniennes. Dans cette étude, un modèle murin de dégénérescence rétinienne sera utilisé pour co-administrer les produits des deux gènes et l'effet thérapeutique du traitement combiné sur la vision des souris sera évalué par les tests visuels. Les résultats obtenus pourraient également s'inscrirent dans un futur assai clinique pour la thérapie génique au profit des patients.

Bénéfices attendus

La rétinite pigmentaire manque actuellement de traitements efficaces. Le projet étudiera le rôle protecteur de deux gènes dans la rétine. Une stratégie thérapeutique basée sur l'un de ces gènes est entré en essai clinique cette année. Les deux gènes prolongent la survie des cellules rétiniennes de différentes manières. Nous possédons des arguments pour penser que l’administration des deux gènes d’intérêt aurait un effet thérapeutique synergistique. A plus long terme l’objectif est de faire la preuve de concept du bénéfice pour la vision d’une thérapie combinant les deux. Les résultats obtenus seront bénéfiques pour faire avancer le traitement de la rétinite pigmentaire.

Procédures

Le projet comporte 2 étapes : La première étape consiste à injecter le traitement à des souris modèles. Chaque lot d'expériences est divisé en 5 groupes (n = 5), dont 4 groupes recevront des injections (un total de 20 souris) et 1 groupe sera un groupe témoin non injecté (un total de 5 souris). Des souris seront injectées sous anesthésie gazeuse et une pommade oculaire sera appliquée sur la cornée pour une anesthésie locale et une analgésie. La procédure d'injection durera environ 5 minutes par souris. La deuxième étape est l'évaluation de la fonction visuelle. La deuxième étape est l'évaluation de la fonction visuelle. 5 groupes de souris seront testés 1, 4 et 6 mois après l'injection. Au total, 4 tests seront effectués, comme suit : Test 1 : La vision sera mesurée pour chaque souris pendant environ 5 minutes chacune (sur éveillé). Test 2 : Des photos du fond d'œil des animaux seront prises pour évaluer la santé du fond d'œil. Les animaux seront testés sous anesthésie gazeuse. Test 3 : Une imagerie rétinienne d'animaux sera réalisée pour obtenir des informations structurelles rétiniennes. Les animaux seront testés sous anesthésie gazeuse. Les tests 2 et 3 seront réalisés sous la même anesthésie gazeuse et dureront 15 à 20 min par souris. Test 4 : La fonction électrophysiologique de la rétine de l'animal sera testée. L'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale. Le test durera au total 30 minutes.

Impact sur les animaux

Lésion : Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés au niveau de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Douleur : Les injections intra péritonéales, sous-cutanées peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. Maladie : La majorité des gestes expérimentaux auxquels sont soumises les souris seront réalisés sous anesthésie générales par induction gazeuse ou chimique (injection intraoculaire, fond d’œil, tests de la structure rétinienne et des fonctions électrophysiologiques). L’anesthésie peut provoquer une hypothermie. Environnement non adapté : Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme) et lors des tests visuels d’optocinétique.

Devenir

Au regard des résultats que nous attendons, le point final est fixé à 6 mois, mais on se laisse la possibilité d'aller jusqu'à 10 mois si les résultats observés le nécessitent. Les animaux seront euthanasiés et la rétine sera prélevée pour obtenir la quantification des photorécepteurs à cônes.

Remplacement

Le modèle de souris de la dégénérescence de la rétine peut simuler le processus pathologique de l'homme, qui ne peut pas être remplacé par la culture cellulaire et les organoïdes rétiniens. Le test d'acuité visuelle et la mesure de la fonction électrophysiologique des photorécepteurs à cônes ne peuvent pas être réalisées sur des modèles in vitro.

Réduction

Il y a 5 groupes au total, dont 4 groupes de souris injectées, et 1 groupe contrôle sans injections, comme suit : Groupe 1 : 10 souris recevront une injection de vecteur vide sans effet thérapeutique Groupe 2 : 10 souris recevront une injection de médicament contenant le produit du gène 1 Groupe 3 : 10 souris recevront une injection de médicament contenant le produit du gène 2 Groupe 4 : 10 souris recevront un médicament comprenant une combinaison de deux produits géniques Groupe 5 : 8 souris non injectées Pour réduire le nombre d'animaux, nous ne définissons pas un groupe de contrôle fictif séparé, remplaçant en profitant des deux yeux. Un contrôle fictif a été utilisé pour évaluer l'effet de l'intervention chirurgicale elle-même sur les résultats expérimentaux. Nous injecterons le traitement dans l'œil droit, et l'œil gauche sera un contrôle factice avec une seule opération chirurgicale. Le nombre de souris par groupe est estimé à partir de travaux antérieurs pour garantir la génération de résultats statistiquement significatifs, en tenant compte d'environ 15 pour cent de perte d'animaux au cours de la progression.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifie de l’animalerie et seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifie de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront héberges dans des cages de stabulation avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Une anesthésie courte, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale au gaz pour les procédures courtes (injection intraoculaire, techniques d’imageries), et d’une anesthésie générale par injection intrapéritonéale pour les procédures plus longues (électrorétinogrammes). Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections cornéenne pendant les procédures. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu'à leur complet réveil. Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intraoculaires/intrapéritonéales/sous-cutanées. Application d’une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne en post injection intraoculaire er a la fin des électrorétinogrammes. Un temps de repos minimal de 24h sera réalisé entre une anesthésie au gaz et une anesthésie fixe (injection intrapéritonéale ) et de 7 jours entre deux anesthésies fixes. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel, ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrête ou points limites ont été détermines pour chaque étape de la procédure expérimentale. Les animaux provenant de l’extérieur observeront un période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Les souris modèles de dégénérescence rétinienne sont un modèle de rétinite pigmentaire (RP) autosomique récessive. Le modèle imite la RP humaine typique, et s'avère être un excellent modèle pour étudier les approches thérapeutiques de la RP. Le traitement par injection sous-rétinienne sera effectué sur PN15 (15 jours post-natal). Le début de la dégénérescence rétinienne dans ce modèle se situe autour de PN25, le traitement doit être le plus précoce. A PN15 , les yeux des souris sont ouverts et suffisamment pour les injections sous-rétiniennes. Le test de vision sur les 5 groupes sera effectué à 1, 4 et 6 mois après l'injection selon les études publiées avec un traitement similaire. Au regard des résultats que nous attendons, le point final est fixé à 6 mois, mais on se laisse la possibilité d'aller jusqu'à 10 mois si les résultats observés le nécessitent.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont vaccinées puis soumises à une infection par Staphylococcus aureus, avant un prélèvement sanguin et une mise à mort à trois ou vingt-quatre heures pour dénombrer les bactéries dans le foie, la rate et les reins. Le porteur fixe des points limites, une température inférieure ou égale à 33 °C et une perte de poids supérieure à 20 %. Il affirme que le recours aux animaux est "indispensable" pour tester si l'antigène administré sous forme d'ADN protège mieux que sous forme de protéine.

Objectifs

Les differentes stratégies vaccinales développées à ce jour vis-à-vis de S. aureus – un pathogène bactérien représentant un enjeu majeur de santé publique chez l’homme – se sont révélées décevantes. La principale raison invoquée aujourd’hui est que ces stratégies ciblaient uniquement une réponse immune humorale et ne stimulaient pas l’immunité cellulaire. La voie de recherche actuellement privilegiee consiste ainsi a obtenir une reponse immunitaire a la fois humorale et cellulaire, comme cela est le cas par vaccination ADN ou ARN. Dans une etude recente, nous avons identifie une proteine de S. aureus constituant un antigène vaccinal prometteur. Néanmoins, lorsqu’elle est utilisée pour immuniser les souris sous forme de protéine purifiée, elle n’a qu’un effet protecteur partiel vis-à-vis d’un challenge infectieux de S. aureus (diminution significative de la charge bactérienne uniquement dans les reins). Le present projet vise a etudier si l’utilisation de cet antigène candidat sous forme ADN permet d’accroître le pouvoir protecteur de cet antigène (baisse significative de la charge bactérienne dans les reins, mais aussi dans le foie et la rate des animaux), et ce dans le meme modele murin d’infection a S. aureus que celui que nous avons utilise precedemment. Le vaccin utilisé consiste en l’antigène candidat sous forme ADN associé au véhicule Nanotaxi®, qui est administré par voie intramusculaire tibiale antérieure ; les animaux témoins reçoivent une injection du véhicule seul selon le même protocole.

Bénéfices attendus

Les différentes stratégies vaccinales développées à ce jour vis-à-vis de S. aureus – un pathogène bactérien représentant un enjeu majeur de santé publique chez l’homme – se sont révélées décevantes. La principale raison invoquée aujourd’hui est que ces stratégies ciblaient uniquement une réponse immune humorale et ne stimulaient pas l’immunité cellulaire. La voie de recherche actuellement privilegiée consiste ainsi a obtenir une réponse immunitaire a la fois humorale et cellulaire, comme cela est le cas par vaccination ADN ou ARN. Dans une étude recente, nous avons identifié une proteine de S. aureus constituant un antigène vaccinal prometteur. Néanmoins, lorsqu’elle est utilisée pour immuniser les souris sous forme de protéine purifiée, elle n’a qu’un effet protecteur partiel vis-à-vis d’un challenge infectieux de S. aureus (diminution significative de la charge bactérienne uniquement dans les reins). Le présent projet vise a étudier si l’utilisation de cet antigène candidat sous forme ADN permet d’accroître le pouvoir protecteur de cet antigène (baisse significative de la charge bactérienne dans les reins, mais aussi dans le foie et la rate des animaux), et ce dans le même modele murin d’infection a S. aureus que celui que nous avons utilise précédemment.

Procédures

Un prélèvement sanguin sub-mandibulaire est effectué juste avant l’euthanasie à H3 ou H24 post-challenge. Un volume maximum de 500 microL de sang sera prélevé.

Impact sur les animaux

Nous n’attendons aucun effet délétère sur les animaux. Néanmoins : - La prise de température permettra d’être réactif (point limite : température égale ou inférieure à 33°C). - En cas de perte de poids, la surveillance sera renforcée et l’alimentation complémentée par de la nourriture gélifiée ; une perte de poids trop importante (supérieure à 20% par rapport au poids le jour de la première intervention/injection) constituera un point limite. Enrichissement du milieu : carrés de cellulose et à bâtonnets de bois (même matériau que la litière).

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever les organes (foie, rate, reins) pour dénombrement des « UFCs ».

Remplacement

•Le recours a des animaux est indispensable à ce stade du processus d’évaluation préclinique dans une perspective de développement réglementaire du vaccin envisagé.

Réduction

•Limitation du nombre d’animaux utilisés : étude uniquement de l’antigène d’intérêt (pas de comparaison avec l’antigène d’intérêt sous forme de protéine (expérience précédente), ou avec d’autres antigènes connus) ; sous-groupes de 6 souris par temps et par dose, de manière à obtenir des analyses statistiques amenant à une significativité (p ≤ 0,05 par le test de Kruskal-Wallis). •Les expériences utilisent le nombre minimal d’animaux par sous-groupe nécessaire à une analyse statistique amenant à des résultats significatifs (variabilité individuelle) : 6 animaux sont, en effet, utilisés pour chaque point d’analyse, soit un total de 36 animaux vaccinés par l’antigene d’interet et 36 animaux contrôles.

Raffinement

•Enfin, concernant le bien-être des animaux : - Les animaux sont anesthésiés avant de recevoir les injections de vaccin et le challenge infectieux, et aucun effet délétère n’est attendu jusqu’à leur euthanasie (utilisation de doses non létales de S. aureus et euthanasie au plus tard 24 heures après l’inoculation de S. aureus) ; - Le bien-être proprement dit des animaux sera assuré a tous les stades des expériences, qu’il s’agisse de l’espace d’hébergement, des soins ou des modes operatoires. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement du milieu (carrés de cellulose et bâtonnets de bois). Les soins et les gestes operatoires seront effectués par du personnel expérimenté et qualifié. La surveillance des animaux reposera sur une évaluation quotidienne utilisant une grille de scoring. La prise de température permettra d’être réactif (point limite : température égale ou inférieure à 33°C). Une perte de poids trop importante (supérieure à 20% par rapport au poids de référence de l’animal) sera également un point limite.

Choix des espèces

Les souris, et particulièrement les souris BALB/c, sont très sensibles à l’infection par S. aureus et sont donc des animaux particulièrement pertinents pour juger de l’efficacité d’une protection vaccinale. Les souris utilisées auront 6 semaines au moment de leur arrivée à l’UE-IERP, recevront leur première dose de vaccin ADN à 7 semaines, et seront âgées de 15 semaines au moment du challenge infectieux.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de nanoparticules d'ARN messager par voie intraveineuse ou intramusculaire, suivies d'une imagerie de bioluminescence, pour optimiser des formulations vaccinales. Le porteur indique n'attendre d'autre douleur que celle liée à l'aiguille et suivre les animaux par une grille de points limites. Il affirme que des études sur "l'animal entier" restent nécessaires et qu'aucune méthode de remplacement fiable n'est disponible.

Objectifs

Les différents vaccins contre le COVID ont montré que la technologie de vaccination ARNm permet une réponse rapide à un nouveau pathogène. Ces vaccins (Moderna, Pfizer, Curevac) sont administrés sous forme de nanoparticules lipidiques (LNP) par voie intramusculaire et induisent une réponse immune protectrice. De nombreux essais cliniques utilisent des vaccins LNP ARNm avec des résultats prometeurs contr ede nombreux cancers solides. De plus, de bons résultats précliniques ont été démontrés pour la régénération tissulaire après administration locale d'ARNm codant des gènes de morphogénèse. Notre projet vise donc à optimiser à la fois la séquence des ARNm et leur mode de délivrance pour maximiser leur expression in vivo. Ce projet vise à mettre au point des vaccins à base de nanoparticules d’ARNm en testant différents types de nanoparticules et différentes séquences ARNm développés au laboratoire. Le projet comporte deux étapes: une première étape d'injection des complexes ARNm et une deuxième étape d'injection du substrat et d'imagerie non-invasive de bioluminescence. Les applications thérapeutiques sont la vaccination anticancéreuse et la régénération tissulaire. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous allons évaluer différentes formulations de LNP et séquences d’ARNm pour maximiser l’expression de l’ARNm après injection intraveineuse ou intramusculaire chez la souris. L’expression des ARNm sera évaluée par imagerie non-invasive de bioluminescence. Nos travaux seront menés dans le respect de la règle des 3R : l’effectif des souris mis en œuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Des expériences in cellulo ont montré que les nanoparticules de types LNP sont capables de transfecter des cellules musculaires ou des cellules dendritiques avec l’ARNm. Les travaux chez le modèle animal sont dans la continuité de ces résultats.

Procédures

aucun prélèvement ni chirurgie ne sont prévus

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à une douleur suite à l'injection des formulations, mis à part la douleur induite lors de l'injection liée à l'aiguille. Nous prendrons en compte la douleur générée par les injections intramusculaires. Nous suivrons les animaux avec une grille de scoring présentant des points limites prédictifs liés à la douleur et à la désiorientation.

Devenir

les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure

Remplacement

L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.

Réduction

Réduction: l’effectif des souris mis en œuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive, le suivi longitudinal permettra de diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

les méthodes utilisées seront mises en œuvre par du personnel formé (niveau chirurgie) et les points limites sont validés par le comité éthique local. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive chez la souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et de régénération tissulaire. Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage de formulations et de structures ARNm Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.

20 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrées au troupeau selon leur état en fin d'essai. Pendant quinze semaines, elles reçoivent des additifs à base d'algues destinés à réduire leurs émissions de méthane et subissent huit prises de sang à la veine caudale. Le porteur indique que ces additifs peuvent réduire l'appétence et donc l'ingestion et la production laitière, effets qu'il qualifie de réversibles et sans conséquence sur la santé. Il affirme qu'il "n'est pas possible de remplacer" l'expérimentation in vivo, l'enjeu déclaré étant de diminuer les gaz à effet de serre de l'élevage bovin.

Objectifs

L'objectif de ce projet expérimental est de tester les effets d’additifs alimentaires à base d’algues marines sur les performances zootechniques (ingestion, production et composition du lait) et les émissions de méthane entérique de vaches laitières en lactation. Cette expérimentation in vivo permettra de démontrer l'intérêt éventuel de 3 additifs différents basés sur différentes espéces d'algues (algues rouges, algues vertes et extraits d'algues brunes seuls ou en association) pour la réduction des émissions de méthane entérique, sans effet délétère pour les performances animales.

Bénéfices attendus

L’agriculture représente 17,4% des émissions de gaz à effet de serre (GES) en France. L’élevage bovin émet 60,4% des ces GES agricoles. La réduction de ces émissions polluantes ets donc un enjeu majeur pour la durabilité des élevages. Le méthane entérique (CH4) représente 50-55% émissions de gaz à effet de serre (GES) en élevage bovin. En moyenne, les émissions de CH4 d'une vache laitière se comptabilisent à environ 400 g par VL/jour, soit environ 150 kg/an. L'alimentation est un des leviers majeurs pour réduire les émissions de CH4 entérique chez les bovins. D'après la bibliographie et les essais in vitro (assez peu d'essais in vivo pour l'instant), les attentes pour ce projet sont de diminuer de 10 à 20% les émissions de méthane entérique des vaches laitières, soit 5 à 10% des GES d’un élevage.

Procédures

Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront herbergés et logés selon les normes en vigueur dans les élevages laitiers, durant 15 semaines (3 semaines de mesures de référence, puis 4 périodes de 3 semaines). Les vaches seront nourries à volonté et traitent 2 fois par jour. Des échantillons de lait seront prélevés à la traite (6 traites par semaine). Les seules prélèvements invasifs seront des prises de sang à la veine caudale, à raison de 2 par périodes (soit 8 au total). Les mesures de méthane sont réalisées à l'aide de dispositifs assimilés à des distributeurs d'aliments concentrés, comme ceux rencontrés dans les élevages bovins.

Impact sur les animaux

Les quelques essais in vivo de la littérature font parfois état d'une faible appétence des additifs à base d'algues, selon l'espèce, le mode de présentation et le taux d'incorporation dans la ration. Cela peut entrainer une baisse des quantités d'aliments ingérées et donc une baisse de production laitière. Par ailleurs, certaines algues sont connues pour fortement diminuer les fermentations ruminales (donc pour fortement réduire les émisisons de CH4 associées) ce qui peut avoir pour conséquence de réduire la digestibilité de la ration. L'objectif de cet essai sera justement de quantifier ces potentiels effets négatifs, néanmoins réversibles et sans conséquence sur la santé des animaux.

Devenir

Suite à l’estimation de l’état général des animaux en fin d’essai, la décision pourra être prise par le responsable de l'installation de réintégrer ces vaches dans le troupeau non expérimental. Si une alerte au niveau de l’état général d’un animal le justifiait, la cellule bien-être (SBEA) et le vétérinaire seraient consultés.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux pour étudier l'impact de stratégies d'alimentation sur les performances zootechniques (notamment l'ingestion, la production laitière et la composition du lait) et les émissions de méthane entérique réelles. Les études in vitro ne peuvent que renseigner sur un potentiel antiméthanogène mais doivent être confirmées par des essais in vivo.

Réduction

20 vaches laitières seront utilisées pour ce projet, nombre minimum pour tester 4 traitements selon un carré latin (4 lots, 4 traitements, 4 périodes) et mettre en évidence des différences statistiques. Ainsi, chaque vache recevra chaque traitement dans un ordre différent, permettant de tenir compte des effet rémanents potentiels. Les vaches recevant également la ration témoin (sans additif), chaque vache sera son propre témoin pour réduire le plus possible le nombre d’animaux en gardant une puissance statistique suffisante pour montrer l’effet des traitements expérimentaux. Les tests statistiques utilisés seront des analyses de variance (ANOVA, intégrant l'effet période et l'effet lot) pour comparer les performances des animaux (ingestion, production laitière, composition du lait, poids vif...) et les émissions de méthane entérique entre les 4 traitements. Chacun des traitements expérimentaux sera d'abord comparé au traitement témoin pour attester de l'effet significatif ou non de l'additif offert. Le cas échéant, les traitements expérimentaux seront comparés entre eux (comparaison deux à deux) pour déterminer lequel serait le plus efficace.

Raffinement

La conduite d’élevage sera conforme aux règles d’élevage en vigueur. Un suivi régulier du comportement des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou de douleur. Des points limites adaptés ont été définis afin d’éviter au maximum toute forme de souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les vaches laitières utilisée sont de race Prim’Holstein. Pour diffuser les résultats, la race Prim’Holstein, qui est la race la plus répandue dans le monde en bovin lait, est la race appropriée. Les vaches seront en lactation afin de déterminer les effets des traitements sur les performances zootechniques et la composition du lait.

204 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur inocule dans le tibia une bactérie Gram-négatif multirésistante, puis on leur administre des antibiotiques deux à trois fois par jour pendant sept jours avant une mise à mort à J24 pour disséquer la patte infectée. Le porteur indique que l'ostéomyélite provoque une douleur justifiant un traitement antalgique dès l'inoculation. Il affirme que ces modèles apportent des données "indispensables" et vise notamment à appuyer l'autorisation de mise sur le marché de l'antibiotique Ceftazidime-avibactam.

Objectifs

Dans ce travail nous évaluerons l’efficacité des antibiotiques seuls et en association dans un modèle d’infection ostéo-articulaire à bacilles Gram-négatif (BGN), bactéries de plus en plus fréquemment en cause en pathologie humaine. Ce modèle permettra d’évaluer l’histoire naturelle des ostéomyélites à BGN résistants aux antibiotiques (infections à germes multi résistants de plus en plus fréquemment rencontrées en raison de l’augmentation importante de la résistance aux antibiotiques dans le monde), et l’efficacité des traitements, ce qui n’a jamais été abordé dans ce type d’infection complexe. Trouver le meilleur traitement efficace, permettra en modèle chez l’homme de débuter de façon empirique un traitement antibiotique optimal avec la plus grande chance de succès thérapeutique pour une infection réputée difficile à traiter.

Bénéfices attendus

Les modèles expérimentaux apportent des informations indispensables pour l’utilisation optimale des antibiotiques et le traitement des infections bactériennes chez l’homme. Les modèles expérimentaux sont particulièrement utiles pour évaluer l’impact d’un mécanisme de résistance sur l’activité d’une antibiothérapie en termes d’effet bactéricide et de sélection de mutants résistants. Les données expérimentales peuvent, par ailleurs, servir de base aux recommandations de traitement des sociétés savantes, notamment quand les données cliniques manquent comme c’est le cas pour les ostéomyélites à bactéries Gram négatif (BGN). Notre travail sur l’antibiotique Ceftazidime-avibactam permettra également de donner des données solides pour l’approbation de son indication dans le traitement de l’ostéomyélite (AMM).

Procédures

Pour tous les animaux, inoculation localement dans le tibia d’une souche de bactérie type BGN multi-résistant sous cédation par Ketamine/Xylazine durant 30 minutes par animal, 1 jour donné. Pour tous les animaux, réalisation d’un prélèvement de 0,3 ml de sang après désinfection cutanée, à partir de la veine marginale de l’oreille à J1 et J24 pour la réalisation d’hémoculture sur animaux vigiles. Injection antibiotique sur animaux vigiles durant 7 jours 2 à 3 fois par jour en injection SC ou 1 fois en IM selon l’antibiotique pour tous les an

Impact sur les animaux

L’osteomyélite induite du tibia génère une douleur qui justifie un traitement antalgique dès l’innoculation initiale. Des signes neurologiques, des difficultés respiratoires pourraient être observés en cas d'extension de l'infection depuis le tibia. Des diarrhées sont possibles en lien avec l'administration d'antibotiques.

Devenir

Pour tous les animaux, mise à mort de tous les animaux par injection létale (de pentobarbital) puis dissection de la pate entière infectée de chaque lapin en fin de traitement (à J24).

Remplacement

Les modèles expérimentaux apportent des informations indispensables pour une utilisation optimale des antibiotiques et le traitement des infections bactériennes complexes. Les modèles expérimentaux sont particulièrement utiles pour évaluer l’impact d’un mécanisme de résistance sur l’activité d’une antibiothérapie en termes d’effet bactéricide et de sélection de mutants résistants. Les données expérimentales peuvent, par ailleurs, servir de base aux recommandations de traitement des sociétés savantes, notamment quand les données cliniques manquent comme c’est le cas pour les ostéomyélites à bactéries Gram négatif (BGN), en particulier BGN multirésistants.

Réduction

Douze animaux sont utilisés dans chaque groupe de traitement. Onze animaux par groupes permettent de mettre en évidence une différence de 50% entre les groupes avec une puissance de 80% et un risque de première espèce a de 5%, tout en considérant le risque de décès prématuré, soit 12 lapins dans chaque groupe. Ce nombre est le nombre minimal pour pouvoir interpréter les résultats, compte tenu de la variabilité inter-individuelle. Une analyse statistique non paramétrique par tests Mann-Whitney et Kruskal–Wallis, déjà utilisée dans nos travaux antérieurs compte-tenu du faible effectif (n

Raffinement

- La surveillance est particulièrement renforcée dans les 24 heures suivant l’inoculation de la bactérie où l’animal peut-être transitoirement géné par la procédure. - De notre expérience cette expérimentation est bien vécue par les animaux avec de façon exceptionnelle de rares animaux qui peuvent présenter une douleur résiduelle au niveau de la pate infectée. En effet, la procédure antalgique permet de couvrir largement la période douloureuse et permet une phase longue d’observation avant la suite de la procédure avec un délai entre l’expérimentation (inoculation) et la mise en place du traitement antibiotique 14 jours plus tard.

Choix des espèces

Le modèle d’infection sur prothèse ou d’ostéomyélite chez le lapin est facile à réaliser et il mime de façon très proche l’infection humaine. Ce modèle a déjà été évalué dans de multiples études, et dans nos travaux antérieurs déjà publiés. Jeunes adultes (12 à 14 semaines pour des raisons de croissance osseuse)

2 368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une chimiothérapie ou sont irradiées puis greffées de moelle pour reproduire une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et diarrhée attendues, avant d'être tuées par dislocation cervicale sous anesthésie pour prélever l'intestin. Le porteur teste divers facteurs censés renforcer la barrière intestinale et améliorer la survie. Il affirme qu'un "système biologique intégré" est "indispensable", la souris restant selon lui le modèle de choix.

Objectifs

L'étude de la barrière intestinale étant difficilement réalisable en pratique chez les patients, nous souhaitons utiliser des modèles murins de chimiothérapie/radiothérapie et de GvHDa. Notre objectif est de mieux comprendre et de renforcer l’effet de barrière de l’intestin de ces souris en intervenant sur leur microbiote/flore, leur mucus et leur trophicité épithéliale. Pour cela nous testerons individuellement chaque facteur susceptible de renforcer la barrière intestinale, puis l'association des facteurs ayant individuellement fait la preuve de leur efficacité.

Bénéfices attendus

Nous attendons que un ou plusieurs des facteurs testés (alimentation hyperprotéique, glutamine, vitamine D, Zinc, prébiotique et facteurs de croisssance intestinaux) permette : i. la diminution du retentissement clinique, de la perméabilité intestinale, du score histologique des dommages intestinaux, de la translocation intestinale et de la dysbiose ; ii. l' amélioration de la survie, de la citrulline plasmatique.

Procédures

1. Dans le modéle de chimiothérapie: les animaux recevront soit 5 jours de chimiothérapie par injection quotidienne intra-péritonéale. Il pourront également recevoir des gavages d'antibiotiques, de prébiotiques ou d'eau pendant une 10aine de jours. Le sacrifice sera réalisé à J6 ou J8 par rapport à l'initiation de la chimiothérapie. 2. Dans le modèle de gvHDa les animaux seront irradiés et recevront le lendemain une greffe de moelle par injection intrapétonéale ou injection dans le sinus retro-orbitaire (après anesthésie à l'isoflurane). Les animaux recevront le facteur testé sous forme de nourriture, de gavage ou d'injection sous-cutanée pendant 14 jours. Le sacrifice sera réalisé à J7. L'étude de la survie ne sera pas prolongée au delà d'un mois. Dans tous les cas, le sacrifice sera réalisé par discolation cervicale après anesthésie à l'isoflurane.

Impact sur les animaux

Perte de poids et asténie liée à la chimiothérapie, à l'irradiation et à laGvhDa qui peuvent également entrainer de la diarrhée. Administration par gavage ou voie sous cutanée de certains facteurs. Injection du greffon par injection intrapéritonéale ou dans le sinus retro-orbitaire (sous anesthésie par inhalation d'isoflurane concernant ce dernier).

Devenir

1. Modèle chimio: les animaux devront être sacrifiés à J6 ou J8 pour analyse de leur intestin. 2. >Modèle GvHDa: les animaux servant à la préparation des greffons sont sacrifiés sans aucune expérimentation au préalable. La majorité des animaux sont sacrifiés à J7 post-greffe pour étude leur intestin. L'étude de la survie n'est pas prolongée au delà de J30 post-greffe (euthanasie au delà).

Remplacement

Chez l’homme, il s'avère en pratique difficile d’évaluer l’atteinte intestinale avant ou lors de la déclaration d’une GvHDa du fait du risque et de la contrainte que constitue la réalisation d'examens endoscopiques digestifs répétés avec biopsies. L’utilisation d’un système biologique intégré est indispensable pour l’étude des conséquences de la chimiothérapie et de la GvHDa sur barrière intestinale. La souris reste un modèle de choix pour étudier la barrière intestinale (mucus/muqueuse/immunité) comparativement aux modèles plus éloignés dans l’évolution.

Réduction

Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques non appariés (test de Wilcoxon-Mann- Whitney, coefficient de Spearman). La littérature indique que les groupes doivent être constituées d'au minimum de 12 souris pour atteindre une puissance statistique suffisante. Le nombre prévu est de 15 souris par groupe contrôle et 25 par groupe traité. Une analyse intermédaire (sur le score histologique des dommages intestinaux) sera réalisée à 2/3 des inclusions par groupe, afin d'interrompre toute expérimentation montrant un résultat déjà significatif à ce stade. - La réalisation de l'étude i. de la perméabilité intestinale (FITC-Dextran), ii. de la survie sera toujours soumise à un GO/No GO et ne sera par conséquent réalisée qu'en cas d'effet positif de la condition testée sur le score histologique des dommages intestinaux. Ces mesures permettent de passer d'un effectif de 2368 animaux au maximum à un effectif de 947 animaux au mimimum.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans une animalerie EOPS agréée avec une surveillance quotidienne. L’environnement sanitaire sera donc idéal pour l’hébergement (température et hygrométrie réglementaire et stables). Les animaux livrés seront laissés en quarantaine pendant une semaine avec de la nourriture ad libitum. Les souris, hébergées par 2 à 5 individus/cage avec un enrichissement (batonnets en coton permettant la confection de cocons) seront manipulées par des personnels formés en possession d’une habilitation à l’expérimentation animale. Les expérimentations seront effectuées par un duo, toujours identique, afin de minimiser des différences inter-individuelles. L'injection du greffon dans le sinus rétro-orbitaire sera réalisée sous anesthésie. Avant dislocation cervicale les animaux seront anesthésiés. Le sacrifice sera réalisé à J7 avant que la perte de poids et la prostration liées à l'irradiation et/ou laGvHDa ne soient trop importantes. Durant l'étude de survie, les animaux avec une perte de poids > ou = à 20% ou atteints d'une prostration importante seront euthanasiés.

Choix des espèces

- La souris est un modèle de mammifère proche de l’Homme pour la physiologie intestinale. - Le laboratoire a créé une souris génétiquement modifiée pour renforcer le mucus intestinal. - La modélisation de la GvHDa chez des souris hybrides F1 est bien documentée. Adultes de 8 à 12 semaines (étude des animaux dont le systéme immunitaire est mature)