Procédures modérées

L'évaluation d'un dispositif médical implantable avant sa mise sur le marché relève d'une obligation réglementaire, et c'est elle qui commande ce projet. 150 porcs, 100 moutons et 80 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour nécropsie et examen histologique. Ils sont mis à jeun six à seize heures selon l'espèce, cathétérisés, puis opérés sous anesthésie générale au cours d'interventions pouvant durer plusieurs heures, avec une douleur postopératoire annoncée sur plusieurs jours. Le porteur indique que les moutons sont utilisés pour éprouver la durabilité des matériaux et que les chiens interviennent quand leur anatomie est la plus proche de celle de l'homme, ce volet 1/2 doublant un projet 2/2 aux effectifs identiques.

Objectifs

Les dispositifs implantables chirurgicalement sont des dispositifs médicaux conçus pour être insérés en totalité ou partiellement dans le corps humain, ou à remplacer une surface épithéliale, grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer après l'intervention de façon temporaire ou définitive, pour soutenir les fonctions d'organes ou de tissus spécifiques, surveiller les activités physiologiques ou administrer des médicaments. La chirurgie uro-néphrologique s’est développée rapidement dans la deuxième moitié du XXème siècle avec par exemple l’avènement de la transplantation rénale (années 60-70), ou encore de l’hémodialyse (années 50-60) permettant de sauver des millions de personnes par an, le développement de nouvelles technologies comme les circuits extracorporels avec filtre de dialyse permettant la déviation du sang vers un filtre externe et ainsi sa purification artificielle. Il est possible dès lors de pallier des dysfonctions importantes du rein par exemple. De même, le traitement des affections prostatiques, tumorales par exemple a fait des progrès immense grâce par exemple à l’avènement de techniques chirurgicales peu invasives assistées ou non de la vidéo endoscopie et/ou de la robotique. Les progrès diagnostiques et thérapeutiques se développent rapidement pour l’ensemble des organes de l’appareil urinaire et ses annexes. L’évaluation et le développement de nouveaux dispositifs, méthodes, techniques, molécules et tissus pour le diagnostic et le traitement des affections de l'appareil urinaire et ses annexes par des techniques de chirurgie standard ou mini-invasives, demandent une phase de recherche/développement préalable. Les différentes itérations de prototypes doivent être confrontées au modèle animal en reproduisant fidèlement le contexte clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire visé pour les futures applications humaines. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour les valider selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58). Ce projet de recherche se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (EU 1/2 et 2/2).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour améliorer leur tolérance et éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients avec des durées d'hospitalisation et de convalescence réduites.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. La période d'acclimatation d'une durée de 7 jours se fera dans l'EU 2/2. Les actes chirurgicaux d'implantation de dispositif et/ou d'évaluation de technique chirurgicale avec ou sans réveil pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. Le suivi clinique et fonctionnel des animaux après les procédures chirurgicales ainsi que les administrations de soins pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2. Pour les études chroniques, les évaluations finales avec euthanasie pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim, lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins, 6 à 12 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive, - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale avec prise en charge multimodale de l'analgésie per, et post-opératoire avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés avec ajout d'anesthésiques locaux pour certains actes chirurgicaux, la protection et la surveillance des plaies, la surveillance du reveil d'anesthésie dans des espaces calmes et spécialement aménagés avec évaluation et scoring de la douleur réguliers, ou la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens spécialement formés supervisés par des Véterinaires).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur l'animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Cette estimation répond à différents paramètres et en premier lieu aux besoins de la démarche expérimentale spécifique de mise au point et de raffinement des prototypes de dispositifs, puis de validation et d’évaluation des versions des dispositifs jugées efficaces et sécuritaires, mais aussi de l’expérience du laboratoire sur d’autres projets avec ce même type d’approche, elle répond enfin à un besoin de développement et d’évaluation de l’efficacité, de l’innocuité et de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs en robotique chirurgicale. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Dans ce projet les canins seront utilisés plus rarement que les porcins, lorsqu’ils sont le seul modèle à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle la plus proche de l’Homme (comme par exemple une prostate bilobée, ou un pénis formé comme chez l'homme...). Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateaux techniques opératoires et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge multimodale de la douleur sont systématiquement appliqués. Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées ayant reçu une autorisation AT1 délivrée par la DDPP, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antidérapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est validé par un Vétérinaire. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs doivent être testés sur une anatomie semblable à celle de l’Homme (de l’enfant à l’adulte de grande taille), cela impose l’expérimentation sur des gros animaux. Les différences interspécifiques tissulaires, anatomiques et fonctionnelles nécessitent différentes espèces pour optimiser l’expérimentation. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements de chirurgie interventionnelle et d'imagerie standards utilisés chez l'Homme. Les ovins sont un modèle pertinent pour évaluer la durabilité des matériaux des dispositifs testés dans les phases de développement dans ce projet. Les porcins sont avec le chien, un modèle pertinent pour l’évaluation des dispositifs intéressant des structures anatomiques de taille similaire à l’homme comme le rein, les uretères, la vessie, l’urètre. Les canins ne seront utilisés que rarement, lorsqu’ils sont le seul modèle à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle la plus proche de l’homme. Par exemple les canins sont le seul modèle à présenter une prostate bilobée, ou un pénis formé comme chez l’homme. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

Pour mesurer l'effet de deux médiateurs lipidiques sur le vieillissement des vaisseaux, 320 souris âgées de deux à vingt-quatre mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à trois injections intrapéritonéales par semaine pendant un à trois mois, avec un prélèvement de sang hebdomadaire sur animal vigile, la dernière prise de sang étant terminale. Le porteur écrit que "le bien-être animal est au cœur de cette étude" et que les contraintes subies restent faibles, tout en reconnaissant le stress lié à la fréquence des manipulations et la douleur au point d'injection. Aucun analgésique ne peut leur être administré, les antidouleurs modulant l'expression des lipides étudiés, et les souris atteignant un point limite sont tuées.

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons explorer le rôle de 2 médiateurs lipidiques sur le vieillissement vasculaire. Le vieillissement de la population est un enjeu majeur du XXIe siècle. Il s’accompagne d’une augmentation de la fréquence de maladies telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires. Ces dernières sont la principale cause de mortalité dans le monde, majoritairement causé par un dysfonctionnement du système vasculaire (vaisseau sanguin et lymphatique) et du système de coagulation. Cette étude sera menée selon plusieurs axes : Axe 1. Evaluation de l’implication du lipide 1 dans le vieillissement vasculaire Axe 2. Evaluation de l’implication du lipide 2 dans le vieillissement vasculaire

Bénéfices attendus

Le choix des lipides à tester (2) ainsi que leur concentration ont été déterminées grâce à nos études in vitro et ex vivo chez l’humain. Brièvement, les lipides circulants dans le sang des humains ont été mesurés et quantifiés en spectrométrie de masse, puis étudiés sur cellules tapissant les vaisseaux sanguins (les cellules endothéliales) in vitro. Cependant, l’effet in vitro est certes significatif, mais ne représente pas la complexité d’un modèle vivant entier. C’est pourquoi l’axe 1 et 2 de cette demande éthique permettra d’évaluer dans un modèle murin, l’impact de ces lipides sur le vieillissement en général, mais aussi vasculaire et à l’échelle multi-cellulaire.

Procédures

Les prélèvements sur animaux vigiles auront lieu 1 fois par semaine sur 1 à 3 mois selon les groupes

Impact sur les animaux

Nous sommes conscients que la répétition de contentions restreignantes, d'injections IP, et de prises de sang peuvent entrainer des effets indésirables. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent. Les animaux risquent d'être stressé par le nombre fréquent de manipulation pour les injections en IP (1 à 3 fois par semaine, de 1 à 3 mois). Ils risquent de ressentir une douleur au niveau de l'injection en IP. La prise de sang est terminale sous anesthésie

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L’usage de médiateurs lipidiques nécessite l’évaluation de l’efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant mise en place chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisant. Nous avons au préalable évaluer in vitro le vieillissement sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs. Afin de réduire le protocole, deux études pilotes dans l’Axe 1 et 2 utiliseront chacune 80 souris afin d’optimiser la durée du traitement avec les lipides et le nombre d’injection. Dans l’étude principale #2 et 4, un groupe contrôle ainsi que 3 groupes de souris permettront par la suite de répondre à l’hypothèse de travail, le détail des groupes est abordé. Considérant une variance hypothétique maximale de 16%, le nombre minimal d’animaux nécessaire a l’observation d’une difference significative pour une mesure unique, si elle existe, est de 10 par groupe experimentale (a

Raffinement

Le bien-être animal est au cœur de cette étude. Nous veillerions à ce que l’hébergement des animaux leur permettent d’avoir un enrichissement (avec paille, bois, coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les contraintes subites par les animaux sont faibles. Il s’agit d’une étude de vieillissement avec une manipulation réduite des animaux (prise de sang en veine saphène ou caudale et/ ou injection de médiateurs lipidiques en intrapéritonéale). Les souris seront observées quotidiennement et lorsqu’une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Dans notre étude nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique puisque nous étudions les médiateurs lipidiques dont l’expression est modulée par ces produits.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique du vieillissement. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations de la coagulation par exemple. Les souris utilisées seront de 2 à 24 mois. Pour notre étude, nous avons besoin de souris jeunes (2 mois) et souris vieillissante de 6 à 24mois. Elles ont toutes un stade de développement complet.

Des cellules tumorales sont injectées dans la muqueuse intestinale par voie rectale sous endoscopie, geste répété chaque semaine pour suivre la croissance de la tumeur. 2 752 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever rate, ganglions, intestins et tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des traitements anticancéreux par voie orale, rectale, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse ou par gavage, avec des prélèvements de sang à la veine faciale jusqu'à une fois par semaine. Le porteur affirme que l'effectif est calculé "au plus juste" à partir d'expériences antérieures en greffe sous-cutanée, sans donner un seul chiffre à l'appui de ces 2 752 animaux.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans la continuité de projets déjà existants et ayant donné des résultats très prometteurs. Il consiste à mettre au point des modèles de greffe de cellules tumorales dans la muqueuse intestinale afin de se rapprocher au plus près de ce qui se passe chez l’homme dans le cas de personnes atteintes de cancer digestif. En effet des expériences préliminaires ont été réalisées en greffant des cellules tumorales sous-cutanées afin de développer et de tester de nouvelles approches de thérapies de vaccination anti-cancer. Afin de continuer et d’optimiser ces thérapies, il est intéressant et judicieux d’améliorer les modèles d’études. La localisation des cellules tumorales est un paramètre important à prendre en compte dans nos études. En effet, celle-ci peut modifier la réponse aux thérapies due à un différentiel de biodistribution du médicament selon les organes, le microenvironnement, une réponse immunitaire différente selon les organes. C’est pour cela qu’il est important de développer des modèles murins de greffe de cellules tumorales au niveau de l'instestin. De plus dans le cancer colo-rectal les immunothérapies sont peu efficaces, cette étude a pour objectif de tester un traitement local in-situ afin d’augmenter les efficacités de traitements. La stratégie de vaccination des lésions in-situ permettrait d’empêcher les lésions pré-cancéreuses de se développer.

Bénéfices attendus

Malgré les progrès importants dans la prise en charge des patients atteints de cancer digestifs, un certain nombre ne répondent pas aux différente de traitement ou récidivent. Il est donc essentiel de développer de nouvelles thérapies ou d’optimiser les traitements existants. Pour cela, nous avons besoin de modèles se rapprochant au plus près de la pathologie humaine. L’utilisation du modèle murin de greffe de cellules tumorales issues de cancer digestifs au niveau de l'intestin permettra de créer un environnement au plus proche de celui des cancers digestifs chez l’Homme et pourra ainsi répondre à des interrogations auxquelles nous ne pouvons pas répondre dans les modèles traditionnels de greffe tumorale en sous-cutané.

Procédures

Les animaux subiront une endoscopie sous anesthésie afin d'injecter des cellules tumorales dans la muqueuse intestinale. Ces animaux subiront ensuite d'autres endoscopies sous anesthésie afin de suivre l'évolution de la tumeur (une par semaine). Pour les animaux ayant reçu une lignée cellulaire dont le suivi peut être réalisé par imagerie une fois par semaine, une injection intra-péritonéale de produit de traçage sera réalisée suivi par une anesthésie gazeuse pour le placement dans l’appareil d’imagerie. Les animaux recevront ensuite différents traitements anti-cancer (un traitement par animal). Ceux-ci seront administrés soit par voie orale, rectale sous endoscopie, intra-musculaire, intra-péritonéale, inra-veineuse ou par gavage. Les animaux, au cours de la procédure pourront subir des prélèvement de sang veineux périphérique au niveau de la veine faciale après anesthésie gazeuse à l’isoflurane au maximum une fois par semaine.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales sera réalisée sous anesthésie gazeuse par endoscopie dans la muqueuse intestinale ce qui peut induire un stress de l’animal. Le développement des tumeurs peut être à l’origine de souffrance et de gênes qui seront évaluées par observations fréquentes des animaux (poids, état général) 3 fois par semaine et estimation de la prise tumorale par imagerie de bioluminescence après injection IP de luciférine lors de l’utilisation de lignées cellulaire possédant la luciférase ou par endoscopie.

Devenir

A l'issu de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes (rate, ganglions, intestins, tumeurs...) et ainsi réaliser des analyses immunologiques complémentaires. Ces analyses sur les organes permettront de mieux comprendre les mécanismes de développement tumoral ainsi que les mécanismes d'actions et les conséquences des traitements.

Remplacement

Un modèle animal, et plus précisément mammifère doté d’un système immunitaire complexe, est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes dans le cancer. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées préalablement à l’aide de modèles de culture cellulaire in vitro, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Les études de délivrance et de biodistribution nécessitent forcément d’avoir recours à l’expérimentation animale. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu. Préalablement à ces expériences in vivo des études in vitro ont été réalisées afin de définir des conditions optimales de croissance tumorale et de conditions d’administration des traitements.

Réduction

Ces expériences in vivo sont réalisées pour soutenir et compléter des résultats qui ont été obtenus in vitro. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste afin de pouvoir montrer des différences significatives ainsi que la reproductibilité et la répétabilité des résultats obtenus. Ces effectifs sont calculés à partir des résultats que l’on a pu obtenir par le passé sur des expériences utilisant des modèles de greffe sous cutanée ainsi que les données de la littérature sur le sujet.

Raffinement

Après une semaine d’acclimatation, les souris seront habituées au geste de la contention et à la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi (abris, matériaux de nidification, contrôle du cycle lumineux, de l’hygrométrie et de la température). Ils bénéficient d’un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et sont manipulés exclusivement par du personnel formé et habilité. Les animaux seront suivis de façon adaptée à l’intensité de la pathologie afin d’évaluer les nuisances causées ainsi que la sévérité de la pathologie. Les procédures expérimentales potentiellement douloureuses seront encadrées par une anesthésie. L’apparition d’une potentielle douleur en lien avec les procédures expérimentales sera appréciée par une échelle d’évaluation de la douleur. Lorsque cela sera possible, des techniques d’imagerie par bioluminescence seront privilégiées pour le suivi de la maladie à la place des endoscopies. Enfin, des points limites seront mis en place, prenant en compte plusieurs paramètres tels que la perte de poids, l’état du pelage, la capacité de locomotion et la présence d’une douleur qui sera évaluée grâce à une grille de score précise. Ces points limites permettront, lorsqu’ils sont atteints, de mettre à mort immédiatement les animaux.

Choix des espèces

La souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’humain, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques. Les modèles utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. La souris présente également l’avantage d’être disponible avec différentes mutations génétiques permettant d’étudier plus profondément certains mécanismes cellulaires. Des souris âgées de 4 à 12 semaines seront utilisées. Ce stade de développement a été retenu car le système immunitaire est pleinement mature permettant d'obtenir une réponse inflammatoire reproductible après implantation de la tumeur. L'utilisation d'animaux adultes limite également les variations physiologiques observées au cours de la croissance ou liées au vieillissement, susceptibles d'influencer les paramètres étudiés. Par ailleurs, la majorité des données publiées concernant le modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales au niveau de l’intestin a été obtenue chez des souris jeunes adultes, ce qui permet de comparer les résultats générés dans ce projet avec ceux de la littérature scientifique et d'assurer la reproductibilité des expériences.

Chaque souris est irradiée sous anesthésie générale, greffée par voie intraveineuse avec des cellules immunitaires modifiées, puis injectée avec des cellules tumorales sous la peau ou dans la veine de la queue, cette dernière injection sans anesthésie. 1 440 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever rate, moelle osseuse et foie. Le porteur reconnaît que les tumeurs diffuses peuvent provoquer une douleur ou un inconfort modéré dans plusieurs organes, et que les tumeurs solides gêneraient les déplacements si les animaux n'étaient pas tués avant. Il présente pourtant cet enchaînement comme "plusieurs manipulations simples, réalisées dans des conditions assurant le confort et la sécurité des animaux".

Objectifs

Les cellules immunitaires sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Elles ont besoin d’énergie pour remplir efficacement leur rôle, et plusieurs mécanismes à l’intérieur de la cellule régulent cette utilisation d’énergie. Ce projet cherche à comprendre comment ces mécanismes influencent l’activité des cellules immunitaires, leur activation, leur déplacement et leur capacité à combattre les tumeurs, qu’elles soient localisées (tumeur solide) ou diffuses dans l’organisme (métastases).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’énergie disponible dans les cellules immunitaires influe sur leur capacité à agir contre les cellules cancéreuses. Le rôle des cellules immunitaires étant primordial, les résultats pourraient aboutir à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques visant à renforcer la réponse immunitaire anti-tumorale. Le projet permettra également d’évaluer l’intérêt potentiel d’un médicament déjà utilisé pour traiter le diabète dans la prise en charge du cancer. Si son efficacité est démontrée, son utilisation en thérapeutique pourrait être facilitée et plus rapide, car ce médicament est déjà autorisé et utilisé chez l’humain.

Procédures

Chaque souris sera soumise à plusieurs manipulations simples, réalisées dans des conditions assurant le confort et la sécurité des animaux. Chaque animal recevra : • Une anesthésie générale suivi d’une irradiation (30 minutes) • Une greffe de cellules immunitaires par injection intraveineuse (durée : 1 min) sous anesthésie volatile (durée : 5 min) • Un prélèvement sanguin sous anesthésie afin d’évaluer la prise de greffe (durée : 5 min) • Une injection de cellules tumorales sous la peau (durée : 30 s), sera effectuée sous anesthésie volatile (durée : 5 min) pour la moitié des animaux ou une injection dans la veine de la queue sans anesthésie (inaccessible avec anesthésie), (durée : 1 min) pour l’autre moitié. • Une injection dans l’abdomen ne nécessitant pas d’anesthésie (30 s) ou en sous-cutanée (30 s) après une anesthésie volatile (durée : 5 min)

Impact sur les animaux

Les procédures peuvent provoquer une douleur légère et temporaire lors des injections. L’irradiation aux rayons X n’induit qu’un faible stress et une faible douleur car les animaux seront anesthésiés profondémment. L'injection des cellules de la moelle osseuse et les prélèvements sanguins ne provoquent pas de douleur ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. Nous n’attendons pas de souffrance suite à la greffe. En effet, la prise de greffe se déroule bien dans >90% des cas, d'autre part, les cellules immunitaires modifiées au cours de ce protocole ne sont pas strictement nécessaires à la survie de l’animal et ne sont pas connues pour induire de pathologie. Le développement des tumeurs, notamment dans le modèle de tumeur diffuse, peut entraîner une douleur ou un inconfort modéré en raison de la présence des tumeurs dans différents organes (rate, moelle osseuse, foie). En revanche, la croissance des tumeurs solides n’affecte pas les mouvements ni ne provoque de gêne locomotrice au cours du protocole, les animaux étant euthanasiés avant l’apparition de ces gênes. Tout animal présentant une réaction anormale ou une souffrance non contrôlable sera immédiatement euthanasié conformément aux critères de fin d’expérience établis.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes post mortem pour des analyses sur les cellules immunitaires modifiées et mises en compétition.

Remplacement

Les cellules du système immunitaire modifiées ont été testées in vitro notamment face à des cellules tumorales. Cependant, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité de la réponse anti-tumorale. De ce fait, la mise en place d’expériences in vivo sur un modèle animal est pertinente. Pour des raisons éthiques et de praticité cela ne peut être effectué directement chez l'homme avant preuve chez l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé au strict minimum nécessaire pour permettre une analyse fiable des résultats. Des calculs statistiques simples montrent qu’il faut au moins cinq animaux par groupe pour pouvoir détecter des différences réelles et solides entre les conditions testées, sans augmenter inutilement le nombre d’animaux. De plus, des expériences préliminaires déjà réalisées nous confortent dans ce choix et confirment que cet effectif est suffisant pour obtenir des données solides. La procédure a été conçue pour obtenir le plus de données possibles à partir d’un seul individu, en réalisant plusieurs analyses sur les mêmes animaux. Enfin, la co- injection dans un même animal permet une comparaison directe de nos conditions expérimentales et limite la variabilité, réduisant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires à la réalisation du projet. Cette organisation permet de réduire la répétition d’expériences indépendantes et donc de limiter l’utilisation d’animaux tout en garantissant la qualité scientifique du projet.

Raffinement

L’équipe possède une expertise solide se traduisant par la mise en place de plusieurs mesures visant à garantir au maximum le bien-être des animaux : • Utilisation d’une armoire chauffante pour assurer une bonne récupération de l’animal suite à l’irradiation • Contrôler précisément le nombre de cellules injectées, afin d’éviter une croissance tumorale trop rapide ou imprévisible. Données déterminées suite à l’expertise de l’équipe (8 ans d’utilisation du modèle tumorale) • Assurer une surveillance régulière, tous les deux jours, en observant notamment la motricité, le comportement, la posture et la réponse aux stimulations • Définir des points limites stricts (perte de motricité, perte de réponse aux stimulations) et précoces : si l’un de ces seuils est approché, la fréquence de surveillance est augmentée pour intervenir au bon moment et éviter toute souffrance inutile. • En cas d’apparition de signes d’irritation ou d’inflammation des lavages au sérum physiologique sera effectué deux fois par jour pendant 48h. Si cela ne s’améliore pas un vétérinaire sera alors contacté.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront âgées de 8-9 semaines le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

Sept macaques, quatre crabiers et trois rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse post-mortem de leur cerveau. Ils subissent une restriction hydrique pendant douze à vingt-quatre mois, une chirurgie de pose d'implant crânien de quatre à six heures, parfois répétée sur l'autre hémisphère en cas d'infection, puis des séances quotidiennes d'enregistrement neuronal d'une à deux heures pendant six à huit mois. Le porteur liste les risques encourus : œdème cérébral, accident vasculaire lors de la descente des électrodes dans le cerveau, infection au site d'implantation. Le projet vise à créer chez le primate non humain un modèle de troubles compulsifs par inactivation de neurones du striatum, démarche que le porteur juge "indispensable" pour extrapoler aux aptitudes humaines.

Objectifs

Nous nous intéressons aux mécanismes neuronaux qui contrôlent l’adaptation du comportement de l'organisme aux contraintes changeantes de l’environnement (flexibilité comportementale). Plus précisément, nous étudions la contribution d'une région du cerveau appelée striatum, située sous le cortex cérébral, qui est censée intervenir dans la flexibilité comportementale. L’innervation cholinergique de cette région est altérée dans des pathologies neuropsychiatriques où prédominent des signes compulsifs (tics, stéréotypies, persévérations). La libération d’acétylcholine dans le striatum est assurée par un groupe spécifique d'interneurones cholinergiques (INChs) dont le dysfonctionnement est associé à un manque de flexibilité comportementale et à la manifestation de compulsions. Ainsi, une diminution de densité en INChs est décrite dans le striatum de patients atteints du syndrome de Gilles de la Tourette et des études chez le rongeur indiquent que l'inactivation des INChs perturbe l'adaptation des animaux à des changements de contexte. Les informations traitées par le striatum sont transmises aux circuits de commande du comportement par les neurones de projection qui influencent les commandes comportementales. L'adaptation comportementale résulterait de la mise en jeu coordonnée de ces neurones, sous contrôle des INChs. Les connaissances acquises chez le rongeur ne permettent pas de déterminer comment les INChs exercent ce contrôle. Notre projet vise à (1) déterminer la connectivité entre des populations distinctes de neurones du striatum; (2) examiner les interactions fonctionnelles entre ces populations; (3) établir si l'inactivation sélective des INChs induit des signes compulsifs assimilables à ceux observés chez l'humain. Pour cela, nous utilisons des approches expérimentales innovantes de marquage de populations neuronales distinctes dans le striatum, d’enregistrements simultanés de ces populations neuronales et d’inactivation des INChs par un procédé de ciblage sélectif de ces interneurones par utilisation d'outils génétiques.

Bénéfices attendus

Les troubles compulsifs sont une cause majeure de handicap dans bon nombre de maladies neuropsychiatriques. A n’en pas douter, les progrès à venir dans la compréhension et le traitement de ces anomalies passeront par une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents. Dans cette perspective, la piste d'une anomalie de la neuromodulation cholinergique au niveau du striatum, une région profonde du cerveau, est actuellement privilégiée. On suppose qu'un défaut du signal cholinergique perturbe les informations transmises par le striatum aux circuits de commande comportementale qui aboutirait à l'expression de conduites inadaptées. Notre projet vise à préciser les bases anatomiques et physiologiques de cette régulation. Un aspect innovant de notre projet est le développement d'une méthode d'inactivation sélective des interneurones du striatum à la source du signal cholinergique à l'aide d'outils génétiques. Cet aspect du projet offre la possibilité de créer un modèle de troubles compulsifs chez le primate non humain permettant d'appréhender précisément la signification fonctionnelle de ce signal. Cette recherche fondamentale ouvre des perspectives prometteuses pour de nouvelles thérapies chez l'humain destinées à compenser un contrôle cholinergique défaillant dans les troubles compulsifs.

Procédures

(1) Contrôle hydrique pendant toute la durée des expériences (12 à 24 mois). (2) Examen IRM d'environ 2 h. (3) chirurgie pour la pose d'un implant crânien sur un hémisphère cérébral, suivi éventuellement d'une seconde implantation sur l'autre hémisphère dans le cas d'un incident (infection et/ou inflammation) obligeant à retirer le premier implant). Ce type de chirurgie dure de 4 à 6 heures. (4) enregistrements de l'activité neuronale chez le singe effectuant une tâche instrumentale au cours de séances quotidiennes de 1 à 2 h pendant 6 à 8 mois (5) injections de vecteurs viraux sous anesthésie générale conformément à un plan d'injection défini sur la base de l'examen IRM et du repérage électrophysiologique. Selon le nombre de sites d'injection (striatum et/ou globus pallidus), les injections durent entre 2 et 3 heures.

Impact sur les animaux

1) la restriction hydrique; (2) la capture des animaux depuis leur site d’hébergement, leur transfert au laboratoire et la contention de la tête sont source de stress dans les premiers temps de ces manipulations; (3) l'anesthésie générale présente des risques d'incident cardiaque ou respiratoire; (4) la chirurgie crânienne présente des risques d'infection au site d'implantation ou d'oedème cérébral; (5) la descente d'électrodes ou de canules d'injection dans le cerveau présente des risques d'infection ou d'accident vasculaire cérébral; (6) le maintien à long terme d'un implant crânien présente des risques liés au développement d'une infection ou de réactions inflammatoires au site d'implantation.

Devenir

Notre projet implique une analyse post-mortem de la connectivité entre différents types de neurones striataux et une évaluation de l'expression d'un transgène (DREADD) dans les INChs. Chaque animal sera mis à mort à l'issue de la procédure expérimentale.

Remplacement

Nos recherches portent sur la contribution de l’innervation cholinergique du striatum dans la flexibilité comportementale. L’approche expérimentale consiste à décrire le schéma des connexions anatomiques au sein du striatum, à corréler des indices de la flexibilité comportementale à l’activité électrophysiologique et à examiner les conséquences d’une inactivation cholinergique sur le comportement. Une telle approche exclut toute alternative basée sur des modèles in vitro (tranches de tissu, cultures de cellules ou cellules dissociées) ou sur l’animal anesthésié. Les neurosciences computationnelles permettent d’élaborer des modèles utiles pour la compréhension des processus sensorimoteurs ou cognitifs. Ces modèles tirent parti des données neurophysiologiques, acquises chez l'animal comme chez l'humain, et fournissent des hypothèses de travail ou des cadres d'interprétation utiles pour guider la recherche, mais en aucun cas ils ne peuvent remplacer l'expérimentation. De plus, un modèle computationnel, aussi sophistiqué soit-il, est une approximation de la complexité neurobiologique susceptible d'être améliorée sur la base des nouvelles données acquises.

Réduction

Nous avons restreint autant que possible le nombre d'animaux impliqués dans le projet tout en restant compatible avec l'exigence d'analyses statistiques fiables. Pour cela, l'analyse électrophysiologique des populations neuronales du striatum sera faite chez les mêmes singes qui seront ensuite utilisés pour les injections de vecteurs viraux. Pour l’électrophysiologie, l'analyse porte sur des échantillons de neurones enregistrés lors de séances quotidiennes, pendant plusieurs mois. L'analyse est d'abord faite pour chaque animal et les données sont ensuite groupées. Ce "pooling" permet d'augmenter la puissance statistique, en particulier si les échantillons de neurones disponibles pour chaque animal sont trop faibles. Nous complétons cette analyse globale par une analyse cas par cas si les performances et les données neuronales divergent trop entre les sujets. Afin de réduire le nombre d’animaux pour étudier la connectivité entre neurones striataux, nous réaliserons les injections de vecteurs viraux dans les 2 hémisphères cérébraux de chaque singe. Comme les projections des neurones de sortie striataux vers le globus pallidus sont strictement ipsilatérales, on ne risque pas d'induire de chevauchement des marquages en intervenant sur chacun des hémisphères.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour favoriser la coopérativité de l'animal dans les expériences de conditionnement, d'enregistrement et d'inactivation pharmacogénétique. Pour diminuer le stress des animaux au début de certaines phases de la procédure expérimentale (capture, contention de la tête), on les habitue progressivement aux contraintes imposées. A l'animalerie, les animaux sont hébergés en duo ou trio, selon les affinités, dans un environnement enrichi qui inclut l'accès à une volière munie d'objets à manipuler, de perchoirs et de cordages. Les interventions sources de douleur (implantation crânienne, injections intracérébrales, perfusion intracardiaque) sont effectuées sous anesthésie générale. Les chirurgies crâniennes sont suivies d'un traitement analgésique morphinique en période post-opératoire immédiate. Tout constat d'anomalie affectant l'état général de l'animal en cours d'expérience donnera lieu, sous anesthésie ou sédation profonde, à un examen complémentaire par le vétérinaire pour auscultation et/ou prélévements sanguins. Les éventuels épisodes inflammatoires ou infectieux au site d'implantation donneront lieu à des traitements locaux adaptés. Les points limites définis dans le cadre des différentes étapes de notre procédure expérimentale seront pris en considération pour décider de l'interruption de l'expérimentation afin de mettre en oeuvre une prise en charge thérapeutique adaptée, impliquant notamment le retrait du dispositif implanté, ou l'euthanasie de l'animal si son état s'est trop dégradé en dépit des soins.

Choix des espèces

L'analyse des anomalies comportementales après inactivation expérimentale chez le rongeur n'est jamais aussi détaillée que celle faite chez le singe. Les spécificités du répertoire comportemental des primates font du macaque rhésus un bon modèle pour l'expression de compulsions semblables à celles qui se manifestent chez l'humain. Une abondante littérature atteste de la similitude d’organisation des circuits qui relient le cortex préfrontal au striatum chez le macaque rhésus et l'humain. Il est donc indispensable d’étudier les supports neuronaux des fonctions de planification et de sélection de l'action chez le singe pour extrapoler aux aptitudes humaines et à leur dérèglement en pathologie. De plus, les tests comportementaux sont proches de ceux employés chez l'humain (mouvements d'atteinte de cibles avec la main) et les données électrophysiologiques recueillies à l’échelle neuronale chez le singe sont un complément précieux aux mesures plus globales, non invasives, de l'activité cérébrale chez l'humain. Nous utilisons des animaux dans une gamme de poids 6 à 12 kg dont la morphologie crânienne est compatible avec la mise en place chirurgicale de la chambre d'enregistrement et du dispositif de fixation de la tête.

Un hypersensibilisant est appliqué sur le ventre rasé sous anesthésie, puis un second sur l'oreille droite pour déclencher une réaction proche d'une dermatite atopique : 1 236 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 432 d'entre elles reçoivent en plus une injection sous-cutanée de cellules immunitaires triées, et toutes subissent un prélèvement de sang à la veine mandibulaire en fin d'expérience. Le porteur ne décrit que des démangeaisons légères et passagères et un épaississement de la peau, tout en prévoyant des points limites au-delà desquels un animal est retiré de l'étude et tué. Toutes les souris sont mises à mort pour prélever leurs tissus, onze lignées étant mobilisées afin de trier des cellules dendritiques qui représentent moins de 1 % d'un ganglion.

Objectifs

Dans ce projet, l’objectif est de mieux comprendre le rôle des cellules dendritiques du système immunitaire, soupçonnées d’avoir une fonction apaisante dans une forme expérimentale d’inflammation de la peau. Pour cela, plusieurs approches complémentaires seront utilisées. D’abord, des animaux recevront une substance irritante sur la peau afin de déclencher une réaction ressemblant à une dermatite atopique. Les chercheurs analyseront ensuite les cellules immunitaires stimulées au cours de l’inflammation induite. Dans un second temps, La production d'autres cellules immunitaires seront induites à partir d’animaux traités avec un hypersensibilisant. Ces dernière cellules seront ensuite injectées dans la peau d’animaux afin d’observer si elles modifient l’intensité ou la nature de la réaction inflammatoire. Plusieurs quantités de cellules seront testées pour identifier la dose la plus efficace. Une fois cette étape validée, les chercheurs compareront l’effet de cellules activées ou non activées, afin de comprendre ce qui leur confère un potentiel anti inflammatoire. Les analyses utiliseront différentes techniques seront utilisées. L’ensemble de ces expériences permettra de déterminer si ces cellules immunitaires peuvent réellement atténuer l’inflammation cutanée, comment elles agissent et quelles conditions favorisent leur apparition. À terme, ces connaissances pourraient contribuer au développement de stratégies visant à mieux contrôler les réactions inflammatoires de la peau.

Bénéfices attendus

La mise en évidence de la fonction de cellules immunitaires spécialisées dans la modulation des réponses inflammatoires constituerait une nouvelle cible thérapeutique intéressante dans le traitement de pathologies en lien avec le système immunitaire, comme les maladies auto-immunes ou le cancer. En effet, la modulation de la réponse immunitaire de l'atténuer ou de la restreindre dans un contexte d'allergie ou de maladie auto-immune, ou de l'amplifier dans un contexte de cancer. De plus, l'utilisation de cellules immunitaires spécialisées générées ou modifiées ex vivo/in vitro est une stratégie thérapeutique innovante qui peut s'appliquer à l'homme et qui est déjà étudiée, notamment dans un contexte de lutte anticancéreuse.

Procédures

Les animaux vont être sensibilisés avec l'application unique topique d'un hypersensibilisant sur le ventre préalablement rasé sous anesthésie gazeuse (durée : 1min pour la survenue de la narcose et 1min pour l'application de l'haptène). 432 animaux vont être injectés en sous-cutanée au niveau du ventre avec les cellules immunitaires triées et présensibilisées (durée : 30s) et ces animaux vont etre soumis à une phase de déclenchement au niveau de l'oreille droite par un autre haptène hydrophile, sous anesthésie gazeuse . A la fin de l'expérience, un prélèvement sanguin à la veine mandibulaire sera effectué.

Impact sur les animaux

L’administration de l'haptène pour la sensibilisation se fait par application cutanée sur le ventre rasé sur 1cm2. Cette application peut être accompagnée de légères démangeaisons qui s'estompent quelques heures après le traitement. On constate un épaississement localisé de la peau du ventre. L’administration de l'haptène pour le challenge se fait sur l’oreille droite. On constatera une augmentation de l’épaisseur de l’oreille traitée ainsi qu’une légère démangeaison locale et passagère. L'application de l'haptène engendrera un léger stress d'une courte durée sur les animaux. L'injection de cellules engendrera un léger stress et douleur d'une courte durée sur les animaux injectés et sur les animaux ayant subi une application topique et unique de l’haptène sur l’oreille où une inflammation accompagnée de démangeaisons et d'une rougeur, pourraient survenir de manière passagère.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort pour permettre les prélèvements de tissus pour analyses (cytométrie en flux, histologique, ...).

Remplacement

Les phénomènes à l'oeuvre dans cette réaction immunitaire nécessitent deux phases distinctes, de sensibilisation et de déclenchement, et mettent en jeu différents organes et plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Le protocole de sensibilisation sera appliqué à un total de 11 lignées murines afin de mettre en place différentes stratégies d'identification et d'obtention des cellules dendritiques ou d'étudier l'implication de différentes molécules dans l'induction des réponses pro- et anti-inflammatoires. 12 souris par groupe seront suffisantes pour obtenir des résultats interprétables des modifications des sous-types de populations de cellules dendritiques entre les lignées mutantes et la lignée sauvage. Le protocole de traitement à l’haptène sera appliqué à un total de 6 lignées murines afin de mettre en place différentes stratégies d'identification et d'obtention des cellules dendritiques ou d'étudier l'implication de différentes molécules dans l'induction des réponses pro- et anti-inflammatoires. Cependant, les cellules dendritiques d'intérêts représentent moins de 1% de la population cellulaire totale d'un ganglion lymphatique après traitement et, d'après l'expérience sur de précédents projets, nous savons qu'il est nécessaire d'avoir 10 animaux dans chaque lignée murine pour avoir un nombre de cellules suffisant pour la suite du projet. Seul un groupe traité sera nécessaire dans l'obtention des cellules dendritiques ex vivo, donc nous n'inclurons pas de groupe non traité comme contrôle. Le protocole d'injection des cellules dendritiques sera réalisé sur un total de 5 lignées afin d'étudier la réponse immunitaire résultante de l’injection des différentes populations de cellules injectées issues des 7 lignées murines transgéniques. 8 animaux par groupe seront nécessaires pour arriver à des conclusions significatives. Les analyses statistiques seront réalisées à l'aide de plusieurs formules en fonction du nombre de paramètres et du nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et auront un accès constant à de l'eau et de la nourriture pendant toute la durée de l'expérience. L'application topique de l'haptène ou l'injection unique de cellules immunitaires spécialisées au niveau du ventre seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress et/ou la douleur des animaux pendant les procédures. Pendant l'expérience, il pourrait être possible d'observer une inflammation au niveau du ventre, accompagné de démangeaisons et d'une rougeur, mais n'impactera pas le comportement des animaux (soin du pelage, posture, activité normale, ...). Le dépôt de l’hypersensibilisant sur le ventre rasé provoquera une augmentation de l’épaisseur de la peau et une légère démangeaison localisée et limitée dans le temps. Cependant, si un animal vient à dépasser les points limites fixés par la grille de score de chaque procédure expérimentale, il sera retiré de l'étude et euthanasié.

Choix des espèces

Les phénomènes à l'oeuvre dans la réaction immunitaire étudiée nécessitent deux phases distinctes, de sensibilisation et de déclenchement, et mettent en jeu différents organes et plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier et étudier les cibles thérapeutiques. Les souris C57BL6/J utilisées seront agés de 10 à 12 semaines afin que leur système immunitaire soit mature.

Douze à seize heures de mise à jeun avant chaque anesthésie, des chirurgies pouvant durer plusieurs heures et un prélèvement de sang par semaine : 150 porcs, 100 moutons et 80 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet évalue des dispositifs implantables et des techniques de chirurgie du rein, de la vessie et de la prostate, avec une douleur postopératoire annoncée sur plusieurs jours selon l'invasivité de la technique. Les chiens sont retenus parce qu'ils sont, écrit le porteur, le seul modèle à présenter une prostate bilobée ou un pénis de forme comparable à celui de l'homme. Tous les animaux sont tués à la fin, la nécropsie et l'examen histologique servant à mesurer la tolérance des tissus et l'usure du dispositif.

Objectifs

Les dispositifs implantables chirurgicalement sont des dispositifs médicaux conçus pour être insérés en totalité ou partiellement dans le corps humain, ou à remplacer une surface épithéliale, grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer après l'intervention de façon temporaire ou définitive, pour soutenir les fonctions d'organes ou de tissus spécifiques, surveiller les activités physiologiques ou administrer des médicaments. La chirurgie uro-néphrologique s’est développée rapidement dans la deuxième moitié du XXème siècle avec par exemple l’avènement de la transplantation rénale (années 60-70), ou encore de l’hémodialyse (années 50-60) permettant de sauver des millions de personnes par an, le développement de nouvelles technologies comme les circuits extracorporels avec filtre de dialyse permettant la déviation du sang vers un filtre externe et ainsi sa purification artificielle. Il est possible dès lors de pallier des dysfonctions importantes du rein par exemple. De même, le traitement des affections prostatiques, tumorales par exemple a fait des progrès immense grâce par exemple à l’avènement de techniques chirurgicales peu invasives assistées ou non de la vidéo endoscopie et/ou de la robotique. Les progrès diagnostiques et thérapeutiques se développent rapidement pour l’ensemble des organes de l’appareil urinaire et ses annexes. L’évaluation et le développement de nouveaux dispositifs, méthodes, techniques, molécules et tissus pour le diagnostic et le traitement des affections de l'appareil urinaire et ses annexes par des techniques de chirurgie standard ou mini-invasives, demandent une phase de recherche/développement préalable. Les différentes itérations de prototypes doivent être confrontées au modèle animal en reproduisant fidèlement le contexte clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire visé pour les futures applications humaines. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour les valider selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58). Ce projet de recherche se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (EU 1/2 et 2/2).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour améliorer leur tolérance et éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients avec des durées d'hospitalisation et de convalescence réduites.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. La période d'acclimatation d'une durée de 7 jours se fera dans l'EU 2/2. Les actes chirurgicaux d'implantation de dispositif et/ou d'évaluation de technique chirurgicale avec ou sans réveil pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. Le suivi clinique et fonctionnel des animaux après les procédures chirurgicales ainsi que les administrations de soins pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2. Pour les études chroniques, les évaluations finales avec euthanasie pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim, lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins, 6 à 12 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive, - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale avec prise en charge multimodale de l'analgésie per, et post-opératoire avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés avec ajout d'anesthésiques locaux pour certains actes chirurgicaux, la protection et la surveillance des plaies, la surveillance du reveil d'anesthésie dans des espaces calmes et spécialement aménagés avec évaluation et scoring de la douleur réguliers, ou la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens spécialement formés supervisés par des Véterinaires).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur l'animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Cette estimation répond à différents paramètres et en premier lieu aux besoins de la démarche expérimentale spécifique de mise au point et de raffinement des prototypes de dispositifs, puis de validation et d’évaluation des versions des dispositifs jugées efficaces et sécuritaires, mais aussi de l’expérience du laboratoire sur d’autres projets avec ce même type d’approche, elle répond enfin à un besoin de développement et d’évaluation de l’efficacité, de l’innocuité et de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs en robotique chirurgicale. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Dans ce projet les canins seront utilisés plus rarement que les porcins, lorsqu’ils sont le seul modèle à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle la plus proche de l’Homme (comme par exemple une prostate bilobée, ou un pénis formé comme chez l'homme...). Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateaux techniques opératoires et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge multimodale de la douleur sont systématiquement appliqués. Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées ayant reçu une autorisation AT1 délivrée par la DDPP, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antidérapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est validé par un Vétérinaire. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs doivent être testés sur une anatomie semblable à celle de l’Homme (de l’enfant à l’adulte de grande taille), cela impose l’expérimentation sur des gros animaux. Les différences interspécifiques tissulaires, anatomiques et fonctionnelles nécessitent différentes espèces pour optimiser l’expérimentation. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements de chirurgie interventionnelle et d'imagerie standards utilisés chez l'Homme. Les ovins sont un modèle pertinent pour évaluer la durabilité des matériaux des dispositifs testés dans les phases de développement dans ce projet. Les porcins sont avec le chien, un modèle pertinent pour l’évaluation des dispositifs intéressant des structures anatomiques de taille similaire à l’homme comme le rein, les uretères, la vessie, l’urètre. Les canins ne seront utilisés que rarement, lorsqu’ils sont le seul modèle à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle la plus proche de l’homme. Par exemple les canins sont le seul modèle à présenter une prostate bilobée, ou un pénis formé comme chez l’homme. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

Remises à l'eau moins d'une heure après l'opération, 35 anguilles argentées capturées dans le milieu naturel vont subir des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un émetteur est implanté dans leur abdomen sous anesthésie, au cours d'une chirurgie de dix minutes au plus, pour mesurer combien d'entre elles atteignent l'estuaire malgré la dizaine d'ouvrages hydroélectriques installés sur leur route. Le porteur annonce une inflammation ou une gêne locale pouvant durer quelques semaines après l'implantation, ainsi qu'une altération temporaire du comportement. L'effectif de 35 individus est calé sur un objectif de trente poissons détectés à l'arrivée, l'espèce ayant été retenue parce que sa survie est déjà entamée par le franchissement des turbines.

Objectifs

L'objectif du projet est d'évaluer le succès de migration des anguilles en dévalaison depuis l'amont d'un bassin-versant jusqu'à son estuaire. Plus d'une dizaine d'ouvrages hydroélectriques sont construits sur cette voie de migration et peuvent induire un retard ou un échec de migration (mortalité lors du franchissement par les turbines par exemple). Cette étude vise à estimer un premier ordre de grandeur du taux d'échappement des anguilles présentent à l'amont du bassin.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont une amélioration de la connaissance sur cette espèce et du degré de continuité écologique de la portion étudiée. Les principaux résultats attendus concernent la vitesse générale de dévalaison et le taux d'échappement (succès de migration) des anguilles.

Procédures

Les poissons seront soumis à une procédure chirurgicale (d'un maximum de 10 minutes) au cours de laquelle des émetteurs seront posés dans l'abdomen des individus.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables possibles sur les animaux sont : le stress lié à la capture et à la manipulation, les effets de l’anesthésiant utilisé pour l'opération, les effets post-opératoires (inflammation liée à l’implantation de l'émetteur ou gêne locale pouvant aller jusqu’à quelques semaines), l'altération temporaire du comportement (lié au stress, à l’implantation, à l’anesthésie pouvant aller jusqu’à quelques heures).

Devenir

Les animaux sont replacés dans leur milieu naturel à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’objectif du projet étant d’évaluer le succès de migration des poissons issus du milieu naturel à l'échelle d'un bassin-versant, le remplacement n’est pas envisageable.

Réduction

Le taux de détection à l'estuaire n'est par nature pas connu avant l'expérimentation puisqu'il est l'objectif même de celle-ci. Néanmoins, lors d'études similaires sur l'anguille menées par notre bureau, nous avons constaté des taux de détection des individus marqués situés entre 80 et 96%. Dans ce cadre exploratoire, afin de tenter de disposer d'une trentaine d'individus détectés à l'estuaire, nous proposons de marquer un effectif de 35 anguilles.

Raffinement

Les opérations d'implantation sont réalisées sous anesthésie et ont la durée la plus courte possible, entre 1 à 3 minutes pour l’implantation d’un émetteur. Une recirculation d’eau avec une légère sédation est installée pour le poisson. Le poids de l'émetteur (3.5g) ne dépasse pas 2% du poids de l'individu (en moyenne 800g). Les émetteurs sont tous encapsulés dans des matériaux biocompatibles. Concernant le marquage, les solutions d'anesthésiant sont changées tous les 20 individus. Les poissons sont manipulés à l'aide d'épuisette en maille en silicone pour éviter l'abrasion provoquée par les mailles classiques en nylon. Les points de suture sont réalisés avec du fil monofilament résorbable. Le fil monofilament endommage moins les tissus et empêche une infiltration d’eau par capillarité. Le matériel est désinfecté avant chaque session de marquage. Les lames de scalpel sont stériles. Les opérateurs portent des gants stériles. Les poissons sont anesthésiés un par un. Un pansement antiseptique est appliqué sur la cicatrice du poisson, ayant un effet dans les heures suivant le marquage. Lors des stabulations pré et post marquage, les poissons sont placés dans des volumes d'eau adaptés de 40L. Une pompe à air à grande capacité permet de maintenir un taux d'oxygène adapté et une limitation à l'exposition à la lumière (couvercle opaque) est prévue. La température est également contrôlée pour éviter le stress thermique. Afin de limiter le stress, les poissons sont relâchés le plus rapidement possible (

Choix des espèces

L’espèce a été choisie, car c’est une espèce migratrice dont la survie est impactée par le franchissement des usines hydroélectriques. Les anguilles utilisées seront les anguilles dites argentées, présentant les signes morphologiques suivants: coloration argentée du ventre et des flancs, fort contraste ventro-dorsale, taille des yeux importante, développement accru des nageoires pectorales, ligne latérale marquée.

Pour tester si deux cibles pharmacologiques combinées freinent la fibrose du foie liée à l'obésité, 270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras pendant vingt semaines, puis un gavage oro-pharyngé quotidien pendant vingt-huit jours et quatorze incisions de la veine de la queue pour mesurer leur glycémie. Le porteur reconnaît que ce régime peut les rendre incapables d'accéder à la nourriture et à la boisson, provoquer un état dépressif et de l'anxiété, et que l'isolement en cage individuelle des vingt-huit derniers jours sera une source d'angoisse prolongée. L'effet chez les patients reste au conditionnel, les deux molécules ayant chacune été testées séparément sans que leur combinaison ait été évaluée.

Objectifs

La prévalence mondiale de l’obésité est en constante progression. L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement du diabète de type 2 et de perturbations cardiométaboliques dont la MAFLD (Metabolic dysfunction-Associated Fatty Liver Disease). Cette pathologie est principalement caractérisée par une profonde perturbation du métabolisme du foie et par un développement de fibrose. Aucune approche médicamenteuse efficace n’est commercialisée à l’heure actuelle. L’objectif de notre projet est d’étudier les potentielles interactions entre 2 cibles thérapeutiques sur l’évolution de fibrose dans un modèle de souris souffrant de MAFLD.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type 2 et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses, bien que multiples, voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un récepteur et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi leur efficacité. Ce projet permettra de nous renseigner sur le réel potentiel thérapeutique d’une double approche pharmacologique dont les deux stratégies ont chacune déjà démontré des effets hépato-protecteurs. Ceci pourrait avoir un réel impact pour les patients.

Procédures

Pendant les 20 premières semaines de la procédure, les souris seront manipulées hebdomadairement pour monitorer leur masse corporelle. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 10 minutes par souris cette période. Pendant les 28 jours de traitements pharmacologique, la masse corporelle sera évaluée quotidiennement. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 14 minutes par souris cette période. De plus, l’administration quotidienne des traitements pharmacologiques par gavage oro-pharyngé nécessitera l’immobilisation de chaque animal pendant 10 secondes supplémentaires, soit 19 minutes au total par animal sur cette période et 29 minutes sur l’ensemble du projet. Pour chaque test nécessitant une mesure de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local afin de prélever du sang total et ainsi réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle).

Impact sur les animaux

En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Enfin, l’hébergement en cages individuelles pendant les 28 derniers jours de la procédure sera une source d’angoisse prolongée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’action mis en jeux.

Remplacement

L’obésité, le diabète de type 2 et le développement de MAFLD sont le fruit de dérégulations multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin et une perturbation de l’homéostasie lipidique ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier ces aspects, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier, justifiant ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu, au cours des projets, réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécules, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi, des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe (10 animaux par cages) pendant les 20 premières semaines avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. Pendant les traitements pharmacologiques, les souris seront amenées à être hébergées de manière individuelle afin de pouvoir monitorer la prise alimentaire quotidienne pouvant être influencée par les différents traitements. Par conséquent, un enrichissement plus important sera apporté dans chaque cage. De plus, le contact visuel et olfactif entre animaux sera maintenu via l’utilisation de cages transparentes sans couvercle filtrant.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont les plus proches possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le début du projet fera appel à des souris de 12 semaines. Considérant les 20 semaines de régime WD, les animaux seront âgés de 32 semaines lors du commencement de l’approche pharmacologique et de 36 semaines lors de la fin de l’expérimentation.

Mises en accouplement pendant environ six mois, leurs petits anesthésiés pour un prélèvement de tissu destiné au génotypage, 279 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles appartiennent à quatre lignées qui développent spontanément une fibrose des voies biliaires et une hypertension portale, entretenues pour étudier une cible thérapeutique dans la cholangite sclérosante primitive. Le porteur ne compte parmi les dommages que la douleur transitoire du prélèvement, alors que la pathologie hépatique, ictère compris, tient à la lignée elle-même et se déclare sans intervention. Les reproducteurs sont tués à huit mois, avant l'apparition de signes cliniques significatifs, et les jeunes rejoignent d'autres projets expérimentaux.

Objectifs

Ce projet a pour but la gestion de 4 lignées qui développent spontanément une maladie hépatique caractérisée par une fibrose biliaire et une hypertension portale. Ces 4 modèles de souris vont nous permettre d’étudier l’implication d’une cible thérapeutique sur le développement de la cholangite sclérosante primitive. La cholangite sclérosante primitive est une maladie inflammatoire chronique des voies biliaires qui entraîne une fibrose et une destruction progressive des canaux biliaires, menant à des complications très sévères, telles qu’une insuffisance hépatique et des tumeurs hépatobiliaires. La cholangite sclérosante primitive est relativement rare, touchant environ 1 personne sur 10 000 dans la population générale. Elle est plus fréquente chez les hommes que chez les femmes et est souvent diagnostiquée chez les patients atteints de colite ulcéreuse. À l’exception de la greffe du foie, qui est réservée aux patients les plus gravement touchés, il n’existe actuellement aucun traitement pour cette maladie. Ainsi l’objectif de ce projet est la gestion de deux lignées de souris qui permettrons d’étudier la cholangite sclérosante primitive afin de comprendre cette pathologie et optimiser la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

La gestion de ces lignées permettra d’optimiser l’élevage et donc leur reproduction pour nos projets scientifiques. L’utilisation de ces deux lignées vise à évaluer l’implication de l’expression d’une cible thérapeutique sur le développement de la CSP. Les résultats permettront de comprendre comment cette cible participe à l’évolution de la maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront mises en accouplement durant 6 mois environs afin de produire les souris nécessaires pour réaliser nos projets scientifiques. Les petits générés par ces croisements pourront subir un prélèvement de tissus pour caractériser leur génotype. Ce prélèvement se fera sur animaux anesthésiés et prendra moins d’une minute à être réalisé.

Impact sur les animaux

Ce modèle de souris développe spontanément une maladie hépatique caractérisée par une cholestase intrahépatique avec ictère, une fibrose biliaire, une hypertension portale. Une diarrhée peut être observée à partir de 12 semaines d’âge (5% des cas). Le prélèvement de tissu induit une douleur aigüe transitoire.

Devenir

Utilisation continue : utilisation vers le projet scientifique prévu pour ces animaux. Les souris produites au fur et à mesure seront utilisées pour les projets scientifiques et les couples seront utilisés en continus pour les prochains accouplements. Les reproducteurs seront mis à mort lorsqu’ils auront atteint 8 mois d’âge (avant apparition de signe clinique significatif).

Remplacement

L’étude de cellules isolées ne permet pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, où plusieurs organes interagissent entre eux. Une étape supplémentaire chez l’animal est donc nécessaire pour comprendre précisément les mécanismes biologiques impliqués et évaluer la sécurité et l’efficacité du traitement avant toute application chez l’être humain.

Réduction

La production est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistiques. Les tailles d’effectifs ont été déterminées en se basant sur le strict minimum dont nous avons besoin pour la reproduction de nos souris pour générer le nombre de souris nécessaire à nos projets scientifiques. Toutes les données recueillies seront analysées avec des méthodes statistiques adaptées afin d’exploiter au maximum les informations obtenues et d’éviter toute utilisation animale supplémentaire inutile.

Raffinement

L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour l’étude de cette pathologie. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à partir d’un âge adulte de 7-8 semaines minimum pour les reproductions afin d’optimiser l’élevage.