Procédures modérées

Trente-cinq administrations et trente-deux pesées par animal, en cage individuelle: 60 souris rendues obèses par un régime dont 60 % des calories viennent des graisses sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Les témoins voient leur ration calorique quotidienne strictement alignée sur celle des souris traitées, afin de savoir si la perte de poids obtenue avec le composé X vient de la seule baisse de la prise alimentaire. Le porteur signale que l'obésité elle-même réduit la capacité de mouvement des souris, et que les prélèvements de sang causent des douleurs légères et du stress. L'étude est commandée par un client dont le porteur reprend l'objectif, faire aboutir la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Objectifs

Depuis 1975, la prévalence de l’obésité mondiale a presque triplé, atteignant plus de 650 millions d’adultes obèses en 2016 selon l’Organisation mondiale de la Santé (OMS). L’obésité constitue aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique, pour lequel de nombreuses approches thérapeutiques, interventions chirurgicales et dispositifs médicaux sont en cours de développement ou d’évaluation. Le présent projet s’inscrit dans la continuité d’une étude préliminaire menée par notre client, ayant démontré que le composé X induit, chez la souris rendue obèse par un régime enrichi en graisses, une diminution significative de la prise alimentaire associée à une réduction du poids corporel. Cet effet a été observé dans un contexte d’administration chronique. Afin de préciser la nature des effets observés, notre client souhaite déterminer si la perte de poids induite par le composé X résulte exclusivement de la diminution de la prise alimentaire ou si d’autres mécanismes métaboliques intrinsèques contribuent à cet effet. Pour répondre à cette question, nous avons conçu une étude de type pair-feeding. Le composé X sera administré à un groupe d’animaux afin de caractériser la réduction spontanée de la prise alimentaire induite par le traitement. En parallèle, des groupes témoins recevant le véhicule auront leur ration calorique quotidienne strictement ajustée à celle des animaux traités. Si la perte de poids observée s’avère comparable entre les deux groupes, il sera alors possible de conclure que l’effet du composé X sur le poids corporel est principalement imputable à la seule réduction de la prise alimentaire. En revanche, toute différence supplémentaire en faveur du groupe traité suggérerait l’existence d’un effet métabolique propre, indépendant de la restriction calorique.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (32 mesures au cours de l'étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration des traitements (35 administrations ; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (3 mesures ; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (3 prélèvements ; durée du prélèvement : 5 minutes); 5) Anesthésie générale avant mise à mort et prélèvement d'organes (durée : 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. L'administration des traitements sera source de stress. Par ailleurs les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après mise à mort pour analyses ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 12 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de tunnels, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue une semaine avant la phase de traitement afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans le tube de couleur rouge permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures. Les prélèvements sanguins seront limités au volume minimum nécessaire aux analyses pharmacocinétiques et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'anti-douleur en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (avec 60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 18 semaines à réception. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 12 semaines de régime enrichi en graisses chez le fournisseur.

Les souris utilisées sont déficientes pour des protéines de l'audition et deviennent sourdes et déséquilibrées dès la deuxième semaine de vie, un état qui dure jusqu'à leur mise à mort. 8 985 souris sont engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection unique dans l'oreille interne sous anesthésie, à un jour de vie ou entre 14 et 30 jours, puis des tests auditifs sous anesthésie répétés à 1, 2 et 3 mois, et des tests comportementaux d'équilibre et d'orientation, dont un test d'équilibre de 31 minutes et un test de flottaison de dix secondes. 4 635 souris sont tuées pour prélever les tissus de leur oreille interne, et 4 350 sont réutilisées pour de l'exploration fonctionnelle.

Objectifs

La surdité et les troubles de l'équilibre sont parmi les déficits sensoriels héréditaires les plus fréquents chez l'homme. Environ 1 nouveau-né sur 700 est atteint de surdité congénitale, et 80 % de ces cas ont une origine génétique, dont 30 % sont associés à des troubles de l’équilibre. Parmi les syndromes responsables, le syndrome d’Usher est l’une des principales causes de surdicécité et de troubles d’équilibre héréditaires chez l’homme. À ce jour, aucun traitement ne permet de prévenir ou de corriger ces atteintes sensorielles. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner ces déficits. Notre objectif est d’évaluer l’efficacité d’une telle approche dans différents modèles murins de surdités sensorielles parmi lesquelles le syndrome d’Usher. Nous testerons deux stratégies de thérapie génique dans des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder les déficits sensoriels de l’oreille interne d’origine génétique. A court terme : Nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour exprimer la protéine non mutée ou réparer la protéine mutée et déterminerons l’efficacité de ces stratégies pour corriger les troubles sensoriels chez nos souris déficientes. A long terme : Nous espérons avec ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques afin de prévenir ou retarder les signes cliniques chez les patients atteints du syndrome d’Usher. Ceci inclut : - la mise en évidence d’approches nouvelles pour le transfert de gène, - la mise en évidence de l’efficacité in vivo de l’édition de gène pour la correction de mutations spécifiques.

Procédures

Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections dans l’oreille interne sous anesthésie gazeuse et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes au stade néonatal et 20 minutes au stade post-natal. Tests auditifs : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à 1, 2 et 3 mois. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront également soumises à des tests comportementaux. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera évaluée par deux tests : un premier de 31 minutes (composé de 3 sessions de 2 minutes et 3 sessions de 5 minutes, séparées par des pauses de 2 minutes) et un second de 2 minutes. Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à deux autre tests (10 à 60 secondes chacun). Un test de flottaison sera finalement réalisé (10 secondes) avant le retour en cage d’hébergement.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en protéine fonctionnelle de l’audition présentent des déficits qui se manifestent par des troubles de l’équilibre. Les injections dans l’oreille interne seront réalisées sous anesthésie et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en pré- et post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté contribuera à rétablir les fonctions sensorielles des souris injectées. En découle la liste ci-dessous des interventions après raffinement, et de leurs éventuels effets indésirables supérieurs ou égal à une piqûre d’aiguille : 1) Les lignées de souris transgéniques déficientes non traitées, élevées dans un milieu fortement enrichi, montrent une surdité et des troubles de l’équilibre, qui apparaissent à partir de la 2ème semaine de vie post-natale et perdurent jusqu’à la mise à mort. 2) Les injections dans l'oreille d’une durée maximum de 20 minutes, sont réalisées sous anesthésie avec analgésie et sous contrôle strict pré- et post-opératoire. Les souris sont placées sur un tapis chauffant (37°C) et surveillées tout au long de la procédure. 3) Un test entraîne de faibles nuisances, dont une chirurgie de courte durée (15min) et l’étude vidéo, qui nécessite de maintenir les animaux immobilisés pour une durée n'excédant jamais 30 minutes.

Devenir

4350 souris seront réutilisés pour exploration fonctionnelle. Les autres animaux (soit 4635 souris) seront mis à mort pour récupérer des tissus de l’oreille interne afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transmission de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous aurons recours à la souris dans notre projet pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la surdité et les troubles de l’équilibre, et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs ou curatifs.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de publications. Un effectif de 5 individus par groupe permettra d’obtenir des résultats significatifs, au regarde des effets attendus. Nous limitons également le nombre d’individus de nos groupes contrôles en réexploitant, quand cela est pertinent, les données contrôles de nos expériences antérieures. Afin de contrôler d’éventuels effets techniques, les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents, et plusieurs répétitions seront réalisées. Ces facteurs seront pris en compte dans les analyses.

Raffinement

Enrichissement de l’environnement Chez la souris, les troubles sensoriels peuvent s’accompagner d’hyperactivité, de désorientation, de stress et de bagarres (chez les mâles). D’expérience, nous avons remarqué que pour limiter ces effets, il suffisait d’ajouter deux igloos par cage, des copeaux en carton (et non pas en coton propice aux garrots), des bâtonnets en bois à grignoter (1 par souris), et d’équilibrer le nombre d’animaux normaux et d’animaux déficients dans une même cage. Les cages doivent de plus être manipulées avec une très grande délicatesse et le moins souvent possible (une fois par jour maximum). Les personnes amenées à intervenir sur nos cages de souris déficientes sont alertées sur les consignes à appliquer. Surveillance des souris en amont et en aval d’une anesthésie avec ou sans chirurgie L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie des souriceaux. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans leur cage. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par notre SBEA.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Ces modèles vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections se feront sur des souriceaux (P1, age 1 jour) ou des souris âgées de P14-P30 (age entre 14 et 30 jours). Le stade P1 est un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. Les stades P14/P30 correspondent à des stades où les tissus sensitifs de l’oreille interne sont matures. La mise à mort se fera entre 30 jours et 3 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long terme d’une correction génique.

Soumises à six séances d'électrostimulation musculaire sous anesthésie générale, à sept mesures de force, à une injection sous-cutanée et à un prélèvement de sang, 416 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue parce que l'analyse détaillée du tissu musculaire ne peut pas se faire sur l'animal vivant. Ce cumul d'actes est annoncé comme une source de stress, et le porteur qualifie pourtant son dispositif de "totalement non-invasif", ce dont il tire une réduction du nombre de souris utilisées. L'objet déclaré est d'identifier les molécules que la fibre musculaire sécrète en réponse à l'exercice, en vue de pathologies humaines de fonte musculaire. Les points limites appliqués portent sur le gonflement anormal de la patte, sa non-utilisation persistante, la prostration, les démangeaisons et une mobilité réduite.

Objectifs

Le projet vise à i) identifier les molécules sécrétées par la fibre musculaire en réponse à l’exercice, ii) évaluer leur impact sur les différents types cellulaires du muscle, iii) à analyser la persistance des noyaux dans la fibre musculaire, ainsi que sa durée ; et identifier leurs effets fonctionnels, tissulaires, biochimiques, cellulaires et moléculaires

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la réponse à la contraction musculaire induite par l’exercice est fondamentale pour la prise en charge de pathologies associées à une fonte du tissu musculaire et à une dysfonction des cellules souches musculaires (i.e., vieillissement, cancer, sepsis, insuffisance cardiaque).

Procédures

Les souris sont soumises à un protocole d’exercice par électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum, 6 séances maximum), à une mesure de force (sous anesthésie générale, durée 5 minutes maximum, 7 mesures maximum), une injection sous cutanée et à un prélèvement de sang.

Impact sur les animaux

Un stress pour les animaux est attendu du fait d’un cumul d’actes (stimulations électriques musculaires, anesthésies, injection sous cutanée, prélèvement sanguin)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car la procédure implique un exercice par stimulations électriques musculaires qui est impossible à reproduire in vitro. Enfin, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe.

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice par stimulations électriques musculaires et de mesurer la force musculaire de manière simultanée sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. L’enchaînement des procédures est construit sur une stratégie de type GO/NO GO qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire. Notre expérience sur ce modèle d’exercice montre que l'ensemble (100%) des animaux est inclus pour réaliser des analyses fonctionnelles et biologiques. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués (gonflement anormal de la patte, non utilisation persistante de la patte, prostration de l'animal, démangeaison, mobilité réduite). Un traitement antalgique est utilisé pour le prélèvement sanguin.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans la fonction du muscle ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 10 et 14 semaines d'âge.

8 chevaux atteints d'asthme sévère, appartenant à des particuliers, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant trois mois, chacun reçoit d'abord des pellets de foin, puis du foin sec pendant douze jours, exposition dont le porteur attend une toux, un jetage ou une gêne respiratoire modérée, avant dix jours de corticoïdes qui peuvent entraîner une fourbure ou une surinfection respiratoire. Cinq prises de sang et des lavages bronchoalvéolaires sous sédation, environ 45 minutes par cheval et par série, servent à chercher des exosomes susceptibles de renseigner sur l'inflammation pulmonaire. Aucun cheval n'est tué, les huit retournent à leur lieu de vie d'origine à la fin du protocole.

Objectifs

L’asthme équin regroupe plusieurs maladies respiratoires inflammatoires non infectieuses, récurrentes ou chroniques, qui altèrent durablement le confort et les performances du cheval. Parmi elles, l’asthme équin sévère concerne une part importante de la population équine, en particulier les chevaux adultes et âgés. Aujourd’hui, son diagnostic repose principalement sur l’examen clinique et sur l’analyse du lavage bronchoalvéolaire, qui permet d’évaluer l’inflammation dans les voies respiratoires profondes. Cependant, cet examen de référence n’est pas toujours réalisable, notamment lorsque l’animal présente une crise respiratoire. En outre, il reste difficile de distinguer avec précision un cheval asthmatique en rémission d’un cheval atteint d’une forme modérée ou d’un cheval sain. Ce projet propose d’explorer une piste innovante : l’étude des exosomes, de très petites vésicules libérées par les cellules, présentes notamment dans le sang et dans les fluides respiratoires. Ces structures jouent un rôle majeur dans la communication cellulaire et pourraient refléter fidèlement les mécanismes à l’œuvre dans les poumons au cours de l’asthme. En analysant de manière large leur contenu biologique, le projet vise à mieux comprendre la physiopathologie de l’asthme équin sévère, à identifier de nouveaux biomarqueurs et, à plus long terme, à ouvrir la voie vers des outils diagnostiques plus simples et des approches thérapeutiques mieux ciblées. L’enjeu est important : mieux détecter, mieux suivre et, demain, mieux traiter cette affection respiratoire fréquente en médecine vétérinaire équine.

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu est une meilleure compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans l’asthme équin sévère. Cette avancée est essentielle, car une meilleure connaissance de la maladie constitue la base d’une prise en charge plus précise, plus précoce et plus adaptée aux chevaux atteints. En médecine vétérinaire équine, où les outils diagnostiques restent parfois limités, tout progrès dans la compréhension fine de la maladie peut avoir un impact direct sur la qualité du suivi clinique. Le projet doit également permettre d’établir un véritable “profil” des exosomes et de leur contenu selon deux paramètres majeurs : le type d’exposition étudié et la réponse au traitement par corticoïdes. Cette approche pourrait aider à identifier des signatures biologiques utiles pour mieux repérer les phases d’aggravation, objectiver l’amélioration sous traitement et, à terme, affiner le pronostic et le suivi des chevaux asthmatiques. Il s’agit donc d’une recherche à fort potentiel translationnel, c’est-à-dire susceptible de déboucher sur des applications concrètes pour la pratique vétérinaire. Enfin, le projet doit aussi préciser si l’alimentation à base de pellets de foin peut être considérée comme sûre sur le plan respiratoire chez les chevaux souffrant d’asthme. Cet aspect présente un intérêt très concret, car la gestion de l’environnement et de l’alimentation fait partie intégrante de la prise en charge de cette pathologie. Si leur innocuité est confirmée, ces aliments pourraient représenter une solution pratique et sécurisée pour limiter l’exposition à des facteurs aggravants, tout en facilitant la conduite quotidienne des chevaux asthmatiques.

Procédures

Sur une période de trois mois, huit chevaux atteints d’asthme équin sévère seront suivis au cours de plusieurs phases successives. Ils seront d’abord exposés à une alimentation sous forme de pellets, puis à du foin sec, chaque période durant douze jours, avant de recevoir un traitement corticoïde pendant dix jours. Au cours de cette étude, cinq prises de sang et des lavages bronchoalvéolaires de seront réalisés chez chaque cheval, après sédation, afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses. Chaque série de prélèvements (sang + LBA) durera environ 45 minutes par cheval.

Impact sur les animaux

L’exposition au foin sec pendant deux semaines peut entraîner chez certains chevaux une réaction clinique modérée et transitoire, avec apparition possible de toux, de jetage ou de gêne respiratoire modérée. Cette aggravation reste réversible et fera l’objet d’une surveillance attentive dans le cadre du protocole. Elle est précisément étudiée, car elle permet de mieux comprendre les facteurs susceptibles de déclencher ou d’entretenir l’asthme équin sévère. La réalisation des lavages bronchoalvéolaires peut provoquer une toux passagère lors du passage de l’endoscope, malgré l’ensemble des précautions prises. Les prises de sang et la sédation peuvent aussi s’accompagner d’effets secondaires limités, tels qu’un hématome local ou, de manière transitoire, une ataxie, une bradycardie ou une hypotension. Un risque d’hémorragie existe également lors du lavage bronchoalvéolaire si une zone fragile est touchée, mais ce risque reste limité par l’utilisation d’un endoscope. Dans les minutes suivant la sédation, un risque de fausse déglutition est aussi pris en compte. Enfin, l’administration de corticoïdes peut comporter un risque potentiel de fourbure ou de surinfection respiratoire. L’ensemble de ces effets indésirables est connu, anticipé et encadré par des mesures de prévention adaptées. Le protocole a donc été construit de manière à concilier l’intérêt scientifique du projet avec un niveau élevé de vigilance vis-à-vis du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux sont maintenus en vie à l'issue de la procédure, et pourront ainsi retourner à leur milieu de vie d'origine.

Remplacement

L’étude de l’asthme équin sévère nécessite d’observer une maladie respiratoire complexe dans l’organisme entier, avec l’ensemble des interactions entre les voies respiratoires, le système immunitaire et les autres organes. À ce jour, cette réalité biologique ne peut pas être reproduite de manière complète par des modèles alternatifs seuls. C’est pourquoi l’utilisation de chevaux est nécessaire pour répondre de façon pertinente aux objectifs principaux du projet. Toutefois, les prélèvements réalisés ne serviront pas uniquement à l’analyse in vivo. Ils permettront aussi de mener des investigations ex vivo afin d’explorer plus finement le rôle potentiel des exosomes et les réponses cellulaires associées. Cette stratégie permet de tirer le meilleur parti possible des échantillons recueillis et de produire des connaissances qui pourront, à terme, préparer le développement de nouvelles approches diagnostiques ou thérapeutiques.

Réduction

Le projet prévoit l’étude de huit chevaux asthmatiques, sans ajout d’un groupe contrôle distinct. Ce choix permet de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance suffisante pour mettre en évidence des différences significatives sur les paramètres étudiés. Il s’appuie en outre sur des travaux antérieurs, qui ont déjà apporté des éléments concernant la tolérance respiratoire de l’alimentation administrée. Par ailleurs, chaque cheval représentera son propre contrôle lors des différentes étapes du protocole. Cette approche est particulièrement pertinente, car elle réduit la variabilité entre individus et permet d’obtenir des résultats robustes avec un effectif restreint. Elle contribue ainsi à répondre à une double exigence : produire des données scientifiques solides tout en limitant le recours aux animaux.

Raffinement

Afin de « limiter » l’impact d’une éventuelle dégradation clinique des chevaux asthmatiques sévères sur le déroulé du projet, l'ordre des phases d’exposition ne sera pas aléatoire. En effet, chaque cheval recevra initialement les pellets, et ne recevra le foin sec que lors de la phase suivante. Par ailleurs, les différents chevaux recevront systématiquement un traitement par corticoïdes à l’issue du projet. Également, le rassemblement des différents chevaux (appartenant à des particuliers volontaires pour participer à ce projet de recherche) se fera par étapes successives (espacées de 24 à 48h) afin de limiter le stress lors de la mise en lot. Ainsi, les 8 chevaux seront tous ensemble dans la pâture à partir de J-21 (début du maintien dans l'environnement "faible en poussière"). Celle-ci sera de dimension suffisante (10 hectares) et localisée au plus "proche" de leurs lieux respectifs de stationnement habituel. Une personne attitrée prendra soin et manipulera quotidiennement les différents chevaux tout au long de la procédure, afin de pouvoir mettre en place un climat de confiance auprès de chaque cheval. Une sédation est prévue préalablement à la réalisation des prélèvements, ainsi que l'utilisation d'un anesthésique local au préalable dans la trachée et les bronches principales afin de limiter l'inconfort et la réaction de toux lors du passage de l'endoscope. À lissue des prélèvements, les chevaux seront équipés d'un panier de jeûne et temporairement placés dans un paddock individuel, délimité dans la pâture proprement dite, et donc à proximité immédiate des différents congénères. Une surveillance visuelle sera mise en place pendant cette période, et le cheval ultérieurement libéré de son panier et relaché dans le pré une fois dissipés les effets de la sédation.

Choix des espèces

Les travaux menés ont pour espèce cible le cheval, et ses spécificités intrinsèques en termes de gestion alimentaire et environnementale. Critères d’inclusion des animaux dans le projet : chevaux adultes (> 6 ans ; > 400 kg) ; préalablement diagnostiqués comme asthmatiques sévère. Critère d’exclusion des animaux dans le projet : Présenter des signes cliniques (autres que respiratoires), ou toute anomalie aux examens complémentaires (prise de sang, endoscopie et prélèvements des voies respiratoires)

Tuées pour qu'on prélève la moelle de leurs os, 150 souris donneuses fournissent les cellules souches injectées à 450 souris receveuses, elles-mêmes tuées à la fin de la reconstitution pour analyse de leurs organes. Les 600 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les receveuses sont irradiées une fois pendant une vingtaine de minutes, ce qui détruit leurs cellules souches et provoque une immunodéficience transitoire, couverte par deux semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson. Le porteur annonce que les connaissances produites permettront, à terme, de reconstituer le développement de ces cellules immunitaires in vitro et donc de s'affranchir du recours au vivant.

Objectifs

Les cellules lymphoïdes innées (CLI) ont été récemment découvertes et jouent des fonctions très importantes et uniques dans l’immunité et l’homéostasie. Les CLI pourraient également jouer un rôle bénéfique dans la lutte contre les tumeurs solides. La compréhension des mécanismes contrôlant le développement des CLI permettrait de moduler et optimiser ce processus à des fins immuno- thérapeutiques. Dans ce but, nous souhaitons examiner le rôle de facteurs de transcription dans le développement des CLI chez la souris. Pour cela, nous allons modifier génétiquement les facteurs d'intérêt dans les cellules souches hématopoïétiques de souris, et examiner l'effet de ces modifications sur le développement des CLI. Les cellules souches hématopoïétiques seront isolées à partir de « souris donneuses », modifiées génétiquement "in vitro", puis injectées dans des « souris receveuses » dans lesquelles elles se développeront ou non en CLI.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les mécanismes contrôlant le développement des CLI chez la souris in vitro et in vivo, et d’identifier des moyens d’optimiser la génération de populations spécifiques de CLI chez l’Homme in vitro. Les connaissances générées par ce projet permettront, à terme, de récapituler le développement des CLI in vitro, et donc de s’affranchir du modèle in vivo.

Procédures

Les souris donneuses de cellules souches hématopoïétiques (150 souris) recevront une injection (une minute environ). Les souris receveuses de cellules souches hématopoïétiques (450 souris) seront irradiées une fois en début de procédure (20 minutes environ) ou recevront deux injections, en plus de l'injection de cellules souches hématopoïétiques (une minute environ par injection).

Impact sur les animaux

La destruction des cellules souches hématopoïétiques des souris receveuses induit une immunodéficience transitoire. Pour pallier à cet effet, les souris seront traitées avec des antibiotiques à large spectre dans l’eau de boisson. Le traitement commencera le jour précédant l’irradiation, pour accommoder les souris au gout des antibiotiques, et se poursuivra pendant 2 semaines après l’irradiation, le temps que les cellules immunitaires innées soient reconstituées.

Devenir

Les souris donneuses seront mises à mort afin d'isoler leurs cellules souches hématopoïétiques présentes dans la moëlle osseuse. Les souris receveuses seront mises à mort à la fin de la reconstitution hématopoïétique, afin d'analyser en détail le développement des CLI dans différents organes (ex. moëlle osseuse, thymus, poumon, intestin, foie,...).

Remplacement

Les facteurs de transcription dont nous souhaitons examiner le rôle dans le développement des CLI ont déjà été impliqués dans ce processus, ou sont prédits comme jouant des fonctions importantes par des modélisations bioinformatiques du développement des CLI. Leur rôle sera tout d’abord examiné in vitro, puis confirmé in vivo. Le passage in vivo est nécessaire pour récapituler tous les stades de développement des CLI et identifier précisément les stades nécessitant les facteurs de transcription d’intérêt.

Réduction

Le modèle de chimères hématopoïétiques pour étudier le développement des CLI donne des résultats très robustes. Le nombre de souris nécessaires pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs est donc faible (n=5 par groupe).

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages enrichies. Tous les actes douloureux seront effectués sous anesthésie générale. Après chaque acte, les souris seront réintégrées dans leurs cages et groupes d'origine pour éviter le stress. Les souris déficientes pour le développement de CLI ne développent pas de pathologies. Les chimères hématopoïétiques de cette étude ne devraient donc pas développer de pathologies. Les souris seront donc suivies quotidiennement, et en cas d’apparition du moindre signe clinique, les souris concernées seront sorties du protocole et mises à mort.

Choix des espèces

Les processus développementaux sont très conservés entre l’homme et la souris, donc la souris est un bon modèle d’étude pour comprendre le développement de cellules humaines. De plus de nombreux outils permettant l’analyse du développement des CLI ont été générés chez la souris et seront utilisés dans cette étude (anticorps, souches génétiquement modifiées). Les souris seront utilisées à l’âge jeune adulte (6-12 semaines) pour une meilleure récupération des souris après la procédure.

Les souris utilisées portent la mutation du syndrome de Wolfram et développent, dès 21 jours de vie, une surdité et un syndrome vestibulaire, auxquels s'ajoute un diabète. 1 440 souris sont engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever plusieurs structures cérébrales. Elles subissent des injections quotidiennes pendant deux mois et demi, six contrôles alimentaires de quinze heures, six piqûres caudales sur neuf mois, et le porteur signale une irritation possible aux sites d'injection sur l'abdomen. Des tests comportementaux servent à évaluer les capacités motrices du premier mois à l'âge adulte, sans que le document précise lesquels.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie génétique rare mais qui ne dispose aujourd'hui d'aucune thérapie. L'identification de la protéine responsable de la pathologie et la compréhension récente de son rôle dans la cellule et son implication dans les processus neurodégénératifs, fondamentaux dans des pathologies comme Alzheimer, Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique ou la maladie de Huntington, permet aujourd'hui d'envisager des approches thérapeutiques. Il est important de caractériser les effets thérapeutiques de composés neuroprotecteurs chez les souris pour définir les paramètres d'efficacité des candidats médicaments testés par la suite chez l'Homme. Le modèle d'étude est la souris qui possède la même mutation que l'Homme. Cette souris développe plusieurs déficits d'équilibre et d'audition. Les objectifs de ce projet sont de déterminer l'ampleur des déficits observables et d'évaluer les effets bénéfiques des composés médicaments testés.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'apporter une preuve d'efficacité des composés testés. Le bénéfice à terme est d'amener en clinique des composés à visée thérapeutique pour des pathologies rares/orphelines (Sclérose latérale amyotrophique, Hungtington...) pour lesquelles il n'existe actuellement aucun traitement.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : Les animaux seront soumis à 1 contrôle alimentaire (durée 15h), des injections journalières pendant 2 mois et demi et des prélèvements de quelques gouttes de sang mensuellement pour suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murin. Au total, en plus des injections journalières, les animaux seront soumis à 6 contrôles alimentaires, 6 injections et 6 piqures caudales sur une période de 9 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". Le contrôle alimentaire sur un durée de 15h peut également engendrer un stress. Une irritation peut survenir aux sites d'injections sur l'abdomen de l'animal. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels ( surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle mammifère est le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques du syndrome de Wolfram, type déficit vestibulaire, dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. Aucune alternative à ce jour ne peut se substituer totalement à ce modèle. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant. Toutes les molécules testées ont été préalablement testées sur des modèles in vitro de culture cellulaire et sur des tests comportementaux sur la larve de poisson zèbre dont l'âge est inférieur à 5 jours.

Réduction

Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe. Ce nombre de 12 souris par groupe fait également références aux études antérieures réalisées au laboratoire. Une veille bibliographique sera également prise en compte durant la durée du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de collecter un maximum d’échantillons.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en carton pour éviter que les animaux ne se blessent et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Si les animaux présentent un augmentation de leur production d'urine (dû à l'installation d'un diabète) les fonds de cages seront changés plus régulièrement. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Une crème analgésique sera appliquée sur la queue avant les prélèvements de sang. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu .

Choix des espèces

Ces expérimentations seront réalisées sur un modèle murin de type syndrome de Wolfram qui mime tous les symptômes que l'on retrouve chez l'Homme atteint par cette pathologie, à savoir un diabète, et une dégénérescence des cellules ciliées de l'oreille menant à des troubles vestibulaires. Les capacités motrices des animaux seront testées dès le 1er mois jusqu'à l'âge adulte.

Des cellules cancéreuses mammaires sont greffées dans le coussin graisseux de 500 souris, la tumeur primaire est mesurée au pied à coulisse jusqu'à 500 mm3, puis retirée chirurgicalement pour laisser les métastases se développer. Les souris, immunocompétentes, immunodéficientes ou porteuses d'un système immunitaire humanisé, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et de sang. Le porteur attend des pertes de poids, des prostrations, des vocalisations, des tremblements ou des convulsions liées aux métastases cérébrales, et prévoit jusqu'à dix prélèvements de sang par jour par une incision de la veine de la queue. L'étendue réelle de ces gestes n'est pas arrêtée par le protocole, le document indiquant qu'elle dépendra des demandes des clients.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer chez la souris de nouveaux traitements pour les métastases des cancers du sein dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits. La dissémination métastatique constitue la principale cause de mortalité liée au cancer du sein, impliquant un enchaînement complexe d’événements biologiques incluant l’invasion locale, l’intravasation (entrée dans la circulation sanguine), la survie circulante, l’extravasation (sortie de la circulation sanguine) et la colonisation d’organes distants. Dans ce contexte, le développement de modèles précliniques pertinents est essentiel pour comprendre les mécanismes de la progression métastatique et pour évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Parmi ces modèles, les modèles murins orthotopiques avec exérèse de la tumeur primaire représentent aujourd’hui une approche particulièrement pertinente pour se rapprocher de la situation clinique observée chez les patientes. Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses du sein, soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans le coussin graisseux mammaire des souris. En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Une fois la tumeur primaire bien développée, elle sera retirée chirurgicalement pour permettre le développement de métastase. Les études consistent à administrer des traitements à potentiel thérapeutique à ces souris porteuses de métastases de cancer du sein, puis à mesurer les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines ou tissulaires du composé d’intérêt et/ou la croissance métastatique. Les mesures de concentrations permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et la pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité préclinique, de toxicologie réglementaire et enfin pour prédire les doses en développement clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Historiquement, de nombreuses études précliniques ont utilisé des modèles expérimentaux basés sur l’injection intraveineuse ou intracardiaque de cellules tumorales, permettant de générer rapidement des métastases. Toutefois, ces modèles court-circuitent des étapes clés de la cascade métastatique, notamment l’échappement à partir du site primaire et les interactions précoces avec le microenvironnement tumoral. De plus, dans les modèles spontanés sans intervention chirurgicale, la croissance de la tumeur primaire conduit souvent à l’euthanasie précoce des animaux, empêchant l’étude des phases tardives de la maladie métastatique. Ainsi, ces limitations compromettent la capacité de modéliser fidèlement la progression clinique du cancer du sein, en particulier dans le contexte du traitement adjuvant, qui intervient après exérèse de la tumeur primaire chez les patientes. Les modèles murins combinant implantation orthotopique de cellules tumorales mammaires et exérèse chirurgicale de la tumeur primaire permettent de surmonter ces limites. Dans ces systèmes, les cellules tumorales se développent initialement dans un environnement anatomique et stromal approprié, puis disséminent spontanément vers des sites distants, tels que les poumons, le foie, les ganglions lymphatiques ou les os, reproduisant fidèlement les schémas métastatiques humains. En conclusion, les modèles murins de cancer du sein intégrant une exérèse de la tumeur primaire constituent une avancée majeure pour la recherche translationnelle. En reproduisant de manière plus fidèle la progression clinique de la maladie et les conditions thérapeutiques auxquelles sont exposées les patientes, ils permettent une meilleure compréhension des mécanismes métastatiques et une évaluation plus pertinente des stratégies thérapeutiques. Ces modèles apparaissent ainsi comme des outils essentiels pour combler le fossé entre recherche préclinique et application clinique dans le traitement du cancer du sein métastatique.

Procédures

1) Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales à l’aide d’une aiguille réalisées dans le coussin graisseux mammaire sous anesthésie gazeuse : durée 30 secondes 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs primaires avec un pied à coulisse, max 2 fois par semaine pendant 6 semaines max (jusqu’à ce que la taille de la tumeur permettent sa résection entre 150 et 500 mm3) • Résection chirurgicale des tumeurs primaires, max 1 fois, durée 10 min sous anesthésie gazeuse. • Mesure des tumeurs avec l’appareil de bioluminescence : durée 15 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 2 fois par semaine pendant max 8 semaines. • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence par voie intrapéritonéale : durée 30 secondes sur animaux vigiles (maximum 2 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines, max 8 semaines). • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max2xjour), , sous-cutanée (max1xjour), intramusculaire (max1xjour) ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à 4 semaines de traitement. OU o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 1 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). 2) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 1xjour) o via la veine faciale : durée 30 secondes (max 1xjour) o via une incision de la veine latérale de la queue (1 seule incision d’environ 2 mm réalisée pour la totalité des prélèvements) durée 1 min (max 10xjour).

Impact sur les animaux

Ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux étant opérés et ayant des métastases, il est possible que les animaux présentent des signes d’origine neurologique comme des tremblements et/ou des convulsions (métastases cérébrales) ou pulmonaires (métastases pulmonaires). Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Tous ces effets seront dans la majorité des cas liés au modèle. La perte de poids peut, quant à elle, être due au produit testé ou au modèle. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement). Des animaux à phénotype potentiellement dommageable (immunodéprimés) sont utilisés ; pour la bonne santé des animaux, l'absence d'expression de ce phénotype est contrôlée grâce à des conditions d'hébergement adaptées garantissant l'absence de contact avec des germes pathogènes ou opportunistes pouvant altérer leur santé.

Devenir

Les animaux sont mis en mort en fin de procédure pour prélèvements d’organes/de sang.

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, selon la littérature, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral et encore moins dans un contexte métastatique. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre 1) d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes 2) d’obtenir un modèle pertinent de processus métastatique comparable à ce qui se passe chez l’humain.

Réduction

La prise et la croissance métastatiques seront suivies au cours du temps par imagerie de bioluminescence. L’utilisation de cette technique non-invasive permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme) et de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et de détermination de la taille des groupes expérimentaux. Nous évaluons à 500 le nombre de souris maximal utilisé pour ce projet.

Raffinement

Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés dans des cages de 5 animaux contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. Pour les anesthésies longues (instillation des cellules tumorales ou traitement des animaux) les animaux seront placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température corporelle pour éviter toute hypothermie. A noter qu’afin de protéger la sécheresse oculaire durant la phase d’anesthésie, du gel ophtalmique est déposé sur les yeux de l’animal à l’aide d’un coton-tige. Pour éviter l’apparition de potentielle douleur lors de la résection de la tumeur primaire, une injection en sous-cutanée d’analgésique sera réalisée 30 minutes avant l’instillation des cellules. Cette injection sera répétée en cas d’apparition de signe de douleur. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées. En fonction de l’état des animaux la surveillance sera renforcée et si les points limites anticipés sont atteints, l’animal sera immédiatement euthanasié. Pour les souches à phénotype potentiellement dommageable (immunodéprimés), les animaux sont hébergés en conditions adaptées pour garantir leur bonne santé par absence de contact avec des germes pathogènes ou opportunistes.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles de cancer du sein/métastases du cancer du sein chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.. La souris est un modèle d’étude de choix car : 1) sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2) la disponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes

Un médicament oral à usage double, pour la population générale et pour les militaires en opération en cas de dissémination radioactive, est testé sur 710 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour mesurer les radionucléides fixés dans leurs organes. Chaque souris reçoit deux administrations orales sous contention, puis passe 48 heures seule en cage métabolique pour la collecte des urines et des fèces. Le porteur écrit qu'aucun prélèvement invasif n'est prévu et juge peu probable d'atteindre le point limite de 20 % de perte de poids sur des études de huit jours au maximum, tout en annonçant une vigilance sur le risque de fausse route lors des gavages. L'effectif de 710 est présenté comme le résultat d'une étude statistique dont le document ne donne ni les hypothèses ni la puissance visée.

Objectifs

Lors d’un accident nucléaire ou d’une attaque terroriste avec un dispositif de dispersion radiologique, des matières radioactives peuvent être libérées sous forme de poussière ou de fragments. Outre les traumatismes corporels et l’irradiation externe, la contamination interne par inhalation ou par blessure représente un risque majeur. De nombreuses victimes pourraient aussi être touchées en cas de contamination intentionnelle de la nourriture ou de l’eau potable. Bien que le mode d’action des attaques terroristes ne soit pas prévisible, les radionucléides (RN) les plus couramment utilisés dans l’industrie, en médecine ou bien en recherche doivent être particulièrement considérés en raison de leur relative disponibilité. En l’occurrence, les radionucléides pouvant potentiellement faire l’objet d’un détournement pour la conception d’une bombe sale ont été identifiés parmi les isotopes de l’américium (Am), du cobalt (Co), du césium (Cs), du plutonium (Pu), du strontium (Sr), du thorium (Th), du neptunium (Np) ou encore de l’uranium (U-235). En cas de contamination interne par ces RN, des toxicités chimique et radiologique potentielles peuvent être rencontrées au niveau des organes de rétention majeurs (le foie pour le cobalt, le rein pour l’uranium ou le squelette pour le strontium) entrainant divers troubles. Les stratégies de décorporation, principalement élaborées durant la guerre froide, ont peu évolué malgré l’augmentation des risques liés aux tensions géopolitiques et au développement de l’énergie nucléaire. Malheureusement, les solutions actuelles sont limitées par leur mode d’administration, par leur action spécifique sur une gamme de RN restreinte et parfois par leur manque d’efficacité. Ce projet vise à développer un médicament oral pour le traitement de patients en cas de dissémination radioactive par un large panel de RN en se focalisant principalement sur la contamination par ingestion. L’ambition de ce projet est d’envisager une application duale de ce médicament à la fois pour la population générale et pour le militaire en opération.

Bénéfices attendus

Actuellement, il manque des médicaments capables de protéger efficacement contre la contamination interne d’éléments radioactifs. Le composé testé a pour objectif de combler ce manque. Il est conçu pour avoir une double utilisation : d’une part pour la population générale en cas d’accident ou de crise nucléaire, et d’autre part, pour les militaires en opération, exposés à des risques radiologiques. Facile à prendre sous forme de comprimé, il pourra être distribué rapidement et à grande échelle en cas d’urgence. Il viendra compléter les autres mesures de protection déjà existantes, comme le confinement, l’évacuation ou les restrictions alimentaires. Grâce à son action préventive, ce composé renforcera aussi les moyens de protection des militaires sur le terrain. Il offrira une protection large contre différents types de substances radioactives, tout en limitant les effets nocifs des radiations sur le corps.

Procédures

Aucun prélèvement invasif ou procédure chirurgicale sur les animaux n'est prévu(e) au cours des études. En revanche, les animaux auront une administration orale avec contention à deux reprises ce qui peut être source de stress. Par ailleurs, la collecte des excreta (urine et fèces), sans intervention sur l’animal, mais nécessitant un hébergement individuel en cage métabolique, est planifiée afin de pouvoir évaluer l’efficacité du nouveau traitement pharmacologique.

Impact sur les animaux

La période d’acclimatation et les études d’efficacité du traitement étant de courte durée (maximum 8 jours), il paraît peu probable d’atteindre des points limites tels que la perte de poids de 20%. Toutefois, en cas de signes cliniques ou comportementaux anormaux, l’euthanasie anticipée sera réalisée par une personne compétente. L’ensemble du personnel sera très vigilant au risque de fausse route lors des gavages et au bien-être des animaux au cours du passage durant 48h en cage à métabolisme.

Devenir

La fin des procédures consistera à collecter les différents organes de rétention d’intérêt pour mesurer la quantité de radionucléides et ainsi, pouvoir apprécier l’efficacité du nouveau traitement pharmacologique par rapport au traitement de référence. Il sera donc nécessaire d’euthanasier tous les animaux.

Remplacement

Le principal objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité d’un nouveau traitement pharmacologique en cas de contamination interne par différents radionucléides. Pour y parvenir, il est indispensable de pouvoir mesurer la rétention des éléments radioactifs dans les organes d’intérêt majeurs (tels que les os et le foie) et leur excrétion dans les urines et les fèces. S’appuyer sur le modèle animal apparait donc essentiel.

Réduction

Des études d’affinité chimique du composé avec les radionucléides seront préalablement réalisées dans des tubes à essais. Seuls les radionucléides pour lesquels le composé présente une efficacité d’extraction supérieure à 20% seront sélectionnés pour les études chez l’animal. Ces études in vitro permettront in fine de définir les conditions expérimentales dans lesquelles les études in vivo seront réalisées (notamment les RN retenus) et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de la procédure. Par ailleurs, l’exposition des animaux se fera sous forme de mélange de RN selon notamment les techniques analytiques employées pour les mesurer, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Enfin, une étude statistique a été menée. Le nombre total d’animaux pour obtenir une puissance statistique suffisante est de 710. Cet effectif nous permettra d’obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Afin de garantir leur bien-être, les animaux auront à leur disposition le nécessaire en enrichissement pour satisfaire leurs besoins physiologiques et comportementaux. Une observation quotidienne des signes comportementaux (prise alimentaire, etc.) et cliniques (absence de blessure, peur, souffrance) sera également faite.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris comme modèle animal, couramment employé pour des études de pharmacologie en raison de sa pertinence physiologique et expérimentale. De plus, des études de toxicité du traitement ont déjà été menées chez cette espèce permettant ainsi de s’appuyer sur des données existantes. Dans le cadre d’une première étude d’efficacité d’un traitement pharmacologique, le stade adulte (animaux âgés de 8 à 10 semaines au moment de l’étude) sera utilisé.

2 672 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs dépôts de tissu adipeux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un même groupe de 360 souris subit 35 gavages, 3 injections, 3 périodes de jeûne de quatre à six heures et 27 prélèvements d'une goutte de sang, la moitié étant hébergée seize semaines à une température dérogatoire. D'autres reçoivent un régime riche en graisses pendant vingt semaines, et le porteur signale une prise de poids, un stress lié à l'hébergement individuel et au froid, et des hypoglycémies possibles lors des tests de tolérance à l'insuline. Sur le remplacement, il indique passer par des lignées cellulaires d'adipocytes bruns et beiges plutôt que par des cellules primaires pour la partie in vitro, tout en affirmant qu'il est "indispensable" de recourir au vivant pour saisir les interactions entre types cellulaires.

Objectifs

Chez les mammifères, il existe deux grands types de cellules graisseuses. Les cellules graisseuses blanches servent principalement de réserve d’énergie : elles stockent l’excès de calories sous forme de graisses et les libèrent lorsque l’organisme en a besoin. À l’inverse, les cellules graisseuses brunes et beiges ont une fonction différente : elles brûlent de l’énergie pour produire de la chaleur. Ce mécanisme, appelé thermogenèse, est particulièrement activé en cas d’exposition au froid, mais peut aussi se déclencher lorsque l’apport alimentaire est élevé. Ces cellules jouent donc un rôle important dans la régulation de la température du corps et dans l’équilibre énergétique. En situation d’obésité, le nombre et le fonctionnement de ces cellules capables de brûler des calories sont diminués. Cependant, les mécanismes responsables de cette altération restent mal compris. Il a été montré qu’une molécule issue du métabolisme des lipides peut freiner la formation de ces cellules « brûleuses » de graisses. Des données suggèrent également qu’un type particulier de cellules immunitaires présentes dans le tissu adipeux constitue une source importante de cette molécule. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre le rôle de cette molécule produite par ces cellules immunitaires dans le développement de l’obésité et de ses complications (comme le diabète), ainsi que dans la capacité de l’organisme à produire de la chaleur en réponse au froid. Nous étudierons également si bloquer la production de cette molécule pourrait représenter une nouvelle piste thérapeutique pour lutter contre l’obésité et ses conséquences métaboliques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui favorisent l’obésité et ses complications, en particulier le rôle des cellules immunitaires dans le tissu adipeux. À terme, ces travaux pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à stimuler la dépense énergétique et à prévenir ou traiter l’obésité et les maladies métaboliques associées.

Procédures

Les interventions réalisées sur animaux vigiles seront les suivantes : 1) 360 animaux : 35 gavages (30 secondes) + 3 injections (30 secondes) + 3 périodes de jeûne (4 ou 6 heures) + 27 prélèvements d’une goutte de sang (30 secondes) + prélèvement sanguin terminal (1 minute), dont la moitié sera hébergée à une température dérogatoire pendant 16 semaines ; 2) 360 animaux : régime riche en graisses pendant 16 semaines + 35 gavages (30 secondes) + 3 injections (30 secondes) + 3 périodes de jeûne (4 ou 6 heures) + 27 prélèvements d’une goutte de sang (30 secondes) + prélèvement sanguin terminal (1 minute), dont la moitié sera hébergée à une température dérogatoire pendant 16 semaines ; 3) 512 animaux : régime riche en graisses pendant 20 semaines + 13 gavages (30 secondes) + 2 injections (30 secondes) + 3 périodes de jeûne (4 ou 6 heures) + 18 prélèvements d’une goutte de sang (30 secondes) + prélèvement sanguin terminal (1 minute), dont la moitié sera hébergée à une température dérogatoire pendant 20 semaines ; 4) 360 animaux : 3 gavages (30 secondes) + prélèvement sanguin terminal (1 minute), dont la moitié sera hébergée individuellement à une température dérogatoire pendant 6 heures ; 5) 360 animaux : 6 gavages (30 secondes) + prélèvement sanguin terminal (1 minute), dont la moitié sera hébergée à une température dérogatoire pendant 10 jours ; 6) 720 animaux : régime riche en graisses et hébergement à une température dérogatoire pendant 20 semaines + 19 injections (30 secondes) + 1 période de jeûne (6 heures) + prélèvement sanguin terminal (1 minute).

Impact sur les animaux

Le régime riche en graisses entraîne une prise de poids. La contention pour les gavages induit un stress transitoire. Les injections et prélèvements sanguins provoquent une douleur légère. Lors du test de tolérance à l’insuline, l’injection d’insuline peut provoquer une hypoglycémie. L’hébergement individuel et l'exposition au froid induisent un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les différents dépôts de tissus adipeux dans le but de les analyser pour répondre aux objectifs scientifiques définis.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro seront réalisées sur des lignées cellulaires d’adipocytes bruns/beiges au lieu de cellules primaires isolées à partir des animaux. Cependant, pour comprendre les fonctions d'une molécule produite par les macrophages du tissu adipeux, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux et entre les différents organes.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous organiserons les croisements de manière à éviter de faire naître des animaux dont nous n’avons pas besoin. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.

Raffinement

Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Nous surveillerons l’aspect des sites d’injection et de prélèvement. Dans le cas d’injections répétées, nous utiliserons des aiguilles très fines et nous effectuerons une rotation des sites d’injection. En cas d’hypoglycémie lors des tests de tolérance à l’insuline, une injection de glucose sera réalisée. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins une fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les macrophages du tissu adipeux et nous disposons déjà du modèle génétique murin permettant de les cibler. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. L’ensemble des procédures se fera sur des souris jeunes adultes (à partir de 7 semaines d’âge), de façon à étudier des organismes physiologiquement stables, qui ne sont ni en phase de croissance ni en processus de vieillissement.