Procédures modérées

219 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque hamster est hébergé seul seize semaines en conditions hivernales, exposé au froid à 8 °C pour entrer en hibernation, et subit deux chirurgies, la pose d'un capteur de température puis d'une pompe diffusant des hormones, la moitié des animaux étant en plus castrés. Le porteur indique que des injections pratiquées pendant la torpeur peuvent provoquer une douleur aiguë et le réveil de l'animal, et que la castration peut entraîner une hémorragie et des douleurs supplémentaires. Il affirme que l'hibernation met en jeu l'organisme entier et qu'aucun moyen de substitution ne permet de la modéliser, justifiant le recours au hamster syrien.

Objectifs

L’hibernation est une adaptation physiologique et comportementale qui permet la survie de l’espèce pendant les périodes saisonnières défavorables (en hiver : température extérieure basse et pénurie des ressources alimentaires). Tout au long de l’hibernation, afin d’économiser de l’énergie, l’animal va réaliser des cycles d’éveil/sommeil, alternant entre des phases actives avec une température corporelle à 37°C et des épisodes de torpeur, caractérisés par un endormissement profond associé à une hypothermie corporelle sévère. La température corporelle s’ajustant sur les températures extérieures froides de l’hiver peut descendre à 5°C. Des travaux antérieurs suggèrent que les hormones thyroïdiennes du cerveau seraient impliquées dans ces processus d’hibernation. Nous allons vérifier cela chez une espèce hibernante : le hamster syrien.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet concernent les connaissances obtenues en recherches fondamentales sur le système nerveux central, le métabolisme ainsi que sur la biologie d'un animal hibernant.

Procédures

Les hamsters syriens seront hébergés seul pendant 16 semaines dans des conditions où les jours sont courts comme en hiver mais également exposés au froid afin d'obserser les comportements hibernatoires des animaux. Les animaux subiront deux actes chirurgicaux à 2 semaines d'intervalle. Le premier acte durera moins d'une heure 1 h pour l'insertion d'un capteur télémétrique de température corporelle, permettant le suivi à distance de l'hibernation des animaux. Le deuxième acte, d'une durée de 2h30 maximum pour la mise en place d'une mini-pompe diffusant des hormones. Ils seront exposés au froid (8°C) pour entrer en hibernation. Lors d'utilisation de pompe rechargeable, des injections transcutanées sont réalisées en phase de torpeur (animaux profondément endormis). Une castration est ajoutée à la première chirurgie pour la moitié des animaux. L'évolution de l'hibernation des animaux est surveillée pendant 6 semaines environ.

Impact sur les animaux

Lors des chirurgies, l’anesthésie générale peut induire une hypothermie, de la sécheresse occulaire et une légère déshydratation. Au niveau du site d’incision, il y a des risques de douleur, d’inflammation et d’infection de la plaie. Une perte de poids légère (inférieure à 5%) sur 24h est attendue, mais devrait être transitoire. Elle pourrait se maintenir en cas de complications post-chirurgicales (inflammation, infection, douleur). L’insertion de la pompe sous la peau du dos pourrait éventuellement gêner la motricité de l’animal (encombrement, frottements) si celle-ci est trop proche du cou ou des membres antérieurs. Dans le cas d'utilisation de la pompe rechargeable, lors d'un épisode de torpeur, des injections transcutanées sont réalisées et peuvent induire une douleur aigüe légère et son réveil. La castration peut induire une hémorragie et de douleurs supplémentaires.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements en fin d'expérience.

Remplacement

L’expérience doit être réalisée sur l’animal entier. Les processus impliqués dans l’hibernation font intervenir l’ensemble de l’organisme, aussi est-il impossible, en l’état actuel de nos connaissances, de réaliser une telle étude sur des organes isolés. Aucun moyen de substitution ne permet de modéliser les différentes étapes de l’hibernation et les processus liés à chaque étape ni les relations entre les organes périphériques et le cerveau.

Réduction

Le nombre d'animaux (8 par groupe) a été calculé pour obtenir des résultats statistiquement robustes et de faible variance pour comparaisons inter-groupe.

Raffinement

Pour éviter les agressions dans les jours courts comme en hiver, les animaux seront hébergés en cages individuelles enrichies avec de la frisure de nidation et un bâton à ronger. Lors des chirurgies, les animaux bénéficieront d'une anesthésie générale et d'analgésiques locaux. La température corporelle sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Un anti-inflammatoire non stéroïdien sera administré en post-chirurgie. La longueur du cathéter entre la canule et la pompe est tout particulièrement ajustée afin de pas gêner le hamster syrien dans ses mouvements. Des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est le hamster syrien (Mesocricetus auratus) car c’est un animal hibernant. Les animaux sont des adultes mâles (entre 3 et 9 mois ; poids corporel moyen 120 g) car notre expérience requiert qu’ils soient sexuellement matures et ce sexe nous permet de voir facilement si le système reproducteur de l'animal est activé ou inhibé grâce à la taille des testicules.

1 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de deux jours sont infectés par la bactérie Bacillus cereus puis traités par injection, et sont tués au bout de 48 heures avec les mères, susceptibles d'avoir été contaminées. Le porteur indique que l'infection provoque une baisse d'activité, une pâleur, puis le rejet par la mère et l'absence d'alimentation, la survie des animaux étant le critère suivi. Il affirme avoir déjà testé les composés in vitro mais conclut à la nécessité de vérifier l'effet dans un modèle d'infection vivant.

Objectifs

L’identification d’un nombre croissant de cas d’infections dues aux bactéries du groupe Bacillus cereus sensu lato, pathogène opportuniste (ne causant en général pas de maladie chez les personnes en bonne santé) présent dans l’environnement, représente un problème majeur en santé publique. Il s’agit de la 3ème cause d’intoxications alimentaires dans le monde (Autorité Européenne de Sécurité des Aliments : EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). EFSA J, 2016), et de plus en plus de travaux font aussi état d’infections fatales chez le nouveau-né prématuré. Le traitement antibiotique de référence contre ces infections à Bacillus cereus consiste en une association vancomycin/aminoglycoside. Cependant, la recherche d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place serait un plus dans la prise en charge de ce type d’infections. Ce projet devrait permettre de répondre à la question de l’EFSA et de l’ANSES (Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l'Alimentation de l'Environnement et du Travail) sur les risques en santé publique, des bactéries du groupe Bacillus cereus et permettre la mise au point de nouveaux traitements contre ce type d’infection.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Bacillus cereus. S’il existe un traitement antibiotique de référence contre ce type d’infection chez le nouveau-né prématuré, la découverte d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.

Procédures

Aucune intervention ne sera effectuée sur les femelles gestantes avant, pendant ou après mise bas. Les souriceaux de 2 jours seront infectés par voie intrapéritonéale, puis, une heure plus tard, traités par injection par voie intrapéritonéale. Le temps nécessaire à l'infection ou au traitement, par voie intrapéritonéale, n'excéde pas 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux liés à l'infection en général, à savoir principalement chez les souriceaux, baisse de l'activité, pâleur, pouvant aboutir au rejet par la mère et à l'absence d'alimentation, visualisée par l'absence de lait dans l'estomac. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées dans un précédent projet. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux traités avec une solution saline.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au bout des 48 heures de la procédure, les souriceaux ayant été infectés et/ou traités avec différents composés chimiques et les femelles gestantes après mise bas ayant pu être contaminées par les souriceaux infectés.

Remplacement

Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cultures de Bacillus cereus et les concentrations minimales inhibitrices déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre sera calculé en tenant compte de nos résultats d'un précédent projet. Il pourra être réduit encore en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

En termes de raffinement, afin de garantir le bien-être des souris, celles-ci seront hébergées dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). Également, ce projet fait suite à un précédent projet au cours duquel les doses infectantes ont été déterminées. Après infection et après traitement avec les composés, les animaux seront surveillés quotidiennement (aux temps 2 heures post infection et 1, 2, 4, 6, 8, 24 et 48h post traitement) par les responsables du projet et par le personnel animalier, permettant de détecter toute apparition de signes de souffrance durables non reliés à l’infection et pouvant être dus à une mauvaise injection. Le cas échéant, les animaux concernés seraient immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Ce modèle est celui que nous avons utilisé dans nos études précédentes dans un modèle de bactériémie à Escherichia coli chez la souris, dans un modèle murin de bactériémie induite au cours d'une pneumonie à Staphylococcus aureus et dans un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa. Plus précisément, ce modèle d'infection chez la souris C57Bl/6JRj nouveau-née est celui que nous avons utilisé par ailleurs dans l'étude de l'infection à Bacillus cereus chez le nouveau-né prématuré. Les animaux utilisés seront des souriceaux nouveau-nés de 2 jours, afin de coller au plus prés aux cas d'infections fatales observées en clinique chez le nouveau-né prématuré.

31 macaques à longue queue vont être utilisés, une partie tuée à l'issue pour nécropsie et l'autre réutilisée dans de nouvelles procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des anesthésies répétées, plusieurs fois par semaine, pour des séances d'imagerie pouvant durer huit heures, des administrations dans le nez sous anesthésie, des prises de sang jusqu'à quatre fois par semaine et des ponctions lombaires, afin de valider un dispositif d'administration de médicaments par le nez chez le nouveau-né humain. Le porteur qualifie l'administration de peu traumatique tout en reconnaissant un possible manque d'appétit, de la fatigue et une irritation de la narine. Il affirme avoir d'abord testé un moule en trois dimensions mais présente le recours à l'animal vivant comme "indispensable", le macaque cynomolgus ayant selon lui les cavités nasales les plus proches de celles d'un nouveau-né humain.

Objectifs

Cette demande s’inscrit dans le cadre d’un projet international, qui implique 4 partenaires. Elle vise à développer un dispositif biomédical innovant d’administration de médicaments au niveau du système nerveux central chez le nouveau-né humain en utilisant la voie de transport directe de la cavité nasale au cerveau et en contournant la barrière hémato-encéphalique. Ce nouveau dispositif doit permettre de cibler très précisément la lame criblée, une zone perméable entre le nez et le cerveau, et ainsi d’améliorer l’efficacité thérapeutique de l’administration intranasale, jusqu’à présent moindre que par les voies systémiques (intraveineuse ou intramusculaire). Le projet prévoit le développement de candidats thérapeutiques, le développement d’un système d’administration intranasale chez le nouveau-né humain, et des essais précliniques qui permettront d’évaluer à la fois les candidats médicaments et le dispositif d’administration. Le dispositif en cours de développement chez notre partenaire sera pratique, sûr, devra être adapté à l’anatomie des nouveau-nés, aux pratiques cliniques actuelles des néonatologistes, ainsi qu’aux produits biologiques, des anticorps monoclonaux à la thérapie cellulaire. Dans ce projet, nos objectifs sont : -de valider le dispositif innovant d’administration intranasale dans un modèle primate non-humain (PNH) -d’évaluer l’innocuité du dispositif d’administration dans notre modèle PNH -d’étudier la biodistribution des produits administrés chez le PNH.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de développer et faire progresser l’administration intranasale de produits biologiques chez le nouveau-né humain grâce au développement d’un nouveau dispositif biomédical et sa validation préclinique dans un modèle PNH. L’efficacité de l’administration sera validée et caractérisée par la mesure de la molécule d’intérêt au plus près de la zone ciblée dans le cerveau (méninges…). À court terme, nous développerons une technologie innovante de marquage des cellules souches par le complexe 89Zr-oxine pour permettre le suivi spatio-temporel de cellules par une technique d’imagerie non invasive, le PET-CT scan, sans avoir recours à l’euthanasie. Ainsi grâce à cette technique, nous pourrons suivre en temps réel la position des cellules dans les primates. Grâce aux propriétés lipophiles du complexe 89Zr-oxine, qui s’insère dans la membrane plasmique, ce type de marquage pourra s’appliquer ensuite à tous types de cellules. L’étape de validation du dispositif d’administration demeure un prérequis nécessaire avant d’envisager l’évaluation de candidats thérapeutiques et des essais cliniques chez des humains nouveau-nés souffrant d'encéphalopathie hypoxique-ischémique.

Procédures

Lors de chaque intervention, les animaux seront anesthésiés afin d’éviter tout stress ou douleur. Chez les premiers animaux un radiotraceur classiquement utilisé chez l’humain sera administré pour caractériser et localiser le dépôt intranasal en utilisant le nouveau dispositif médical. Ce radiotraceur sera visualisé par imagerie à différents temps pour valider le dispositif et affiner le mode opératoire. La séance d’imagerie durera au maximum 8h avec la possibilité de faire un suivi dynamique de la molécule durant les trois premières heures. Deux autres sessions courtes d’une heure maximum pourront être programmées dans la même journée. Cette séquence d’imagerie pourra être réitérée 2 fois, espacées de 7 jours minimum. Le deuxième groupe d’animaux recevra les cellules souches radiomarquées utilisées comme traitement potentiel (administration simple ou multiple sur un temps de 30 minutes maximum). La migration de ces cellules sera observée par imagerie pendant 2 semaines maximum en fonction des résultats obtenus, avec 3 sessions possibles le jour de l’administration comme décrit précédemment pour le radiotraceur classique, et un maximum de 10 sessions. En parallèle, des échantillons de sang seront prélevés au maximum 4 fois par semaine pour monitorer les effets cliniques (durée 20 minutes). Des prélèvements lombaires seront possibles, au maximum 3 fois par animal avant ou après l’administration de cellules (durée 30 à 45 minutes). Enfin, nous traiterons 4 animaux avec chaque candidat ce qui durera 30 minutes maximum et nous procéderons à une euthanasie pour une nécropsie extensive afin de déterminer la biodistribution exacte de chaque candidat après administration intranasale. Pour chaque animal, nous pourrons procéder 2 fois à des prélèvements de sang, des prélèvements du tractus respiratoire et à des lavages broncho-alvéolaires ainsi que des ponctions lombaires le tout durera au maximum 1 heure.

Impact sur les animaux

Lors de la procédure expérimentale, les animaux seront anesthésiés plusieurs fois par semaine et certaines anesthésies pour les séances d’imagerie seront relativement longues, ceci pourra induire un manque d’appétit et de la fatigue pour les animaux. L’administration intranasale sera faite sous anesthésie et est peu traumatique mais elle pourrait induire un stress et possiblement une petite irritation (introduction d’un cathéter dans la narine).

Devenir

Les animaux utilisés pour suivre par imagerie le dépôt du radiotraceur ou la migration de cellules souches marquées pourront être inclus dans de nouvelles procédures après examen et validation par un vétérinaire. En effet, aucune séquelle n’est a priori attendue suite à ces traitements. Une partie des animaux sera euthanasiée afin de caractériser la biodistribution des candidats thérapeutiques. Dans tous les cas, l’état clinique des animaux sera étroitement surveillé, et une euthanasie sera envisagée en cas de dégradation pour éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Dans une première partie du projet, un modèle de moule en 3 dimensions de la partie supérieure d’un PNH a été conçu pour tester le dispositif d’administration par voie intranasale développé par notre partenaire. Des ajustements du dispositif d’administration ont ainsi pu être réalisés sur ce modèle de moule en remplacement des PNH. Le modèle 3D permettra de plus de déterminer la position optimale du PNH lors des interventions pour déposer la solution contenant le composé d’intérêt au plus près de la lame criblée. Toutefois, nous devrons valider le dispositif sur les animaux grâce au dépôt d’un composé radioactif utilisée en clinique chez l’homme. Le recours à des animaux vivants reste indispensable, aucun modèle ne représentant que partiellement un organisme ne pouvant mimer les muqueuses et les échanges entre le nez et le cerveau, ni ensuite la biodistribution dans le cerveau.

Réduction

Malgré des données encourageantes de notre partenaire sur des PNH juvéniles d’une autre espèce, cette étude reste assez précoce et nous ne disposons pas de données chez l’espèce qui sera utilisée ici. Nous envisageons de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans notre étude, tout en nous assurant de la fiabilité de nos résultats pour valider nos hypothèses. Dans un premier temps, nous prévoyons de tester le mode d’administration sur 3 PNH pour valider le ciblage de la lame criblée. En cas d’échec et après modification du système, le dispositif d’administration sera à nouveau testé sur 3 PNHs, avec un maximum 3 cycles de tests, soient 9 PNH pour cette phase. Dans un second temps, afin de développer la technique et le marquage des cellules, les tests seront réalisés sur 5 groupes de 2 PNH. Après validation de la technique de marquage, une même préparation de cellules marquées sera inoculée à 2 animaux. Pour répondre à cette dernière question, des sous-groupes de 4 animaux seront constitués, avec administration du même candidat médicament et euthanasie au même moment afin d’obtenir des données de biodistribution solides.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera réalisé sur des animaux anesthésiés. Nous serons très vigilants lors des anesthésies répétées au cours d’une même semaine et avons un système d’alerte automatique via notre base de données en cas de perte de poids supérieure à 10% en 15 jours ainsi que pour les analyses sanguines anormales. Lors des sessions d’imagerie, un soin particulier sera apporté au confort de l’animal et notamment au maintien de sa température corporelle par tapis chauffant, et de son hydratation par perfusion. Les animaux seront monitorés en continu pour différents paramètres (oxymétrie, fréquences cardiaque et respiratoire, pressions artérielle, température rectale). Un suivi vétérinaire est en place et l’arrêt de l’expérimentation sera décidé en cas d’observation d’une anomalie sur l’un des paramètres surveillés durant l’anesthésie (hypothermie, hypotension, arythmie etc). Les animaux seront surveillés quotidiennement et tous les cas décrits ensuite seront rapportés à un vétérinaire. Toute modification de comportement comme une agitation ou une apathie sera remontée. Nous suivrons le poids et la température de chaque animaux et les variations déclencheront une alerte automatique grâce à un logiciel de suivi quotidien. A chaque alerte, un examen clinique approfondi sera alors réalisé afin d’évaluer les chances de survie de l’animal et de procéder à une euthanasie précoce si nécessaire.

Choix des espèces

Le modèle de PNH macaque cynomolgus a été sélectionné pour plusieurs raisons : -Il représente (avec le babouin) l’espèce dont les cavités nasales sont les plus proches de celles de l’humain. Il est indispensable de mener l’étude sur un modèle dont les cavités nasales proches de celles d’un nouveau-né, ce qui est le cas des macaques cynomolgus âgés de 2 à 4 ans, qui présentent une taille et un poids comparables à ceux d’un nouveau-né humain. Des analyses morphologiques à partir de scan de macaques et de babouins, nous ont permis de visualiser que la cavité nasale la plus comparable à l’homme est celle du macaque cynomolgus. -Pour étudier le passage de molécules/cellules du nez vers le cerveau via la lame criblée, le modèle doit se rapprocher au maximum du cerveau et des tissus muqueux humains. -Notre partenaire a déjà montré un passage possible du nez vers le cerveau dans un modèle de PNH. Dans cette étude, des animaux adultes de 2 ans minimum seront utilisés, pour leur poids semblable à celui d’un nouveau-né humain. Nous utiliserons préférentiellement des animaux jeunes de 2 à 4 ans dont la morphologie de la tête est très proche de celle d’un nouveau-né humain,

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après la pose d'un implant sous anesthésie, elles subissent une restriction d'eau à un millilitre par jour et une contention tête fixée trente minutes par jour pendant environ trente jours, avant d'être tuées pour un contrôle du cerveau. Le projet étudie les bases cérébrales du choix entre exploration et exploitation, le porteur mettant surtout en avant la visibilité internationale attendue. Il affirme que ces mécanismes ne s'étudient que chez l'animal vigile en situation de choix, sans modèle in vitro possible.

Objectifs

La prise de décision est un processus crucial qui régit chacun de nos comportements les plus évolués. Tandis que nous apprenons de notre environnement et prenons des décisions sur la base de ces connaissances, nous conservons également la capacité d’adapter notre comportement face aux modifications soudaines de l’environnement. Cette adaptation serait favorisée par l’équilibre entre les comportements d’exploitation (c'est-à-dire l'utilisation des connaissances déjà disponibles pour obtenir un gain connu) et ceux d’exploration (c'est-à-dire la recherche d’options plus favorables). Cette hypothèse résulte des études cognitives menées chez l'homme, les primates non humains et les rongeurs. L’objectif général de ce projet est d’étudier les mécanismes cérébraux responsables de la transition entre comportements d’exploitation et d’exploration chez la souris. De nombreuses structures corticales et sous-corticales pourraient participer à ce phénomène. En particulier, des recherches récentes proposent que le cortex moteur secondaire (M2) des rongeurs constitue un nœud critique permettant le contrôle flexible des actions volontaires. Ce constat est étayé par la spécificité de cette structure ayant un rôle démontré dans les comportements flexibles. Ce projet vise donc à éclairer le rôle du M2 pour décider quand explorer ou quand exploiter l'environnement. Pour cela, nous utiliserons l’imagerie cérébrale des structures d’intérêts lorsque la souris est soumise à un test comportemental permettant de quantifier les comportements d’exploitation et d’exploration. Enfin, nous testerons le rôle causal des connexions neuronales identifiées pendant l'exploration et l'exploitation en effectuant des manipulations sélectives des différentes voies sous-corticales.

Bénéfices attendus

Cette étude est avant tout un projet de science fondamentale visant à comprendre les principes neuronaux permettant l’adaptation de la prise de décision dans des environnements changeants. Ce champ de recherche est en effet devenu un domaine extrêmement compétitif au niveau international, et pourtant n'est que faiblement représenté en France. Ce projet améliorera significativement la visibilité internationale de la recherche académique française et placera le porteur en position de force pour réévaluer les rôles complexes des régions motrices et leur connexions aux régions corticales. Au-delà de cet aspect fondamental, ce projet possède une forte composante translationnelle. En effet, l'accent mis sur l'exploitation-exploration des actions volontaires est central dans les neurosciences cognitives, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre efficacement le compromis exploitation-exploration est une caractéristique frappante de plusieurs troubles mentaux.

Procédures

1) Anesthésie chimique sans chirurgie pour la procédure 1 d'implantation. Elle sera realisée une seule fois par souris, pour une durée maximale d'une heure. 2) Restriction hydrique (1 ml/ jour) et contention « tête-restreinte » (30 min/jour) pendant environ 30 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

1) Anesthésie chimique sans chirurgie pour la procédure 1. 2) Restriction hydrique (1 ml/ jour) et contention « tête-restreinte » (30 min/jour) pendant environ 30 jours consécutifs. Ces nuisances sont indispensables pour l’imagerie biphotonique et motiver les souris à la tâche expérimentale.

Devenir

A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort. Il est nécessaire de réaliser des contrôles histologiques ou des expériences d’immunohistochimie sur les cerveaux fixés afin de valider les coordonnées des sites d’injection des virus et des sites d'enregistrement.

Remplacement

L’étude des mécanismes de la prise de décision est un enjeu sociétal et économique majeur des neurosciences modernes, comme le relèvent de nombreuses situations humaines inadaptées (prise de risque, addiction au jeu, compulsivité, troubles psychiatriques). Par définition, ces mécanismes ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision et permettra de jeter les bases d'études plus appliquées.

Réduction

La nature innovante des méthodes utilisées (imagerie biphotonique chronique, et optogénétique chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l’expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre des animaux. En effet, certains tâches dans les procédures mettent en jeu des techniques non invasives et non douloureuses qui seront réalisées de façon quotidienne pendant le comportement chez le même animal. Ces techniques modernes permettent donc de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient être le résultat d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques pairés sur la base des données préliminaires déjà obtenues (moyenne et ecart-type) afin de satisfaire les conditions statistiques de puissance et de significativité (puissance (beta) de 0.8 et un seuil de significativité (alpha) de 0.05).

Raffinement

Les compétences techniques et expérimentales du porteur du projet sont reconnues internationalement, comme prouvé par la qualité élevée des financements obtenus faisant suite à une évaluation exhaustive du projet par de multiples comités d’expert scientifique du domaine scientifique, et garantissent la qualité des procédures expérimentales et de leur raffinement (habituation des animaux, optimisation du comportement et des techniques d’enregistrement, points limites, …). Le projet ne comprend pas de chirurgies. Cependant, la procédure d’implantation, bien que non invasive et non douloureuse se fera malgré tout sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les animaux ne sont jamais isolés mais maintenus en groupe sociaux (5 par cage avec nourriture adaptée et enrichissement : nid, maison et tunnel) et manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée (2 fois par jour) après la restriction hydrique. Des points limites spécifiques suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux : 1) Déshydratation (persistance au test de pli) et/ou perte de poids supérieur à 25 % du poids mesuré au jour 1 avant restriction ; 2) Infection de l’implant (plaie purulente, rougeur, tuméfaction, abcès) ; 3) Qualité de l'implant (perte ou dégradation) ; 4) Neurologie (tremblements, ataxie marquée, tête penchée, crises convulsives). Ces points sont vérifiés deux fois par jour selon un tableau de suivi simplifié (absence/présence) permettant la mise en place de mesures rapides et ciblées (et d’arrêt si nécessaire) si ces points sont observés, respectivement : 1) arrêt immédiat de la restriction hydrique et sortie du protocole le temps nécessaire pour une prise de poids ; 2) analgésie générale (Buprenorphine) pendant 3 jours ; 3 et 4) euthanasie immédiate.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux qui nous intéressent ici (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine sans avoir recours à des primates non-humains. Les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris seront donc largement transférables à l'homme, et permettront de mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision en général tout en jetant les bases d'études plus appliquées chez les humains. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Toutes tuées pour la collecte de leurs tissus, 320 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit sous anesthésie une injection de cellules de mélanome sous la peau, et certaines reçoivent un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines, en injections faites sans anesthésie. Selon le porteur, la tumeur peut s'ulcérer et les injections répétées dans l'abdomen causer une douleur. Il écrit que l'anticorps a déjà freiné en partie le mélanome chez des souris dépourvues de système immunitaire, qu'il a passé des tests de toxicité et vient d'entrer en essai clinique pour d'autres pathologies. Il affirme que l'approche, validée in vitro, appelle maintenant "une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l'humain".

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du mélanome. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du mélanome dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer de la peau. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer de la peau de type mélanome est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses de mélanomes. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8-10 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

Pour décrire l'inflammation du cerveau liée aux lésions de la maladie d'Alzheimer et tester un anti-inflammatoire, 39 microcèbes, des primates prosimiens, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin du projet. Chacun subit une inoculation dans le cerveau, lors d'une intervention de deux heures, de composés qui induisent ces lésions ou de composés témoins, cinq IRM de trois heures sous anesthésie, cinq prises de sang et des tests de mémoire et de saut, et 13 d'entre eux reçoivent pendant six mois un anti-inflammatoire mêlé à de la compote. Le porteur écrit que ces tests peuvent entraîner "une angoisse pour un animal qui réalise que sa mémoire est déficiente". Il annonce des points limites "pour limiter la douleur" sans en décrire aucun.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives. Elle est caractérisée par des pertes de mémoires suivies au cours des années par des troubles cognitifs plus généraux et handicapants. La mort des neurones est liée à l'accumulation dans le cerveau de protéines pathologiques (on les appelle lésions de la maladie d'Alzheimer). Elle est associée à une inflammation du cerveau. Cette dernière est désormais établie comme un régulateur clé de la maladie, mais la nature des interactions entre l'inflammation et la maladie d'Alzheimer n'est toujours pas claire. Il est possible d'induire les lésions de la maladie d'Alzheimer chez un modèle primate non-humain. Notre hypothèse de travail est que la description de l'inflammation en réaction aux lésions de la maladie d'Alzheimer chez un modèle primate non-humain fournira de nouvelles connaissances inestimables vers de futures thérapies contre la maladie d'Alzheimer. Ce projet vise à répondre à deux interrogations scientifiques. 1. Décrire le processus inflammatoire associé aux lésions d'Alzheimer induite chez un primate. 2. Évaluer l'impact sur la maladie d'Alzheimer d'un traitement anti-inflammatoire. Globalement, ce projet permettra de mieux comprendre la maladie d'Alzheimer et de proposer une thérapie adaptée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de 1. Mieux comprendre les interactions entre les lésions de la maladie d'Alzheimer et l'inflammation. 2. Evaluer une thérapie contre la maladie d'Alzheimer avec une approche innovante basée sur l’utilisation d’un anti-inflammatoire.

Procédures

Intervention 1 pour tous les animaux : Etude du comportement des animaux dans des tests qui évaluent leur mémoire et leurs capacités à sauter (animaux arboricoles). -Tests de mémoire : Une session d'accoutumance et 4 sessions d'une heure chacune -Tests de sauts : 4 sessions d'une heure chacune Intervention 2 pour tous les animaux : Réalisation d'examen IRM (imagerie par résonance magnétique) pour étudier la réduction de la taille du cerveau qui est un signe associé à la maladie d'Alzheimer (appelée atrophie cérébrale). -5 sessions de 3 heures chacune Intervention 3 pour tous les animaux : Réalisation de prise de sang pour étudier la santé des animaux. -5 sessions de 5 minutes chacune Intervention 4 pour tous les animaux: Inoculation intracérébrale de composés permettant d'induire la maladie d'Alzheimer ou de composés contrôles (qui n'induisent pas la maladie d'Alzheimer). -1 session de 2 heures. Intervention 5 pour un groupe appelé Alzheimer-Traité (13 animaux) : Thérapie par un inhibiteur de l'inflammation. Le médicament est donné pendant 6 mois, par voie alimentaire mélangé avec de la compote de pomme.

Impact sur les animaux

Intervention 1 (étude comportementale) : Ce test peut entrainer une angoisse pour un animal qui réalise que sa mémoire est déficiente. Intervention 2 (examen IRM) : Stress lié à l'anesthésie lors de la réalisation des examens IRM. Intervention 3 (prise de sang) : Douleur et stress liés à une piqure d'aiguille. Intervention 4 (chirurgie cérébrale) : Douleur post-chirurgie. Réduction des capacités cognitives (légère et en général uniquement détectable dans des tâches comportementales très élaborées). Intervention 5 (Thérapie par un inhibiteur de l'inflammation) : Goût modifié de la compote de pomme entrainant une diminution de l'appétence.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet. Nous voulons étudier l'impact des lésions de la maladie d'Alzheimer et d'une thérapie contre l'inflammation sur les lésions de la maladie d'Alzheimer qui ne peuvent être étudiées qu'en post-mortem par des études histologiques, biochimiques ou transcriptomiques .

Remplacement

L'apparition des lésions de la maladie d'Alzheimer et leur diffusion dans le cerveau dépend de l'interaction entre les lésions, le système immunitaire et le cerveau de l'hôte. Il n'y a actuellement aucun modèle alternatif non animal disponible pour effectuer une analyse complète de la dynamique d'apparition des lésions sans utiliser des animaux. L'inflammation du cerveau est très différente chez les primates et les rongeurs. Nos études ne peuvent donc pas être menées chez des rongeurs. Les tests in vitro ne permettent que d'étudier des aspects non-intégratifs de la maladie d'Alzheimer.

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimal d'animaux qui permettra d'obtenir un résultat statistiquement fiable. Le calcul de la taille de l'échantillon a été réalisé en utilisant la cognition (capacité d'apprentissage) comme critère principal et en nous basant sur des résultats expérimentaux obtenus au cours d'études précédentes. Ce calcul a permis de réduire le nombre d'animaux, car si nous n'avions pas fait cette estimation, le nombre d'animaux utilisés aurait été plus élevé.

Raffinement

Pendant toute l'étude, les animaux sont hébergés dans un environnement à température contrôlée, avec cycles jour-nuit optimisés. Eau et nourriture sont fournies à volonté. L'environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire. Les animaux sont examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision d'un vétérinaire. Tout examen par imagerie IRM et intervention chirurgicale sont effectués sous anesthésie générale. Des points limites sont mis en place pour limiter la douleur. Toute intervention chirurgicale est effectuée sous anesthésie générale associé à des traitements anti-douleur. En cas de manifestation de douleur, une analgésie sera discutée avec le vétérinaire. Ces mesures garantissent que les conditions de douleur et de souffrance inutile des animaux sont contrôlées.

Choix des espèces

Les travaux sont menés sur des microcèbes adultes car la maladie d'Alzheimer touche les adultes. Le microcèbe est un primate qui présente un vieillissement cérébral très proche de celui de l'homme. Il est possible d'induire artificiellement des lésions de la maladie d'Alzheimer chez cet animal. Il s'agit du seul modèle primate de la maladie d'Alzheimer qui ne repose pas sur une surexpression de protéines anormales. Les modèles rongeurs de la maladie d'Alzheimer reposent sur une surexpression de protéines mutées anormales et ne représentent que partiellement la pathologie humaine. Surtout, la réaction inflammatoire des rongeurs est très différente de celle des primates. Le microcèbe est donc idéal pour étudier les relations entre pathologie Alzheimer et inflammation.

Ayant reçu sous anesthésie gazeuse une prodrogue de vinblastine sous la peau du dos, ou de la vinblastine dans la veine de la queue, des souris BALB/c sont ensuite tuées pour l'analyse de leurs organes ou de leur sang, certaines après une ponction cardiaque sous dose létale de pentobarbital. 108 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Il s'agit de fixer la dose maximale tolérée de la prodrogue, en testant jusqu'à quatre doses croissantes sur des groupes de quatre souris, soit la dose "la plus élevée qui produira l'effet souhaité sans entrainer d'effets indésirables inacceptables". Parmi les nuisances attendues, le porteur ne cite que le stress de l'anesthésie et des pesées et une gêne ou une inflammation au point d'injection, sans rien dire des effets des doses les plus fortes.

Objectifs

L’administration de médicaments anticancéreux par voie sous-cutanée est actuellement limitée par leur faible solubilité, leur viscosité et leur toxicité au niveau du site d’injection (irritations voire nécroses cutanées). Nous proposons dans ce projet une nouvelle approche permettant d’administrer efficacement par voie sous-cutanée des chimiothérapies anticancéreuses déjà présentes sur le marché. Nous avons en effet développé une technologie innovante qui consiste à coupler un agent de chimiothérapie existant, la Vinblastine, à une succession de molécules pour le rendre soluble et injectable par voie sous-cutané. L’objectif de cette étude est d’étudier la toxicité et la distribution dans l'organisme de cette prodrogue de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC), comparativement à la Vinblastine seule, administrée en intraveineuse (IV). L’étude de toxicité a pour objectif de déterminer la dose maximale tolérée (DMT, dose la plus élevée qui produira l’effet souhaité sans entrainer d’effets indésirables inacceptables) par voie SC de la prodrogue de Vinblastine, et de vérifier qu’elle n’induit pas de toxicité au niveau du site d’injection. L’étude de pharmacocinétique permettra de vérifier qu’il est possible d’avoir une exposition au principe actif comparable à la voie intraveineuse, et donc une efficacité thérapeutique similaire.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est de démontrer l’innocuité de la prodrogue polymère de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC) et de comparer son profil pharmacocinétique à celui de la Vinblastine libre administrée en intraveineuse (IV). De tels résultats permettraient d’envisager la délivrance des principes actifs anticancéreux par voie sous-cutanée, qui seraient à la fois efficace, confortable pour le patient et bien moins couteuse dans son utilisation que les chimiothérapies actuelles.

Procédures

Chaque souris recevra une seule injection de la prodrogue polymère par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%) dans la région dorsale préalablement rasée ou de la Vinblastine libre en intraveineuse sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%). Cette intervention durera environ 10 minutes, anesthésie comprise. Certaines souris subiront également un prélèvement sanguin terminal effectué par ponction cardiaque après injection d’une dose léthale d'anesthésique de pentobarbital, un anesthésique puissant, et la mise à mort de l'animak sera confirmée par élongation cervicale. Cette intervention durera environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances suivantes sont attendues : - L'anesthésie par cage à induction qui pourrait entrainer un stress de l'animal avant endormissement. - Les injections de la vinblastine en intraveineuse dans la veine de la queue et de la prodrogue en sous-cutané, qui pourraient causer une gène ou une inflammation au niveau du site d'injection - Les pesées qui peuvent entrainer un stress chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de prélever les organes et la zone d'injection pour des études histologiques afin de vérifier l’absence de toxicité systémique et de toxicité locale aigue (procédire 1) ou pour effectuer des prélèvements sanguins terminaux (procédure 2).

Remplacement

Les médicaments, durant leur transport dans l’organisme, vont interagir avec les éléments du système immunitaire et être soumis à une métabolisation (hépatique, rénale, …) qui peut provoquer l’apparition de métabolites pouvant être plus ou moins actifs voire toxiques. Cette chaine de phénomènes complexes ne peut pas être modélisée ou mimée in vitro. Il est donc nécessaire de mener ces études sur des animaux vivants pour reproduire tous ces processus et évaluer la toxicité et la fraction de substance active qui arrive dans le sang.

Réduction

Les études préliminaires in vitro ont permis le criblage de différentes formulations dont une seule sera testée in vivo, permettant ainsi une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans cette étude. Une planification statistique minutieuse permet aussi de réduire le nombre d’animaux tout en préservant la validité statistique de l’étude. La DMT de la prodrogue sera déterminée en testant des doses croissantes de prodrogue à partir de la dose équivalente à la DMT par voie IV de la molécule libre (connu dans la littérature) car la prodrogue polymère est censée avoir une DMT supérieure à celle de la molécule libre. Quatre doses seront testées au maximum, nous nous arrêterons avant si la DMT de la prodrogue est atteinte. Le dimensionnement des groupes a été déterminé par un test de puissance (erreur de 5% et puissance de 80%) qui permet de mettre en évidence une perte de poids de 10% avec une variabilité de 10% avec 4 animaux par groupe. La DMT du principe actif libre, bien décrite dans la littérature, ne sera testée qu’à deux doses maximum pour tenir compte de la variabilité inter-souche. Pour la pharmacocinétique de libération du principe actif, une seule dose sera testée pour déterminer quelle est la prodrogue qui permet une libération optimale du principe actif dans le sang. La prodrogue polymère et la molécule libre seront administrées à une dose équivalente permettant leur détection pendant 48 à 72 heures, afin de pouvoir comparer la cinétique de la molécule libre et de la prodrogue. Nous cherchons à mettre en évidence une augmentation du temps de présence de la molécule dans l'organisme. Le nombre d’animaux nécessaire (erreur 5%, puissance 90%) a été évalué à 4 animaux par groupe. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test non-paramétrique.

Raffinement

Dans notre laboratoire, les animaux en provenance des centres d'élevage sont pris en charge dès leur arrivée (environ 8 jours avant le début de l'expérimentation), jusqu'à l'euthanasie. Le bien-être animal sera respecté : -Conditions d’hébergement adaptées : nourriture et eau à volonté, température constante de 20°C et mise en place d’un cycle jour/nuit inversé par période de 12 heures. -Temps d’acclimatation de 8 jours avant toute procédure -Souris hébergées en groupes (6 par cage) -Enrichissement des cages : dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques (Cell Nest) -Définition des points limites et évaluation quotidienne des signes de douleurs (difficultés respiratoires, prostration, atonie, défaut d’alimentation, isolement, ou tout autre signe physique tel que la position des oreilles ou des vibrisses). La définition exacte des points limites se trouve dans une grille des scores de la douleur, qui évalue le bien-être animal sur chacun de ces points et décrit la conduite à tenir en fonction de l’état de l’animal (par exemple augmentation de la fréquence du suivi, utilisation d’analgésique…). De plus, toutes les procédures se feront sous anesthésie pour éviter toute forme de douleur.

Choix des espèces

Pour la réalisation de nos études, nous utiliserons des souris BALB/c. Les souris BALB/c sont un bon modèle car elles sont blanches et permettent de suivre plus facilement les apparitions de nécroses ou d’irritations au niveau cutané. Les premières études ayant été réalisées sur cette souche, cela nous permettra aussi de comparer les résultats. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 7-10 semaines qui ont un système immunitaire mature et des fonctions physiologiques bien établies.

90 souris et 80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie pour une injection intrathécale ou intracérébrale d'un candidat médicament, avant d'être tué par surdose d'anesthésique et exsanguination. Le projet étudie la distribution d'oligonucléotides dans le système nerveux au stade préclinique. Le porteur affirme que ce degré de complexité ne peut être atteint qu'avec un modèle animal.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives sont causées par la mort de neurones, ce qui affecte le fonctionnement du système nerveux de manière chronique et progressive. Ces maladies sont fortement invalidantes et peuvent affecter la motricité, et les fonctions cognitives. Pour être efficace, un médicament doit pouvoir atteindre sa cible neuronale pour agir et ralentir les procéssus neurodégénératifs. Pour atteindre le système nerveux, les médicaments doivent traverser la barrière hématoencéphalique, ou, être directement injectés dans l'environnement neuronal. Cette dernière approche est particulièrement appropriée pour des composés tels que des peptides ou des nucléotides. L'objectif est d'étudier la distribution de candidats-médicaments, tels que les oligonucléotides antisens, dans le système nerveux de rongeurs après injections intra-thécales ou intra-cérébrales.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour des maladies neurodégénératives. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.

Procédures

Les animaux subiront une seule opération chirurgicale (injection intrathécale ou injection intra-cérébrale), sous anesthésie. Les stratégies d'anesthésies et d'analgésies impliquent des injections intra-péritonéales et sous-cutanées, ce qui peut induire à stress, avant la chirurgie et juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un acte chirurgical, sous anesthésie et analgésie, pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Les injections d'analgésiques et d'anesthésiques peuvent induire un stress lors de l'administration. La classe de composé utilisée ici n'est pas décrite comme toxique dans la littérature, cependant un effet indésirable des traitements ne peut pas être exclu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésique et par exsanguination.

Remplacement

La distribution de composés dans le système nerveux dépend de plusieurs facteurs, tels que la diffusion au sein du liquide qui entourne les neurones, et la capture par différents types de cellules. Ces variables impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les études publiées dans la littérature scientifique suggèrent qu'un nombre de 10 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec 10 souris ou 10 rats par groupe.

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnels en carton), (ii) des approches d'analgésies quand nécessaire, (iii) et le contrôle strict des paramètres physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (rats et souris) et 4 au maximum (souris uniquement), avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique (buprénorphine, 0.1mg/kg) sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs, dont les souris et les rats, possèdent un système nerveux complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. Les rongeurs sont donc des modèles appropriés permettant l'étude de la distribution des candidats-médicaments dans le système nerveux central. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiés aux études impliquant des souris ou des rats. Les procédures expérimentales utiliseront soit des souris, soit des rats. Le choix de l'espèce, pour chaque procédure, est motivée par les séquences des oligonucléotides, ainsi que par les analyses réalisées avec les échantillons biologiques.

150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une craniotomie pour implanter une canule, puis jusqu'à quatre injections de molécules inflammatoires sur les méninges pour mimer une crise de migraine, et restent isolés en cage individuelle pendant deux semaines. Le projet compare l'intégration de la douleur méningée entre mâles et femelles selon le cycle hormonal, les retombées thérapeutiques restant à long terme. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer cette étude in vivo.

Objectifs

La migraine est une pathologie à forte prévalence féminine, qui est caractérisée par des céphalées associées à d’autres symptômes telles que la photophobie, la phonophobie ou encore l’allodynie (douleur déclenchée par une stimulation non douloureuse). Pendant la phase de céphalée, la douleur est générée au niveau des méninges puisqu’il n’existe pas de récepteurs à la douleur dans le cerveau. L’hypothèse actuelle est que cette douleur est la conséquence d’une inflammation provoquée par des molécules (histamine, bradykinine, sérotonine, prostaglandines…) libérées par les fibres nerveuses au niveau des méninges. L’objectif du projet sera de comparer l’intégration de la sensibilité méningée au niveau du système nerveux central chez les mâles et chez les femelles selon le cycle hormonal, dans un modèle animal de migraine. Ce modèle consiste à mimer l'inflammation qui a lieu au niveau des méninges pendant les crises de migraine et qui provoque la douleur ressentie. Nous réaliserons des enregistrements électrophysiologiques d’une population neuronale localisée dans une région cérébrale impliquée dans l’intégration de l’information douloureuse, et comparerons les effets de l’inflammation méningée sur la physiologie de ces neurones chez les mâles et les femelles, et chez les femelles à différents cycle hormonaux.

Bénéfices attendus

Même si la migraine touche plus les femmes que les hommes et est fortement corrélées aux cycles hormonaux, la plupart des études précliniques ont été réalisées chez les mâles. Ainsi, à moyen terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiologiques d’intégration de la douleur méningée au niveau du système nerveux central chez les mâles et les femelles selon le cycle hormonal. A plus long terme, mieux comprendre cette pathologie pourra nous aider à développer de nouveaux traitements qui pourraient mieux soulager les patients en tenant compte des différences hommes/femmes et cycle menstruel.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale qui consiste en une craniotomie pour pouvoir implanter une canule pour appliquer à la surface des méninges une inflammation, mimant ce qui se passe pendant les crises de migraines. Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. Chaque chirurgie dure environ 30 à 45 min. Injection des molécules sur les méninges afin de mimer les crises de migraine: 4 injections (au maximum) tous les 2 jours ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min.

Impact sur les animaux

Nous réalisons une procédure chirurgicale avec l’implantation de la canule. La douleur est prise en charge en post-opératoire. Par ailleurs, nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie pendant 2 h après l’injection, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Un autre effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour la mise en place de la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 2 semaines.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Cependant, l’expérience montre qu'un certain nombre d'échecs est rencontré lors des études qui incluent une chirurgie (perforation des méninges, anesthésie, canules bouchées, échec de l'habituation) soit des échecs dans environ 20% des cas, ce qui nous amène à prendre 10 animaux par groupe. Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles. Enfin, nous réduirons le nombre d'animaux en ne faisant pas de groupe contrôle de 2 injections d'aCSF et en utilisant le groupe contrôle de 4 injections d'aCSF à la place.

Raffinement

Les rats bénéficieront d’un enrichissement environnemental avec des rouleaux qui seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue)...mettrait fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.