Procédures modérées

2 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce volet se déroule dans le premier des deux établissements du projet, où une tumeur humaine leur est greffée avant l'administration d'un anticorps couplé à un métal radioactif et une imagerie nucléaire. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales, une déplétion des cellules sanguines et un "sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression" liés à l'hébergement individuel après l'injection radioactive. Il conclut que l'expérimentation animale est "requise", les données précliniques étant imposées par les autorités.

Objectifs

Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un métal radioactif à un anticorps spécifique d'une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que l'anticorps puisse diriger et concentrer le métal dans les cellules cancéreuses. En fonction du métal choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Un anticorps spécifique de cette protéine a donc été développé afin de bloquer sa liaison avec ses récepteurs dans la cellule et ainsi conduire à leur mort. Cet anticorps est actuellement en cours d'investigation dans le cadre d'un essai clinique chez l'Homme. Dans le but de mieux sélectionner les patients exprimant fortement la protéine N, cet anticorps a été modifié par couplage à un métal radioactif émetteur de particules lumineuses afin de détecter sa présence par imagerie nucléaire. Ce nouvel outil devrait permettre d'inclure les patients sur la haute expression de la cible afin de les traiter avec l'anticorps seul (non radioactif) et ainsi déclencher la mort des cellules tumorales. Par ailleurs, les mécanismes d'échappement de la cellule tumorale concernant la protéine N étant déjà décrits, l'efficacité de l'anticorps non radioactif est donc limitée. C'est pourquoi l'ajout de la radioactivité est alors nécessaire afin de détruire les cellules cibles. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs agréés (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les patients pris en charge en clinique ne sont généralement pas testés pour l'expression de la cible, limitant ainsi les chances de réponse aux traitements. Dans ce présent projet, il est proposé de valider l'utilisation d'un test compagnon basé sur l'imagerie chez différents modèles tumoraux hautement représentatifs de la pathologie humaine afin de n'inclure que des patients exprimant un fort taux de la cible et d'augmenter l'effet anti tumoral des thérapies ciblées. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l'Homme à la fin de l'étude.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Interventions chirurgicales : greffe de tissu tumoral humain (1 ou 2 par animal en fonction de la greffe unilatérale ou bilatérale, durée : 5 minutes maximum). -Injection de produit en intraveineuse dans la veine caudale : 2 injections chez les souris incluses lors des expérimentations d'imagerie et de traitement. -Injection de produit en sous-cutanée : 2 injections prévues au moment de la greffe (peropératoire et post-opératoire). Des injections supplémentaires de produit analgésiant pourront être réalisées en cas de nécessité seulement et selon les conditions définies dans chacune des manipulations expérimentales. -Anesthésie gazeuse à l'isoflurane réalisée lors de la greffe, lors de chaque injection ou au moment de la mise à mort. -Imagerie Nucléaire : imagerie SPECT/CT dans les procédures d'imagerie. -Mesures du poids ainsi que du volume tumoral dans toutes les procédures (deux fois par semaine). La greffe de tissu tumoral humain sera réalisée dans l'EU1 tandis que tous les autres actes (injections de produit non radioactif, radioactif, imagerie nucléaire) seront effectués dans l'EU2. Les anesthésies gazeuses ainsi que les merures de poids et de volume tumoral pourront être effectuées dans les deux établissements utilisateurs.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : -douleurs générées post-intervention chirurgicale (incision réalisée sur la peau pour la mise en place du greffon), lors de la prise du greffon, lors de l'injection ou de l'application de produit d'analgésie ou d'antiseptsie, lors de l'injection des anticorps. -fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines dans les jours suivants l'injection de l'anticorps radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. -stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. -sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris inclue dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficicacité thérapeutique.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de la greffe est réduit au minimum tout en prenant en compte le taux de reprise des modèles de tumeurs humaines lors de la décongélation. Lors de l'étape d'amplification du modèle tumoral humain, une greffe bilatérale sera effectuée sur les animaux afin de réduire leur effectif. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. Les effectifs des animaux des autres procédures ne reposent sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la variabilité biologique possible entre les souris. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées et chaque étape devra montrer de bons résultats avant le passage à l’étape suivante afin de limiter le nombre d'animaux strictement nécessaire.

Raffinement

Méthode utilisée pour réduire la douleur : -Anesthésie générale gazeuse. 1 anesthésie/animal lors de la greffe (5min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque injection sous la peau ou dans la veine de la queue (5 min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque acquisition d'imagerie nucléaire (45min) et 1 anesthésie lors de la mise à mort de l'animal. -Analgésie mise en place en cas de douleur chez l'animal, possibilité de renouvellement toutes les 24h. -Antisepsie : application cutanée en cas de blessure observée en zone d'hébergement ou en amont de l'incision de la peau lors de la greffe. Raffinement des conditions d'hébergement : afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection de la molécule d'imagerie, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte dans le but de permettre un contact visuel des animaux et en enrichissement de la cage (jouet) sera ajouté.

Choix des espèces

Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux établis à partir du tissu cancéreux de patients (PDX) est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de PDX car celles-ci se caractérisent par l'absence de thymus, ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont entre 6 et 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées dans la veine de la queue pour former des tumeurs dans les poumons, suivies de traitements, avant une mise à mort à treize ou dix-sept jours pour prélever les poumons. Le porteur indique que chaque poumon porte alors de cent à deux cents foyers tumoraux, qu'il affirme sans conséquence sur la vie des animaux au vu de son expérience. L'objectif est de confirmer in vivo une observation faite in vitro sur le recrutement de globules blancs, qu'il juge non transposable sans passer par l'animal entier.

Objectifs

NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues d’autres globules blancs appelés lymphocytes, isolés de souris montrent que NLRP3 est présent dans ces cellules. En l’absence de NLRP3 ces globules blancs ont une activité anti-tumorale marquée contre différents types de tumeurs. L’absence de NLRP3 dans ces globules blancs semble impacter le recrutement de ces cellules au site tumoral. Grâce à des cellules isolées des tumeurs de souris déficientes pour NLRP3 nous avons pu observer une différence dans l’expression de certains récepteurs membranaires suspecter d’être impliqué dans le recrutement des globules blancs déficients pour NLRP3. Le récepteur appelé CXCR3 interagit avec 3 molécules ayant des effets différents. Différentes lignées tumorales sont capables de les produire. Nous avons validé in vitro la différence de recrutement. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui valider ces observations in vivo. En effet, la complexité de la réponse immunitaire anti-tumorale est telle que les résultats obtenus in vitro ne sont pas suffisants pour affirmer que les mécanismes de recrutement des globules blancs identifiés in vitro sont transposables à un organisme entier et qu’ils pourraient servir de cible thérapeutique. Pour confirmer nos hypothèses in vivo, nous utiliserons des souris contrôles ou déficientes pour NLRP3 comme donneurs de globules blancs. Ces globules blancs seront injectés à des souris ayant de tumeurs au niveau pulmonaire. Ainsi, nous pourrons comparer le recrutement des globules blancs contrôles ou déficients pour NLRP3 dans des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - apporter des connaissances nouvelles concernant NLRP3. - évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie

Procédures

Les injections de cellules seront réalisées en intra veineux sur souris anesthésiées par isoflurane (2 par souris, chaque injection dure quelques secondes). Les traitements par chimiothérapies seront réalisés en intra péritonéal sur souris vigiles (4 par souris, chaque injection dure quelques secondes). La mise à mort sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront induites dans les poumons suite à une injection intra veineuse dans la veine caudale. Cet acte peut engendrer du stress chez l’animal car il doit être maintenu dans un système de contention. L’injection induit une douleur de faible intensité au site de l’injection. Les foyers tumoraux au niveau des poumons permettent d’obtenir des résultats plus clairs et de meilleure qualité. Les animaux seront mis à mort à J13 ou J17 post-injection des cellules tumorales. A ce stade, il y a entre 100 et 200 foyers tumoraux sur les poumons (d’environ 1mm de diamètre) et cela n’impacte pas la vie des animaux (nous avons plus de 10 ans d’expérience sur ces modèles).

Devenir

Les 260 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les poumons

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et des phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires.

Réduction

Dans un souci de réduction et étant donné que nous voulons confirmer des résultats obtenus in vitro, les expériences ne seront réalisées que 2 fois avec 5 souris par groupes et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience sera accompagnée d’une analyse complète de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences (1 lobe pour l’analyse de l’infiltrat et 1 lobe pour les marquages). Enfin, un « go-no go » est appliqué à la fin de chaque phase du projet. En d’autre terme si les résultats de la phase n ne confirment pas l’hypothèse, la phase n+1 ne sera pas réalisée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un cytomégalovirus, reçoivent jusqu'à six injections et deux irradiations aux rayons X, avant prélèvement des organes. Le porteur indique que les effets de l'irradiation, stress, douleur et baisse d'alimentation, ne pourront pas être atténués par un analgésique, celui-ci modifiant les réponses immunitaires étudiées. Il décrit une grille de score de la douleur menant à l'euthanasie au-delà d'un seuil et présente la souris comme le "modèle de référence en immunologie".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier les mécanismes contrôlant la génération et le renouvellement de cellules du système immunitaire au cours d’une infection virale : les cellules innées lymphoïdes de type 1 (ILC1). Les ILC1 jouent un rôle important dans le contrôle précoce d’une infection virale et du développement tumoral. Cette efficacité repose sur le développement de fonctions effectrices adéquates, mais également sur le maintien, l’expansion, et le renouvellement du nombre de cellules effectrices disponibles. Notre laboratoire étudie le développement des cellules du système immunitaire à l’état basal, notamment des ILC1, dans le but d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de moduler l’activité de ces populations cellulaires. Nous souhaitons maintenant étudier les mécanismes contrôlant la taille de la population d’ILC1 en conditions pathologiques. Pour mener cette étude nous utiliserons le modèle classique et couramment utilisé d’infection par le cytomégalovirus murin (MCMV), bien caractérisé sur le plan physiopathologique.

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans le cadre de ce projet vont générer des retombées importantes dans plusieurs domaines. En termes de recherche fondamentale, elles vont permettre d’approfondir nos connaissances sur le développement de ce lignage cellulaire. Elles vont également nous fournir de précieux éléments nécessaires à la compréhension de la réponse immunitaire. En termes de recherche appliquée, ce projet s’inscrit dans le cadre de travaux visant à identifier de nouvelles cibles (cellulaires et/ou moléculaires) dont l’activité pourrait être manipulée à des fins thérapeutiques, tels que le développement de vaccins ou de traitements anticancéreux.

Procédures

Selon la procédure expérimentale, les animaux pourront recevoir une injection intraveineuse, plusieurs injections intra-péritonéales (jusqu'à 6 dans le cas d'un traitement au tamoxifène et d'une infection), être soumises à un prélévment de sang, et à 2 irradiations aux rayons X de 3.5 Gy chacune. Les injections et prélèvements intraveineux sont réalisés sous anesthésie générale. Le temps total de manipulation d’une souris ne dépasse pas 5 minutes. 80 animaux auront 1 injection intraveineuse et 1 prélèvement de sang. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animaux vigiles. Le temps de manipulation d’une souris ne dépasse pas 1 minute. La totalité des animaux (280) recevront entre 1 et 6 injections. Le temps de manipulation nécessaire à une irradiation au rayon X (comprenant l’irradiation elle-même) ne dépasse quelques dizaines de minutes. Les 2 irradiations sont espacées de 6h. 80 animaux suivront ce traitement.

Impact sur les animaux

Stress lié à la manipulation. Douleurs ponctuelles liées aux injections. Stress, douleur et altération de l’alimentation suite à une irradiation (< 2 semaines). Ces effets ne pourront être atténués par un traitement analgésique. Les analgésiques modifient les réponses immunitaires antivirales et peuvent influer sur l’histoire naturelle de la maladie, donc sur la finalité expérimentale. Il est important de noter ici que bien que certaines procédures incluent l’utilisation de produits référencés comme toxiques (tamoxifène et toxine diphtérique (DT)), ou des infections virales (MCMV), mais leur utilisation et/ou mise en œuvre n’ont pas de conséquences attendues sur le bien-être animal dans les conditions utilisées dans ce projet.

Devenir

Toutes les procédures utilisées dans ce projet aboutissent à des prélèvements d'organes, et par conséquent à la mise à mort de la totalité des animaux

Remplacement

La multiplicité des populations cellulaires impliquées, le rôle de multiples tissus et structures tissulaires, ainsi que la complexité des interactions cellulaires et moléculaires dans le temps et l’espace, ne permettent pas le recours à des modèles in vitro pour l’étude du développement de la réponse immunitaire. Le recours à un modèle animal est donc essentiel à la réalisation de notre projet de recherche.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux requis pour ce projet : i) une étude préalable de la littérature a été réalisée pour éviter le recours à des expériences de mise au point, ii) nous utilisons des modèles de souris congéniques réduisant considérablement la variabilité inter-individus. L'utilisation de modèles statistiques applicables à des petits échantillons nous permettra d'évaluer la significativité et la robustesse des résultats sur des groupes d’animaux restreints et un faible nombre de répétitions, iii) nous utiliserons des techniques d’analyses à haut et très haut débits afin de maximiser l’acquisition de données pour chaque expérience.

Raffinement

Les souris seront élevées dans des animaleries conventionnelles et de niveau 3, exemptes d'organismes pathogènes spécifiques (EOPS). Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles (jusqu’à 5 animaux/cage), et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant leur entrée dans les procédures. Ils disposeront d’un environnement enrichi incluant du matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Les doses infectieuses utilisées seront des doses non-létales n’entraînant pas de signes de souffrance chez des souris de type sauvage (contrôles). Toutefois, certains animaux génétiquement modifiés sont plus sensibles aux infections. Pour les procédures où ces animaux seront utilisés, l’accès à la nourriture et à l’eau sera favorisé en positionnant de la nourriture humidifiée au fond de la cage. Il ne sera pas possible de remédier à leur souffrance dans la mesure où les analgésiques modifient également les réponses immunitaires étudiées, et donc, influent sur l’histoire naturelle de la maladie et sur la finalité expérimentale. Cependant, dans toutes les procédures décrites, une grille d’évaluation de la douleur sera appliquée (ci dessous) pour détecter, quantifier et suivre tout signe de souffrance, stress et anxiété relatifs à l’expérimentation en cours. Tout animal dépassant un niveau modéré sera immédiatement euthanasié. Perte de poids : 0 à 10% = +1, 10 à 20% = +2, >20% = +11. Apparence physique : normale = 0, absence de toilettage, signes de barbering et perte de poils = +1, pelage hirsute, lésions de peau minimes peu évolutives, écoulement oculo-nasal = +2, pelage très ébouriffé, lésions de peau évolutives, dos rond, yeux mi-clos = +3. Modification du comportement non provoqué (à distance) : normal = 0, changement mineurs, boiterie, hyperactivité = +1, mobilité réduite, isolement, léthargie = +2, automutilation, prostration, tremblements = +3. Modification du comportement après stimulation (à la manipulation) : normal = 0, prostration transitoire = +1, tremblements ou convulsions intermittents = +2, tremblements ou convulsions persistants = +3. Masses : aucune = 0, petite, non évolutive, sans gêne associée = +1, grosse, modérément ulcérée = +2, nombreuses, évolutives, largement ulcérée, gêne la marche ou l'alimentation = +3. Score total 10 : euthanasie

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence en immunologie. Le choix de ce modèle repose sur la proximité de son système immunitaire avec celui de l’homme, les conditions d’élevage peu coûteuses, un temps de génération court, ainsi qu’un nombre important d’individus par portée. La facilité et la rapidité de génération de souches mutantes, la très large disponibilité de souches mutantes préexistantes, le très grand nombre d’outils et de techniques d’analyses dédiées permettent également de limiter le nombre d’animaux nécessaire à un projet. Notre projet utilisera des souris adultes âgées de 6 à 15 semaines ayant un système immunitaire mature. Pour réaliser des chimères hématopoïétiques à l’aide de cellules souches de foie fœtal nous utiliserons des fœtus dans le dernier tiers de gestation, au stade embryonnaire 18.5 (e18.5). A ce stade, le foie contient des cellules souches spécifiques n’étant pas retrouvées chez des souris adultes.

2 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est greffée, puis elles reçoivent un anticorps couplé à un métal radioactif, avec imagerie nucléaire et hébergement individuel après l'injection, avant une mise à mort par dislocation cervicale pour compter la radioactivité organe par organe. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales, une déplétion des cellules sanguines lors de la recherche de la dose radioactive maximale tolérée, ainsi qu'un "sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression" liés à l'isolement en cage. Il conclut que l'expérimentation animale est "requise", les données précliniques étant imposées par les autorités.

Objectifs

Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un métal radioactif à un anticorps spécifique d'une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que l'anticorps puisse diriger et concentrer le métal dans les cellules cancéreuses. En fonction du métal choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Un anticorps spécifique de cette protéine a donc été développé afin de bloquer sa liaison avec ses récepteurs dans la cellule et ainsi conduire à leur mort. Cet anticorps est actuellement en cours d'investigation dans le cadre d'un essai clinique chez l'Homme. Dans le but de mieux sélectionner les patients exprimant fortement la protéine N, cet anticorps a été modifié par couplage à un métal radioactif émetteur de particules lumineuses afin de détecter sa présence par imagerie nucléaire. Ce nouvel outil devrait permettre d'inclure les patients sur la haute expression de la cible afin de les traiter avec l'anticorps seul (non radioactif) et ainsi déclencher la mort des cellules tumorales. Par ailleurs, les mécanismes d'échappement de la cellule tumorale concernant la protéine N étant déjà décrits, l'efficacité de l'anticorps non radioactif est donc limitée. C'est pourquoi l'ajout de la radioactivité est alors nécessaire afin de détruire les cellules cibles. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs agréés (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les patients pris en charge en clinique ne sont généralement pas testés pour l'expression de la cible, limitant ainsi les chances de réponse aux traitements. Dans ce présent projet, il est proposé de valider l'utilisation d'un test compagnon basé sur l'imagerie chez différents modèles tumoraux hautement représentatifs de la pathologie humaine afin de n'inclure que des patients exprimant un fort taux de la cible et d'augmenter l'effet anti tumoral des thérapies ciblées. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l'Homme à la fin de l'étude.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Interventions chirurgicales : greffe de tissu tumoral humain (1 ou 2 par animal en fonction de la greffe unilatérale ou bilatérale, durée : 5 minutes maximum). -Injection de produit en intraveineuse dans la veine caudale : 2 injections chez les souris incluses lors des expérimentations d'imagerie et de traitement. -Injection de produit en sous-cutanée : 2 injections prévues au moment de la greffe (peropératoire et post-opératoire). Des injections supplémentaires de produit analgésiant pourront être réalisées en cas de nécessité seulement et selon les conditions définies dans chacune des manipulations expérimentales. -Anesthésie gazeuse à l'isoflurane réalisée lors de la greffe, lors de chaque injection ou au moment de la mise à mort. -Imagerie Nucléaire : imagerie SPECT/CT dans les procédures d'imagerie. -Mesures du poids ainsi que du volume tumoral dans toutes les procédures (deux fois par semaine). La greffe de tissu tumoral humain sera réalisée dans l'EU1 tandis que tous les autres actes (injections de produit non radioactif, radioactif, imagerie nucléaire) seront effectués dans l'EU2. Les anesthésies gazeuses ainsi que les merures de poids et de volume tumoral pourront être effectuées dans les deux établissements utilisateurs.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : -douleurs générées post-intervention chirurgicale (incision réalisée sur la peau pour la mise en place du greffon), lors de la prise du greffon, lors de l'injection ou de l'application de produit d'analgésie ou d'antiseptsie, lors de l'injection des anticorps. -fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines dans les jours suivants l'injection de l'anticorps radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. -stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. -sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris inclue dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficicacité thérapeutique.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de la greffe est réduit au minimum tout en prenant en compte le taux de reprise des modèles de tumeurs humaines lors de la décongélation. Lors de l'étape d'amplification du modèle tumoral humain, une greffe bilatérale sera effectuée sur les animaux afin de réduire leur effectif. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. Les effectifs des animaux des autres procédures ne reposent sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la variabilité biologique possible entre les souris. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées et chaque étape devra montrer de bons résultats avant le passage à l’étape suivante afin de limiter le nombre d'animaux strictement nécessaire.

Raffinement

Méthode utilisée pour réduire la douleur : -Anesthésie générale gazeuse. 1 anesthésie/animal lors de la greffe (5min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque injection sous la peau ou dans la veine de la queue (5 min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque acquisition d'imagerie nucléaire (45min) et 1 anesthésie lors de la mise à mort de l'animal. -Analgésie mise en place en cas de douleur chez l'animal, possibilité de renouvellement toutes les 24h. -Antisepsie : application cutanée en cas de blessure observée en zone d'hébergement ou en amont de l'incision de la peau lors de la greffe. Raffinement des conditions d'hébergement : afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection de la molécule d'imagerie, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte dans le but de permettre un contact visuel des animaux et en enrichissement de la cage (jouet) sera ajouté.

Choix des espèces

Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux établis à partir du tissu cancéreux de patients (PDX) est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de PDX car celles-ci se caractérisent par l'absence de thymus, ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont entre 6 et 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de mélanome humain leur sont greffées sous anesthésie, chaque souris recevant une greffe sur les deux flancs, puis la tumeur est mesurée deux fois par semaine jusqu'à la mise à mort et le prélèvement. Le porteur reconnaît que les souris développeront une pathologie tumorale potentiellement grave, mais qualifie le suivi de non invasif. Il présente le passage à l'animal comme une "étape indispensable" après des travaux in vitro, seul un organisme entier permettant selon lui de conclure sur la fonction des gènes étudiés.

Objectifs

Le mélanome est le cancer de la peau le moins fréquent mais le plus agressif qui ne cesse d’augmenter depuis ces dernières années. Il est dû à une transformation et à une croissance anormale des cellules de la peau. Malgré l’apparition de nouveaux traitements augmentant de façon significative la survie chez certains patients, en particulier les thérapies ciblées et les immunothérapies, ces cancers demeurent un défi majeur pour la recherche du fait de l’apparition de résistances suite à ces traitements. C’est pour cela qu’un retour aux questions fondamentales concernant la compréhension du développement de la maladie est nécessaire en vue d’envisager d’autres angles d’attaque thérapeutiques. Nos études préalables in vitro sur des modèles simplifiés de cellules en culture montrent que la protéine, que nous étudions dans notre laboratoire, a un rôle de suppresseur de tumeur dans les mélanocytes et que son expression empêche ainsi la transformation tumorale. De plus, nous avons identifié l’interacteur principal de cette protéine, qui est nécessaire à sa fonction suppresseur de tumeur. Cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que la formation d’une tumeur. L’objectif de notre projet est donc de valider l’implication de ces protéines au niveau de la transformation tumorale dans le contexte d’un organisme entier, avec toute la complexité inhérente des interactions cellulaires et moléculaires des organismes. De façon plus globale, cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les processus cellulaires mis en place dans le mélanome. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale.

Bénéfices attendus

La transformation cellulaire est un phénomène complexe. Elle fait appel à des processus cellulaires autonomes et non cellulaires autonomes, c’est-à-dire qui impliquent des interactions avec l’environnement cellulaire proche et distal, ainsi que des interactions complexes avec les cellules immunitaires. Dans ces conditions, seules des expériences réalisées dans un organisme auront une relevance pour conclure sur la fonction in vivo des gènes/protéines étudiées. De façon plus globale, cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les processus cellulaires mis en place dans le mélanome.

Procédures

Une transplantation de cellules cancéreuses nécessitant une anesthésie (15 minutes/souris) sera réalisée une fois au début de l’expérimentation. Les mesures du volume de la tumeur et les pesées (5 minutes/souris) seront effectuées 2 fois par semaine pour suivre l’évolution de la maladie sans geste invasif. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien pour estimer au mieux leur état physiologique global. Ce suivi prendra maximum 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Les souris transplantées avec des cellules cancéreuses développeront une pathologie tumorale potentiellement grave. L'anesthésie constituera une nuisance sur les animaux. L'ensemble des manipulations, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.

Devenir

Tous les animaux à l'issue de la procédure seront euthanasiés. Après la mise à mort des souris, les tumeurs seront prélevées et pesées. Une partie sera analysée pour mieux cerner les acteurs impliqués dans la tumeur grâce à des expériences de biologie moléculaire et de biochimie et une autre partie sera mise en présence d’un fixateur pour faire des coupes dans le tissu tumoral et réaliser des analyses immuno-histochimiques : différents marquages pour étudier la prolifération, la mort cellulaire et la différenciation mélanocytaire.

Remplacement

Notre projet se fera dans la continuité des études que nous avons réalisées in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable pour reproduire d’un point de vue phénoménologique tout ce qu’implique le développement tumoral. Seules des expériences réalisées dans un organisme auront une relevance pour conclure sur la fonction in vivo des gènes/protéines étudiées. Nous choisirons des modèles chez la souris, simples et exhaustivement décrits dans la littérature.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux génétiquement modifiés issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés. Le sexe sera choisi en fonction du nombre d'animaux nécessaires et disponibles par cohorte. De plus, lorsque cela est possible, la mutualisation de groupes contrôles sera réalisé. Pour minimiser le nombre d’animaux et pour diminuer la variabilité inter-individu, chaque souris subira une transplantation bilatérale (sur chacun des flancs) de cellules tumorales, le nombre d’animaux étant limité au minimum nécessaire pour permettre de fournir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). De plus, ils seront hébergés en confinement adapté à la stabulation de lignées murines immunodéprimées (cages individuellement ventilées). La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et coton pour nidification), et maintien des animaux en groupes de 3-5 afin de respecter leur instinct grégaire. De même, les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. Les greffes de cellules seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Le suivi du développement tumoral se fera au cours du temps de manière non invasive à l’aide d’un pied à coulisse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Dès l’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance, nous choisirons l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d’un individu d’une espèce donnée chez un individu hôte d’une espèce différente. Ainsi, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise de greffe de cellules tumorales humaines et éviter la réaction de l’hôte vis-à-vis du greffon. Dans ce contexte, les lignées de souris immunodéprimées sont les modèles les plus couramment utilisés et très bien documentés dans la littérature dans le cadre d’études réalisées à partir de xénogreffes de cellules tumorales humaines. . Concernant les stades de développement, nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules tumorales, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.