Procédures modérées
Étude de la locomotion et de la force musculaire chez des souris modèle pour des maladies polyGlycines neurodégénératives et neuromusculaires.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Les souris qui s'isolent, cessent de bouger, s'automutilent ou maigrissent jusqu'à la cachexie sont mises à mort. 192 souris porteuses de mutations liées à des maladies neurodégénératives et neuromusculaires humaines sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue par une chirurgie terminale de quinze minutes sans réveil. Chacune passe huit sessions de tests entre 3 et 17 mois, une mesure de force musculaire répétée trois fois, un test d'agilité et d'endurance en trois essais de cinq minutes, trente minutes d'activité ambulatoire et un test d'équilibre et de motricité fine, avec l'apparition attendue d'ataxie, de tremblements et de faiblesse musculaire. Les pistes thérapeutiques annoncées restent au registre de l'espoir. La dégradation locomotrice, elle, fait partie du protocole.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier le phénotype locomoteur et la force musculaire dans des souris modèles de maladies humaines neurodégénératives et neuromusculaires génétiques. Ces maladies sont dues à des anomalies de l’ADN qui entrainent une perturbation du fonctionnement des neurones et des muscles squelettiques des patients, conduisant à des altérations de leur locomotion et de leur mouvements (perte d’équilibre, tremblements, faiblesse musculaire, etc.). Nous souhaitons donc générer des modèles de souris pour ces maladies pour ainsi étudier leur phénotype locomoteur et leur force musculaire, via une batterie de tests non invasifs. La compréhension de l’effet de ces mutations sur le fonctionnement du cerveau et des muscles squelettiques nous permettra ainsi de mieux comprendre ce type de maladie chez l’homme et, ainsi, espérer découvrir des pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Nous avons besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier des maladies humaines neurodégénératives et neuromusculaires génétiques. En effet, il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la complexité et l’ensemble des symptômes neurodégénératifs, la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion typiques de ces pathologies et à l’échelle d’un organisme entier. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier ces maladies. Le développement et l’analyse de ces nouveaux modèles animaux nous permettront de mieux comprendre les mécanismes et de tester la pertinence de pistes thérapeutique pour ces maladies.
Procédures
1 – L’injection d’analgésique requiert moins d’une minute. Chaque animal sera injecté une première fois à l’âge de deux mois puis tous les deux mois pour l’analyse de la force musculaire. 2 – L’injection de produits anesthésiques requiert moins d'une minute. Chaque animal ne sera anesthésié qu’une seule fois (à l’âge de deux mois). 3 – Les injections de vecteurs viraux requièrent entre 30 secondes et 1 minute par animal. Chaque animal ne sera injecté qu’une seule fois (à l’âge de deux mois). 4 – Les tests locomoteurs sont organisés en sessions avec une mesure de la force musculaire (répétée trois fois, environ 8 minutes total par animal), un test d’agilité et d’endurance (3 essais de 5 minutes chacun), un test d’activité ambulatoire (30 minutes par animal) et un test d’équilibre et de motricité fine (3 essais de 5 min/ animal). Ces sessions seront répétées tous les deux mois et donc chaque souris sera testée 8 fois (la première session de tests à l’âge de 3 mois et la dernière à 17 mois). 5 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 6 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée tous les deux mois et donc chaque souris sera testée 8 fois (de l’âge de 4 mois a 18 mois). 6 - La chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil dure 15 minutes et résulte en la mort de l’animal
Impact sur les animaux
L’injection de produit analgésique peut induire une légère douleur passagère au moment de l’administration et un léger stress lié à la contention de l’animal. De même, l’injection de produits anesthésiques, bien que réalisée sous analgésie, peut induire un léger stress lié à la contention de l’animal. La mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie et analgésie. La chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil induit un stress et une douleur de courte durée au moment de l’anesthésie, ainsi qu’une hypothermie et une dépression cardiorespiratoire. Les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’activité locomotrice de ces animaux sont classiques, non invasifs et sans douleur, mais peuvent induire un léger stress causé par la manipulation des animaux. Enfin, nous souhaitons étudier des maladies neurodégénératives et neuromusculaires touchant les adultes, et ceci en modèle animal, nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices, de faiblesse musculaire et/ ou de signes neurodégénératifs (ataxie, tremblements, etc.) chez ces souris.
Devenir
L’ensemble des souris seront mises à mort à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus (muscle, cerveaux, etc.) pour des analyses histopathologiques et moléculaires.
Remplacement
Cette étude a pour but l'étude de maladies neuromusculaires et/ou neurodégénératives causées par des mutations génétiques. Nous souhaitons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de ces mutations et notamment leurs effets sur la locomotion, la force musculaire et l’apparition de troubles neurodégénératifs (ataxie, tremblements, etc.). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces mutations à l’échelle de l’organisme entier ; des modèles cellulaires ou in vitro ne peuvent pas reproduire ces troubles de la locomotion et de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de ces maladies.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents nous ont permis d’établir les temps et méthodes d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux chacun permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la présence de la mutation (comparaison des souris exprimant la mutation génétique versus des souris contrôles). Compte tenu de notre projet d’analyser les conséquences de mutations responsables de plusieurs maladies à inclusions intranucléaires à la fois sur les muscles squelettiques et les neurones du système nerveux central, nous estimons que l’étude de 192 animaux sur 5 ans est nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Afin de prévenir toute douleur, la procédure expérimentale se fait sous anesthésie et analgésie. De plus, afin de limiter d’éventuelles douleur induite par l’apparition de symptômes locomoteurs, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront mis à mort avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. A ce titre, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. De même, des points limites ont été définis, et si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté, etc.), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. Toutefois, en cas de douleur forte et de dépassement des points limites (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.), les animaux seront mis à mort rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience sera stoppée.
Choix des espèces
La souris est l'animal de choix pour l'études de mutations génétiques responsables de pathologies à l’échelle de l’organisme entier. Notre objectif est d'étudier des mutations responsables de maladies neuromusculaires et/ou neurodégénératives génétiques, et plus précisément leur rôle sur l’apparition d’altérations locomotrices et/ou d’une faiblesse musculaire. Aucun modèle d’expérimentation in vitro ou cellulaire ne peut mimer ou refléter toute la complexité de ces mécanismes biologiques. Nous allons étudier le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris sevrées et adultes (>2mois), car les mutations que nous étudions conduisent à des maladies de l’adulte (>40 ans). Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 18 mois. Ce protocole a été choisi d’après l’étude de la littérature et afin de reproduire l’aspect progressif des maladies que nous étudions.
Evaluation préclinique de l’efficacité d’inhibiteurs de protéases dans des modèles d’hypersensibilité viscérale chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un cathéter est implanté dans le côlon de 800 rats sous anesthésie, puis des substances leur sont administrées une à deux fois par jour pendant dix à quatorze jours, avant des mesures de distension colorectale menées sur animal vigile. Les procédures impliquent un niveau de souffrance qui va de léger à sévère, et le porteur y attend des réponses douloureuses aiguës, une diarrhée possible et des signes d'inconfort abdominal. Le texte annonce pourtant que l'approche sera testée chez la souris, alors qu'aucune souris ne figure au projet et que les 800 rats en constituent l'effectif entier. Tous sont tués à la fin de chaque procédure pour prélever des tissus et des organes.
Objectifs
Nos recherches suggèrent qu’une des causes possibles de ces douleurs est une enzyme produite en quantité anormalement élevée dans l’intestin chez certains patients. Cette enzyme, fabriquée par les cellules qui tapissent la paroi intestinale, peut stimuler les nerfs sensoriels et rendre l’intestin plus sensible à la douleur. Pour agir sur ce mécanisme, nous avons développé une molécule capable de bloquer spécifiquement cette enzyme. Afin qu’elle agisse directement à l’endroit souhaité, nous souhaitons l’intégrer dans une microcapsule conçue pour résister au passage dans l’estomac puis se fixer sur la muqueuse intestinale afin de libérer le traitement au plus près de la paroi de l’intestin. Nous testerons ensuite cette approche chez la souris dans des modèles reproduisant une hypersensibilité intestinale, c’est-à-dire une sensibilité exagérée à la douleur digestive. Si le traitement permet de diminuer cette douleur, cela constituerait une première étape importante vers le développement d’une nouvelle solution pour soulager les douleurs persistantes chez les patients atteints de MICI
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) représentent un enjeu majeur de santé publique. Malgré le contrôle de l’inflammation et l’entrée en rémission, 30 à 50 % des patients continuent de souffrir de douleurs abdominales persistantes liées à une hypersensibilité viscérale, pour lesquelles les options thérapeutiques restent limitées. Les bénéfices scientifiques attendus à court terme concernent une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette douleur persistante, notamment le rôle d’une protéase surexprimée chez les patients atteints de maladie de Crohn en rémission. Le projet permettra également de caractériser son implication dans l’activation des voies sensorielles intestinales et dans l’installation de l’hypersensibilité viscérale. Cette étude permettra par ailleurs d’évaluer une stratégie thérapeutique innovante basée sur l’administration locale d’un inhibiteur sélectif de cette protéase, formulé sous une forme permettant une délivrance ciblée au niveau de l’épithélium intestinal. Les travaux fourniront des données précliniques essentielles sur l’efficacité de cette approche dans des modèles d’hypersensibilité viscérale. À moyen et long terme, les résultats obtenus pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques destinées à améliorer la prise en charge des douleurs persistantes chez les patients atteints de MICI en rémission, répondant ainsi à un besoin médical actuellement insuffisamment couvert. Le recours au modèle animal est nécessaire dans ce projet afin d’évaluer l’effet du traitement dans un organisme entier intégrant les interactions complexes entre l’épithélium intestinal, les systèmes nerveux et les mécanismes physiologiques impliqués dans la perception de la douleur, qui ne peuvent actuellement pas être reproduits intégralement par des méthodes alternatives in vitro.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale unique consistant en l’implantation d’un cathéter au niveau du côlon proximal sous anesthésie générale, avec analgésie péri- et post-opératoire. La durée de l’intervention est d’environ 30 à 60 minutes, suivie d’une période de récupération de 3 jours avant début des administrations. Les animaux recevront des administrations répétées via le cathéter pendant 10 à 14 jours (1 à 2 fois/jour), ainsi que des traitements expérimentaux principalement par voie orale, et selon les besoins par voies intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou intracolique. Les traitements sont administrés pendant 7 à 14 jours (1 à 2 fois par jour). Les mesures de sensibilité viscérale sont réalisées chez l’animal vigile : au minimum 2 mesures ou des mesures répétées chaques jours selon le protocole. Les animaux sont suivis cliniquement (état général, comportement, poids) pendant toute la durée des procédures. L’euthanasie est réalisée à la fin de chaque protocole avec prélèvements de tissus pour analyses.
Impact sur les animaux
Procédure 1: Les effets indésirables attendus sont principalement liés à l’intervention chirurgicale et aux manipulations intestinales. Ils peuvent inclure : douleur et inconfort post-opératoires transitoires, inflammation locale au site d’implantation du cathéter, risque d’infection ou de désunion des sutures, ainsi qu’une diminution temporaire de l’activité et de l’appétit. Des troubles digestifs (diarrhée, modification de la consistance des selles) peuvent également être observés en lien avec les administrations intracoliques de la molécule. Procédure 2: Les effets indésirables attendus sont liés à l’induction pharmacologique et aux mesures de distension colorectale chez l’animal vigile. Ils incluent une hypersensibilité viscérale transitoire, des signes d’inconfort abdominal (contractions, agitation), une possible diarrhée aiguë, ainsi qu’un stress lié aux manipulations et à la contention. Lors des distensions colorectales, des réponses douloureuses aiguës peuvent être observées
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés.
Remplacement
La douleur abdominale étudiée dans ce projet résulte de mécanismes complexes impliquant à la fois le système nerveux de l’intestin, le système nerveux central et certains médiateurs biologiques. Elle se traduit par une sensibilité accrue à des stimulations mécaniques de l’intestin et par des comportements de douleur qui nécessitent une intégration de l’ensemble de l’organisme. L’évaluation de cette douleur repose sur des réponses globales de l’animal (réactions comportementales et sensibilité à la distension de l’intestin), qui ne peuvent pas être reproduites dans des systèmes cellulaires ou des modèles simplifiés. En effet, ces approches ne permettent pas de prendre en compte les interactions entre l’intestin, le système nerveux et les comportements de douleur. Le recours à un modèle animal est donc nécessaire pour étudier ces mécanismes dans un organisme complet et évaluer l’effet de nouvelles stratégies visant à réduire la douleur abdominale dans un contexte physiologique réaliste.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été déterminé afin de concilier la robustesse statistique des résultats et la limitation du recours aux animaux. Il repose sur l’expérience acquise avec ces modèles expérimentaux ainsi que sur les données disponibles dans la littérature. Les protocoles sont conçus pour optimiser l’utilisation de chaque animal. Dans chaque modèle, la comparaison avant/après traitement chez un même individu permet de réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre total d’animaux nécessaires. Le suivi longitudinal des réponses chez un même animal contribue également à limiter le recours à des groupes supplémentaires. Les plans expérimentaux incluent des analyses statistiques adaptées permettant d’exploiter au maximum les données générées et d’éviter les répétitions inutiles. Lorsque cela est possible, les groupes témoins sont mutualisés entre expériences réalisées dans des conditions comparables. Une analyse rétrospective des résultats sera réalisée afin d’évaluer la variabilité observée et d’ajuster, si nécessaire, les effectifs utilisés dans les études futures dans une démarche d’amélioration continue.
Raffinement
Toutes les procédures ont été conçues afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Les animaux sont habitués aux manipulations et aux dispositifs expérimentaux avant le début des procédures afin de réduire le stress lié à la contention et aux interventions. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, de manière à minimiser la durée et l’inconfort associés. Lors des interventions chirurgicales, une anesthésie générale est utilisée, complétée par une analgésie péri- et post-opératoire systématique ainsi qu’une anesthésie locale au site d’incision. Une surveillance rapprochée est mise en place en période post-opératoire et des soins de support sont administrés si nécessaire. Les administrations de substances sont réalisées en limitant les volumes et la fréquence des injections ou gavages, conformément aux recommandations en vigueur. Les techniques utilisées sont choisies afin de réduire l’inconfort lié aux voies d’administration. Les procédures sont interrompues immédiatement en cas de signes de détresse ou d’inconfort important. L’hébergement et l’environnement des animaux sont adaptés avec enrichissement, maintien des interactions sociales lorsque possible, et mesures de soutien (alimentation adaptée, hydratation, réchauffement) mises en place en cas de besoin. Les animaux font l’objet d’une surveillance clinique régulière permettant d’adapter rapidement la prise en charge en cas de signes d’inconfort ou de dégradation de l’état général.
Choix des espèces
Le rat est communément utilisé dans les modèles de douleur viscérale. Nous utiliserons des rats âgés d’au moins 6 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures.
Identification de biomarqueurs de toxicité retardée après administration de produits de référence par voie intrathécale chez le rat pour le traitement de maladies neurologiques
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Jusqu'à six prélèvements de sang en vingt-quatre heures, répétés deux fois, et une chirurgie de trente minutes pour injecter un produit dans le liquide céphalo-rachidien: 405 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 365 tués à l'issue et 40 réutilisables ailleurs s'ils n'ont reçu aucun produit. Les produits injectés sont choisis parce qu'ils provoquent une hydrocéphalie, une accumulation de liquide dans les ventricules cérébraux, que le porteur décrit comme survenant sans signes cliniques visibles chez le rat. L'objet du projet est de repérer des marqueurs précoces de cette toxicité, pour sécuriser plus tard l'évaluation de candidats médicaments dans un autre projet. Le rat est retenu parce que la voie intrathécale y est réalisable, contrairement à la souris, parce que l'hydrocéphalie s'y observe comme chez l'être humain, et parce que les études réglementaires ultérieures utiliseront la même espèce.
Objectifs
Les troubles neurologiques constituent désormais la première cause de handicap et de morbidité mondiale, touchant plus de 3,4 milliards de personnes. Face à l'absence de traitements curatifs pour ces pathologies graves affectant le cerveau et la moelle épinière, la Recherche et Développement accélère le déploiement de thérapies innovantes, notamment les oligonucléotides antisens (ASO). Cette stratégie thérapeutique bloque la production de protéines toxiques avant l’apparition de lésions cérébrales. Le principal obstacle réside dans la difficulté pour ces thérapies de franchir la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre protecteur qui isole le cerveau de la circulation sanguine. Pour garantir que le médicament atteigne les cellules cibles dans le cerveau il est nécessaire de l'administrer par voie intrathécale (IT au niveau des lombaires) directement dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). Cependant, l’administration de certains ASOs par voie IT pendant le développement clinique chez l’Homme peut provoquer des effets indésirables structurels détectables par imagerie par résonance magnétique (IRM), notamment l’hydrocéphalie, caractérisée par une accumulation de LCR dans les ventricules cérébraux (et en conséquence une augmentation de leur taille). Ces modifications anatomiques, souvent asymptomatiques au début, peuvent altérer gravement les fonctions neurologiques à terme. L’enjeu de ce projet est d’identifier des biomarqueurs précoces de cette toxicité retardée à la suite de l’injection par voie IT de produits de référence (provoquant une hydrocéphalie) chez le rat. C’est un modèle présentant une forte homologie physiologique avec l’Humain et pour lequel la voie IT est réalisable (au contraire de la souris). Un suivi de deux semaines post-injection, incluant des prélèvements biologiques à différents temps sont programmés pour effectuer des analyses approfondies. L'objectif scientifique de ce projet est donc de caractériser ces anomalies en intégrant une recherche de biomarqueurs précoces prédictifs d’une potentielle toxicité cérébrale avant même l'apparition de lésions irréversibles telles que l’hydrocéphalie. L’exploitation des résultats de ce projet pourra être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments (ASOs), dans le cadre d’un autre projet. En identifiant ces signaux d'alerte dès les phases non cliniques, cela permet de garantir la sécurité des patients lors des futurs essais cliniques.
Bénéfices attendus
Ces études s’inscrivent dans l’optique d’accélérer la mise à disposition de thérapies innovantes pour le traitement de pathologies neurologiques et d’offrir de meilleures perspectives aux patients touchés par ces maladies. L’objectif de ce projet est d’identifier des marqueurs précoces de la toxicité retardée (hydrocéphalie) observée suite à l’administration au niveau des lombaires de thérapies d’ores et déjà connues en clinique ciblant les pathologies du système nerveux central. Ce projet permettra également de pouvoir corréler les résultats des analyses histologiques et protéiques aux modifications cérébrales pouvant être observées par IRM. La détection de biomarqueurs précoces susceptibles de prédire les effets potentiellement toxiques (anomalies cérébrales) de ces produits de référence permettra in fine de renforcer le profil de sécurité des candidats médicaments en développement dans des études ultérieures. L’exploitation des résultats de ce projet pourra être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments, dans le cadre d’un autre projet afin de sécuriser à terme l’utilisation de ces thérapies chez les patients
Procédures
Chirurgie : - A l’administration unique de produits de référence par voie intrathécale nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique –durée de la chirurgie environ 30 minutes - A l’administration d’analgésique en pré, péri et post opératoire et lors de l’euthanasie -administration de 10 secondes environ - A des prélèvements de sang de faible volume : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum durant l’étude sur animal vigile, contention de 2 minutes maximum, durée du prélèvement de quelques secondes - A un prélèvement unique de Liquide Céphalo Rachidien sous anesthésie générale avant l’euthanasie (durée 30 sec) - A une administration terminale d’une dose létale d’euthanasiant sous sédation (durée 10 sec) - Prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie (durée 10 min)
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : • Les produits de référence administrés peuvent induire une hydrocéphalie sans apparition de signes cliniques (contrôle positif) et peuvent provoquer une nuisance légère pour l’animal. Conséquences directes des actes expérimentaux : • Induction de l’anesthésie gazeuse (pour chirurgie ou prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR), ou préalable à l’euthanasie) : l’induction qui est rapide peut générer du stress (degré de sévérité léger). Administration intrathécale : la phase de chirurgie nécessaire à l’administration du produit de référence (d’une durée d’environ 30 minutes) et de la phase post-opératoire peut générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modérée) • Administrations d’analgésique : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et une douleur liée à l’administration (moins de 10s) (degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang : la contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) • Prélèvement unique de Liquide Céphalo Rachidien sous anesthésie générale avant l’euthanasie (durée 30 sec, degré de sévérité sans réveil)
Devenir
L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un produit de référence seront euthanasiés à l’issue de ce projet pour l’analyse de biomarqueurs et d’organes pour analyse histologique ou pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines selon les groupes. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins une première administration d’analgésique en préparation de la chirurgie a été réalisée dans le cadre du projet et qui n’ont pas reçu de produit de référence /véhicule du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du même groupe par exemple.
Remplacement
Ce projet a pour but d’identifier des biomarqueurs précoces prédictifs d’une toxicité retardée post administration de produits de référence induisant ou non une hydrocéphalie. Cette approche permet d’identifier de potentiels marqueurs précoces de l’hydrocéphalie pouvant être observée avec les ASOs administrés par voie intrathécale (IT). Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet, pour permettre l’identification de biomarqueurs prédictifs de l’apparition d’une toxicité retardée suite à l’injection de ces produits de référence (ASOs). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et le rat est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (voie intrathécale possible chez cette espèce, processus physiologiques très proches de l’Humain).
Réduction
Les produits de référence ont été sélectionnés à l’aide de screening vitro et/ou silico et étudiés via des études vivo de sécurité en imagerie IRM de sécurité avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux prévu par étude est de 12 par temps de prélèvement (3 points envisagés au total par produit de référence ou véhicule).. Ce choix est dicté pour assurer la fiabilité des données face à diverses sources de variabilité. Par groupe, 8 animaux seront nécessaires pour les analyses biochimiques et 4 pour l'examen des tissus. Ce nombre d'animaux a été déterminé empiriquement, s'appuyant sur l'expérience interne des équipes pour la réalisation des analyses ex vivo complexes envisagées. Il est indispensable pour obtenir des résultats robustes et compenser l'hétérogénéité liée à l'injection intrathécale (diffusion du produit de référence variant d'un sujet à l'autre) ainsi que les variabilités interindividuelles. Ainsi, le nombre d'échantillons produit permettra de garantir des données exploitables lors des analyses en laboratoire. Cette approche permettra de détecter avec certitude des signaux d'alerte (biomarqueurs) prédictifs d'une toxicité retardée, assurant ainsi la solidité de nos conclusions. C’est une approche efficace afin d’atteindre les objectifs de la procédure, générer des données consolidées pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible. Le choix de ce nombre est basé sur la littérature et sur l’expérience interne (chaque équipe effectuant les analyses ex vivo ayant une bonne connaissance de la variabilité observée chez le rat et spécifique à son type d’analyse). Les études de ce projet permettent la mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids) ou terminaux (prélèvement de LCR et d’organes…) et des cinétiques complètes sur un même animal. Le design expérimental de ce projet est optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus, la sélection préalable des produits de référence qui seront utilisés dans ces études (contrôle positif induisant des anomalies cérébrales, contrôle négatif ne présentant pas de toxicité retardée) permet d’explorer dans les meilleurs conditions les biomarqueurs prédictifs de toxicité.
Raffinement
Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, une prescription de soins, ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée et au projet, mise en place dès l’apparition de signes cliniques marqués. Bien que l’utilisation de produits de référence dans ce projet n’induisent pas de signes cliniques, l’utilisation de la grille éthique pourra être utilisée si jugée nécessaire. L’administration par voie IT est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire. De plus, un suivi post injection à 1h et 3h sera assuré dès le réveil de l’animal utilisant une analyse observationnelle basée sur des critères définis par une grille d’observation spécifique scorée. Les administrations IT se font de manière séquentielle afin de s’assurer du bon déroulement de la chirurgie et de ne pas inclure l’ensemble des animaux dans la procédure si des signes cliniques venaient à survenir bien que les produits de référence soient injectés à une dose précédemment évaluée et ne devant pas induire de signes cliniques. Les animaux sont régulièrement manipulés par l’ensemble du personnel technique formé pour permettre un renforcement positif afin de générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Pour les études d’une durée supérieure à 1 semaine, une puce électronique d’identification couplée à un capteur de température pourra permettre le suivi de la température corporelle de manière non invasive. Tous les animaux sont hébergés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel n’excédant pas 6 heures), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Ce projet est réalisé chez le rat car : - Le rat présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Humain et ainsi une forte valeur translationnelle. De plus la voie intrathécale nécessaire à l’administration des produits de référence de ce projet peut être réalisée chez le rat. - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des futurs candidats médicaments sont plus faciles à discerner chez cette espèce. - L’hydrocéphalie, qui constitue une toxicité potentielle liée à l’administration d’ASOs en intrathécale, est observée à la fois chez le rat et chez l’humain - Les études réglementaires ultérieures et nécessaires au développement d’un candidat médicament utilisent le rat. De plus, les résultats obtenus pourront être corrélés aux études de sécurité réalisées en amont. Les rats utilisés sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.
Programme de Capture-Marquage-Recapture et suivi par télémétrie RFID et acoustique des déplacements de l’anguille européenne
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Pour suivre les déplacements de l'anguille européenne dans un hydrosystème littoral, 12 500 individus sont capturés et marqués dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La capture se fait au verveux ou par pêche électrique, qui paralyse le poisson quelques secondes et peut provoquer un traumatisme selon l'intensité du courant subi. Suivent une stabulation en bac obscur jusqu'à quatre heures, un bain anesthésiant, une injection analgésique, puis l'implantation d'une marque par trocart ou par laparotomie, geste qui peut induire de la douleur et favoriser une infection. Toutes les anguilles sont remises à l'eau après leur marquage, et le porteur écrit que l'étude ne peut pas s'affranchir d'un nombre conséquent de poissons marqués, les taux de détection observés étant de l'ordre de 0,1.
Objectifs
Ce projet vise à marquer des individus d'anguille européenne dans un vaste hydrosystème littoral afin de les identifier et ainsi contribuer à répondre aux 7 objectifs suivants : 1/ Préciser la dynamique d’échappement dans le temps (saisonnalité, variation intra- et interannuelle) d'individus argentés, en ciblant 3 sous-populations : deux associées à des bassins dominés par l’eau douce et une sous-population associée à un étang saumâtre à salé ; 2/ Identifier les facteurs environnementaux déclenchant l’échappement, en fonction du sexe, du site de marquage (supposé être le principal habitat de croissance) et des conditions climatiques de l’année ; 3/ Déterminer les voies de migration privilégiées en fonction du site de marquage des individus; 4/ Identifier les éventuels obstacles à l’échappement : discontinuités écologiques (ouvrages de connexion fermés, assecs ou hypersalinité), prélèvements par prédation ou prélèvements par pêche artisanale ; 5/ Préconiser des mesures de gestion pour améliorer les conditions favorables au retour en mer des anguilles argentées ; 6/ Faire perdurer les programmes de capture-marquage-recapture (CMR) et obtenir au moins 10 ans de données pour les deux sous-populations des bassins dominés par l'eau douce, ce qui permettra d’étudier et comparer leurs traits d’histoire de vie (taux de croissance, durée d’argenture, sexe) et leur dynamique (taux de survie, abondance par stade, production d’anguilles argentées) ; 7/ Décrire la stratégie des individus en cas de l'assèchement d'un marais, un évènement extrême qui s'accentue dans les zones humides côtières avec le changement climatique.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d'acquérir de la connaissance sur l'état de deux sous-populations d'anguille, sur la dynamique d'échappement des anguilles argentées en fonction de leur habitat de croissance et de leur sexe. Ils permettront de mieux prédire les pics d'échappement et d'identifier les principaux obstacles à la migration. Ces résultats sont notamment attendus pour développer un outil d'aide à la décision pour optimiser la gestion des ouvrages de connexion en milieu lagunaire afin de favoriser la connectivité écologique et l'échappement des anguilles argentés, futurs reproducteurs. De plus, les données collectées au cours de ce projet permettront de mieux appréhender les stratégies d'utilisation des habitats des anguilles, notamment lors d'un évènement extrême comme la sècheresse. Les anguilles ont-elles plutôt tendance à s'enfouir ou à s'enfuir ? Quelles sont leur probabilité de survie en cas d'enfouissement ? Les résultats pourront amener à aménager les mesures de gestion de marais qui visent à les assécher régulièrement, par exemple pour lutter contre des espèces végétales envahissantes.
Procédures
Capture à l'aide d'engins passifs (type verveux) : relève toutes les 24h approximativement, ou capture par pêche électrique : paralysé quelques secondes; Stabulation dans un bac obscur et aéré : de 5 min à 4h; Bain anesthésiant: 5 à 15min; Injection analgésique : 2 s Marquage avec une fermeture de la plaie à l'aide d'un pansement hydrofuge : 30 s à 2 min; Phase de réveil sous surveillance : de 10 à 30 min; Stabulation avant relâcher : de 5 min à 8h.
Impact sur les animaux
La capture, la manipulation et la stabulation des individus sont autant d'étapes sources de stress pour les animaux. La capture par pêche électrique induit une paralysie temporaire des individus, et peut provoquer un traumatisme selon l'intensité du courant subi. Le marquage par trocart ou par laparotomie, avec ou sans points de suture, peut induire de la douleur et éventuellement favoriser une infection.
Devenir
L’ensemble des animaux sera remis en liberté à la suite de leur marquage, ce qui est primordial pour répondre aux objectifs de l’étude.
Remplacement
L’étude portant sur le comportement de poissons en milieu naturel, l’expérimentation doit être réalisée avec des individus capturés dans le milieu, et ne peut donc s’affranchir de l’emploi de poissons sauvages.
Réduction
Le milieu étudié est un vaste système pouvant présenter des densités d'anguilles très élevées. L'anguille présente une grande plasticité des traits d'histoire de vie et du comportement, notamment du point de vue de l'utilisation des habitats et de ses déplacements migratoires. Pour que les modèles de capture-marquage-recapture (CMR) soient robustes et représentatifs de la réalité, il est nécessaire de maintenir un effort de marquage significatif à un pas de temps constant dans le temps sur une période qui couvre la durée de croissance de plusieurs générations. Une lecture d'âge par otolithométrie a montré que, dans nos sites suivis en CMR, les anguilles femelles deviennent argentées à l'âge moyen de 6 à 10 ans. Pour étudier la survie par stade de développement, il est nécessaire d'estimer des probabilités de transition entre stades, ce qui dépend, à l'échelle pluri-annuelle, d'un taux de recapture d'individus à différents stades qui soit non négligeable. Une première modélisation de nos données CMR a montré des taux de détection de l'ordre de 0.1. De nombreux facteurs sont susceptibles d'affecter le taux de recapture, à commencer par la capacité de capture qui est dépendante à la fois de la densité d’anguilles présentes et des conditions environnementales. L’étude de l'échappement doit également tenir compte de différents facteurs qui peuvent nuire à l’acquisition des données de détection : mortalité naturelle des individus marqués par prédation ; prélèvements par la pêche professionnelle ; migration différée ; animaux marqués mais non détectés au passage des portiques. Le marquage d’un échantillon trop petit présente un risque élevé d’incapacité à caractériser de manière robuste la dynamique d'échappement sur l’ensemble de la période (octobre à mai). Ainsi, les conclusions attendues par ce projet, sur l’étude comportementale de l’anguille, ne peuvent pas s’affranchir d'un nombre conséquent de poissons marqués.
Raffinement
Le marquage des individus s'effectue sous anesthésie (benzocaïne) et analgésie (lidocaïne). Les bacs utilisés seront obscurs, de manière à favoriser l'obscurité et diminuer le stress des individus pendant les phases de stabulation (avant leur traitement et pendant la phase de réveil) et d'anesthésie. La densité des individus par bac sera limitée à 0.17kg/L (soit 7kg pour 40L). Et les bacs seront brassés par des aérateurs pour favoriser l'oxygénation de l'eau. Les bacs seront placés à l'ombre pour éviter que l'eau se réchauffe excessivement. Pendant sa manipulation, toujours avec des gants non poudrés, l'individu est placé sur une alèse ou un tissu humide sans aspérités. Au maximum, un tissu humide opaque sera placé sur les yeux de l'animal traité pour limiter son stress. Une fois un individu marqué, il pourra être détecté en continu par les huit portiques RFID présent sur la zone d'étude. Ces suivis télémétriques (RFID et acoustique) constituent un moyen de raffiner le suivi en capture-marquage-recapture, puisqu'il permet de suivre à distance le déplacement d'individus marqués (de recapturer leur signalement) sans avoir à les manipuler à nouveau.
Choix des espèces
L’anguille européenne est une espèce actuellement menacée d'extinction qui a un cycle de vie unique. Elle parcourt au cours de sa vie de longues distances : elle se reproduit dans l'Océan Atlantique, en mer des Sargasses, et vient grandir du stade civelle au stade argenté dans les eaux continentales européennes et nord-africaines. Après une phase de croissance de plusieurs années, les individus ayant atteint le stade argenté cherchent à repartir en mer pour aller se reproduire, c'est l'échappement. Afin de mieux comprendre la dynamique de l'échappement, les voies empruntées et les obstacles rencontrés, et d'améliorer la connectivité pour favoriser leur retour en mer, il est indispensable d’étudier le comportement et le déplacement des stades argentés de cette espèce. De plus, étudier la dynamique de sous-populations associés à des milieux aux conditions environnementales contrastées, du stade anguillette au stade argenté, permet de mieux comprendre l'influence de l'habitat sur la croissance, les traits d'histoire de vie, la condition et le comportement migratoire des futurs reproducteurs. L’impact du transpondeur est négligeable pour les constantes vitales lorsque sa masse est inférieure à 2 % de celle du poisson (Winter, 1996). Le poids des marques implantées ne dépassera jamais 2.5% de la masse des individus utilisés dans ce projet. Les anguilles ayant un poids supérieur à >40g (et une taille supérieure à 30 cm), jaunes ou argentées, seront équipées d’un transpondeur RFID de 23 mm de long (qui a une masse de 0.6 g). Pour la deuxième procédure, des émetteurs acoustiques de 9 ou 7 mm de diamètre, incorporant ou non un capteur de prédation, seront implantés en plus de la marque RFID, uniquement sur des individus argentés.
Rôles de l’hormone thyroïdienne dans la réparation cardiaque post-infarctus chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Injectées, opérées du cœur pour provoquer un infarctus, puis passées à l'échocardiographie sous anesthésie, 2 540 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus et organes. L'objectif immédiat est de comprendre comment une hormone thyroïdienne et ses transporteurs agissent sur la réparation cardiaque, les traitements évoqués pour les personnes malades restant au conditionnel et au long terme. Le porteur signale une douleur modérée de courte durée après l'infarctus expérimental, une baisse d'activité ou d'appétit, et une "mortalité liée au modèle chirurgical". Deux âges sont utilisés, des nouveau-nés de 1 à 3 jours dont le cœur se régénère naturellement, et des adultes de plus de 8 semaines dont le cœur ne se régénère pas, ce que le porteur juge plus proche de la situation humaine.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment certaines hormones et les éléments qui les transportent dans le corps peuvent aider le cœur à se réparer après une crise cardiaque. L’objectif est de découvrir comment ces hormones soutiennent la guérison du cœur et, à terme, de trouver de nouvelles façons d’améliorer la réparation cardiaque chez l’être humain.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices importants pour la santé du cœur : - Nouveaux traitements possibles : En testant de nouvelles façons d’aider le cœur à se réparer après une crise cardiaque, ce projet pourrait ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces que celles que nous avons aujourd’hui. - Idées utiles pour d’autres maladies : Les méthodes développées ici pourraient aussi servir pour d’autres organes ou maladies où les tissus se réparent mal, ce qui pourrait aider à faire avancer la médecine régénérative dans son ensemble. - Moins de séquelles et de coûts pour la société : La crise cardiaque est l’une des principales causes de décès et de handicap. Si le cœur pouvait mieux se réparer, cela réduirait les complications pour les patients, les hospitalisations répétées et certains traitements lourds, ce qui bénéficierait à la fois aux personnes malades et au système de santé.
Procédures
Injection, durée approximative 5 à 10 minutes par animal. Chirurgie cardiaque, durée approximative 15 à 20 minutes par animal. Échocardiographie : durée approximative 5 à 10 minutes par animal. Chaque intervention est réalisée une seule fois par animal sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Ce projet implique des interventions cardiaques qui peuvent provoquer : • Une gêne légère et passagère au point d’injection. • Un stress temporaire lié à la manipulation. • Une douleur modérée de courte durée après l’infarctus expérimental, pouvant s’accompagner d’une baisse d’activité ou d’appétit. • Une gêne très brève lors des échographies. Une mortalité liée au modèle chirurgical.
Devenir
L’ensemble des souris sera mis à mort à la fin du projet afin de permettre le prélèvement de tissus et d’organes nécessaires aux analyses biologiques (histologiques, moléculaires et/ou biochimiques). Ces analyses ne pouvant pas être réalisées in vivo, la mise à mort constitue une étape indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Aujourd’hui, aucun modèle en laboratoire (comme les organoïdes ou les cultures de cellules cardiaques) ne peut reproduire exactement ce qui se passe dans un cœur après une crise cardiaque. On utilise ces modèles pour étudier certains mécanismes précis, mais ils ne peuvent pas remplacer les expériences réalisées sur des animaux vivants, nécessaires pour comprendre la réparation du cœur dans son ensemble.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour chaque manipulation est basé sur notre expérience au laboratoire et a été déterminé afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum l’utilisation d’animaux. Lorsque cela est possible, nous favorisons des approches permettant de suivre les mêmes animaux dans le temps (imagerie non invasive, mesures répétées), ce qui réduit le nombre nécessaire par groupe. Les analyses sont ensuite réalisées avec des méthodes adaptées garantissant la qualité scientifique des résultats, tout en respectant le principe de réduction.
Raffinement
Deux protocoles d’anesthésie et d’analgésie sont proposés, afin de s’adapter aux besoins expérimentaux tout en assurant le confort des animaux. La chirurgie est réalisée par un personnel formé et expérimenté, suivant un protocole standardisé et rigoureux. Le contrôle de la douleur est garanti pendant l’intervention et après, avec une surveillance post-opératoire étroite. Les conditions d’hébergement sont optimisées : cages chauffées, enrichies, avec récupération en groupe. Des points limites sont définis, et des critères de mise à mort sont appliqués en cas de souffrance non contrôlable.
Choix des espèces
Ce projet utilise la souris comme modèle, car elle est aujourd’hui l’animal de référence pour l’étude de l’infarctus du myocarde. La souris a été choisie car : • Elle permet d’observer et de suivre précisément les cellules du cœur. • Sa petite taille facilite l’étude du cœur avec des méthodes d’imagerie et d’analyse détaillées. • Les réactions de son système cardiovasculaire sont bien caractérisées. Deux stades de développement sont étudiés : • Les nouveau-nés (1 à 3 jours) : ils présentent une capacité naturelle de régénération cardiaque. Leur étude permet d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette régénération. • Les adultes (plus de 8 semaines) : leur cœur ne se régénère pas après un infarctus, ce qui correspond davantage à la situation humaine. Ils servent de référence pour comparer les mécanismes de réparation avec ceux observés chez les nouveau-nés.
Impact d’une supplémentation en levures vivantes en pré-sevrage chez le veau en système allaitant sur le développement et la maturation du rumen, les performances et la santé (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour tester un bolus de levures vivantes destiné aux élevages allaitants, 34 jeunes veaux mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun n'étant tué à l'issue. Ils subissent des prélèvements de jus de rumen par sonde gastro-œsophagienne, deux endoscopies avec biopsie de la paroi du rumen, des fouilles rectales, une tonte du flanc et des prises de sang à la veine caudale, réparties sur huit sessions autour du sevrage. Le porteur situe la retombée dans des "recommandations pratiques aux éleveurs" et des valorisations scientifiques et techniques, si le bolus prépare mieux le jeune au stress du sevrage. Ce résumé est le second de deux volets portant le même intitulé et déclarant chacun 34 veaux pour le même protocole, sans que le lien entre les deux soit explicité.
Objectifs
L'objectif du présent projet est d'étudier l'intérêt d'une supplémentation en levures vivantes probiotiques autour du sevrage pour favoriser le développement du microbiote commensal et fonctionnel dans le tube digestif et ainsi de stimuler le développement des papilles ruminales et leur fonctionnalité. Au-delà des effets au niveau de la sphère digestive, un impact bénéfique sera recherché sur la limitation du stress au sevrage et sur la croissance et l'efficacité alimentaire en post-sevrage. Ce projet est multisite et se déroulera sur 2 sites différents distants de 32 km. Le changement de site se fera le jour du sevrage.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces investigations permettra d’approfondir notre connaissance, encore très limitée, sur l’impact des stress de sevrage (séparation maternelle, changement d’alimentation) et de changement de lieux d’hébergement chez des veaux sous la mère. Le suivi longitudinal des animaux permettra de caractériser les effets du sevrage sur la stabilité du microbiote digestif (ruminal et fécal), l’impact de celui-ci sur le développement du rumen et sur sa fonctionnalité, et de mesurer les conséquences potentielles sur le comportement, la santé et la performance des jeunes taurillons. L’étude permettra d’apporter également des informations uniques sur le développement des papilles ruminales grâce à l’utilisation de l’endoscope. Si la stratégie de supplémentation en levures vivantes probiotiques via un bolus nutritionnel permettait de mieux « préparer » le jeune au stress du sevrage grâce à un écosystème ruminal plus stable et performant et une meilleure maturation du rumen, l’étude pourrait conduire à des valorisations scientifiques et techniques ainsi qu’à des recommandations pratiques aux éleveurs.
Procédures
Dans ce projet, les veaux seront soumis à six types de prélèvements : prélèvement gastro-oesophagien, prélèvement de fèces, prise de sang, endoscopie avec prélèvements de papilles ruminales, écouvillonnage buccal et tonte de poils. Lorsque cela est possible, ces prélèvements seront réalisés le même jour afin de limiter le nombre de contentions et de réduire le stress associé aux manipulations répétées. Par ailleurs, un intervalle minimal de 10 jours sera respecté entre deux sessions de prélèvements, afin de permettre un rétablissement complet de l’animal. À l’exception de l’endoscopie, qui sera réalisée deux fois par animal. Les autres prélèvements seront effectués 3 fois au cours de la période pré-sevrage et cinq fois au cours de la période de post-sevrage du veau. La durée cumulée des interventions lors d’une même session n’excédera pas 10 minutes. En cas de dépassement ou de signes de mauvaise tolérance, les interventions seront immédiatement interrompues. Enfin, les volumes et quantités d’échantillons prélevés ont été définis en amont de manière à ne pas compromettre la santé, le bien-être ou la survie des animaux, conformément aux recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
L’étude prévoit plusieurs prélèvements à différents niveaux de sévérité notamment des prélèvements de jus de rumen (PGO) et des biopsies en classe modérée. Différents prélèvements relevant de procédures légères (fèces et sang) afin de caractériser la réponse physiologique, métabolique et digestive des jeunes bovins (JB) à l’engraissement. La prise de sang sera effectuée à la veine caudale et les prélèvements de fèces par défécation naturelle ou fouille rectale si besoin et le prélèvement de poils par tonte au niveau du flanc de l'animal. La prise de sang peut induire une douleur succinte. La prise de sang, la PGO et la fouille (si nécessaire) dureront maximum 3 minutes chacune. Le prélèvement de jus de rumen sera réalisé par prélèvement gastro-oesophagiens (PGO) et pourrait engendrer une irritation de l'oesophage. Les biopsies (J-5 et J+45) seront réalisées par un vétérinaire et pourraient engendrer une irritation de l’oesophage et de la paroi du rumen. Au total, les prélèvements n'excéderont pas 10 minutes. Ces prélèvements seront réalisés en cage de contention et sont susceptibles d'induire de l'inconfort pendant la manipulation.
Devenir
Les 34 veaux seront maintenus en vie à l'issue de l'étude, sous réserve de l'autorisation du vétérinaire. Quatre d'entre eux réintégreront le circuit classique du premier élevage, tandis que les 30 autres poursuivront leur parcours au sein du deuxième élevage, où ils seront suivis durant leur phase d'engraissement.
Remplacement
L’objectif de l’étude étant d’obtenir des données scientifiques sur la maturation du rumen du veau allaitant donc sur un processus dynamique qui est propre à chaque individu, et qui comprend l’analyse de différents compartiments digestifs, aucune solution de remplacement in vitro n’est adaptée pour ce projet.
Réduction
Des tests statistiques prenant en compte, la puissance statistique nécessaire de 75%, la variabilité individuelle entre les animaux (races pures et mixtes et âges de naissance étalés sur plusieurs semaines) de 10% et le seuil de significativité fixé à 0.1, ont permis de déterminer à 15 le nombre minimal d'individus par lot pour générer des résultats statistiquement interprétables.
Raffinement
Les fouilles rectales pour les prélèvements de fèces ne seront réalisées que si les animaux ne défèquent pas naturellement au moment de la collecte. Les animaux seront habitués à chaque acte en mimant les différents prélèvements lors de contention. Cet entrainement sera réalisé 2 fois avant les prélèvements réels. Les prélèvements se feront de façon groupée dans la mesure du possible afin de ne pas multiplier les séquences de manipulation et de contention. L'utilisation de lubrifiant durant la PGO ou de la fouille rectale altère la qualité de l'échantillon. Cependant, lorsque la fouille rectale sera effectuée, les gants utilisés seront humidifiés pour faciliter le prélèvement. L'utilisation d'un lève-tête pour les PGO est systématique afin de limiter les risques de blessures pour l'animal et l'opérateur. Après chaque journée de prélèvements, les animaux seront suivis durant 5 jours pour détecter tout comportement anormal potentiellement induit par les prélèvements. Après le sevrage, lors du changement de site des animaux, ceux-ci auront une phase d'habituation à leur nouvel environnement et auront individuellement une inspection générale de leur état corporel. Le jour du sevrage, les veaux seront transportés dans une bétaillère adaptée, offrant une ventilation suffisante, un sol antidérapant et un espace adapté au nombre d'animaux. De plus, les veaux seront transportés en groupe, avec leurs congénères, afin de limiter le stress lié à l'isolement. Enfin, le transport sera effectué sur une courte distance (moins d'une heure) et nous réaliseront le transport tôt le matin afin de limiter le plus possible les périodes de fortes chaleurs.
Choix des espèces
Parmi les ruminants, l’espèce bovine est une espèce de choix pour étudier la dynamique de mise en place des fonctions ruminales dans les conditions de l’étude. Par ailleurs, un des objectifs de ce projet est d’étudier l’intérêt d’un probiotique distribué sous forme d’un bolus à libération lente permettant une efficacité potentielle prolongée pendant la période d’alimentation à l’herbe jusqu’au post sevrage. Les bovins ont été choisis car ils sont à la fois modèle et sujet de la recherche. Les animaux mobilisés seront des jeunes veaux mâles entre 50 jours avant sevrage et 120 jours après sevrage. La période autour du sevrage étant la cible de notre étude.
Évaluation préclinique multimodale de nouveaux radiotraceurs, agents théranostiques et thérapies innovantes sur des modèles murins de cancers ectopiques et orthotopiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des prises de sang toutes les vingt minutes pendant deux heures, des imageries de quinze minutes à trois heures jusqu'à trois fois par semaine, des traitements administrés jusqu'à deux fois par jour, 1 770 souris vont être utilisées sur trois mois chacune, dans des procédures menées sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère. Une tumeur leur est greffée sous la peau ou dans le cerveau, et la croissance cérébrale peut provoquer pertes d'équilibre, convulsions, baisse de mobilité et perte de poids rapide. Le porteur qualifie son imagerie de non douloureuse et en tire un argument de réduction du nombre de souris, tout en prévoyant 1 676 mises à mort pour prélèvement d'organes. 94 souris sont déclarées réutilisées, et le porteur indique que les souris n'ayant pas développé de tumeur seront gardés en vie pour d'autres projets.
Objectifs
Découvrir un cancer trop tard ou ne pas réussir à localiser précisément certaines tumeurs, notamment dans le cerveau, complique fortement la réussite des traitements. Ce projet de recherche sur 5 ans a pour but de créer des outils de détection très précoces et de tester de nouvelles thérapies Au centre de ce projet se trouve l'imagerie nucléaire Cette technique consiste à injecter une molécule légèrement radioactive appelée radiotraceur. Ce traceur voyage dans le sang et va se fixer spécifiquement sur les cellules cancéreuses comme un aimant. Une caméra ultra-sensible détecte ensuite le signal émis par cette molécule pour reconstituer une image en 3D sur ordinateur. Cela permet de voir la tumeur et de mesurer son activité sans avoir besoin d'opérer. Le programme se divise en trois grandes étapes : développer de nouveaux traceurs encore plus précis pour améliorer le diagnostic, tester des chimiothérapies de nouvelle génération pour voir si elles réduisent la taille des tumeurs, et étudier des molécules deux-en-un capables de détecter et de soigner la maladie en même temps. Pour mener à bien ces recherches, nous suivrons des souris selon deux méthodes. Soit la tumeur est placée juste sous la peau pour observer facilement sa croissance et la réponse aux médicaments Soit la tumeur est développée directement dans son organe d'origine, comme le cerveau pour les tumeurs cérébrales agressives, afin de tester les traitements dans des conditions les plus proches possibles de la réalité. D'autres examens comme l'échographie ou la bioluminescence compléteront ces observations. Le grand avantage de notre méthode d'imagerie est qu'elle n'est pas douloureuse et permet de suivre l'évolution de la maladie sur un même animal tout au long de l'étude. Cela garantit des résultats scientifiques bien plus fiables et permet de réduire de manière très importante le nombre total de souris utilisées, conformément aux règles d'éthique. Ces étapes sur les rongeurs sont indispensables pour vérifier que les futurs traitements sont efficaces et sans danger avant de pouvoir les proposer un jour aux patients humains.
Bénéfices attendus
L'intérêt majeur de ce projet est d'accélérer le passage de nouvelles solutions de diagnostic et de traitement des laboratoires vers les patients. En développant des outils de détection plus sensibles et plus précis, ces recherches permettront de repérer les cancers plus tôt et de localiser précisément des tumeurs complexes, comme les tumeurs cérébrales agressives, dont le pronostic reste aujourd'hui très sombre. L'approche combinant le diagnostic et la thérapie apporte un bénéfice médical considérable : elle ouvre la voie à une médecine personnalisée où le traitement est directement guidé par l'image. Cela permet de cibler uniquement les zones malades tout en épargnant les tissus sains autour. Par ailleurs, tester ces nouveaux candidats médicaments est essentiel pour s'assurer de leur efficacité et de leur sécurité avant de les utiliser chez l'humain. Sur le plan de l'éthique et de la méthode scientifique, l'utilisation de caméras et d'imageries non douloureuses est un avantage majeur. Elle permet de suivre l'évolution de la maladie chez un même animal tout au long de l'étude. Cela garantit des résultats bien plus fiables tout en réduisant de manière très importante le nombre total de souris nécessaires pour obtenir des conclusions valides. À terme, les retombées de ces études contribueront à offrir aux patients des stratégies de soins plus précises, moins toxiques et mieux adaptées à l'évolution de leur maladie.
Procédures
Chaque animal suit un parcours combinant le développement d'une tumeur, des examens d'imagerie et des traitements sur 3 mois maximum. (1) L'installation de la tumeur : Les cellules cancéreuses sont injectées sous la peau ou dans le cerveau lors d'une seule opération (durée de 10 à 40 minutes, sous anesthésie générale). (2) Le suivi de la croissance tumorale : La pesée et la mesure des grosseurs visibles se font 1 à 2 fois par semaine sur l'animal réveillé. (3) Les imageries durent de 15 minutes à 3 heures et ont lieu 1 à 3 fois par semaine selon les tumeurs, tous ces examens se font sous anesthésie générale. (4) Les traitements : Les traitements par la bouche ou sous la peau sont donnés jusqu'à 2 fois par jour sur l'animal réveillé. Les injections dans les veines se font 2 à 3 fois par semaine, sur l'animal endormi . Pour le traitement par radioactivité ciblée, il n'y a que 2 injections à une semaine d'intervalle sous anesthésie. (5) les prise de sang : des petites prise de sang se font de manière répété toutes les 20 minutes pendant 2 heures sur animal anesthésié ou une fois par semaine sur animal réveillé. (6) Une dernière chirurgie de 15 minutes est faite sur l'animal anesthésie pour récupérer les organes, l'animal ne se réveille pas.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux dans ce projet découlent à la fois des actes techniques et de l'évolution même du cancer : D'abord, les actes techniques et l'imagerie peuvent causer de l'inconfort. Les manipulations régulières pour injecter les produits dans la queue ou pour faire les petites prises de sang provoquent un léger stress de contention. De plus, les anesthésies répétées, indispensables pour que les souris restent totalement immobiles sous la caméra, peuvent entraîner une fatigue générale, des réveils difficiles ou des ralentissements de la respiration. Ensuite, la chirurgie nécessaire pour implanter la tumeur directement dans le cerveau entraîne une douleur juste après l'opération, ainsi que des risques d'inflammation, d'infection ou de baisse de la température corporelle pendant l'intervention. Enfin, le développement de la tumeur altère l'état de santé des animaux de façon différente selon sa localisation. Pour la tumeur placée sous la peau, la gêne reste principalement mécanique à cause de la présence d'une grosseur externe. En revanche, pour la tumeur cérébrale, sa croissance dans le cerveau peut provoquer des troubles neurologiques, comme des pertes d'équilibre, des convulsions, une baisse de la mobilité, des changements de comportement ou une perte de poids rapide. Toutes ces étapes sont encadrées par un suivi quotidien pour détecter et soulager immédiatement la moindre souffrance.
Devenir
La mise à mort des animaux en fin d'étude est indispensable pour valider l'efficacité et la sécurité des nouveaux traitements. Même si l'imagerie sur l'animal vivant donne des informations précieuses, elle ne suffit pas pour tout comprendre. Le prélèvement des organes, comme le cerveau ou les tumeurs, permet de réaliser des analyses approfondies au microscope après l'étude. Ces examens sont les seuls capables de confirmer la destruction réelle des cellules cancéreuses, de vérifier l'absence de danger pour les organes sains et de mesurer précisément où s'est fixée la radioactivité. En revanche, les animaux qui n'auront pas développé de tumeur seront gardés en vie et pourront participer à d'autres projets de recherche.
Remplacement
La complexité du corps humain, notamment la façon dont un médicament voyage dans le sang, élimine ses déchets ou s'attache à une tumeur, ne peut pas être reproduite fidèlement par des ordinateurs ou des tests en laboratoire. Pour comprendre le parcours et l'efficacité d'un traitement, il est indispensable d'utiliser un organisme vivant entier doté d'un cœur, de vaisseaux et d'organes fonctionnels. Le recours aux animaux est toutefois limité au strict nécessaire grâce à une sélection très rigoureuse : D'une part, l'accroche du traitement est obligatoirement vérifiée en laboratoire sur des cellules avant d'envisager le moindre test sur les souris. Seules les molécules les plus efficaces sont retenues. D'autre part, le choix des modèles est optimisé : certaines souris permettent d'étudier directement des tumeurs humaines, tandis que d'autres permettent d'observer les réactions en présence d'un système de défense immunitaire actif. Cela garantit que les résultats obtenus soient les plus proches possibles de ce qui se passera, à terme, chez l'humain.
Réduction
Le nombre de souris utilisées est réduit au strict minimum grâce à trois actions principales. D'abord, l'utilisation de l'imagerie par caméra permet de suivre l'évolution de la maladie chez le même animal tout au long de l'étude. Cela évite d'avoir à sacrifier des groupes de souris à chaque étape pour analyser leurs organes. Ensuite, des tests préliminaires sont réalisés en laboratoire sur des cellules pour sélectionner uniquement les modèles les plus prometteurs avant de passer aux tests sur les animaux. Enfin, le nombre exact d'animaux a été calculé scientifiquement par ordinateur pour garantir des résultats fiables avec le moins de souris possible. Pour la phase de test des nouveaux imageurs, 6 souris par groupe sont nécessaires pour détecter une différence d'efficacité de 30 %. Par expérience, 4 souris supplémentaires sont ajoutées par groupe pour pallier les aléas techniques comme une croissance irrégulière des tumeurs ou des injections ratées, soit un total de 10 souris par groupe.
Raffinement
Pour limiter au maximum l'inconfort des animaux, plusieurs mesures de protection et de confort sont appliquées : (1) Amélioration du quotidien et du logement : Les souris vivent en groupe (5 par cage) dans un environnement stimulant avec des maisonnettes, du coton et des tunnels pour réduire leur stress. Elles bénéficient d'une semaine de repos pour s'habituer à leur nouvel environnement avant le début de l'étude. Si une souris faiblit ou perd du poids, une nourriture plus facile à manger (gelée ou aliments ramollis) est déposée directement au fond de la cage. Pour protéger les souris les plus fragiles, elles sont installées dans des cages closes très propres, isolées des microbes, avec de l'eau filtrée et des aliments stériles. (2) Gestion de la douleur et soins : Toute opération se fait sous anesthésie et s'accompagne de médicaments antidouleur puissants, appliqués localement sur la zone opérée et donnés de manière générale pour garantir leur confort. Les plaies sont surveillées quotidiennement et reçoivent des antibiotiques si une infection apparaît. De plus, les souris sont installées sur des tapis chauffants pendant les examens et leur réveil pour éviter qu'elles ne se refroidissent. (3) Surveillance et limites à ne pas dépasser : La santé des souris est suivie chaquesemaine grâce à une grille d'évaluation précise. Si une souris montre des signes de souffrance trop importants, comme une perte de poids supérieure à 20 %, des troubles neurologiques graves ou des difficultés à respirer, elle est immédiatement endormie définitivement pour lui éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris est l'animal de référence indispensable pour ce projet pour plusieurs raisons : D'abord, elle permet d'étudier le cancer de façon très précise. Certaines souris permettent de tester des cellules tumorales humaines, tandis que d'autres possèdent un système de défense immunitaire actif, ce qui est essentiel pour voir comment le corps réagit au traitement. De plus, sa petite taille est idéale pour les caméras de notre laboratoire. Cela permet d'obtenir des images très nettes et de mesurer précisément où se fixe la radioactivité, tout en utilisant de toutes petites quantités de produits. Enfin, les souris utilisées partagent les mêmes caractéristiques biologiques, ce qui garantit des réactions similaires d'un animal à l'autre et permet de réduire le nombre total de souris nécessaires. Les animaux participeront à l'étude au stade de jeune adulte. Ils arriveront au laboratoire à l'âge de 6 semaines pour que la tumeur soit installée entre 7 et 8 semaines. Ce choix d'âge répond à trois impératifs : * Un corps mature : À cet âge, les organes et les défenses immunitaires fonctionnent parfaitement, ce qui garantit que le voyage des produits radioactifs dans le corps soit le même que chez un adulte. * Une méthode standard : C'est l'âge de référence utilisé par les chercheurs du monde entier, ce qui permet de comparer nos résultats avec d'autres études scientifiques. * * Un suivi sur le long terme : Comme l'étude dure plusieurs mois, commencer avec des souris jeunes évite que le vieillissement naturel de l'animal ne vienne fausser les résultats en fin de projet.
Réalisation de tests d’efficacité d’antiparasitaires vétérinaires externes chez les carnivores domestiques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Chiens : 50
Maintenus en vie d'un test à l'autre pendant cinq ans, puis réaffectés à un autre projet ou proposés à l'adoption, 50 chiens beagles et 50 chats européens, soit 100 chiens et chats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun enchaîne jusqu'à dix tests d'efficacité successifs d'antiparasitaires, avec pour chaque test jusqu'à quinze prélèvements sanguins et jusqu'à quinze anesthésies de deux heures, chacune précédée de deux injections intramusculaires. Sous anesthésie, ils sont infestés pendant une heure trente par des puces, des tiques, des moustiques ou des phlébotomes. Le porteur signale un risque d'insuffisance hépatique lié à la répétition des anesthésies, et rappelle que ces tests sur l'espèce cible sont obligatoires pour obtenir une autorisation de mise sur le marché.
Objectifs
Les parasites externes des carnivores domestiques (insectes ou acariens : phlébotomes, moustiques, puces, tiques) peuvent causer diverses nuisances directes aux animaux (prurit, douleur, allergies…) et transmettre des maladies qui sont, pour certaines, des zoonoses. La leishmaniose par exemple, transmise par la piqûre des phlébotomes, est une des maladies vectorielles les plus importantes en Europe chez le chien. Présente dans 80 pays du monde et en extension, cette maladie transmissible à l'homme peut provoquer chez le chien des signes cutanés et viscéraux, qui sans traitement conduisent à la mort de l’animal. Tout chien infecté le reste à vie et représente une source de parasites pour l’homme. Le développement d'antiparasitaires externes ayant pour but de protéger les animaux contre ces parasites est donc un enjeu de santé animale et humaine. Pour évaluer un nouveau produit ou pour obtenir une autorisation de mise sur le marché d'un nouveau médicament vétérinaire, différentes études dont la détermination de l'efficacité chez l'espèce cible sont obligatoires. L’objectif de ce projet est la réalisation de ces tests d’efficacité pour différents antiparasitaires externes contre différents vecteurs, sous différentes formes galéniques, pour chiens ou chats.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont, à court-moyen terme, la mise sur le marché de médicaments antiparasitaires vétérinaires dont l’efficacité a été prouvée afin de prévenir les nuisances des infestations par des parasites externes et le risque de transmission de maladies vectorielles potentielles chez les animaux de compagnie. A plus long terme, les produits développés et testés au sein de l’établissement utilisateur ont pour objectifs de prévenir la transmission des maladies vectorielles à l’animale et pour certains à l’homme. Une meilleure compréhension des mécanismes de transmission des agents infectieux vectorisés et de la résistance aux insecticides permettra respectivement de proposer des méthodes de lutte adaptées pour la prévention des maladies et contourner la résistance
Procédures
Les animaux vont participer à plusieurs études successives pour étudier l’efficacité de différents produits antiparasitaires vétérinaires Chaque test a une durée de 2 semaines à 12 mois et entre chacun, une période de récupération de 2 mois minimum est respectée. Au maximum, sur 5 ans, chaque animal participera à 10 tests d’efficacité successifs. Les animaux reçoivent à chaque test un traitement antiparasitaire, par voie orale (comprimé, souvent appétant donc mélangé aux croquettes, ou solution), cutanée (pipette ou collier) ou injectable. L’administration de ce traitement dure environ 3 minutes. Pour les infestations parasitaires indirectes sur sang, des prélèvements sanguins de 10 mL maximum seront également pratiqués sur les animaux vigile. Un prélèvement dure environ 2 minutes. Chaque animal aura au maximum 15 prélèvements par test, espacés d’une semaine minimum. Pour les infestations parasitaires directe sur animal, les animaux sont anesthésiés à une fréquence variant d’une fois/semaine à une fois/mois, selon les produits à tester. Au maximum, pour chaque produit, l’animal pourra être anesthésié 15 fois. Pour chaque anesthésie, on leur fait 2 injections intra-musculaires de produits anesthésiques à 5 minutes d’intervalle. Chaque injection dure 1 minute maximum. L’anesthésie dure environ 2h maximum. L’infestation réalisée pendant l’anesthésie dure 1h30 maximum. Ces animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins répétés, sur animal vigile, après administration du produit à tester. Un prélèvement dure environ 2 minutes. Chaque animal aura au maximum 12 prélèvements par test, répartis sur plusieurs jours. Le volume prélevé sera adapté en fonction de l'espèce (chien ou chat), et de la molécule. Chaque année, les animaux subiront une prise de sang sur animal vigile (durée d'environ 2 min) afin de réaliser un bilan permettant de s’assurer de leur bonne santé. Ainsi sur 5 ans, les animaux auront au maximum 5 prises de sang de contrôle (1 par an).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles pour les animaux sont : - une réaction d’intolérance au produit antiparasitaire administré - un risque de détresse cardio-respiratoire liée à l’anesthésie - une douleur, un prurit excessif ou le développement d’une allergie liés aux piqures d’insectes - le développement d’une résistance ou l’apparition d’une insuffisance hépatique lié à la répétition des anesthésies
Devenir
A la fin de chaque test et pendant toute la durée du projet, les animaux sont maintenus en vie, ont un suivi vétérinaire régulier et restent dans la colonie de l’établissement utilisateur. A la fin de ce projet, ou en cas d’exclusion de ce projet, ils pourront soit être utilisés dans un autre projet (après évaluation vétérinaire), soit être proposés à l'adoption.
Remplacement
Chaque antiparasitaire testé a d’abord fait l’objet d’une détermination préliminaire d’efficacité in vitro, sans utilisation d’animaux : le produit est mis sur une surface imprégnée directement au contact des parasites pour évaluer son efficacité répulsive, insecticide/acaricide. Il n’est toutefois pas possible à ce jour de reproduire in vitro l’intégralité des mécanismes d’absorption, distribution, diffusion cutanée ou transcutanée, métabolisme et élimination des produits antiparasitaires ainsi leur impact sur les parasites externes. Seuls les antiparasitaires sélectionnés comme étant les meilleurs candidats après les essais préliminaires in vitro sont ensuite être testés sur animaux.
Réduction
Pour chaque test, nous utiliserons le nombre minimal d'individu par groupe permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables, et le nombre minimal réglementaire requis par les guidelines. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous réutiliserons les mêmes animaux pour plusieurs tests successifs pendant toute la durée du projet, en leur laissant une période de récupération adaptée.
Raffinement
Tous les animaux disposent d’élément d’enrichissement adaptés à l’expression de leur comportements naturels dans leurs hébergements et ont un programme de sorties, de jeu et/ou de manipulation : Les chiens disposent de balles, jouets en caoutchouc, plateformes de repos, et sont sortis quotidiennement dans le couloir de l’hébergement pour une courte activité de jeu avec le personnel. Ils sont également sortis dans un parc extérieur de détente ou promenés en laisse une fois par semaine (sauf conditions météo défavorables). Ils sont régulièrement habitués à monter sur la balance, être brossés et amenés en salle d’examen et récompensés à chaque occasion. Les chats disposent de paniers maisonnettes, griffoirs, jouets, tablettes surélevées et d’arbre à chats, ils sont sortis dans le couloir de l’hébergement une fois par semaine. Ils sont également régulièrement habitués à être pesés, brossés et amenés en salle d’examen et récompensés à chaque occasion. Des méthodes d’infestations parasitaires expérimentales indirectes, permettant d’exposer non pas l’animal entier, mais uniquement ses poils (recueillis par brossage non invasif) ou son sang, ont été développées par l’établissement et sont préférentiellement utilisées quand cela est possible. Afin d’éviter tout stress aux animaux lors des infestations parasitaires directes nécessitant une exposition de l’animal entier pendant une heure aux piqûres de parasites volants (moustiques, phlébotomes, mouches piqueuses), ou pour les infestations par les tiques, indolore mais longue (1h en moyenne), ils sont anesthésiés, placés dans un filet individuel, maintenus au chaud et surveillés avec attention pendant la durée de l’exposition et la phase de réveil. A la fin de chaque test, les animaux sont maintenus en vie et restent dans la colonie de l’établissement utilisateur pendant toute la durée du projet. Ils ont un suivi vétérinaire régulier, avec examen complet au moins 2 fois par an, des pesées a minima mensuelles et un bilan sanguin annuel afin de s’assurer de leur bon état de santé. Lorsqu’ils ne sont plus utilisés, les animaux sont tous proposés à l’adoption.
Choix des espèces
Afin d'obtenir une autorisation de mise sur le marché d'un nouveau médicament vétérinaire, la détermination de l'efficacité chez l'espèce cible, est obligatoire. Chiens et chats sont les espèces cibles des médicaments antiparasitaires vétérinaires. Les chiens utilisés sont des Beagles, issus d’élevages agréés. Les chats sont de race européenne, issus d’élevages agréés. Ces races sont représentatives de chacune des espèces cibles. Les guidelines régissant ce genre d'études réglementaires ne donnent pas d'indications sur l'âge des animaux à utiliser. Nous utiliserons des animaux adultes (plus de plus de 6 mois).
Détermination des conditions de greffe et de croissance de tumeurs implantées par voie intracérébrale chez la souris immunodéficiente ou immunocompétente
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour déterminer à quelle vitesse une tumeur cérébrale greffée se développe et quand commencer à tester un traitement, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever cerveau et tumeur. Des cellules cancéreuses leur sont greffées dans le cerveau au cours d'une chirurgie de quarante-cinq minutes, puis la tumeur est suivie jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie sur soixante jours au plus. Le porteur indique que la croissance de la tumeur peut entraîner des effets neurologiques selon la structure cérébrale visée, et classe l'ensemble en souffrance modérée. Il retient six souris par groupe et emploie des souris dépourvues de système immunitaire pour greffer des cellules humaines, ou des souris immunocompétentes lorsque la réaction immunitaire doit être observée.
Objectifs
Les cancers du cerveau (et plus particulièrement les glioblastomes qui représentent 30% de ces cancers) sont des maladies graves qui touchent de nombreuses personnes, et les traitements actuels ne permettent pas d’apporter une solution thérapeutique efficace aux patients. Pour développer de nouveaux médicaments, il faut d'abord les tester sur des modèles qui reproduisent la maladie le plus fidèlement possible avant tout essai chez l’humain. Ce projet vise à améliorer la recherche de traitements contre certains cancers du cerveau, encore difficiles à soigner aujourd'hui. Il a pour objectif d’étudier les meilleures conditions pour reproduire et suivre des tumeurs cérébrales chez la souris. L'objectif est de savoir si les cellules cancéreuses s'installent correctement, à quelle vitesse la tumeur se développe, et quel est le bon moment pour commencer à tester un traitement. Concrètement, des cellules cancéreuses sont greffées dans le cerveau de la souris sous anesthésie générale et anti-douleurs, puis la croissance des tumeurs est observée régulièrement grâce à des techniques d’imageries qui permettent de visualiser la tumeur de façon non invasive. Les souris utilisées seront dépourvues de système immunitaire pour éviter le rejet de la greffe lorsque les cellules tumorales utilisés seront d’origines humaines. Dans le cas où l’impact du système immunitaire serait important dans nos hypothèses, des souris immunocompétentes seront utilisés et des tumeurs de souris seront greffées pour modéliser une tumeur dans son microenvironnement sans risque de rejet de greffe. Ce travail permettra de choisir les meilleurs modèles pour tester de futurs médicaments et comprendre leurs mécanismes d’actions.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de disposer de modèles de recherche fiables qui reproduisent fidèlement la maladie. Habituellement, les cellules tumorales sont implantées sous la peau des animaux, mais cette méthode a des limites importantes : l'environnement autour de la tumeur n'est pas le même que dans le cerveau, et la barrière naturelle (barrière hématoencéphalique) qui protège le cerveau n'est pas présente. En étudiant la tumeur directement dans le cerveau, là où elle se développe réellement, ce projet vise à mieux comprendre comment le cancer se développe dans un organisme vivant. Cela permettra d'adapter les conditions de test pour évaluer plus efficacement les futurs médicaments. À court terme, ces connaissances sont essentielles pour développer des modèles d’études pertinents et identifier à moyen terme des traitements plus efficaces, dans le but d'améliorer la survie et la qualité de vie des personnes atteintes de cancer du cerveau.
Procédures
Intervention chirurgicale pour la greffe des cellules tumorales sous anesthésie générale gazeuse et locale avec injection d’analgésie (45 min) – 1 fois Imagerie sous anesthésie gazeuse (20min) – 1 fois par semaine jusqu’à 8 fois au cours de l’étude après injection d’un substrat dont la transformation émet des photons détectables par imagerie durant 60 jours maximum.
Impact sur les animaux
Une potentielle source de stress ou douleur peut survenir lors : − de la phase chirurgicale sous anesthésie nécessaire à l’administration des cellules (d’une durée d’environ 45 minutes) et du suivi post-opératoire (Stress et douleur modérée) -de la phase de pousse de la tumeur (60 jours maximum). L’évolution de la tumeur pourrait potentiellement avoir des effets neurologiques lié à la pousse de la tumeur et la structure cérébrale ciblée. Ce qui pourrait engendrer une douleur et un stress modéré. - de l’anesthésie gazeuse pour l’évaluation de la taille de la tumeur par de l’imagerie par bioluminescence d’une durée de 20 min hebdomadaire maximum sur une durée de deux mois maximum (Stress léger) - des injections d’anesthésiques et d’analgésiques lors des soins pré- péri- et post-opératoire, et également lors de la mise à mort en fin d’étude mais également l’injection hebdomadaire durant deux mois du substrat dont la transformation émet des photons détectable lors des mesures par imagerie. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress
Devenir
À la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort. Cette étape est nécessaire pour prélever et analyser les tissus (cerveau, tumeur) afin de valider les caractéristiques du modèle et de comprendre précisément le développement de la maladie à l'échelle cellulaire et de l’organe. Ces prélèvements permettent également de générer des échantillons pour des analyses complémentaires, optimisant ainsi l'utilisation de chaque animal.
Remplacement
Ce projet a pour but de déterminer des conditions de greffe et de croissance de tumeurs implantées dans le cerveau chez la souris immunodéficiente ou immunocompétente. Dans un premier temps les lignées d’intérêts sont sélectionnées in vitro lors d’études dites de validation de cible (surexpression ou suppression du gène cible). Puis une fois validée, l’implantation des cellules permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du cerveau (Glioblastome) permettant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. De plus, cette localisation ajoute une complexité au développement du médicament qui se doit d’avoir des propriétés physico-chimiques spécifiques pour atteindre la tumeur et franchir la barrière hématoencéphalique tout en interagissant avec la cible. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le micro-environnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in-vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. Par la suite, l’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux.
Réduction
• Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. En accord avec les données de la littérature et les données générées en interne ainsi que les recommandations du service biostatistique qui nous accompagne, 6 animaux par groupe est le minimum nécessaire • Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. • L’imagerie permet une détection des tumeurs non visibles à l’œil nu. Cette technique permet de suivre l’évolution des tumeurs au cours du temps et fait de l’animal son propre témoin (Suivi longitudinal), ce qui concourt directement à la réduction du nombre de souris nécessaires dans une même étude.
Raffinement
• La procédure de greffe tumorale dans le cerveau est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire, avec un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. • Les souris seront replacées en hébergement groupé après la chirurgie. • Mise en place de gel nutritif en préventif systématiquement 3 à 5 jours avant la chirurgie, dans un but d’habituation des animaux à l’aliment pour favoriser la prise en postopératoire ainsi que la récupération post chirurgie, puis tout au long de l’étude. • L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs comportements naturels comme ronger, se réfugier ou nidifier et favoriser le comportement de fouissage. • Les animaux font l’objet d’une observation clinique en post chirurgie et tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la Structure chargée du bien-être des animaux et les points limites seront appliqués. • Les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées. Ce mode d’hébergement permet de suivre, au cours de l'étude, d’éventuelles altérations de l’activité cumulée des souris dans une cage. Avec ce système l’analyse des résultats fournira une meilleure documentation des modèles. • Le suivi de la croissance tumorale par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive et sans douleur pour l’animal qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude sans procéder à l’examen macroscopique de la tumeur en systématique. Les tumeurs sont mesurées par l’intensité du signal émis par les cellules tumorales 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter le stress ressenti par les animaux .
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe de cellules tumorales dans le cerveau chez la souris est décrite comme hautement pertinente La souris est le modèle de référence grâce à sa structure cérébrale et sa barrière hémato-encéphalique proches de celles de l'humain. La diversité des souches de souris disponibles permet aussi bien l'étude du système immunitaire sur des tumeurs murines (souris immunocompétentes) que la xénogreffe de cellules humaines sans risque de rejet (souris immunodéprimées). Le phénotype dommageable des souris immunodéprimées est maitrisé par les conditions strictes d’hébergement de notre animalerie protégée dans les études précliniques d’oncologie. La souris est le modèle de référence grâce à la structure de son cerveau et sa barrière physico chimique « hémato-encéphalique » proches de celles de l'humain. La diversité des souches de souris disponibles permet aussi bien l'étude du système immunitaire sur des tumeurs murines (souris immunocompétentes) que la xénogreffe de cellules humaines sans risque de rejet (souris immunodéprimées). Le phénotype dommageable des souris immunodéprimées est maitrisé par les conditions strictes d’hébergement de notre animalerie protégée Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie, il permet d’atteindre un poids corporel suffisant de l’animal pour assurer une bonne récupération post- chirurgicale. De plus à cet âge les souris présentent un cerveau développé et accessible pour l’implantation de tumeurs.
Efficacité pharmacologique et suivi en imagerie de nanoparticules capables d’emmener des molécules thérapeutiques dans le cerveau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trépanées au-dessus du cortex pour y sceller une fenêtre de verre, puis maintenues sous anesthésie jusqu'à trois heures pendant l'imagerie, 336 souris vont être utilisées dans des procédures menées sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées en fin de procédure par surdosage d'anesthésique. L'objectif est de suivre le passage, du sang vers le cerveau, de nanoparticules chargées d'une molécule thérapeutique, que le porteur décrit comme un "cheval de Troie" leurrant un transport naturel. Il revendique une "quasi-innocuité" de ses composés et annonce qu'un score de sévérité sévère constitue le point limite déclenchant la mise à mort immédiate.
Objectifs
Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et à développer des petites entités, dénommées vecteurs, pour faire pénétrer dans le cerveau des médicaments dont l’accès est proscrit par la présence d’une barrière biologique appelée Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). Cette barrière est constituée par une paroi extrêmement étanche des vaisseaux sanguins du cerveau. Cette barrière laisse passer uniquement les composés du sang nécessaires au fonctionnement cérébral et le protège des agressions extérieures mais, ce faisant, en empêche l’accès à certains médicaments. Il existe un système de transport naturel de molécules au niveau des vaisseaux sanguins et nos vecteurs sont capables de s’y attacher pour être amenés vers le cerveau. Dans ce projet nous allons attacher à la surface de nanoparticules (100 nm de diamètre) nos vecteurs et les remplir d'une molécule thérapeutique. Ces nanoparticules leurrent se système de transport comme un cheval de Troie pour pénétrer dans le cerveau suite à leur délivrance dans le sang. L’objectif de ce projet et de quantifier l’efficacité de l’agent thérapeutique embarqué et de suivre en imagerie le passage des nanoparticules, du sang au cerveau avec différents types de contrôles. Cette thématique de recherche a donc un potentiel révolutionnaire pour le traitement des pathologies du cerveau comme Parkinson et Alzheimer. Le succès de ces travaux et nos dernières études ont démontré la quasi-innocuité de nos composés et tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’effet de cette stratégie.
Bénéfices attendus
Grâce au profil pharmacologique et à l’optimisation de nos composés, nous pourrons envisager de meilleurs effets pharmacologiques /thérapeutiques notamment par la capacité de délivrer une large quantité d’agents encapsulés dans nos nanoparticules. Les correcteurs transitoires d’ADN (dont les ARN messagers et interférents) sont de plus en plus reconnus comme ayant un potentiel révolutionnaire thérapeutique, notamment par leur capacité à moduler transitoirement l’expression génique, ouvrant la porte au traitement de nombreuses pathologies. Ces entités thérapeutiques peuvent présenter de multiples effets définis par leur design (activation/répression, correction de la transcription de l’ADN en ARN messagers, etc.). Ainsi les limites des applications et des cibles de ces molécules thérapeutiques vont bien au-delà des approches classiques (petites molécules, anticorps, protéines, peptides, etc…). En théorie, ces thérapies pourraient être développés pour toute pathologie et même personnalisables pour chaque patient pour restaurer les fonctions déficientes. C’est particulièrement le cas pour toute pathologie présentant une composante génétique identifiée (maladie génétiques type myopathie de Duchenne, cancers, pathologies neurodégénératives, etc…). Bien qu’ils présentent une excellente sélectivité d’action, grâce à leur appariement précis sur une cible donnée, ils souffrent d’un handicap majeur pour permettre leur développement et leur essor dans l’arsenal thérapeutique : en tant que macromolécules chargées, leurs propriétés physicochimiques, leur stabilité et leur taille ne leur permettent pas de traverser les barrières biologiques à des doses acceptables. En outre, bien qu’ils présentent spontanément une affinité préférentielle pour les organes d’excrétion, avec notamment une accumulation au foie, ils ne se distribuent que très peu dans autres les tissus.
Procédures
Dans la procédure 1 un les animaux subiront une injection dans la queue en contention (durée < 1 min) puis seront stabuler jusqu’à 14 jours post injection avant mise à mort par un surdosage d’un mélange d’anesthésique/analgésique (15min entre l’injection et la mise à mort). Dans la procédure 2 qui se déroule entièrement sous anesthésie générale gazeuse induite en boite (2 min) puis maintenue au masque tout au long de la procédure (jusqu’à 3 heures incluant la session d’imagerie). Ensuite les animaux reçoivent des analgésiques systémiques et locaux (2 min) avant de subir la chirurgie d’implantation d’une chambre optique. Cette fenêtre osseuse est ménagée dans le crâne au-dessus du cortex avec un trépan (10 min) puis une lame de verre est déposée au-dessus puis scellée avec un ciment orthopédique (10min). L’animal est ensuite installé sous le microscope (10min). La procédure d’imagerie commence par une injection caudale d’un traceur vasculaire fluorescent (1 min). S’en suit l’acquisition en imagerie du réseau vasculaire cérébral (10 min). Les nanoparticules sont ensuite injectées de la même manière (1 min) et s’en suit l’acquisition en imagerie durant 2h30 avant la mise à mort de l’animal par surdosage d’un mélange d’analgésique/anesthésique. Dans la procédure 3, les animaux reçoivent la veille en contention soit une injection IV caudale de VEGF A soit d’une NP chargée avec un ARNm Cre (1 min). Le lendemain il subissent la même chirurgie d’implantation, session d’imagerie et protocole de mise à mort que ceux décrits ci-dessus (durée totale 3H).
Impact sur les animaux
Nos conjugués reconnaissent une cible fortement exprimée au niveau des vaisseaux sanguin du cerveau, et sont relativement bien tolérés. Cependant, toute nouvelle entité peut présenter des effets indésirables malgré des évaluations préalables. Pour limiter la douleur et la souffrance, un suivi quotidien est mis en place, avec évaluation comportementale et attribution d’un score de sévérité (non présent, modéré, sévère) pour les procédures éveillées. L’apparition d’un score sévère constitue le point limite et déclenche immédiatement la mise à mort des animaux. Ces mesures garantissent la protection des animaux tout en préservant la fiabilité des résultats expérimentaux. Les points limites liés à l’administration des composés sont : tout signe de toxicité. Pendant les 24h décisives ces points concernent les constantes vitales ainsi que le comportement des animaux. Pour les procédures chirurgicales et la session d’imagerie sous anesthésie générale, les points limites qui seront observés concernent : les constantes vitales au cours de l’anesthésie et les potentiels dommages que pourrait subir le cerveau pendant la chirurgie. Pour les sessions d’imagerie, une partie des études sont classées sans réveil (toutes les sauf « rupture de BHE et NP-ARNm Cre » où les animaux reçoivent une injection la veille : classe modérée). Tous les gestes suivants jusqu’à la mise à mort sont réalisés sous anesthésie générale. L’autre procédure (efficacité pharmacologique), de classe modérée, comprend une injection en contention, une période de stabulation puis une injection terminale avant récupération des tissus/sang pour post analyses. De fait, les seuls stress rencontrés seront des administrations en contention et l’induction des anesthésies (le projet inclura des anesthésiques et analgésiques). Quasiment aucun effet délétère n’est attendu à l’issue des administrations, en termes de toxicité (données antérieures et élimination rapide). Les volumes d’administration sont en accord avec la littérature. L’administration de ces NP peut potentiellement engendrer un léger impact transitoire sur les constantes sanguines (environ 1h post-administration sans conséquences pour le bien-être des animaux) selon nos données antérieures. Il est à noter que nous avons une grande connaissance de l’innocuité de nos composés (toxicité, risques immunogènes) ainsi qu’une maitrise de leur pureté (>97% selon nos standards) et des taux d’endotoxines comparables à une étude clinique humaine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure
Remplacement
Toutes études de mesures pharmacologique ou d’imagerie en temps réel, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécanistiques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de variants génétiquement modifiés ; la souris est l'espèce idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. Le développement de nos vecteurs ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. L'utilisation de rongeurs impose la prise en compte de la règle des 3R, la conformité vis à vis des et du cahier des charges. A noter que la présélection des vecteurs, des NP et des agents thérapeutiques embarqués passent par une phase de criblage in silico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont testés in vitro sur lignées cellulaires avant de passer aux phases in vivo (souches sauvages et génétiquement modifiées) et d’envisager dans d’autre projet un passage au primate non-humain en fin d’étude préclinique. Ce faisant nous respectons scrupuleusement tous les outils à disposition pour sélectionner nos composés avant d’envisager une étude chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs (N.S. one-way anova). Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux nous nous basons sur notre historique de résultats, notamment au niveau de la reproductibilité inter-individuelle, et d’un plan d’expérience aboutissant à un n=4 pour la première procédure dans chaque groupe et un n=6 pour les procédures d’imagerie 2 et 3.
Raffinement
Pour la procédure d’efficacité pharmacologique, les administrations en contention (très rapides
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé (physiologie connue et proche de l’homme). Il facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la pharmacologie (diminution des quantités administrées). On l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations et l’obtention de groupes sans trop de contraintes de stabulation. La souris est également idéale lorsqu’il s’agit de mette en place l’élevage d’une lignée. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés y ont été développés et sont disponibles, dont ceux inclus dans ce projet. Enfin l'utilisation de souris est indispensable car nos Vecteurs ont été développés pour cibler différentes formes de notre récepteur d’intérêt « forme sauvage mais aussi génétiquement modifiée sous sa forme humanisée). Enfin les animaux inclus seront des mâles et femelles à un stade de développement adulte.
Essai thérapeutique de réversion de lésions hépatiques dans un modèle murin d’une maladie vasculaire héréditaire.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
40 souris vont être utilisées, toutes tuées en fin de procédure pour récupérer leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une modification génétique qui fragilise leurs vaisseaux et provoque des lésions du foie, elles reçoivent jusqu'à huit injections en sept jours sur animal éveillé, sous immobilisation de trente secondes, avec un risque d'hématome et d'infection. Le porteur retient dix souris par groupe et quatre groupes, et indique qu'aucun traitement n'existe aujourd'hui pour cette maladie héréditaire. La piste thérapeutique annoncée n'existera que si l'inhibiteur testé améliore effectivement les lésions hépatiques.
Objectifs
Nous travaillons sur une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste, entre-autre, par des hémorragies et des problèmes de déformation entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes : atteintes du foie pouvant nécessiter une greffe, des poumons mais aussi du cerveau. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous avons des modèles de souris de cette pathologie qui sont des animaux génétiquement modifiés. Ces animaux ont été caractérisés pour leurs défauts vasculaires dans le foie qui reproduisent bien certains aspects de la maladie. Nos analyses ont identifié une cible thérapeutique potentielle. Objectif : Etudier l’effet d’un inhibiteur de cette cible sur les manifestations de la maladie dans le foie (lésions hépatiques) de notre modèle animal.
Bénéfices attendus
Il y a actuellement aucun traitement pour la maladie que nous étudions. Si les lésions hépatiques sont améliorés par l’inhibiteur de notre cible, une piste thérapeutique pour traiter les patients sera alors identifiée.
Procédures
Des injections sur animaux éveillés sont effectuées sur l’ensemble des animaux. Les injections sont au nombre de 8 maximum par souris sur une période de 7 jours et d’une durée inférieure à 30 secondes chacune.
Impact sur les animaux
Les injections sur animaux vigiles induisent une douleur passagère (quelques minutes maximum), un risque d’infection et d’hématome, ainsi qu’un stress suite à l’immobilisation (maximum 30 secondes). Une légère perte de poids ou une diminution d’activité sont possibles à la suite de l’invalidation du gène étudié.
Devenir
Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient mis à mort, afin de récupérer les organes.
Remplacement
Le développement de cette pathologie fait intervenir plusieurs types cellulaires. Il n’est actuellement pas possible de recréer les interactions cellulaires entre tous ces acteurs in vitro. De plus, les cellules composant les vaisseaux sanguins ont un phénotype différent d’un organe à l’autre. Cette différence est fondamentale mais non maintenue en culture. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires qui conduisent aux malformations vasculaires hépatiques, nous devons avoir recours à l’expérimentation animale, les modèles in vitro n’étant pas adéquats.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel statistique, ainsi que les données de la littérature pour déterminer la taille des groupes nécessaires permettant de faire les tests statistiques nécessaires à la validation des données par la communauté scientifique. Dix souris par groupe seront nécessaires. Le nombre de groupes est de quatre. Le projet nécessite donc 40 animaux.
Raffinement
Chez les souris adultes, une mise en place de point limite permettra de s’assurer du bien-être des animaux. Pendant toute l’expérience, une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal (voir annexe). En cas de signe de douleur, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet portent des modifications génétiques semblables aux mutations portées par les patients atteints de cette maladie. Elles constituent donc le meilleur modèle de la pathologie pour mieux comprendre les mécanismes de développement de cette pathologie et mieux développer des traitements. Les symptômes de cette maladie apparaissent à l’adolescence, nous allons étudier les phénotypes vasculaires à l’âge jeune adulte uniquement.
Rôle des protéines du métabolisme de la paroi bactérienne dans la virulence
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
9 156 souris vont être utilisées sur cinq ans, chacune recevant par gavage une suspension bactérienne en trois minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur précisant que les animaux ne peuvent être "ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés" puisque l'objectif est de prélever l'estomac ou l'intestin. Il attend de l'infection gastrique aucune souffrance et de l'infection intestinale un inconfort léger épisodique, sur la foi de son expérience et de celle de ses collègues. Le même résumé annonce 9 156 souris au titre du "cas pessimiste" où chaque souche mutante et chaque temps d'observation feraient l'objet d'expériences indépendantes.
Objectifs
Le répertoire des récepteurs de l’immunité innée inclus des protéines capables de reconnaître virtuellement tous les différents composants de la paroi bactérienne. Cette détection de ces composants de paroi permet à l’hôte et aux bactéries d’établir une symbiose bénéfique aux deux partenaires. Cet équilibre est rompu dans le contexte d’une bactérie pathogène. De nombreux pathogènes ont développé des stratégies d’échappement à l’hôte en modifiant ou masquant leur surface au système immunitaire inné. Nous avons fait dans le passé la preuve de principe en étudiant certains mécanismes de modification de certains composants de la paroi bactérienne qui permettent au pathogène d’échapper à la reconnaissance par le système immunitaire inné de l’hôte. Néanmoins, il reste encore à découvrir beaucoup de nouveaux mécanismes de régulation de la paroi bactérienne permettant à des pathogènes d’échapper à la surveillance de l’hôte. Nous étudions ces mécanismes dans deux pathogènes du tractus gastrointestinal : responsable de pathologies gastriques sévères comme le cancer de l’estomac, et responsable de gastroentérites et souvent associé à des maladies chroniques inflammatoires de l’intestin. Ainsi, nous étudierons la capacité de souches mutantes pour des gènes impliqués dans la modification et/ou régulation de la paroi bactérienne à coloniser leur niche naturelle (estomac et intestin). Grâce à ces nouvelles connaissances, nous espérons pourvoir développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant ces fonctions importantes pour la survie de ces deux pathogènes dans leur niche.
Bénéfices attendus
La souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire très proches de l’homme. De plus, il existe un grand nombre de lignées murines mutantes, transgéniques ou invalidées pour des gènes de l’immunité, permettant par la suite, en fonction des résultats obtenus sous ce projet, des études mécanistiques approfondies de la réponse immunitaire de la souris face à l’infection de l’estomac par l’une des bactéries étudiéesi. Ces nouvelles connaissances permettraient d’améliorer les stratégies vaccinales contre cette bactérie qui pour l’instant ne sont pas efficaces. De plus, le fait de se focaliser sur des mutants du métabolisme de la paroi chez cette bactérie nous pourrons identifier des cibles prometteuses pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre cette bactérie. Ainsi, les résultats expérimentaux seront très probablement transférables à l’homme.
Procédures
L’administration des suspensions bactériennes par gavage sur animal vigile est très rapide (3 min par individu).
Impact sur les animaux
Le gavage entraine un inconfort et une douleur légère de courte durée. Suivant la littérature, l’infection de l’intestin par les souches pathogènes de l’une des 2 bactéries étudiées peut entrainer épisodiquement un inconfort léger de la souris avec de la diarrhée. Néanmoins, nous n’avons jamais observé avec nos souches de d’inconfort ou de diarrhée. Par contre, l’infection de l’estomac par l’autre bactérie étudiée n’entraine aucune souffrance pour la souris suivant notre expérience et celle de nos collègues nationaux et internationaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, pour toutes les procédures, l’objectif final est de prélever certains organes pour l’observation de la colonisation bactérienne de l’estomac ou de l’intestin. Ces prélèvements d’organes vitaux sont, par définition, réalisés sur animaux morts.
Remplacement
Pour ce projet, aucun système alternatif au modèle animal n’est possible pour répondre à la question scientifique du rôle des protéines du métabolisme de la paroi bactérienne dans la virulence. Des systèmes cellulaires ou d’organoïdes ne permettent pas d’étudier la réponse immunitaire. De plus, avec ces systèmes in vitro, il y a absence complète de l’environnement complexe de : 1) l’estomac notamment l’acidité produite par les cellules pariétales qui ont un impact très fort sur la survie de l’une des 2 bactéries étudiée ; 2) de l’intestin, notamment, la production d’acides biliaires ou la compétition avec la flore commensale qui impactent fortement la capacité de l’autre bactérie étudiée à coloniser cette niche. Ainsi, le comportement de mutants dans des systèmes cellulaires ne reproduit pas le stress rencontrer dans le tractus gastrointestinal.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utiles à ce projet a été débattue avec les biostatisticiens. Nous utiliserons ici 9156 souris sur une période de 5 ans dans le cas pessimiste où chaque souche mutante et chaque temps d’observation ferait l’objet d’expériences indépendantes. Lorsqu’une expérience permettra l’observation de plusieurs mutants en même temps, ou de plusieurs temps avec une même souche mutante, un seul groupe contrôle sera produit.
Raffinement
Durant les deux semaines précédant toute expérimentation, les expérimentateurs rendront visite aux souris pour les habituer aux manipulations avant toute procédure expérimentale. Pendant le protocole, les expérimentateurs rendront visite tous les jours aux souris lors des deux premières semaines d’infection. Après les 15 premiers jours, si aucun signe visible de détresse est observé, les visites se feront deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. En cas de diarrhée, nous mettrons du gel hydrique dans les cages à dispositions des souris. En cas
Choix des espèces
Ce projet s’inscrit dans la continuité des précédents projets menés au laboratoire. C’est le modèle pour lequel nous avons le plus d’outils moléculaires pour étudier la réponse de l’hôte à l’infection. De plus, nous avons à notre disposition des modèles murins génétiquement modifiés, transgéniques ou invalidées pour des gènes de l’immunité qui permettrons une suite en cas de résultats intéressants avec certains des mutants à tester. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront âgées de 5 ou 6 semaines. Cet âge défini est basé sur nos précédents projets internes et externes qui ont fait appel au modèle murin.