Procédures modérées

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations du gène c-MET associées à des mutations LPR ou GLD, elles reçoivent des injections censées induire une inflammation articulaire, subissent des ponctions de moelle osseuse sous anesthésie, puis sont tuées et disséquées pour analyse de leurs organes. Le porteur relie ce modèle au cas d'une patiente cumulant cancer du sein, syndrome myéloprolifératif et polyarthrite. Il affirme les modèles in vitro "limités" et juge ses lignées murines les seules à répondre à sa problématique.

Objectifs

A partir de l’observation, chez une jeune femme de 36 ans, d’une association inhabituelle de maladies graves (un cancer du sein, un syndrome myéloprolifératif de type Vaquez, et une polyarthrite rhumatoïde), nous avons fait la preuve du concept d’une approche individuelle en génétique constitutionnelle. Pour notre patiente, nous avions deux échantillons pathologiques: un fragment de son cancer du sein et un prélèvement de moelle osseuse. A l’aide d’une nouvelle technologie d’analyse génomique, nous avons identifié une mutation de l’oncogène cMET. C’est une mutation constitutionnelle, retrouvée dans l’ADN de la patiente et dont la valeur pathologique n’était jusqu’alors pas connue. Nous avons établi un modèle de transgénèse non dommageable pour cette mutation de c-MET chez des souris de fond génétique C57bl/6. La caractérisation phénotypique a mis en évidence des syndromes auto-immuns et myéloprolifératifs semblables à ceux observés chez la patiente. Cependant, les phénotypes restent peu sévères et n’altèrent en rien la survie des animaux. Un premier projet sur ces animaux a permis de montrer l'aspect multifactoriel de l'apparition des syndromes autoimmuns en associant cette mutation c-MET avec l'administration de molécules pro-inflammatoires. Toutefois, ce travail n'a pas permis de mettre en évidence de développement tumoral chez ces animaux. Notre objectif est de poursuivre l'étude de cette mutation c-MET et de démontrer son rôle dans l'apparition des cancers.

Bénéfices attendus

L'apparition des cancers trouvent souvent des origines multifactorielles. Cette mutation dans le gène c-MET peut être qualifiée de moyenne à faible pénétrence, ce qui signifie qu'elle ne peut, à elle seule, induire la survenue tumorale. Toutefois, nous penssons que l'on associe cette fragilité génétique à d'autres facteurs, cela peut aboutir à la formation de cancers. Au delà de l'étude des implications que peuvent avoir cette mutation c-MET dans le dévelopement de pathologies, cela constitue également un outil d'étude des fragilités génétiques aboutissant à l'apparition de tumeurs.

Procédures

2 nouvelles lignées ont été créés portant à la fois la mutation c-MET et une mutation du gène LPR ou GLD. Des modèles de souris mutés LPR ou GLD sont commercialisés et ces mutations sont associés à des syndromes auto-immuns tels que l'arthrite, et des lymphadénopathie aboutissant dans 10% des cas à des tumeurs chez les sujets âgés. Les souris double mutés c-MET et LPR ou GLD ont un phénotype non dommageable comparable à celui des souris seulement mutées pour le gène c-MET. La survenue des pathologies trouvant souvent leur origine dans des processus multifactoriels, nous souhaitons traiter ces souris afin de déterminer l’impact de facteurs additionnels sur l’aggravation du phénotype des animaux. Cette objectif sera atteint par l'injection de 2 composés, l'un permettant d'induire une inflammation, et l'autre se liant spécifiquement à cMET. La sévérité se traduira par l'observation d'un gonflement au niveau des articulations. Ce travail propose d’étudier des pathologies très diverses dont l’élément clé serait la mutation du gène MET pour lequel nous avons des modèles animaux pertinents, qui reproduisent la pathologie humaine et sur lesquels nous pouvons étudier les facteurs d’aggravation des phénotypes.

Impact sur les animaux

Les études précédentes sur les souris c-MET traitées avec du LPS et HGF ont montré l'apparition de syndrome auto-immuns sans pour autant induire de répercutions physiologiques visibles chez l'animal. Ici, l'association avec une mutation dans le gène LPR ou GLD devrait permettre d'amplifier ces phénotypes.

Devenir

A l'issu de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés et disséqués afin d'effectuer des analyses histologiques fines des organes, et ainsi qualifier les atteintes (apparition de tumeurs, syndromes auto-immuns, syndromes myéloprolifératifs).

Remplacement

Les modèles d’étude in-vitro sont limités et peu pertinent dans ce cas de figure exceptionnel. L’objectif de notre projet est d'étudier un modèle porteur d'une mutation du gène Met et de faire le lien génétique entre des maladies graves et très différentes telles que la polyarthrite rhumatoïde, des syndromes myéloprolifératifs de type Vaquez mais aussi des cancers. De ce fait, il est actuellement très difficile d’étudier ces pathologies très diverses in-vitro, et les modèles cellulaires dont nous disposons ont des résultats limités. Par ailleurs il s’agit aussi de proposer un projet qui s’inscrive dans une démarche préclinique a visée thérapeutique pour les patients porteurs de cette mutation et pour les patients atteints de ces pathologies. Aussi, les lignées murines uniques développées sont des modèles de choix puisqu’elles reproduisent fidèlement les atteintes humaines. Les modèles dont nous disposons sont les seuls qui permettent de répondre à notre problématique pour laquelle l’expérimentation animale ne peut pas être substituée.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé au minimum sur la base d’une étude statistique pour nous permettre d’atteindre les objectifs fixés. Ce nombre est porté à 144 souris. Tous les animaux sont disséqués selon un protocole rigoureux pour valoriser les animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les actes de ponctions de moelles seront réalisés sous anesthésie générale. Un suivi quotidien des animaux est assuré par les membres de l’animalerie et le personnel formé de l’unité. Pour assurer le bien-être des animaux, les souris sont placées en groupes sociaux et dans des cages avec enrichissement. Des points limites précoces ont été fixés pour limiter la gêne et la souffrance éventuelle des souris.

Choix des espèces

Ce projet utilisera 144 souris C57bl/6 portant la mutation cMET et la mutation LPR ou GLD mâles et femelles. En raison de ses bonnes performances de reproduction, cette souche a été utilisée pour la mise en place de la lignée transgénique. Le modèle murin est un modèle robuste et parfaitement caractérisé sur lequel il est relativement facile de réaliser des expériences de transgénèse. Souris adultes de 8 semaines. Les souris sont obtenues par croisements. Certaines seront utilisées pour les générations suivantes, les autres pour les injections d’HGF ou de LPS. Les animaux seront utilisés pour nos expériences dès l’âge de 8 semaines. En effet, la patiente chez laquelle la mutation Met a été découverte était agée de 36 ans lors du diagnostic. Nous nous plaçons ici dans les mêmes conditions pour nos souris jeunes adultes.

204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection de vecteurs viraux et implantation de fibres optiques ou de lentilles, un test d'évitement de lieu associé à des chocs électriques, puis une perfusion intracardiaque létale pour fixer le cerveau. Le porteur relie ce travail à l'évitement observé dans le stress post-traumatique et espère y trouver des cibles thérapeutiques. Il affirme qu'un "organisme vivant intègre" est nécessaire, aucun modèle in vitro ou informatique ne pouvant selon lui le remplacer.

Objectifs

Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans la persistance de l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les circuits liant l’hippocampe au noyau accumbens via le septum latéral. L’hippocampe a déjà été impliqué dans la persistance d’évitement de place et le noyau accumbens joue un rôle clef dans la génération du comportement d évitement. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’hippocampe contrôle la persistance de l’évitement de place chez la souris. Pour atteindre l’objectif général, nous réaliserons une caractérisation neuroanatomique et optogénétique des circuits neuronaux activés pendant l’encodage et le reversal de l’évitement de place. Un point clé de cette étude est l’aspect longitudinal indispensable à la caractérisation de ces circuits neuronaux. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ces différents circuits.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.

Procédures

Ce projet implique 4 procédures expérimentales décrites en item 4. Chaque procédure (classe modérée) comprend la chirurgie stéréotaxique pour des injections de vecteurs viraux (30-45 min), le comportement d’évitement de place (10-30 min par jour pendant 3-4 jours) et la perfusion intracardiaque (10 min). La procédure 3 comprend également une chirurgie stéréotaxique pour l’implantation de lentilles à gradient d’indice (30-45 min) et la pose d’une baseplate qui n’implique pas de chirurgie stéréotaxique (30-45 min) pour les études d’imagerie calcique. La procédure 4 comprend également une chirurgie stéréotaxique pour l’implantation de fibres optiques (30-45 min) pour les études d’optogénétique.

Impact sur les animaux

Le comportement d’évitement de place et la perfusion intracardiaque n’engendrent ni douleur ni stress. L'intensité du choc électrique choisie (maximum de 0.2 mA) est largement inferieure aux intensités de chocs classiquement utilisées dans la littérature (0,7 mA). Par ailleurs, ce protocole a été démontré comme n’étant pas plus stressant que l’exploration délibérée d’un environnement familier. Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures douloureuses, l’usage d’anesthésiques et analgésiques est prévu, avant, pendant et après la chirurgie (jusqu’à 8 jours).

Devenir

Notre étude nécessite d’une part de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose létale d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.

Remplacement

L’utilisation d'animaux vivants se justifie par la nécessité d’identifier des phénomènes physiologiques complexes au sein des circuits neuronaux impliqués dans le comportement d’évitement chez la souris, ainsi que leur interaction fonctionnelle. De nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent entre elles. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé à ce jour par des techniques in vitro. De plus, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques contrôlant la persistance de l’évitement actif restent inconnus.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 204 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. De plus, ce chiffre comprend le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires (pilotes), afin de 1) déterminer les conditions optimales lors des tâches comportementales de conditionnement et 2) mettre en place de nouvelles techniques, ce qui permettra de diminuer la quantité d’animaux utilisés à long terme. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.

Raffinement

Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont rapprochées les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri-opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés (la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement) et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical. Toutes les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 11 semaines. Les souris transgéniques seront élevées dans notre animalerie. Les procédures expérimentales débuteront après 1 semaine d’habituation. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris ne seront plus utilisées au delà de 10 mois.

600 rongeurs, 480 souris et 120 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 420 tués à l'issue et 180 réutilisés. Ils reçoivent plusieurs injections d'un immunogène émulsionné avec l'adjuvant de Freund, puis un rappel sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever leur rate et récupérer les anticorps. Le porteur indique que les bons répondeurs sont tués tandis que les mauvais répondeurs sont tués ou versés à un programme de formation. Il affirme le recours aux rongeurs "indispensable" et le prélèvement d'organes possible seulement sur un "organisme entier".

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps monoclonaux ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps monoclonaux soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après immunisation de l’animal, l’objectif est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’ajout d’une drogue immunosuppressive. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Les immunisations seront réalisées par voie intrapéritonéale dans un premier temps et par voie intrapéritonéale chez la souris ou intraveineuse chez le rat (stimulation forte des lymphocytes, qualifié de boost final). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris et le rat. Des prélèvements de sang pourront être réalisés à la veine sub-mandibulaire afin de suivre le niveau d’immunisation des souris ou la veine jugulaire chez le rat. A la fin du protocole, les prélèvements de rate et de ganglions lymphatiques seront réalisés afin de récupérer les cellules B productrices d’anticorps à la vue de la fabrication d’hybridome.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique de l’immunogène injecté à l’animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

Pour la génération d’anticorps monoclonaux chez la souris BALB/c ou le rat Wistar, nous effectuerons deux à trois injections par voie intrapéritonéale (i.p.) à quinze jours d’intervalle puis un rappel par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse, trois jours avant la mise à mort. Les administrations i.p. (5-10 ml/kg) sont réalisées sur animaux vigiles en contention. Lors de la première i.p., le liquide injecté contient l’immunogène émulsionné volume à volume avec (ou sans) de l’adjuvant complet de Freund. Les injections suivantes se déroulent de la même façon mais en présence (ou non selon la nature de l’immunogène) d’adjuvant incomplet de Freund. Quinze jours plus tard, le « boost » final est réalisé par voie intrapéritonéale (ou intraveineuse chez le rat). Ce dernier est réalisé via la veine pénienne sous anesthésie gazeuse. Pour ce rappel, l’immunogène est repris uniquement dans du tampon PBS dans un volume final de 0,1mL/animal. Trois jours plus tard, les animaux seront mis à mort et la rate sera prélevée stérilement. Les ganglions lymphatiques pourront également être récupérés. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’administration d’une drogue immunosuppressive. Deux à quatre injections ip seraient réalisées à 14 jours d'intervalle (soit 4 injections sur 42 jours au maximum), trois jours avant le début du protocole de l'immunisation décrit ci-dessus. Chez la souris, des prélèvements de sang via la veine mandibulaire permettront de tester la présence d’anticorps spécifiques dans le sérum. Le prélèvement sera réalisé sur souris vigiles. Un prélèvement sera réalisé un jour avant l’immunisation (basal) puis 7 jours après la deuxième immunisation et 7 jours après la troisième immunisation s’il y en a une. Le volume maximal prélevé est de 0,5 mL de sang total. Chez le rat, les prélèvements se feront au même timing par ponction de la veine jugulaire au travers du muscle pectoral sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4% pour l’induction puis maintien à 2% avec un mélange 50% air / 50% O2). Le volume maximal prélevé est de 1 ml. Un prélèvement terminal de sang pourrait être demandé par le sponsor. Dans ce cas, l’animal sera anesthésié comme indiqué ci-dessus, et un volume de 1 ml pour la souris et 4ml pour le rat serait prélevé. L’animal serait ensuite mis à mort.

Impact sur les animaux

Les points limites ont été fixés sur la base de l’évaluation de signes caractéristiques de la douleur mais aucune mortalité et souffrance n’est attendue dans ce projet (Raffinement). Une grille d’évaluation clinique avec établissement d’un score sera utilisée et des mesures adaptées seront prises pour réduire ou supprimer la douleur des animaux en fonction de ce score.

Devenir

Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une bonne réponse immunitaire seront sélectionnés. Ces animaux seront mis à mort afin de pélever leur rate pour récupérer les anticorps monoclonaux. Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une mauvaise réponse immunitaire ne seront pas sélectionnés. Ces animaux seront soit mis à mort ou gardés en vie pour être réhabilité dans un programme de formation.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules excrétrices d’anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été déterminé par un calcul de N = 10 animaux par série expérimentale. Ce nombre est suffisant pour générer les anticorps par la technique d’hybridomes.

Raffinement

L'acclimatation des animaux durera au minimum 5 jours. À réception, les souris seront collectivement hébergées (au minimum 3 souris par cage selon le poids) dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. Les rats seront hébergés par deux dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. L'eau et la nourriture (RM1, SDS Dietex, ou équivalent) seront données ad libitum. Les animaux auront accès à différents types d’enrichissements, changés de manière hebdomadaire afin d’éviter une éventuelle lassitude ou habituation (maison, coton, cubes de bois, rouleaux de carton, papier kraft). Les conditions d’hébergement et le bon état de santé́ des animaux seront contrôlés quotidiennement. Bien que aucune douleur ne soit attendue si les animaux venaient à présenter des signes de souffrance, des administrations de buprénophine seront réalisées jusqu'aux prélèvements terminaux. La buprénorphine serait administrée par voie sous cutanée, BID, à 0,01 mg/kg pour le rat et 0,05 mg/kg pour la souris. Pour les injections i.v., une anesthésie gazeuse à l'isoflurane sera utilisée.

Choix des espèces

Pour de nouvelles cibles antigéniques, l’utilisation d’animaux pour l’immunisation et la génération d’hybridomes reste nécessaire car aucun modèle in silico (modèle mathématique, analyse bio-informatique) ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d’un antigène. Les nouveaux modèles de génération d’anticorps monoclonaux (utilisation de souris transgéniques « xenomouse » produisant des anticorps humains ou immunisation in vitro de lymphocytes B de souris) ne permettent pas de s’affranchir également de l’utilisation des animaux. La maturité sexuelle des souris et des rats se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris BALB/c ou les rats Wistar seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation.

170 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée à l'issue de l'imagerie. Rendus diabétiques par la streptozotocine ou soumis à l'isoprotérénol pour induire une hypertrophie cardiaque, ils reçoivent chaque semaine, sous anesthésie, des prélèvements de sang et d'urine et l'injection d'un produit de contraste testé. Le porteur reconnaît qu'un surdosage d'isoprotérénol pourrait provoquer un infarctus mortel chez près d'un tiers des animaux. Il indique avoir mené des tests cellulaires préalables mais juge le recours à l'animal "primordial" pour valider la nanoparticule sur un organisme complet.

Objectifs

L'objectif du projet est de tester un composé stable, efficace et biocompatible pour l'imagerie par particules magnétiques (MPI). Le composé sera absorbé/retenu au niveau du cœur selon la préférence de substrat énergétique. Dans ce projet, il sera ciblé l’utilisation préférentielle des acides gras. En effet, nous souhaitons optimiser une technique d'imagerie multimodale (IRM et tomodensitométrie) non invasive qui discrimine des pathologies métaboliques.

Bénéfices attendus

Le projet fournira un nouvel outil d'imagerie pour discriminer les préférences de substrat énergétique du cœur. Le choix du substrat énergétique (principalement le glucose et les acides gras) est influencée par l'homéostasie et les pathologies cardiaques. Or, il n'existe actuellement aucune modalité d'imagerie qui combine les avantages d'une sensibilité et d'une résolution métabolique élevées. Le produit de contraste mis au point nous permettra de tester et de valider une nouvelle méthode d'imagerie multimodale afin de discriminer le substrat préférentiel et ouvrir ainsi de nouvelles stratégies diagnostiques et de la caractérisation des maladies cardiaques. La méthode à tester sera présentée lors de conférences et publier dans des journaux à comité de lecture.

Procédures

Les animaux seront soumis, selon le groupe d'enrôlement, à une injection intrapéritonéale unique ou quotidienne de streptozotocine (injection unique, 44 animaux) ou d'isoprotérénol (7 à 30 injections, 44 animaux). Du sang (de la veine caudale) et de l'urine (du massage abdominal) seront prélevés chaque semaine sous anesthésie pendant la procédure d'imagerie. Ils expérimenteront, lors de l'imagerie, une injection du nouveau ou du produit de contraste biocompatible testé pour le MPI.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress pendant les injections intrapéritonéales, les périodes de jeûne et les prélèvements de sang/urine. Celles-ci seront effectuées sur des courtes durées et uniquement par du personnel formé afin de réduire au maximum l'inconfort des animaux. Le modèle pharmacologique de l'hypertrophie cardiaque n'est pas signalé comme créant de détresse à long court chez les animaux. Néanmoins, un surdosage d’isoprotérénol pourrait provoquer un infarctus du myocarde mortel chez 30% des animaux. Cela sera évité par une injection à une dose optimale, un monitoring quotidien incluant une surveillance les changements de poids corporel. Concernant le modèle de diabète STZ, la durée de vie des animaux traités est raccourcie. Néanmoins, la fenêtre de mortalité est indiquée de 8 à 18 semaines. Or, cela dépasse la durée d’application de notre protocole expérimental appliqué aux animaux. Les procédures d'imagerie seront toutes réalisées sous anesthésie générale, sous thermorégulation et réveil assisté, pour surveiller et limiter l'inconfort des animaux.

Devenir

Selon le stade de suivi, les animaux pourront être euthanasiés à la fin des protocoles d'imagerie (procédures 3 ou 4). Les procédures 1 et 2 ne prévoient pas la mort de l'animal si ce n'est en cas d'événements indésirables incontrôlables ou d'atteinte d'un point limite nécessitant la mise à mort.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation d’animaux est limitée à l'étude de la biodisponibilité systémique du produit de contraste et à la caractérisation du statut métabolique dans le tissu cardiaque. Avant la phase d'étude in vivo, plusieurs tests sur lignées cellulaires immortalisées seront menés pour estimer les effets potentiels des agents de contraste à court et moyen terme, dont la cytotoxicité et les événements indésirables cardiaques. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est primordial afin d'avoir une validitié du concept sur les intéractions complexes du corps, et qui pourra être extrapoler aux réactions du corps de patients.

Réduction

Les animaux seront utilisés pour plusieurs procédures expérimentales, incluant compris l'imagerie, les analyses de sang et des prélèvements d'urine pour suivre l'absorption et la clairance du nouveau produit de contraste à tester. Cette approche transversale nous permettra d'utiliser le moins d'animaux possible pour la robustesse statistique et la solidité technique de notre nouvelle approche d'imagerie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions de soins en fonction de l'espace de cage individuel spécifique à l'espèce, des besoins sociaux, c'est-à-dire sans isolement (à l’exception des très courtes durées de déroulé des procédures), et de la stimulation avec enrichissement environnemental (igloo, bois à ronger...). De plus, les animaux seront suivis par du personnel formé aux meilleurs soins pour les rongeurs.

Choix des espèces

L'utilisation de rats (Wistar wild type) nous permet d'utiliser des techniques d'imagerie à haute résolution – imagerie par résonance magnétique 9.4T et CT – qui sont fondamentales pour révéler les caractéristiques précises de l'agent de contraste. Pour l'imagerie, les rats le meilleur rapport signal/bruit et ils peuvent être utilisés pour les deux modalités d'imagerie envisagées. De plus, les rats permettent la création des modèles pharmacologiques du diabète et de l'hypertrophie cardiaque, de manière reproductible et rapide. Adulte, à partir de 10 semaines afin d’avoir des animaux dont la croissance est achevée.

2 264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent sept jours de privation de sommeil paradoxal pour reproduire une fatigue chronique, passent un test moteur et exploratoire, puis sont tués par prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie ou par décapitation à la guillotine pour prélever le cerveau. Le porteur cherche à modéliser le syndrome de fatigue chronique et à y tester des molécules candidates. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour évaluer la fatigue chronique, rendant selon lui le recours à l'animal "nécessaire".

Objectifs

La fatigue chronique est l’un des principaux facteurs qui dégradent la santé humaine ; aussi appelée syndrome de fatigue chronique (SFC), il se définit comme un ensemble de symptômes d’épuisement intense et quasi permanent qui apparaissent sans raison apparente ou pathologie sous-jacente. Afin d'étudier la physiopathologie de la fatigue chronique, ce projet consiste : 1) Dans un premier temps, à mettre en place un modèle animal de fatigue chronique chez le rat. Les animaux seront exposés à une privation continue de sommeil à mouvements oculaires rapides (REM) pendant 7 jours. L’impact de cette privation de sommeil sera étudié dans un test de comportement moteur/exploratoire. A la fin de l’étude, différents prélèvements (sang et cerveau) seront réalisés pour des mesures de paramètres biochimiques; 2) Puis, dans un deuxième temps, l’objectif sera de tester, dans ce modèle, des médicaments candidats pouvant réduire la fatigue généralisée.

Bénéfices attendus

Les origines du syndrome de fatigue chronique (SFC) restent méconnues et à ce jour il n’existe pas de traitement spécifique au SFC dont l’efficacité ait été démontrée. Les traitements proposés visent à soulager les symptômes qui lorsqu’ils se manifestent de façon intense deviennent particulièrement invalidants pour le malade. Ce modèle est utile pour : 1) identifier les voies neurobiologiques impliquées dans ce syndrome; et 2) tester de nouvelles molécules candidats, pour améliorer sa prise en charge.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes régulières dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre les prélèvements de sang sont réalisés : 1) soit en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris entre 1 ml à 4 ml maximum ; 2) soit par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d’une nécessité de prélèvement sanguin important (supérieur à 4 ml). A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.

Impact sur les animaux

Durant la période d'induction de la fatigue , les animaux sont pesés et leur état général est évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance pour évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans un tableau définissant les points limites expérimentaux, et aussitôt analysées. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Par ailleurs, certains effets indésirables des produits tels que des crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après administration.

Devenir

L’impact de la privation de sommeil sera étudié dans un test de comportement moteur/exploratoire. A la fin de l'étude, pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à : 1) à un prélèvement de sang en intracardiaque sous isoflurane ou par décapitation (sous anesthésie générale) avec une guillotine dans le cas d'une nécessité de prélèvement sanguin important et 2) à un prélèvement de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative pour évaluer la fatigue chronique, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier la physiopathologie de la fatigue et évaluer l’efficacité de nouvelles molécules qui pourrait la réduire.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Ils seront pesés et leur état général évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques, par un personnel dûment formé. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans un tableau définissant les points limites expérimentaux, et aussitôt analysées. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rats correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Espèce/lignée utilisée : rat mâles Sprague-Dawley Ce modèle est reconnu et sa validité a été démontrée chez le rat. Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.

72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumis cinq mois à un régime riche en graisse et en sucre pour induire un état prédiabétique, ils passent des IRM cardiaques sous anesthésie, un test de tolérance au glucose et des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tués par injection létale pour prélever leurs organes. Le porteur affirme vouloir tester la vitamine D comme protection du cœur, avec pour objectif déclaré de proposer un jour cette approche chez l'humain. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut aujourd'hui remplacer le rat, qu'il juge proche de la physiologie cardiaque humaine.

Objectifs

Le but de ce projet de recherche est de proposer une approche thérapeutique simple et innovante afin de protéger le coeur prédiabétique mâle et femelle dans le but ultime de proposer cette approche thérapeutique à l'Homme. Plus précisément,, nous chercherons à mettre en évidence l’effet d’une supplémentation en vitamine D sur le développement des altérations cardiovasculaires précoces chez des animaux mâles et femelles prédiabétiques soumis à un régime riche en graisse et en sucre. Le prédiabète est un véritable enjeu de santé publique car au regard de sa durée longue et réversible, il offre une fenêtre thérapeutique très pertinente. Par ailleurs, la vitamine D a des effets importants sur le système cardiovasculaire en régulant le métabolisme du calcium, l’immunité et l’inflammation et pourrait exercer un effet protecteur sur les altérations cardiovasculaires précoces associées au prédiabète. Au laboratoire, nous avons acquis une solide expérience dans la caractérisation des atteintes cardiovasculaires induites lors du prédiabète et du diabète de type deux selon le sexe sur l’animal in vivo.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d’étudier l’effet de la supplémentation en Vitamine D sur le développement des altérations cardiovasculaires précoces chez des animaux mâles et femelles prédiabétiques soumis à un régime riche en graisse et en sucre dans le but ultime de proposer cette approche thérapeutique chez l’Homme.

Procédures

Nous utiliserons une approche multiparamétrique in vivo combinant les techniques d’imagerie (IRM) de résonance magnétique à une étude de l'homéostasie glucidique et à des analyses biochimiques sur différents tissus. Le modèle animal utilisé sera le rat soumis à un régime riche en graisse et en sucre (HFS) pendant 5 mois, qui mime une alimentation déséquilibrée retrouvée fréquemment dans les pays développés. Nous définirons 3 groupes mâles et femelles de 12 animaux : un groupe contrôle avec une alimentation normale, un groupe sous régime HFS et un groupe sous régime HFS supplémenté par la vitamine D pendant les deux derniers mois de régime. Pour l’ensemble du projet, le nombre maximum d’animaux sera de 36 mâles et 36 femelles, soit un total de 72 rats. Une pesée hebdomadaire et une mesure de la prise alimentaire seront faites toutes les semaines pendant les 5 mois de régime. Les altérations cardiovasculaires seront suivies de manière non invasive in vivo par IRM après 3, 4 et 5 mois de régime. Après 5 mois de régime, un test de tolérance au glucose et une mesure de l’insuline seront faits afin de vérifier l’état prédiabétique et le métabolisme glucidique des animaux. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par injection léthale d'euthasol (400 mg/kg) et des tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques.

Impact sur les animaux

Lors de l'IRM, les rats seront anesthésiés par un mélange d’isoflurane (2%) et d’oxygène (1 L/min) à l’aide d’une chambre d’induction et le bien-être animal sert assuré par le maintien des constantes vitales de l'animal. Pour le test de tolérance au glucose et la mesure de l'insuline à jeun ou l'anesthésie ne peut pas être réalisée,une compresse d'eau chaude sera placée sur la queue de l'animal afin de faciliter le prélèvement de la goutte de sang le plus rapidement possible. Afin d'éviter toute infection, la queue de l'animal sera désinfectée avant et après la procédure avec de la bétadine jaune. Les jours suivants, nous vérifierons la bonne cicatrisation de la queue de l'animal. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par injection d'euthasol (400 mg/kg) et des tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques.Tout le long du projet, le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. L'eau et la nourriture seront mises à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Tous les rats seront visités quotidiennement à la recherche de signes douloureux ou de comportement anormal par un personnel entraîné et compétent. Une grille d'évaluation de la douleur, mise en annexe du projet (annexe 2), nous permettra de calculer un score et d'agir en conséquence après avis vétérinaire.

Devenir

A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés.

Remplacement

A l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode de substitution in vitro et in silico pour étudier l'effet de la supplémentation en vitamine D sur les complications cardiovasculaires précoces associées au prédiabète selon le sexe. De nombreuses similitudes existent entre la physiologie cardiaque des rongeurs, particulièrement celle du rat, et celle de l'homme. Les modèles pathologiques chez les rongeurs sont utilisés au laboratoire depuis de nombreuses années et toutes les techniques d'imagerie de résonance magnétique dans ce projet ont été caractérisées au sein même du laboratoire.

Réduction

Notre approche expérimentale permettra de réduire de façon drastique le nombre d'animaux en accord avec la règle des 3R. En effet, les mêmes animaux seront utilisés pour les analyses décrites (examen par IRM, test de tolérance au glucose et mesure de l'insuline). A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques. Le nombre d'animaux dans ce projet est le minimun nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes et a été déterminé à l'aide d'une analyse statistique utilisant le logiciel Statistica.

Raffinement

L'étude par IRM se fera sous anesthésie inhalée afin de réduire l'angoisse et la douleur. La température corporelle sera maintenue à 37°C pendant l'examen à l'aide d'une couverture chauffante et vérifiée avec une sonde rectale. A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés par une dose lethale d'euthasol (400 mg/kg) et différents tissus seront prélevés. L'impact environnemental sera pris en compte par une phase d'acclimatation des animaux de quelques jours. Le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. L'eau et la nourriture seront mises à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Les animaux seront pesés une fois par semaine par les expérimentateurs pendant les 5 mois de régime. Les animaux seront aussi régulièrement manipulés par les expérimentateurs pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Tous les rats seront visités quotidiennement à la recherche de signes douloureux ou de comportement anormal par un personnel entraîné et compétent. Les points limites seront déterminés en fonction des observations définies par Morton et Griffiths (1985). Une grille d'évaluation de la douleur, mise en annexe du projet (annexe 2), nous permettra de calculer un score et d'agir en conséquence après avis vétérinaire.

Choix des espèces

Le modèle de rat nourri avec un régime HFS permet de développer un modèle de prédiabète reproduisant la même genèse que chez l’Homme et de suivre ces effets sur l’organisme, en particulier le cœur. Le modèle HFS a été décrit pour induire un état prédiabétique. Les rates soumises à ce régime présentent une altération de l’homéostasie glucidique, une dysfonction cardiaque précoce des trois mois de régime, ainsi qu’une sensibilité plus importante aux lésions d’ischémie-reperfusion caractérisée par une altération du métabolisme énergétique et de la fonction cardiaques, par comparaison aux rates contrôles sous-alimentation normale. Les animaux seront âges de 6 semaines à l’achat et de 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement des animaux.

50 chiens porteurs de tumeurs naturelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée à l'issue pour autopsie, dix réutilisés dans d'autres procédures et dix proposés à l'adoption. Ils reçoivent pendant environ six semaines des traitements hebdomadaires, jusqu'à sept prises de sang par jour, des biopsies répétées et une résection chirurgicale de la tumeur en fin d'étude. Le porteur reconnaît un risque de syndrome de libération de cytokines, avec fièvre, déshydratation et perte d'appétit. Il indique que ces chiens, issus d'éleveurs et fournisseurs agréés, sont transférés vers l'établissement pour être traités, et présente l'espèce cible comme "requise" pour démontrer l'efficacité d'un médicament vétérinaire.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé mondial important qui possède un taux d’incidence et de mortalité en constante augmentation, aussi bien chez l’Homme que chez les animaux. Le nombre de traitements vétérinaires indiqués contre le cancer canin est très limité. Actuellement la première approche qui peut permettre de réduire la masse tumorale est la chirurgie. Mais elle peut se révéler inutilisable en fonction de la localisation de la tumeur, voire insuffisante en cas de présence de métastases. La chimiothérapie et la radiothérapie sont aussi des solutions utilisées en deuxième intention pour traiter le cancer. Mais ces solutions possèdent, elles aussi, leurs limites. En effet, ces méthodes sont, elles aussi, parfois inefficaces car certaines tumeurs sont dites chimiorésistantes ou radiorésistantes. De plus, ces types de traitements ont des effets secondaires importants. Ils nécessitent également un matériel adapté ainsi qu’une gestion spécifique des effluents et déchets radioactifs et chimiques générés (risque de pollution pour l’environnement). Il est donc important de développer une nouvelle option thérapeutique qui pourra traiter un plus grand nombre de tumeurs avec un mode d’administration et une logistique des déchets plus simple.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’évaluation précoce de l’efficacité et de l’innocuité de nouveaux traitements médicaux à visée anti-tumoral chez le chien. En fonction des résultats obtenus, ce projet pourrait conduire au développement d’un traitement antitumoral chez le chien. Cette nouvelle thérapie permettra à la fois de lutter contre le développement des tumeurs et de réduire les risques de développement de métastases. En raison de l’activité immunomodulatrice de ces traitements, un panel de tumeurs canines sont ciblées : ostéosarcome, sarcome des tissus mous, glioblastome, tumeurs mammaires…

Procédures

Les animaux seront traités régulièrement (environ une fois par semaine) avec un traitement par voie orale, par intraveineuse (IV), intratumorale ou sous-cutanée pendant environ 6 semaines. Les prélèvements prévus dans la procédure sont les suivants : - Prises de sang : jusqu’à 7 fois par jour, 10 fois par semaine pendant 6 semaines consécutives. Le volume prélevé ne pourra en aucun cas dépasser 7.5% du volume total circulant d’un animal sur 24h ou 15% sur 28 jours. Si le volume total prélevé sur 24 heures atteint 7.5%, la prochaine prise de sang ne pourra pas être réalisée dans les 7 jours suivants (pour laisser un temps de récupération). - Prélèvements d’urine par cystocentèse, ou sondage urinaire, jusqu’à une fois toutes les deux semaines. - Biopsies (punch : 2 à 4 mm de diamètre) de la tumeur, jusqu’à 3 fois sur la durée de l’étude. Pendant le temps des prélèvements, les animaux pourront recevoir des analgésiques ou pourront être anesthésiés ou tranquillisés pour une courte durée, afin de réduire la douleur, l’angoisse ou la souffrance de l’animal. La décision de l’analgésie, de l’anesthésie ou de la sédation dépendra de plusieurs facteurs comme : les prélèvements à réaliser, du comportement des chiens, de la facilité de manipulation. - La résection chirurgicale de la/les tumeur(s) mammaire(s) en fin d’étude sera réalisée sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les produits candidats ont pour objectif d’activer le système immunitaire des animaux. Le principal risque associé, pourrait être une suractivation du système immunitaire, qui entrainerait un syndrome de libération de cytokines. Ce syndrome peut entraîner des symptômes d’intensité faible à sévère comme : de la fièvre, une déshydratation, de l’apathie, une perte d’appétit. Afin de pouvoir objectiver les effets secondaires à l’administration du traitement et adapter le suivi clinique de chaque chien, les chiens seront hébergés individuellement pendant 8 heures (avec contact visuel et olfactif) après l’administration du traitement. Afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité de ces nouveaux traitements, des prélèvements devront être réalisés (sang, urine, biopsies de la tumeur…) ainsi qu’une résection chirurgicale de la/des tumeur(s) en fin d’étude. Ils peuvent générer un stress et de l’inconfort : au moment du geste pour ceux réalisés vigile, ou en post-opératoire pour ceux réalisés sous anesthésie générale. Les contentions liées à ces gestes peuvent générer du stress chez les animaux. La réalisation de biopsies et/ou la résection chirurgicale de la/des tumeur(s) pourraient induire des saignements, des gonflements, une infection, des ulcérations, une altération voire une destruction des tissus traversés. L’anesthésie pourrait générer : un stress au moment de l’induction, de l’inconfort, de la nausée et du stress au moment du réveil. Dans le cas où l’efficacité du candidat ne serait pas suffisante, il est possible que la tumeur continue de se développer (augmentation de la taille et développement de métastases).

Devenir

Les animaux pourront être mis à mort en fin de procédure pour autopsie, prélèvements d’organes ou de tissus pour évaluer l’innocuité et/ou l’efficacité des produits testés. Si au cours de la procédure ou à la fin de la procédure, l’animal présente un état de santé dégradé et qu’il atteint des points limites sévères l’animal sera euthanasié. À la fin de la procédure si l’animal recouvre un bon état physique/clinique, il pourra être (sur décision du vétérinaire désigné) mis à l’adoption ou être inclus dans une autre procédure.

Remplacement

Des études précliniques avec des candidats ont déjà été réalisées in vitro et in vivo sur rongeurs, chiens sains, chats, et sur l’Homme. Ces tests ont montré des résultats favorables. Après cette première étape, le recours aux animaux ayant développé une tumeur est requis, afin de pouvoir évaluer l’efficacité et l’innocuité du candidat médicament chez la population cible. En effet, l’efficacité d’un produit vétérinaire anti-tumoral doit être démontrée sur l’espèce cible. Car les études d’efficacité nécessitent de travailler sur un organisme entier, mettant en jeu des interactions entre différents tissus/organes impliqués dans le métabolisme et le/les effets physiologiques et thérapeutiques du futur candidat médicament.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, seul le ou les composé(s) ayant les meilleurs profils pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et la meilleure innocuité, seront testés sur les animaux présentant une tumeur. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum lors des premières études exploratoires (jusqu’à 10 animaux par composé à tester soit 5 composés maximum). Ces études permettront de caractériser plus précisément les variabilités existantes inter-individus ainsi que les variabilités existantes entre les différents types de tumeurs incluses. Grace à ces informations, le nombre minimum d’individus le plus pertinent pourra être inclus dans les études suivantes. Pas d'étude biostatistique pour ce projet. Chaque chien sera son propre contrôle, c'est à dire que l'on comparera la tumeur avant/après ainsi que l'état clinique avant/après. Ceci permettra de réduire le nombre de chien inclus dans la procédure.

Raffinement

Des chiens présentant naturellement des tumeurs issues d’établissement éleveurs ou fournisseurs agréés seront inclus dans les études. Les animaux présentant des tumeurs (tumeurs mammaires dans un premier temps) seront alors transférés au sein de l’établissement utilisateur pour être traités. Afin de permettre un traitement le plus précocement possible, un chien seul peut être inclus dans la procédure. Dans ce cas, il sera mis en hébergement avec au moins un autre compagnon compatible durant cette période. Ce ou ces compagnons seront des chiens déjà présents au sein de l’établissement utilisateur et qui seront en période de repos entre deux études. Ils bénéficieront de zones de jeu avec interaction avec l’Homme. Les jouets présents dans les zones d’hébergement et dans les zones de jeu sont régulièrement changés pour favoriser la curiosité. Une période d’acclimatation systématique est mise en place. Si la durée n’est pas suffisante elle sera rallongée jusqu’à ce que les animaux soient aptes à entrer dans la procédure. Le personnel intervenant dans l’étude sera formé aux examens et prélèvements afin de travailler avec le plus d’expertise possible. Les animaux sont observés quotidiennement, ou plus si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal et/ou toute anomalie clinique non attendue. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le responsable de l’étude, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal et/ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal. En cas de syndrome de libération de cytokines, un traitement avec des corticoïdes, une réhydratation et/ou un traitement symptomatique digestif seront prescrits pour diminuer les effets dus à ce syndrome. Un suivi clinique rapproché de l’animal sera également mis en place. Des points limites seront définis pour apporter des soins adaptés ou une exclusion de l’étude avec d’autres soins ou une euthanasie si nécessaire. Afin de limiter le stress lié aux actes (contention, traitements, prélèvements, …), ces actes seront travaillés sur les chiens en renforcement positif avec friandises et caresses lors de trainings pendant l’acclimatation puis pendant toute la durée de l’étude. La Structure du Bien Être Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

Espèce cible de la pathologie investiguée. Les animaux utilisés seront des animaux ayant naturellement développés une tumeur. Une tumeur chez le chien peut se développer quel que soit l’âge de l’animal, bien que les animaux les plus âgés sont les plus souvent atteints (en particulier pour les tumeurs mammaires).

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun, un gavage, des prélèvements de sang et l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique, avec induction d'un diabète et d'une inflammation intestinale. Le porteur reconnaît une polydipsie, un poil hérissé, une léthargie, un dos courbé, une ataxie et des tremblements possibles. Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais présente le recours à la souris comme nécessaire pour ces dialogues inter-organes.

Objectifs

L’intestin est directement en contact avec le bol alimentaire et les bactéries de la flore intestinale et assure donc un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage concomitant de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2 (DT2), les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit indépendemment de l'obésité et de l'hyperglycémie, à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline contribue, indépendemment de l'obésité, à l'hyperperméabilité intestinal et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales. Notre projet permettra l'identification dans l'épithélium intestinal des cibles cellulaires et des voies de signalisation dérégulées au cours de la résistance à l'insuline, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

-1 lot d’animaux vigiles fera l’objet d’une mise à jeun (14h), de 6 à 7 contentions (45 secondes chacune), d’une administration orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -1 autre lot d’animaux vigiles fera l’objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 7 à 8 contentions (45 secondes chacune), de 2 administrations orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les prélèvements, l’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou encore les douleurs post-opératoire (implantation de la pompe) ou liées à l’inflammation intestinale. De plus, la chirurgie comporte un risque pour l'animal lié à l'anesthésie (réveil, dépression respiratoire, hypothermie). Les souris rendues diabétiques présenteront une polydipsie associée à une glycosurie. L’implantation des pompes osmotiques en sous cutanée peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale, l’infection par des entéropathogènes, ou l’induction d’un diabète, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux issus de souris diabétiques pour démontrer que la résistance à l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend au total 480 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests statistiques adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser la réponse des cellules épithéliales intestinales à l'insuline à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas à l’insuline. Cette technique ne nécessite donc aucun traitement chez la souris. Elle permet également à partir d'une seule souris d'étudier plusieurs parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post-opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Par ailleurs, le choix de cette espèce est motivé par la volonté de comparer les résultats de ce projet obtenus sur des modèles de perte d'action globale globale de l'insuline à ceux d'un autre projet obtenus sur des souris génétiquement modifiées, déficientes pour l’action de l’insuline spécifiquement au niveau intestinal. Les souris utilisées seront âgées de 12 à 14 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.