Procédures modérées
Fourniture de souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
250 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le projet consistant à leur greffer une tumeur puis à les livrer à un chercheur extérieur. Une lignée de cellules de glioblastome humain leur est implantée sous la peau du flanc sous anesthésie, puis elles sont expédiées au demandeur dans les quinze jours, avant l'apparition annoncée de nuisances. Ce laboratoire se limite donc à greffer une tumeur et à fournir les animaux à un tiers, qui les utilisera pour tester des sondes d'imagerie. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" pour étudier la biodistribution d'un composé.
Objectifs
Ce projet a pour but de fournir, à la demande d'un chercheur extérieur à notre laboratoire, des souris modèles de cancer cérébral. Ces souris modèles seront ensuite utilisées chez le chercheur afin d'évaluer la spécificité de nouvelles sondes d'imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons) ciblant en particulier le métabolisme du tryptophane. La lignée cellulaire tumorale d'origine humaine U87 MG Luc correspond aux besoins du chercheur. L’objectif du financement ANR du chercheur est le transfert en clinique de radiopharmaceutiques innovants pour l’imagerie TEP en oncologie et neurologie et la radiothérapie moléculaire. Il est donc nécessaire des réaliser ce projet sur une lignée cellulaire humaine. Les souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée seront envoyées au chercheur 15 jours maximum après leur induction.
Bénéfices attendus
Le métabolisme du tryptophane via la voie de la kynurénine médiée par l'indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO) joue un rôle dans l'immunomodulation et est devenu une cible plausible pour l'immunothérapie contre le cancer. Ce projet permettra au chercheur d'évaluer la spécificité de nouvelles sondes d'imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons) ciblant le métabolisme du tryptophane. L'imagerie TEP est un outil diagnostique de choix en cancérologie chez l'homme.
Procédures
Souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée : 1 seule injection par animal, cellules injectées sous anesthésie gazeuse en sous cutanée au niveau du flanc des souris. Cette procédure dure moins de 5 minutes. Pesée des animaux vigiles , dure 30 secondes, 1 fois par semaine minimum. Mesure de la tumeur au pied à coulisse, se fait sous anesthésie gazeuse, dure moins de 1 minute, 1 fois / semaine maximum. Si l'envoie des souris se fait 15 jours après l'induction: pour chaque souris 3 pesées minimum et 2 mesures de tumeur au pied à coulisse).
Impact sur les animaux
Les dommages attendus sont liés au développement d'une tumeur sous cutanée. Dans ce modèle, il n'y aura pas de métastases. Les souris seront envoyées au chercheur avant l'apparition de nuisances ou d'effets indésirables soit 2 semaines maximum après l'induction des tumeurs. La douleur infligée par l’injection des cellules correspond à celle d’une piqûre d’aiguille et se fait sur souris anesthésiée (Isoflurane 2% dans l'air) tout comme la mesure de la tumeur au pied à coulisse qui est indolore. Les souris immonodéficientes utilisées présentent un phénotype dommageable dû à leur immunodéficiences qui n'apparait pas puisqu'elles sont hébergées en portoir ventilé.
Devenir
Tous les animaux du projet (50 souris x 5 envois= 250 souris) seront uniquement induits puis hébergés dans nos locaux pendant 2 semaines maximum. Ils pourront ensuite être fournis au chercheur demandeur de ce modèle pour des projets expérimentaux autorisés réalisés dans son UE. Nous lui fournirons la grille de scoring et le suivi pondéral des animaux dans nos locaux.
Remplacement
Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro nous permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution/ciblage de nouvelles sondes d'imagerie.
Réduction
Ce modèle de cancer chez la souris a pour finalité d'être utilisé par un chercheur pour l'étude de nouvelles sondes d'imagerie. D'une part, nous avons déterminé avec lui le nombre minimal de souris nécessaire pour mener à bien son projet et d'autre part le chercheur mettra en œuvre une technique d'imagerie (Tomographie d'émission de positon) qui permettra de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Pour chaque série expérimentale, il analysera les images ce qui permettra de comparer l’accumulation du traceur dans différentes zones (« zones d’intérêt ») entre les temps d’imagerie pour chaque groupe, et entre les groupes. Les différences d’accumulation du traceur dans chaque zone d’intérêt seront analysées statistiquement.
Raffinement
Les cages sont enrichies avec des petits cylindres de coton pour la fabrication d’un nid. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement et afin d’éviter toute souffrance avant leur départ chez le chercheur, nous mettrons en place une grille de score et utiliserons des points limites adaptés et un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Etude du rôle de la voie IL-1/IL-1R1 sur la réponse à la chimio-immunothérapie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont greffées sous la peau du flanc, puis elles reçoivent des chimiothérapies et immunothérapies par voie intrapéritonéale, la masse tumorale pouvant gêner leurs mouvements avant leur mise à mort lorsque la tumeur devient trop volumineuse ou pour en prélever le tissu. Le projet vise à comprendre le rôle de la cytokine IL-1 dans la résistance aux traitements de trois cancers parmi les plus mortels. Le porteur affirme que l'évaluation de ces combinaisons "doit être réalisée sur les organismes vivants" et conclut au recours à des souris immunocompétentes greffées.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer le rôle de l’ IL-1sur l’efficacité des traitements de chimiothérapies et d’immunothérapies utilisés en clinique. Nous étudierons également la présence de cellules immunitaires dans les tumeurs. Ainsi, nous pourrons évaluer l’efficacité des traitements et déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiée. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.
Bénéfices attendus
Les cancers du côlon du pancréas et du poumon font partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Leur traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies qui malheureusement ne conduisent pas systématiquement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie, visant à activer le système immunitaire, a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas et pour certains cancers colorectaux et pulmonaires. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. L’IL-1 est une cytokine inflammatoire pouvant être produite à la suite d’un traitement par chimiothérapie. Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de l’ IL-1, sur l’efficacité anti-tumorale des chimio-immunothérapies, utilisées en clinique dans différents modèles de cancers murins. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par chimio-immunothérapie. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.
Procédures
- Injection sc des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Nombre de souris : 1600 souris C57BL/6, 800 souris C57BL/6 Il1b-/- et 800 souris C57BL/6 Il1r1-/-. - Traitements par chimiothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 800 souris C57BL/6, 400 souris C57BL/6 Il1b-/- et 400 souris C57BL/6 Il1r1-/-. - Traitements par immunothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 800 souris C57BL/6, 400 souris C57BL/6 Il1b-/- et 400 souris C57BL/6 Il1r1-/-.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies, immunothérapies et thérapies spécifiques utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important..
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Les souris utilisées pour les expériences de croissances tumorales seront mises à mort lorsque la taille des tumeurs sera trop importante. Les souris utilisées pour les expériences d’analyse du système immunitaire seront mises à mort afin de prélever la tumeur.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Les différents modèles (cancers du pancréas, du poumon et du colon) utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon l’organe d’origine, les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements. De plus, selon le type de cancers, les régimes de chimiothérapies seront différents afin de se rapprocher de la clinique. Ces traitements affecteront également de manière différentielle les cellules du microenvironnement. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour un ou plusieurs modèles, les expériences d’immunomonitoring ne seront pas réalisées sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe. Certains points limites peuvent survenir, ce qui conduira dans un premier temps à un arrêt des traitements, puis si persistance à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence des souris C57BL/6 génétiquement modifiées pour ne plus exprimer l’IL-1R1 ou l’IL-1β renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.
Rôle des changements épigénétiques liés à l’âge dans les cellules oligodendrogliales sur la cognition des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1734 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à modéré, les cohortes expérimentales tuées à l'issue et une lignée conservée pour de futures études. Elles subissent un génotypage par prélèvement d'oreille ou de queue, des injections répétées de tamoxifène, une chirurgie stéréotaxique du cortex moteur et des tests d'apprentissage moteur sur roue à échelons, une perte de poids atteignant 20 % déclenchant la mise à mort. Le projet vise à décrire le rôle de cellules de la myéline dans le déclin cognitif lié à l'âge, le porteur renvoyant au conditionnel et au long terme l'espoir de "rajeunir" ces cellules chez l'humain. Il affirme que les organoïdes "ne suffisent pas" et présente le recours à la souris comme "nécessaire".
Objectifs
La cognition et son déclin avec le vieillissement font partie intégrante des maladies psychiatriques et neurodégénératives liées au développement et à l'âge. Si les circuits neuronaux sont à la base de l'organisation cérébrale, une accumulation de preuves a désormais mis en évidence le rôle potentiel des cellules oligodendrogliales dans la plasticité cérébrale et la cognition. Notre équipe a récemment découvert un activateur épigénétique dépendant de l'âge (enzyme Ten-Eleven Translocation 1 (TET1)), nécessaire à la différenciation et à la remyélinisation des oligodendrocytes, mais défaillant dans le vieillissement. Nous avons développé une lignée de souris, dans laquelle l'ablation de Tet1 dans la lignée oligodendrogliale (lignée de souris Tet1cKO) imite un phénotype myélinisant semblable au vieillissement, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier le rôle des cellules oligodendrogliales dans le vieillissement. Nous avons également identifié une cible TET1 spécifique à l'oligodendrogliale : le symporteur SLC12A2, dont l'expression à l'interface neurogliale diminue avec l'âge, entraînant directement une myélinisation défectueuse (caractérisée par un gonflement). Dans ce projet, nous allons 1/ Caractériser le rôle du vieillissement oligodendroglial sur la mémoire et l'apprentissage et sur la fonction neuronale, en utilisant notre modèle de souris Tet1cKO ; 2/ Identifier les gènes cibles TET1 réactivés lors de tâches d'apprentissage moteur ; 3/ Caractériser le rôle de l'ablation de Slc12a2 sur la mémoire et l'apprentissage et sur la fonction neuronale, à l'aide d'un modèle de souris (Slc12a2icKO) et d'un lentivirus Scl12a2KO. En caractérisant mieux le rôle dépendant de l'âge des cellules oligodendrogliales sur la fonction neuronale et les capacités comportementales, notre projet aborde pleinement le rôle de la myélinisation sur la cognition, ce qui pourrait donner lieu à des développements cliniques à fort impact.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle des oligodendrogliaux dans le vieillissement, en particulier autour de la compaction de la myéline, et l'identification des voies spécifiques aux oligodendrogliaux nécessaires aux fonctions cognitives. À long terme : développer des stratégies pour rajeunir les cellules oligodendrogliales, pour favoriser les fonctions cognitives dans le vieillissement et les maladies liées à l'âge. Le déclin de la cognition cérébrale représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.
Procédures
Les souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille pour le génotypage. Certains peuvent être génotypés de manière non invasive (lampe UV, 5 secondes, une fois). D'autres devront être génotypés avant sevrage, en prélevant un échantillon de queue (sous anesthésie, 5 secondes, une fois). Les souris seront soumises à des tests comportementaux (1 à 2 semaines, une fois). Les souris seront injectées en IP pour la recombinaison du tamoxifène (4 fois par semaine, une fois). Des souris seront injectées chirurgicalement dans la zone corticale motrice (chirurgie de 30 minutes, comprennat le temps pré- et post-opératoire, une fois). Les souris seront anesthésiées avant d'être sacrifiées (1 minute, une fois).
Impact sur les animaux
Au cours de cette DAP, les animaux subiront les différents génotypages soit par punch à l'oreille pour les adultes ou le prélèvement d'un bout de queue pour les souriceaux. Il subiront, en fonction de la procédure, ou de l'anesthésie à l'isoflurane (en induction (4%) et/ou en entretien (2 à 3%)) ou de l'anesthésie injectable kétamine - Xylazine. Les animaux seront soumis à différents tests d'apprentissge, et de mémorisation. Lors du test d'apprentissage moteur dependant de la plasticité myélinique, à l'aide de dix cages équipées d'un roue à 38 échelons, les animaux seront hébergés à un animal par cage. Quelques animaux pourront recevoir du Tamoxifène en injection intrapéritonéale. Enfin certains animaux subiront une chirurgie stéréotaxique d'une durée de 30 minutes.
Devenir
Toutes les cohortes expérimentales seront euthanasiées à la fin de l'étude, afin de corrélerer l'analyse comportementale par une anlayse au niveau moléculaire et/ou cellulaire. Une cohorte des lignées de souris générées sera conservée dans notre animalerie, pour des études ultérieures.
Remplacement
Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans les cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions et dysfonctionnements cognitifs au niveau de l'organisme. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques et de voies moléculaires dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, nous exploitons des modèles in vitro de co-cultures primaires, de lignées cellulaires et d'iPSCs. En effet, pour notre approche lentivirale Slc12a2KO, nous allons d'abord optimiser notre protocole sur des lignées cellulaires (Olineu), afin de limiter les étapes d'optimisation sur des cultures cellulaires primaires.
Réduction
Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 9 ou 10 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos cohortes seront donc composées de souris des deux sexes. Pour les animaux sacrifiés pour les cultures de tissus, nous devons mettre en commun 3 tissus de souris par expérience. Notre expérience avec ce modèle de co-culture suggère de prévoir 4 répétitions par test in vitro, pour chaque analyse (immunohistochimie, électrophysiologie,...).
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un cycle obscurité-lumière de 12h à 21°C(±1°C) dans des cages ventilées (12vol/h), sous environnement contrôlé et enrichi (alternance entre dôme en carton et en plexiglax, coton Nestlets). Les animaux sont sous la surveillance et l'observation quotidiennes de soigneurs animaliers dévoués et formés, chargés de veiller à leur bien-être. Lors de l'apprentissage face à une roue complexe, les animaux seront hébergés individuellement jusqu'à 7 jours dans une cage enrichie, dans laquelle nous n'observons normalement aucun phénotype d'isolement social. Cependant, si nous observons un changement de comportement ou un manque d'intérêt pour la roue, l'animal sera exclu de la procédure et replacé dans sa cohorte de groupe. Pour les injections IP, nous alternerons les côtés et les souris seront surveillées pour détecter toute perte de poids, éruption cutanée ou infection. Pour la chirurgie stéréotaxique, les souris recevront une injection de buprénorphine (0,5-1 mg/kg, IP), le jour de la chirurgie et deux fois par jour les 2 jours suivants. Pendant la chirurgie, nous appliquerons une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée et couvrirons les yeux pour éviter une exposition intense à la luminosité pendant la procédure, nous procéderons à une infiltration de lurocaïne avant incision de la peau. La chirurgie sera réalisée dans des conditions stériles (gants, outils, instruments,...). Après la chirurgie, l'animal sera placé sous une lampe chauffante jusqu'au réveil anesthésique avant de retourner dans la pièce d'hébergement. Des granulés alimentaires ramollis et de l'eau supplémentaires seront fournis à l'intérieur de la cage pour les animaux, afin de fournir un soutien trophique général et de garantir que la perte de poids est contenue (inférieure à 20 % du poids corporel d'origine). Si l'état général du corps semble médiocre (perte de mobilité, dos arqué, incapacité à se toiletter) ou si la perte de poids est égale ou supérieure à 20 %, les souris auront atteint des points limites et seront euthanasiées et retirées de l'étude.
Choix des espèces
Les modèles de souris sont pertinents car ils sont couramment utilisés dans les études comportementales portant sur les fonctions et les déficits cognitifs. Notre modèle Tet1cKO, que nous allons recréer dans notre installation, combine les lignées Olig1-cre et Tet1-flox, induisant une ablation constitutive de Tet1 dans la lignée oligodendrogliale (cellules Olig1+). Le modèle Slc12a2icKO sera créé dans l'institut en combinant les lignées Plp-creERT et Slc12a2-flox, induisant une ablation inductible par le tamoxifène de Slc12a2 dans les oligodendrocytes matures (cellules PLP+). La lignée transgénique PDGFRa-eGFP est une lignée, dans laquelle la fluorescence GFP imite le schéma d'expression de PDGFRa, permettant la détection et l'isolement de cellules progénitrices d'oligodendrocytes. Pour études comportementales, des souris adultes seront utilisées à l'âge de 2 mois, âge idéal pour cette approche, puisque les souris sont jeunes et actives. Pour établir des modèles in vitro, les souriceaux de 7 jours et des animaux de 2 mois et 12 mois seront utilisés pour collecter les tissus cérébraux, nécessaires à une culture tissulaire efficace et viable.
Etude des effets thérapeutiques lors du traitement par radiothérapie interne via l’utilisation de nanoparticules chargées au Rhénium-188 et d’un bio-implant dans le cas du glioblastome chez le rat (1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de glioblastome leur est implantée dans le cerveau, suivie de la pose d'implants biodégradables et de séances de radiothérapie interne au rhénium-188 et externe, cette dernière imposant un transport aller-retour d'environ 95 kilomètres, avec un suivi IRM hebdomadaire. Le porteur reconnaît une fatigue, du stress, une mauvaise cicatrisation, une perte de poids et une prostration possibles, et prévoit la mise à mort de tous les rats pour éviter la souffrance liée à la croissance tumorale. Il indique avoir mené des essais préalables sur cellules et sphéroïdes mais présente le recours à deux modèles de rats comme "indispensable" pour obtenir des données transférables à la clinique.
Objectifs
Le développement de ce projet chez le rat permettra d'évaluer si l'attraction de cellules cancéreuses résiduelles dans un implant biodégradable en zone confinée (la cavité d'ablation de la tumeur dans le cerveau) apporte un bénéfice préclinique en synergie d'une radiothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements du fait de l'inclusion d'un acte de radiothérapie externe à distance du site principal.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavité d'éxérèse dans le glioblastome en synergie d'irradiation pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) - la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h) - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h30) - l'association ou non à des radiothérapies (durée d'environ 30 minutes fractionnée en 2 ou 3 fois selon le type de radiothérapie). En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 3. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire. L'un des actes (radiothérapie externe) inclue un transport aller-retour d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.
Remplacement
La thématique de recherche de notre équipe concerne le développement d’approches thérapeutiques pour le traitement du glioblastome et l’étude des modalités de mise en place posant à la fois des questions fondamentales et des questions de biotechnologies pour la santé. Le projet ici proposé a pour but l’étude du piégeage tumoral au travers de bio-implants polymères pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes de piégeage (au travers d’un leurre environnemental) et celle d’élimination (au travers de l’application d’une procédure de radiothérapie interne vectorisée). L’utilisation de deux modèles pour valider ces procédures et obtenir des données interprétables par la suite valorisables par la publication et transférables à la clinique est indispensable pour répondre aux questions et livrables scientifiques indiqués dans le résumé non technique.
Réduction
En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur des cellules dissociées ainsi que des sphéroïdes ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Un groupe référence incluant la radiothérapie externe est introduit, toutefois sans modifier le nombre initial d'animaux prévus pour l'étude, tout en devant générer des données statistiquement interprétables.
Raffinement
Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Ce projet sera développé chez le rat, permettant des gradients d’infusion de chimio-attractant et des migrations cellulaires sur des volumes et distances plus importants que chez la souris. La possibilité d’utiliser deux types cellulaires dans deux types de rats est envisagée afin d’investiguer les réponses dans un cadre de xénogreffe d’une part et dans un cadre syngénique d’autre part (permettant d’étudier le rôle de l’immunité). En effet, nous avons validé des cellules humaines modifiées (de niveau sécuritaire 1) sur-exprimant le récepteur CXCR4, jouant un rôle dans les réponses aux radiations, et une protéine de fluorescence ; ce modèle sera utilisé chez le rat nude. Par ailleurs la lignée cellulaire F98 (modèle de GB de rat) sera utilisée chez le rat Fischer pour les études syngéniques. Les rats seront utilisés à 8 semaines car ils seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.
Etude du rôle de nouveaux gènes dans les pathologies osseuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Certaines subissent le retrait des ovaires sous anesthésie, d'autres une arthrite provoquée, avec injections, prises de sang et biopsie de la queue, pour étudier le rôle d'un gène dans l'érosion des os. Le porteur indique que l'arthrite provoque rougeurs, gonflements des pattes et douleurs des membres, prises en charge par une grille de score et des analgésiques. Il affirme, après des études sur cellules, que le modèle animal est "indispensable" pour répondre dans un contexte physiologique et pathologique.
Objectifs
Avec le vieillissement de la population Européenne, les maladies inflammatoires chroniques deviennent un problème de santé publique majeur (100 millions selon l’OMS). En plus de l’inflammation, elles sont souvent associées à de l’érosion osseuse (localisée ou généralisée) responsable de douleurs et d’une augmentation du risque de fractures. Les thérapies anti-résorptives actuelles sont très efficaces pour bloquer l’érosion osseuse mais ont des effets secondaires délétères à long terme sur le remodelage osseux, affectant la qualité osseuse et augmentant le risque de fractures et d’ostéonécrose. Parce que le bon fonctionnement du tissu osseux repose sur un équilibre entre formation et érosion de l’os, il est nécessaire de comprendre la biologie de l’érosion osseuse pour développer des thérapies ciblées anti-résorptives qui n’affectent pas la formation osseuse. Dans l’organisme, la seule cellule responsable de l’érosion osseuse est l’ostéoclaste et l’objectif de ce travail est d’étudier le rôle d’un gène d’intérêt dans ces cellules et l’érosion osseuse.
Bénéfices attendus
- Impact scientifique et technologique : Identification d’un nouveau gène jouant un rôle clé dans la formation et l’érosion des os, acquisition de nouvelles connaissances dans le domaine de la biologie de l’os et de données qui seront mis à disposition de la communauté scientifique internationale pouvant servir à d’autres disciplines de la biologie. - Impact sociétal et économique : ce projet peut déboucher sur l’identification de gènes candidats qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques intéressantes pour développer des traitements anti-résorptifs et/ou des marqueurs de la qualité osseuse utilisables en cliniques.
Procédures
Les prélèvements sanguins seront effectués sur animal anesthésié (2 minutes). Certains animaux recevront une injection intra-péritonéale (30 sec). Certains animaux seront opérés sous anesthésie générale et avec analgésique pour retirer les ovaires (30 min). Afin d’identifier les animaux porteurs de la modification génétique voulue, une biopsie de queue est réalisée avant le sevrage (2-3 secondes).
Impact sur les animaux
Dans le cas de l’arthrite, les effets indésirables attendus sont : rougeurs, gonflements des pattes, douleurs des membres, altération légère de la marche. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau, des gels de nourriture hydratée seront placés dans la litière. Ils sont euthanasiés à J21 maximum. Les animaux sont observés quotidiennement et les signes de souffrances sont recherchés et scorés en suivant une grille de score. Dans le cas du retrait des ovaires, des douleurs post-opératoires au niveau des cicatrices peuvent apparaitre et seront prises en charge par les mesures analgésiques adaptées.
Devenir
Euthanasie pour prélèvement d’organes.
Remplacement
En préliminaire à cette saisine, nous avons mené toute une série d’études in vitro pour étudier le rôle de notre gène dans la formation et les fonctions érosives des ostéoclastes. Nos résultats nous ont conduit à émettre l’hypothèse que l’élimination de ce gène chez l’animal altérerait la dynamique du remodelage osseux pendant la croissance chez des animaux sains, et améliorerait les phénomènes d’érosion osseuse dans des pathologies inflammatoires comme l’arthrite ou l’ostéoporose. Le modèle animal est donc indispensable pour répondre à cette question dans un contexte physiologique et dans différentes pathologies.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au minimum avec des outils statistiques.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours y compris le weekend et les jours fériés et les signes de souffrance seront recherchés. En cas d’apparition, ces manifestations cliniques seront scorées suivant une échelle prenant en compte plusieurs paramètres, avec établissement de points limites entrainant euthanasie des animaux si nécessaire. Pour les animaux arthritiques, afin de faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau, des gels de nourriture hydratée sont placés dans la litière.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés pour étudier le gène d’intérêt. Tous les animaux seront utilisés à un âge adulte (à partir de 8 semaines).
Etude de la biocompatibilité d’un dispositif médical (DM) sur la santé humaine par l’utilisation d’un modèle de cobaye.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
17 955 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'effectif de loin le plus élevé du lot. Ils reçoivent des injections dans la peau et des applications cutanées répétées de dispositifs médicaux, dont des applications sur le pénis, pour tester leur pouvoir irritant et sensibilisant avant mise sur le marché. Le porteur indique que ces tests peuvent provoquer des rougeurs allant jusqu'à la nécrose de la peau, des escarres et une destruction de l'épiderme et du derme. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est reconnu pour ces dispositifs et que ces essais sont imposés par la réglementation européenne.
Objectifs
Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux (implants, prothèses, instruments…) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Pour cela il existe des tests règlementaires de toxicité qui peuvent évaluer les potentiels risques de réactions allergiques et/ou d’irritation cutanée de ces DM. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaire européennes.
Bénéfices attendus
Le projet permet d’évaluer les risques biologiques potentiels de l’utilisation des DM sur la santé humaine. Ceci dans un but de commercialisation des DM sans risque pour la santé de l’homme.
Procédures
- SMKiso : sur 15 (ou 30 dans le cas d’extraits) animaux vigiles, 6 injections intradermiques, une application locales occlusive pendant 48h et une application locale pendant 24h. 3 pesées, observations locales. Injection IP pour la mise à mort - SMBiso : sur 30 animaux vigiles, 3 à 9 applications occlusives locales de 24 heures, 3 pesées, observations cliniques quotidiennes. Injection IP pour la mise à mort. - MP : au moins 4 applications locales sur le pénis sur au moins 6 animaux, pesées, observations cliniques quotidiennes. Injection IP pour la mise à mort.
Impact sur les animaux
Un phénomène de sensibilisation peut apparaître . Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Les effets locaux peuvent rester jusqu’à la fin de l’étude, soit 35 jours. Selon l’intensité des effets observés, s’il y a atteinte des points limites alors l’animal peut être euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Il peut y avoir, assez rarement, des effets de toxicité systémique. - test SMKiso : À la suite des injections intradermiques, il peut y avoir de l’érythème allant jusqu’à la nécrose du derme. À la suite des applications locales, peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée. - test SMBiso : peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée. Un phénomène d’irritation peut apparaître . Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. -test MP : peuvent apparaître des érythèmes, de l’œdème, de la sécheresse cutanée.
Devenir
- SMKiso et SMBiso : Les animaux ayant reçu des traitements sur différentes parties de leur corps ceux-ci ne peuvent donc pas être réutilisés pour une procédure différente utlérieurement. Ils sont donc euthanasiés en fin d’essai. - MP : les animaux sont euthanasiés en fin d’étude pour prélèvement des pénis et analyse histologique.
Remplacement
Les relations quantitatives structure-activité et les modèles in vitro ne sont pas encore suffisamment élaborés à l’heure actuelle pour un rôle significatif dans l’évaluation du potentiel de sensibilisation cutanée des substances ; on doit donc continuer à déterminer ce potentiel sur des modèles in-vivo. Les tests in vitro permettant d’évaluer la sensibilisation du produit à tester ne sont pas reconnus pour les DM. Tout matériau irritant pour la peau, les yeux ou les muqueuses ou ayant un pH ≤ 2 ou ≥12.5 ne doit pas être testé et doit être étiqueté comme irritant potentiel. Par ailleurs les tests d’irritation ne doivent être envisagés que si les données de sécurité ne peuvent petre obtenues par d’autres moyens. Il n’existe pas de modèle in-vitro validé pour l’irritation pénienne. L’évaluation du potentiel sensibilisant et irritant des DM est imposée par la règlementation européenne pour leur mise sur le marché et les industriels ne peuvent se passer de réaliser ces tests.
Réduction
Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les normes demandent de réaliser des groupes témoins positifs à chaques tests. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un test témoin positif tous les six mois et non à chaque essai. Lorsque plusieurs DM sont testés dans un même temps, le lot contrôle sera communs aux différentes études dans la mesure du possible (3 DM maximum par lot commun pour les SMKiso et SMBiso et autant de DM que nécessaire par lot commun pour les MP).
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages communes par 2 ou 3, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles contiennent de la litière constituée de particules de bois résineux déshydratée puis tamisée et un tunnel en carton comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 2 fois par semaine. En cous d’étude (pendant une phase de repos) les animaux sont passés en cages plus grandes, par 5, toujours dans un souci de respect des règles de bien être animal (surface au sol). Des essais préliminaires sont réalisés afin de déterminer pour l’essai principal les doses non irritantes par application topique, non nécrosantes par injection intradermique et ne présentant pas de toxicité systémique et donc de limiter toute souffrance animale inutile. Des points limites (basés sur l’état général de l’animal) sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Le cobaye, reste le modèle de choix utilisé pour les tests de sensibilisation cutanée et d’irritation des tissus péniens. De plus la capacité de sensibilisation du cobaye est assez voisine de celle de I'homme. L’espèce et le stade de développement des animaux est imposé par les normes correspondantes. Cobayes jeunes adultes de 3 à 6 semaines pesant au moins 300g au début d’étude et arrivant à environ 800g à 1kg en fin d’étude. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.
Formation aux procédures peu ou faiblement invasives en expérimentation animale dans le cadre d’une formation réglementaire « Formation à l’expérimentation animale – Concepteur de projet ».
- Formation professionnelle
Rats : 150
300 souris et rats vont être utilisés, tous maintenus en vie à l'issue puis réutilisés, replacés ou adoptés, dans des procédures classées en souffrance modérée. Sur les animaux vivants, seuls les gestes de préhension et de contention sont pratiqués, pendant une formation réglementaire de concepteurs de projet, les injections et prélèvements étant réalisés sur des animaux déjà morts ou sur un simulateur. Le porteur indique avoir réduit à ces deux gestes ce qui était auparavant pratiqué en entier sur l'animal vivant, après avoir observé un surcroît de stress. Il justifie le maintien d'animaux vivants par le principe "jamais la première fois sur l'animal vivant" et la nécessité de ressentir les mouvements de l'animal dans la main.
Objectifs
La formation des personnes qui utilisent des animaux à des fins scientifiques est obligatoire et rentre dans un cadre réglementaire au sens de la directive du 1er février 2013. L’objectif du projet est de couvrir la partie pratique relative à l’initiation et à l’apprentissage aux gestes techniques dans le cadre de la formation « Concepteur de projet ». Cette formation est dédiée aux étudiants et auprès des doctorants ainsi que des professionnels. Cette formation réglementaire doit permettre l’initiation et l’acquisition de compétences théoriques ainsi que pratiques permettant le travail avec des animaux dans le respect du bien-être animal. Le TP portera sur les bonnes pratiques pour la réalisation des méthodes de préhension, contention, d’injection et prélèvement chez le modèle rongeur (rat et souris). Dans un souci de bien-être animal et pour limiter le stress, seuls les gestes de préhension et de contention seront réalisés avec des animaux vivants. Concernant les gestes techniques d’administration et de prélèvement, ils seront faits sur des animaux décédés issus de précédent TP ou récupérés auprès d’un fournisseur et sur le rat Koken. Il y a 2 sessions de 2 jours par an et 40 participants environs par session. Les participants sont repartis en 3 à 4 groupes de 10 à 13 participants.
Bénéfices attendus
Les objectifs pédagogiques sont : -la familiarisation et sensibilisation des participants avec les animaux vivants et au respect du bien-être animal. -l’apprentissage des règles sanitaires et sécuritaires à la manipulation des animaux. -la connaissances du choix du matériel, la préparation pour les administrations et les prélèvements -la mise en situation dans des conditions réelles par l’utilisation d’animaux décédés et d’animaux vivants.
Procédures
Seuls les gestes techniques de préhension et de contention seront réalisés sur les animaux vivants. L’exécution de ces gestes techniques dure 45 minutes (20 min pour la préhension et 25 min pour la contention) sur l’ensemble d’un TP de 3h30.
Impact sur les animaux
Ce projet fait suite à une précédente demande dans laquelle tous les gestes techniques (préhension, contention, administration et prélèvement) ont été faits sur animaux vivants. Nous avons observé un supplément de stress aux animaux lié à la présence de beaucoup de participants autour du poste et à l’inexpérience des participants pour la réalisation des gestes techniques. C’est pourquoi, nous avons fait le choix de réduire le nombre de gestes effectués sur l’animal vivant à ceux de préhension et de contention uniquement. Sur ces 5 derniers années, nous n’avons pas eu de décès ou de mise à mort lié à une mauvaise manipulation par participant. Malgré tout, l’équipe encadrante reste vigilante lors de la manipulation des animaux vivants et une observation accrue sera faite pendant 3 à 4 jours après les TP. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués.
Devenir
Les animaux après le TP seront : Tous les animaux sont gardés en vie et peuvent être réutilisés pour un autre projet (procédure sans réveil), replacés ou adoptés avec l’aide d’une association après avis vétérinaire.
Remplacement
L’axiome stipulant « Jamais la première fois sur l’animal vivant » est important pour le respect de l’animal et du bien-être. La formation utilisant des animaux vivants est primordiale pour encadrer les gestes techniques et apprendre les bons gestes et réflexes pour le travail avec l’animal vivant. Les gestes techniques (administration et prélèvement) pouvant être trop invasif et générer une douleur évitable ne seront faits que sur des simulateurs de type rat Koken ou animaux décédés issus d’autres projets antérieurs. L’utilisation des animaux vivants ne concernera que la préhension et la contention pour apprendre aux participants à ressentir les mouvements de l’animal dans la main ce qui n’est pas possible avec un simulateur.
Réduction
Lors de la précédente de demande, nous avons sollicité une demande pour 670 animaux pour 5 ans soit 134 animaux par an. La modification de la progression d’apprentissage et l’introduction de simulateur (rat Koken, par exemple), nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés à 300 animaux pour 5 ans soit 60 animaux par an. Cela représente une diminution de 55%.
Raffinement
L’installation des différents postes permettra d’avoir des groupes de 3 à 5 participants par poste afin de réduire le stress autour des animaux. De plus, l’utilisation d’animaux décédés et du rat Koken permet de raffiner l’apprentissage du geste technique en maintenant un réalisme dans la formation. S'agissant d'une simple préhension avec ou sans contention aucune anesthésie n'est prévue. Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Les rongeurs (rat et souris) sont les modèles les plus utilisés en expérimentation. L’utilisation de 2 espèces permet aux participants de réaliser qu’il est important d’adapter le geste à l’espèce pour des considérations techniques mais aussi comportementales. Jeunes adultes (7-8 semaines). Il s’agit du stade de développement le plus couramment utilisé en laboratoire de recherche.
Role de la proteine de densite post-synaptique PSD-95 dans la myelinisation et la remyelinisation du systeme nerveux central chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever la moelle épinière, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion de la myéline leur est provoquée par injection d'un agent dans la moelle épinière sous anesthésie, précédée de cinq injections quotidiennes, pour étudier le rôle d'une protéine dans la réparation de la myéline, comme dans la sclérose en plaques. Le porteur indique un risque d'hypothermie, de saignement et une douleur postopératoire légère de 48 heures, ainsi que des hématomes liés aux injections répétées. Il affirme qu'après des essais sur cellules, seul le modèle animal reproduit les lésions observées dans la maladie humaine.
Objectifs
L’établissement de la gaine de myéline du système nerveux, processus nommé myélinisation, vise à protéger l’axone et à accroître considérablement la vitesse de conduction de l’influx nerveux. Dans le système nerveux central, cette myélinisation est assurée les oligodendrocytes. Au cours du développement, la formation de la gaine de myéline requiert que ces cellules subissent deux processus : la migration/prolifération des progéniteurs, appelé progéniteurs d’oligodendrocytes, puis leur différentiation en cellules capables de myéliniser. L’établissement de la gaine de myéline est crucial et les déficits occasionnés résultent en de lourdes pathologies telle que la sclérose en plaques dans le système nerveux central. L’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la myélinisation est donc vitale afin d’accéder à une meilleure connaissance de ce processus physiologique en conditions normale et pathologique. Des études récentes ont montré que les cellules oligodendrogliales expriment des protéines synaptiques, protéines dont les fonctions sont bien établies dans les neurones. Plusieurs études scientifiques récentes suggèrent un rôle de ces protéines dans le processus de myélinisation. Notre projet a donc pour objectif de déterminer les fonctions précises de certaines de ces protéines dans le contrôle de la myélinisation et de la remyélinisation du système nerveux central.
Bénéfices attendus
La protéine synaptique qui nous intéresse est connue pour être impliqué dans certaines maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, et dans lesquelles une hypomyélinisation est aussi observée. Il est donc intéressant d’étudier l’implication spécifique des protéines synaptiques dans les oligodendrocytes afin de déterminer son implication dans le processus de myélinisation et de remyélinisation du système nerveux central. In fine, ce projet pourrait nous permettre de découvrir de nouvelles cibles moléculaires pour les thérapies de neuromodulation visant à promouvoir la régénération de la myéline dans les maladies démyélinisantes.
Procédures
Afin de répondre à notre question scientifique, nous allons générer un modèle de démyélinisation de la moelle épinière par injection de lysophosphatidylcholine (LPC). Ce modèle consiste pour chaque animal âgé de 12 semaines, en une injection dans la moelle épinière, effectuée sous anesthésie générale, d’un agent induisant une lésion focale de la myéline. Cette intervention dure environ 30 minutes par animal. L’analyse de la lésion permettra d’évaluer l’impact de notre protéine sur la réparation des lésions de la myéline semblable à celles observées lors de la sclérose en plaques. Nous allons utiliser 126 animaux. Dans le cadre de notre étude, une semaine avant la procédure de chirurgie, les animaux âgés de 12 semaines recevront 5 injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs sur animal vigile (5 secondes par animal). 48 heures après la dernière injection, les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie et analgésie pour une injection unique dans la moelle épinière (30 minutes par animal). Ils seront maintenus pendant différents temps post-chirurgie (4, 7, 14, 21 ou 30 jours). A l’issue du temps de maintien prévu, les animaux seront tous euthanasiés selon une méthode réglementaire en vue des prélèvements des moelles épinières. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie générale et analgésie pendant toutes les interventions, quand cela s’avèrera nécessaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux lors des procédures sont liées à la chirurgie : risque hypothermique, lésion musculaire, saignement et douleur post-opératoire légère (faim, soif, stress physique et/ou thermique) durant 48 heures. Il est aussi possible d’observer un stress ainsi que l’apparition d’hématomes dus à l’injection quotidienne répétée de solutions, avant la chirurgie.
Devenir
Les prélèvements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Après des essais préalables sur différents modèles cellulaires, seul le modèle animal est pertinent pour cette étude car nous pouvons ainsi analyser l’effet de ces molécules dans un contexte in vivo reproduisant le mieux les caractéristiques des lésions observées dans la pathologie humaine.
Réduction
Ce modèle a déjà démontré sa pertinence pour l’analyse des mécanismes de réparation des lésions de la myéline. Le nombre d’animaux (126 au total) est limité au stricte nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables.
Raffinement
Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et coton), d’alimentation et de soins quand nécessaire (directive européenne 2010/63/UE) seront contrôlées quotidiennement. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie générale et analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désignée. Ils seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie recommandées par les normes européennes. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe dans un nid). Les points limites sont : - perte de poids rapide ou progressive de 20 pourcents en 24h par pesée tous les jours pendant la première semaine puis 2 fois par semaine avant euthanasie ; - tumeur dont le volume est supérieur à 2 cm3; - état de choc, léthargie, inconscience, immobilité; - difficultés respiratoires L’euthanasie de l’animal sera réalisée si on observe l’un de ces critères.
Choix des espèces
Pour établir si notre protéine d’intérêt a un effet positif ou négatif sur les processus de myélinisation et de remyélinisation, la souris est un modèle de choix puisqu’en tant que mammifère, ses processus physiologiques se rapprochent de ceux décrits chez l’Homme. De plus, la facilité d’élevage et le cours temps de reproduction de cette espèce sont des avantages. Grâce à nos collaborations, l’obtention des lignées transgéniques déjà préétablies, nous a permis d’accélérer considérablement le temps nécessaire à l’obtention de la réponse scientifique, mais aussi de réduire le nombre d’animaux à générer. Notre étude aura lieu sur des animaux mâles et femelles. Ce modèle murin de démyélinisation et de réparation de la myéline est bien établi dans la littérature et au sein de notre laboratoire. La chirurgie de démyélinisation sera réalisée sur des animaux lorsqu’ils seront âgés d’au moins 12 semaines (jeunes adultes), afin d’avoir atteint une maturité suffisante du système nerveux central. De plus, à ce stade du développement, la chirurgie de la moelle épinière est facilitée par la relative faible masse musculaire et de tissus graisseux des animaux, permettant ainsi une meilleure accessibilité à la moelle lors de la chirurgie. Par la suite, les animaux seront euthanasiés à 4, 7, 14, 21 et 30 jours post-lésion, afin d’observer respectivement : -Le recrutement des cellules progénitrices des oligdendrocytes au site de lésion (4 jours post-lésion), -Leur pic de prolifération (7 jours post-lésion), -Leur pic de différenciation (14 jours post-lésion), -Et le processus de remyélinisation (entre 14 et 30 jours post-lésion).
les bases neurales de l’espace chez le macaque
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 macaques rhésus vont être utilisés, maintenus en vie à l'issue et réutilisés pour la reproduction, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Déjà porteurs d'un implant crânien, ils subissent deux chirurgies du crâne sous anesthésie puis une quarantaine de séances d'enregistrement par électrodes intracrâniennes, sous restriction hydrique, pendant qu'ils naviguent dans un environnement de réalité virtuelle. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une léthargie, une dissociation passagère et une douleur postopératoire, et que le contrôle de l'eau peut engendrer un inconfort. Il affirme que le macaque rhésus est le seul modèle doté d'un système visuel proche de celui de l'humain, justifiant le recours au primate.
Objectifs
Ce projet est le prolongement d'un autre projet pour obtenir des données manquante sur deux individus et vise à déterminer la base neuronale de la navigation, dans les structures corticales en connexion avec de l'hippocampe : les cortex rétrosplénial et cingulaire postérieur. Ces zones cérébrales sont des aires touchées de façon précoce dans les maladies neurodégénératives telle que la maladie d’Alzheimer et leur perturbation entraine des déficits de la navigation spatiale et de la mémoire épisodique chez l’homme. Des études d’imagerie ont montré qu’une hypoactivité localisée dans ces cortex est un signe précurseur précoce associé aux démences. Toutefois, à cause de la faible probabilité d’accident vasculaire cérébraux dans ce cortex, il y a très peu d’études cliniques décrivant les fonctions associées à ce cortex, ni d’études électrophysiologiques. Ainsi, le fonctionnement neuronal de ces aires sont encore très peu connus chez l’homme, malgré que, ces aires, avec l’hippocampe, aient un rôle essentiel dans la mémoire. Afin de comprendre quelles sont les propriétés fonctionnelles des cellules nerveuses dans ces régions chez le primate, nous effectuerons des enregistrements neuronaux pendant que des primates non humains naviguent dans un environnement en réalité virtuelle et effectuent des apprentissages spatiaux. Le dispositif virtuel permet un contrôle expérimental de l'entrée visuelle sensorielle et une caractérisation fine des facteurs qui influent l’intégration visuo-spatiale et mnésique dans cette zone. Ainsi, nos expériences renseigneront sur la plasticité neuronale ayant lieu dans cette région, et si une stimulation de cette zone permet d’améliorer la mémoire.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de caractériser les propriétés fonctionnelles des cellules neuronales au sein du cortex cingulaire postérieur, et du cortex rétrosplenial, qui sont tous deux impliqués dans la mémoire spatiale et la navigation. Nous déterminerons comment les cellules représentent l'espace visuo-spatial et la nature de leur rôle dans la mémoire grâce à un protocole qui permet leur stimulation pendant des tâches comportementales. En apportant des données neuronales fines, les résultats pourront expliquer pourquoi les atteintes de cette région entrainent des désorientations topographiques et des pertes mnésiques. Ce projet vise à documenter le rôle fonctionnel du cortex postérieur cingulaire et rétrosplénial pour lesquels il y a aujourd'hui que très peu de données.
Procédures
Les animaux sont soumis à deux chirurgies effectuées sous anesthésie générale, visant respectivement à permettre l'accès au cerveau par la mise en place d'une petite craniotomie au sein de l'implant dont les animaux sont déjà équippés, et une chirurgie de désimplantation qui permet de retirer cet implant. Les animaux seront soumis à une quarantaine de sessions d'enregistrement au cours desquelles des électrodes intracrâniennes seront descendues au sein des zones ciblées à raison de 3à 4 séances par semaine. les sessions d'enregistrement serontalternées avec des sessions d'entrainement, pour que le comportement des animaux soit optimal. Les animaux seront aussi soumis à 2 examens d'imagerie sous anesthésie générale après la craniotomie; .
Impact sur les animaux
Les chirurgies peuvent induire au réveil une léthargie et une dissociation mentale passagère, et une douleur post-opératoire qui sera maitrisée par la prise d'analgésique. L’animal est équipé d’un implant crânien qui permet d’enregistrer des données neuronales dont les bords présentent un risque infectieux. L’utilisation du contrôle hydrique peut engendrer un inconfort.
Devenir
Les animaux seront réutilisés à des fins de reproduction.
Remplacement
L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude de recherche fondamentale, utilisant des approches d’électrophysiologie et de pharmacologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. De plus notre projet porte sur la caractérisation du comportement de navigation grâce à une stimulation visuelle, pour lequel, le macaque rhésus est le seul modèle expérimental doté d’un système visuel très proche du nôtre. Aucun autre modèle animal ne présente ces caractéristiques. Par ailleurs, cette approche d’électrophysiologie telle que décrite dans le projet ne peut être à ce jour réalisée chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations. De fait, nous réaliserons les enregistrements chez deux animaux afin de voir si les résultats obtenus chez l'un sont reproduits chez l'autre. Etant donné la nature des aires cérébrales intervenant précocement dans le traitement des informations visuelles, nous pensons qu'il n'est pas nécessaire de récolter des données chez plus de 2 animaux. Les deux animaux concernés par cette DAP sont déjà implantés, mais la récolte des données neuronales et la stimulation neuronale n'ont pas pu avoir lieu.
Raffinement
Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bienêtre des animaux. Les douleurs engendrées par les chirurgies seront prises en charge par un antiinflammatoire et un agent morphinique pendant au moins trois jours et jusqu’à ce que les signes de douleur disparaissent. La craniotomie réalisée chirurgicalement au sein de la chambre d’enregistrement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes laminaires fuselées à faible diamètre pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt, et pour augmenter le nombre de neurones récoltés à chaque enregistrement et réduire le nombre de sessions au minimum. La douleur éventuelle induite par le passage de l’électrode sera contrôlée par une anesthésique pulvérisée sur la dure mère. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiquerons comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques et métaboliques. Le poids de l’animal sera contrôlé de façon quotidienne, afin que le contrôle hydrique n’engendre pas de perte de poids significative. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux sont entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire. De plus, la mise en place de points limites précoces nous permet un suivi régulier du stress des animaux.
Choix des espèces
Certaines des aires cérébrales et comportements qui font l’objet de nos expériences ne sont pas exprimés chez le rongeur tels que le cortex cingulaire postérieur qui n'a pas d'équivalent histologique chez le rongeur. Le singe rhésus possède une organisation du système visuel (Fovéa, stéréospie, champ visuel binoculaire large), alliée à un développement du néocortex correspondant, similaire à celui de l'homme.
Etude de l’impact du dysfonctionnement de la connectivité neuronale cérébelleuse sur l’ataxie de Friedreich
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
498 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Une partie subit une chirurgie lourde du crâne de deux heures et demie, pose d'une fenêtre crânienne et injection de virus dans le cervelet, d'autres passent des tests de coordination motrice, pour étudier l'ataxie de Friedreich sur un modèle de souris privé d'une protéine. Le porteur reconnaît une douleur postopératoire possible après la chirurgie du crâne, mais qualifie les tests comportementaux de non invasifs et non stressants. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire en culture des réseaux neuronaux aussi complexes, justifiant le recours à la souris.
Objectifs
L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive des neurones sensoriels. Elle mène à l’apparition de symptômes ataxiques, comme la perte de coordination des mouvements volontaires, mais affecte aussi d’autres organes comme le cœur et le pancréas. L’AF peut être déclenchée par plusieurs facteurs et est due à un déficit de la protéine frataxine (FXN) dans tous les tissus. Un modèle murin a été créé pour comprendre la maladie. Les résultats de nos collaborateurs et de notre laboratoire montrent que le modèle murin utilisé présente les symptômes de l’ataxie et peut donc être un bon modèle pour notre projet. Le projet va se diviser en plusieurs parties. En premier lieu, nous allons caractériser le comportement de ces souris à plusieurs temps, en utilisant des tests non douloureux et sans stress pour les animaux. En parallèle, nous caractériserons les cellules du système nerveux impliquées dans l’évolution de la maladie. La deuxième partie du projet vise à pratiquer de l’imagerie in vivo afin de visualiser l’activité du cervelet. Ceci nous permettra d’observer d’éventuels changements dans les réseaux neuronaux de façon directe chez les animaux. Ceci sera fait avant et après apparition des symptômes. Le dernier axe visera à utiliser les données d’imagerie obtenues précédemment afin de moduler les circuits neuronaux du cervelet par des approches chimiogénétiques. Cette approche consiste à injecter sous anesthésie différents types de récepteurs qui pourront être activés par un composé qui sera distribué dans l’eau de boisson des animaux. Ceci est dépendant des données obtenues précédemment, et notre approche sera adaptée au cours du projet. Nous espérons ainsi compenser les déficits comportementaux et obtenir des données fondamentales pour mettre en place le développement d’une thérapie. Ce projet présente donc deux intérêts majeurs, qui sont en premier la récolte de données fondamentales indispensables à une meilleure compréhension de la maladie, afin que la communauté scientifique puisse en bénéficier, et l’avancée vers un développement d’une thérapie pour traiter les patients atteints de l’AF.
Bénéfices attendus
Ce projet combine plusieurs techniques afin d’obtenir des données les plus complètes possibles sur ce nouveau modèle. En effet, bien que plusieurs modèles aient déjà été générés par le passé, notre modèle murin est celui qui est le plus proche génétiquement de ce qu’il se passe chez le patient, car il présente une quantité de la protéine Frataxine très basse dans tout le corps, dès le développement de l’embryon. Nos approches combinées de comportement, biologie moléculaire et microscopie vont permettre d’avoir une vue d’ensemble des événements responsables de l'évolution de la maladie. Ce projet permettra d'isoler des pistes pour mettre en place un traitement. Nous pourrons partager ces données avec l’ensemble de la communauté scientifique afin que d’autres travaux puissent utiliser ces connaissances et progresser dans la recherche fondamentale et pré-clinique. Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques. De plus, les techniques utilisées pour ce projet pourront être déclinées sur d’autres modèles. Les mécanismes sous-jacents de l’AF sont en cours d’étude et de nombreux éléments ne sont pas encore compris. Ce projet va permettre de rassembler une quantité de données non négligeable dans la compréhension de la maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes : -Tests comportementaux pour la caractérisation neurologique à 3, 6, 9, et 12 mois. 80 animaux au total (10 témoins et 10 mutants par temps). Les tests effectués visent à évaluer la coordination générale des animaux, et ne sont pas invasifs ni stressants. Comme pour toutes les procédures de comportement, les animaux seront habitués à l’expérimentateur pendant plusieurs sessions avant le début des tests. Les tests ont une durée comprise entre 30 secondes et 5 minutes, et une période de repos est prévue entre chaque test. Au total, chaque souris passe au maximum 15min à être évaluée en comportement. Les tests comportementaux seront répétés à 4 temps différents. -Imagerie in vivo à 40j et 150j. 48 animaux au total. Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale unique pour l’implantation d’une fenêtre crânienne et l’injection de virus codant pour des récepteurs activables chimiquement. L’intervention dure 2.5h par souris, et se fait sous anesthésie générale avec suivi vétérinaire quotidien pendant les 10 jours suivant l’intervention. -Modification chimiogénétique des circuits neuronaux cérébelleux par injection de virus codant pour des récepteurs activables chimiquement. 240 animaux au total, injectés à 40j et 150j -80 animaux injectés avec le virus codant pour les récepteurs, activés chimiquement via un produit dans l’eau de boisson (CNO) -80 animaux injectés avec le virus codant pour les récepteurs, qui ne seront pas activés chimiquement -40 animaux injectés avec un virus ne codant pas pour les récepteurs -20 animaux injectés avec le virus codant les récepteurs et traités au CNO -20 animaux injectés avec le virus non codant, traités également au CNO Les 4 premiers groupes seront utilisés pour les tests de comportement décrits précédemment, ainsi que des études histopathologiques. Les 2 derniers groupes seront utilisés pour des études protéomiques. Tous ces animaux seront soumis à l’intervention d’1h décrite précédemment, avec le même suivi vétérinaire.
Impact sur les animaux
Les données recueillies par nos collaborateurs et notre laboratoire montrent que notre modèle murin de l'AF ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois. A partir de 4 à 5 mois, des symptômes légers d’incoordination motrice commencent à apparaître. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs ni stressants, et ne causent donc aucun dommage aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection et d’implantation de fenêtre crânienne est une chirurgie lourde, et les mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires ont été prises en amont. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. Les traitements pharmacologiques pour les animaux concernés se fera via l’eau de boisson, et n’apportera donc aucun stress pour les animaux. Lors des sessions de microscopie, la tête des animaux sera immobilisée sur une courte période de 30min maximum par souris, pour assurer une acquisition optimale des images.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort pour prélever des tissus. Ces prélèvements seront utilisés pour plusieurs types d’analyses moléculaires et histologiques. Il est en effet indispensable de déterminer l’évolution du taux des protéines d’intérêt à plusieurs temps lors de l’étude.
Remplacement
Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques. Tous les animaux sont réutilisés d’un autre projet de notre laboratoire dont l’un des axes vise à étudier le comportement néonatal des souriceaux. Ces 2 projets sont donc complémentaires et permettront l’obtention de données sur toute la durée de vie des animaux. Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l’Ataxie de Friedreich affecte de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. De plus, nous effectuons un marquage de couleur à la base de la queue avec une encre légère non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Pour la prise en charge de la douleur per-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet, comprenant plusieurs molécules, avec la vétérinaire référente de la structure. Pour éviter au maximum de séparer les animaux lors de la phase post-opératoire, nous allons tester un système séparateur de cage qui permettrait aux animaux de se voir, se sentir et d’avoir des contacts sociaux réduits afin qu’ils soient moins stressés lors de cette période critique du projet. Pendant cette période, de l’enrichissement supplémentaire sera fourni pour prévenir toute apparition de comportement stéréotypique, marqueur de souffrance. De plus, un suivi vétérinaire sera effectué quotidiennement pendant 10j, avec une grille de score adaptée et plusieurs types d’analgésiques disponibles pour prévenir toute douleur post-opératoire. Des points limites adaptés à cette chirurgie ont été mis en place afin de prévenir toute souffrance. Ceux-ci comprennent notamment l’évaluation de la consommation d’eau et de nourriture, le toilettage et les mouvements de chaque animal. L’administration de molécules pharmacologiques sera faite via l’eau de boisson, qui sera sucrée pour en masquer le goût. Ceci permettra un traitement sans aucune manipulation supplémentaire, ce qui ne stressera pas les souris.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Ce nouveau modèle va permettre de raffiner l’étude de l’AF car il s’agit du premier modèle disponible qui présente une perte de FXN dans le corps entier. Plusieurs stades de la vie adulte ont été choisis pour ce projet, afin d’avoir une vision globale de la progression de la maladie. La caractérisation neurologique par tests comportementaux se fera à 3, 6, 9 et 12 mois. A 3 mois, les souris ne présentent pas encore de symptômes, mais il est possible que des dégradations neuronales soient déjà en cours. Les 3 stades suivants nous permettront de relier l’évolution des symptômes avec l’état de dégradation du système nerveux central. Pour les expériences d’imagerie in vivo, les animaux seront opérés à 40j puis observés à 70j pour la partie pré symptomatique. Pour la partie post symptomatique, ils seront opérés à 150j et observés à 180j. comme précédemment, ceci nous permet de mesurer les paramètres d’intérêt avant et après l’apparition de la maladie, pour déterminer la gravité des changements qui ont lieu.
Altération de l’activité corticale et maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau, reçoivent des injections pendant sept jours et passent des tests comportementaux, dont un conditionnement par la peur, pour étudier les altérations précoces de la mémoire dans la maladie d'Alzheimer. Le porteur qualifie le conditionnement par la peur de peu stressant en s'appuyant sur des projets antérieurs, et reconnaît un inconfort modéré et une perte de poids possible après la chirurgie. Il affirme qu'aucun modèle in silico ne reproduit le cerveau entier et que seule la souris réunit les critères recherchés.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie progressive, mortelle et est la cause principale de syndrome démentiel et en représente au moins deux tiers des cas la plus courante. MA commence bien avant le stade démentiel par l’apparition de troubles cognitifs donc le diagnostic précoce est un objectif important pour la recherche préclinique et clinique sur la MA. Il peut représenter une fenêtre thérapeutique critique où les interventions peuvent être initiées avant que ne se produise un déclin cognitif sévère. Une accumulation de peptide bêta-amyloïde (Aß) dans le cortex préfrontal est corrélée à un oubli rapide. Ensable, ils constituent un symptôme précoce de la MA qui peut être détecté par des mesures d'évaluation cognitive expérimentale et clinique bien avant l'apparition d'une démence sévère. En effet, les déficits d'apprentissage et de mémoire sont parmi les premiers symptômes rapportés par les familles de patients. Aβ a des effets sur les signalisations impliquées dans la régulation des diverses formes de plasticité corticale et donc la formation de la mémoire. L'objectif de notre projet actuel est d'aboutir à une meilleure compréhension des processus neurobiologiques qui sous-tendent les mécanismes sous-jacents de la formation de mémoire altérée aux premiers stades de la maladie. Nous proposons d'explorer les altérations corticale en tant que marqueur précoce de l'oubli anormal dans la MA.
Bénéfices attendus
La diagnose précoce de la maladie d`Alzheimer est l'étape la plus importante dans l'identification : i) de l'altération cérébrale initiale et par conséquent ii) des thérapies possibles. L'oubli précoce pourrait représenter une cible pour des études précliniques visant à prévenir ou retarder l'apparition de formes plus sévères de la MA. Notre projet vise à relier l'oubli précoce aux changements moléculaires responsables de l'altération de l'activité corticale en offrant une nouvelle voie pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent les interventions chirurgicales (< 40 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportementale se compose de deux épreuves, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque épreuve dure 6 à 7 minutes). Ils reçoivent également des injections pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent un ou deux brèves procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces procédures sont un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Les autres procédures expérimentales de ce projet comprennent des tests comportementaux : conditionnement par la peur (CdP) et procédure sans reveil. Le conditionnement par la peur peut être un événement stressant pour les souris. Afin de réduire le stress, nous gardons le groupe d'animaux en cage, ce qui leur permet d'exprimer leur comportement social naturel et nous permet de suivre le toilettage mutuel et la nidification des animaux après l'exécution de la tâche. Les projets précédents qui ont utilisé cette tâche comportementale ont montré que les animaux expriment leur comportement naturel dans les 15 minutes qui suivent la tâche, ce qui signifie que cette procédure n'entraîne pas une augmentation significative du niveau de stress. Le test est également effectué dans une pièce différente, avec des odeurs différentes de celles de la cage, afin de désactiver le lien entre la cage d'origine et l'événement redoutable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.
Remplacement
Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la mémoire dans le néocortex et leur changement dans MA. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) adapté à la réalisation de tests cognitif, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) qui se prête facilement à la modification de son génome, v) possédant un néocortex, vi) adapté aux approches expérimentales invasives. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possibles. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent à tous ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et par conséquent ne sont pas adaptés à l'objet de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones et leur altération dans MA. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas la modélisation au niveau du cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.
Réduction
Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : Selon les caractéristiques de nos données (normalité, variance, cohérences avec les critères de chaque test), nous appliquons les tests statistiques. Selon les caractéristiques de nos données certains tests supplémentaires seront effectués.
Raffinement
i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Manipulation quotidienne des animaux avant les expériences pour réduire le niveau de détresse. iv) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que NC3R. vii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives avec l'enrichissement et le matériel pour la nidification.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquant la production d’amyloïde beta. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier le génome et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés au niveau comportemental et moléculaire. Selon les données précédemment rapportées et les données sur le développement de la pathologie, nous les utilisons à l'âge auquel les animaux commencent à développer les premiers signes de la maladie avant l'apparition de la maladie grave.
Evaluation in vivo de la biocompatibilité et de la dégradation de polymères à visée thérapeutique chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
2 588 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des disques de polymère leur sont implantés sous la peau ou dans un muscle sous anesthésie, puis les rats sont gardés de un à vingt-quatre mois avant mise à mort pour analyser la dégradation et la tolérance des matériaux. Le porteur ne décrit que des effets transitoires, léthargie, douleur et perte de poids après l'opération. Il affirme que les tests in vitro ne suffisent pas à reproduire les propriétés d'un organe entier et présente l'étape in vivo comme un préalable à l'implantation chez l'humain, sur l'un des effectifs les plus élevés du lot.
Objectifs
La réparation tissulaire conventionnelle par chirurgie implique l’utilisation de sutures, d’agrafes ou autres techniques utilisant des points d’ancrage qui induisent un traumatisme supplémentaire au tissu. Ces techniques peuvent engendrer une inflammation et de la fibrose à l’origine d’effets délétères sur la réparation, notamment fonctionnelle, des tissus, et sur la qualité de vie du patient. Ces techniques constituent pourtant, faute d’alternatives satisfaisantes, les méthodes de référence pour la réparation chirurgicale des tissus. L’objectif de notre laboratoire est de développer des systèmes de réparation sans sutures qui pourront être utilisés dans la réparation de tissus. Des dispositifs sous forme d’implants et de colles chirurgicales sont développés pour différentes applications de la réparation des nerfs périphériques aux hernies abdominales. Les formulations d’adhésifs et d’implants développées à ce jour ont démontré une efficacité pour restaurer la fonction de certains tissus avec une grande biocompatibilité. Pour étendre les indications possibles pour la réparation des tissus, notre laboratoire développe de nouvelles formulations de polymères applicables à de nouveaux tissus. Le développement de ces systèmes de réparation nécessite de caractériser le comportement in vivo des matériaux qui les constituent, notamment en termes de biocompatibilité et dégradation. Pour cela, les différents matériaux seront synthétisés sous forme de disques qui pourront être implantés chez l’animal en sous-cutané (dégradation) ou en intramusculaire (biocompatibilité). Les disques seront analysés avant implantation, puis à différents temps après implantation pour déterminer leur dégradation et leur biocompatibilité au cours du temps. Ces informations sont cruciales pour caractériser nos produits avant implantation chez l’Homme. Afin de réaliser cet objectif, le rat a été choisi comme modèle expérimental pour sa pertinence. Nous intégrerons, au maximum, 2588 rats dans l’étude sur une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider au niveau préclinique le comportement de nos polymères, notamment en termes de biocompatibilité et de dégradation. Ce projet fait partie de l’étape de recherche et validation de produits qui seront implantés dans le corps humain, qui permettra de réduire le risque pour le patient.
Procédures
Les animaux seront soumis à une implantation sous-cutanée ou intramusculaire de disques de polymère effectuée sous anesthésie et analgésie (durée de la chirurgie 30 minutes). Les animaux seront ensuite maintenus et suivi durant une période comprise entre 1 mois et 24 mois selon les groupes et euthanasié selon une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Les deux procédures nécessitent un geste chirurgical réalisé sous anesthésie générale. L’anesthésie est associée à un risque d’hypothermie et d’assèchement de la cornée. La procédure va engendrer une léthargie et une douleur transitoires pouvant être à l’origine d’une perte de poids post-opératoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure pour des analyses post-mortem destinées à évaluer la dégradation et la biocompatibilité des disques de polymère.
Remplacement
De nombreux tests ont été réalisés ex vivo et in vitro pour obtenir un maximum de données préliminaires et sélectionner les polymères les plus prometteurs pour une utilisation in vivo. Malheureusement, ces études ne peuvent pas suffire car ces modèles ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Le présent projet in vivo consiste à caractériser la biocompatibilité et la dégradation des polymères in situ dans un individu intégré et autonome pour permettre un développement optimal pour la clinique.
Réduction
Au maximum, 2588 rats seront intégrés dans l’étude. Nos dispositifs ont subi une batterie de tests préalables. Seuls les implants et colles les plus prometteurs ont été sélectionnés pour un passage sur l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. 3 à 4 disques seront implantés chez un animal en sous-cutané et 1 en intramusculaire. Au cours de l’étude les résultats intermédiaires seront analysés et pourront permettre d’écarter d’autres formulations. La taille des groupes expérimentaux a été définie à l’aide d’un test statistique de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en utilisant le moins d’animaux possible (n=8 animaux exploitables par groupe). Les résultats seront également analysés par un test statistique.
Raffinement
Les rats seront hébergés en cages individuellement ventilées (2 rats/cage), en milieu enrichi par des tunnels et des balles en bois avec eau et aliments à volonté. La température et l’hygrométrie seront contrôlées. Une période de stabulation réglementaire minimale d’une semaine sera respectée entre l’arrivée des animaux et le début de la procédure pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement et ainsi de limiter leur stress. Une étape de socialisation sera mise en place pour habituer les rats à la préhension et réduire leur stress avant la procédure. Les gestes expérimentaux seront pratiqués par du personnel qualifié avec une anesthésie et/ou une analgésie adaptée à la nature et à la durée du geste. Une pesée des animaux sera réalisée 24h après la chirurgie pour évaluer la récupération de l'animal. Si nécessaire, un complément gélifié et/ou des granules humidifées seront déposés directement dans le fond de cage pour faciliter la prise alimentaire (1 pot par cage). Des graines de tournesol seront ajoutées à l'alimentation ususelle pour diversifier l'enrichissement. Suivi tout au long de l'étude: suivi quotidien. Une grille de score et des points limites seront mis en place.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour des protocoles de chirurgie. De plus, la taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison avec d’autres espèces mammifères telles que porc ou brebis. De plus, leur taille, comparée à celle de la souris, permet plus aisément de pratiquer un acte chirurgical fin. Enfin, la composition de la matrice extracellulaire des humains et des rongeurs est très similaire. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude (une période d’acclimatation minimale de 7 jours sera respectée avant le début des expérimentations). Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. L’efficacité de nos systèmes de réparation tissulaire est testée sur des animaux adultes du même âge. Pour assurer une reproductibilité des résultats, l’étude de biocompatibilité/dégradation est réalisée au même âge. De plus, les animaux seront jeunes et auront donc une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement ce qui est un critère important pour notre projet qui implique un suivi sur 24 mois pour certains groupes expérimentaux.