Procédures modérées

144 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein leur sont greffées sous la peau du flanc, puis des anticorps anticancéreux sont injectés, avec suivi de la croissance de la tumeur jusqu'à un volume limite de 1600 mm³ déclenchant la mise à mort. Le porteur signale un stress à la contention, une douleur aux injections et une possible perte de poids liée à la tumeur. Il présente le passage in vivo comme nécessaire pour évaluer les anticorps sur un 'organisme entier', les bénéfices visant des cancers en 'impasse thérapeutique'.

Objectifs

Dans un contexte où de nombreux patients atteints de cancer résistant sont en manque de traitements efficaces, nous proposons dans un premier temps d’établir un modèle de greffe de cellules cancéreuses d'une lignée de cancer du sein présentant des caractéristiques récapitulant les cancers résistants retrouvé chez l'Homme. La mise en place de ce modèle va ensuite nous premettre dans un deuxième temps d'évaluer des anticorps ciblant une protéine impliquée dans le mécanisme de résistance ainsi que leurs versions couplés à des molécules cytotoxiques. Ces anticorps ont une activité anti-tumorale in vitro prometteuse que nous nous proposons de tester in vivo afin d'évaluer leur efficacité dans ce modèle de cancer en impasse thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. En effet, il n’y a pas aujourd’hui de stratégies thérapeutiques pour les patients atteintes de cancer du sein avec tumeurs difficiles à traiter. L’étude de nouvelles stratégies va permettre de développer en phase préclinique de nouvelles molécules qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Injection (unique) des cellules cancéreuses sur souris vigiles en sous-cutanée dans le flanc droit : contention et geste de quelques minutes - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral atteint le point limite - Injection intrapéritonéale (unique), durée du geste : quelques secondes de composés thérapeutiques non toxiques - Pesée et mesure de tumeur : contention et geste de quelques minutes

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir des injections sous cutanée qui vont générer du stress à la contention et une douleur courte à l’injection. Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur courte lors de l’injection intrapéritonéale. La pousse tumorale peut engendrer de la perte de poids et des douleurs au niveau de la tumeur. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à l'issue de chaque procédure, pour cause de volume tumoral hors-éthique (supérieur à 1600mm3).

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation des différents anticorps ont été réalisées qui ont permis de sélectionner les deux candidats les plus efficaces. Le passage vivo est maintenant nécessaire pour l’évaluation du candidat médicament sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour cette raison nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris.

Réduction

Les études pour l'établissement du modèle seront faites séquentiellement, ce qui donnera lieu à un GO/NO GO pour la mise en place de la deuxième phase impliquant l'étude des anticorps. Cette décision sera prise par le comité scientifique, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un outil statistique et les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. En conséquence, les études statistiques nous ont permis de déterminer qu'il nous faudra 144 animaux au total pour cette étude.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures, les animaux seront habitués à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort au plus tard 56 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Si l'état des animaux le nécessite, des analgésiques seront utilisés.

Choix des espèces

Nous souhaitons évaluer nos traitements anticancéreux in vivo. l'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter les phénomènes de rejet des cellules ou des tissus implantés et favoriser la prise des greffes. Après l’utilisation d'une souche moins immunodéprimée sans prise tumorale de ce modèle, nous allons utiliser une souche de souris plus immunodéprimée. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif est un modèle qui permet une prise tumorale avec de nombreuses lignées humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie d'implantation sous-cutanée de biomatériaux destinés à la régénération osseuse, puis est tuée à deux ou quatre semaines pour analyse histologique de la vascularisation. Le porteur signale une gêne ou une douleur légère et de rares complications comme une infection ou une réouverture de suture, reprise sous anesthésie. Il indique que ces dispositifs destinés à l'humain doivent d'abord être testés chez un petit animal faute de méthode in vitro évaluant à la fois formation osseuse et vascularisation.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses en chirurgies orale et orthopédique représentent un réel défi. Les moyens de reconstruction actuels font souvent appel à des greffes autologues qui sont disponibles en quantité limitée et peuvent être source de complications post-opératoires pour les patients. L’ingénierie tissulaire osseuse cherche à développer de nouveaux substituts osseux d'origine naturelle pour pallier aux inconvénients de l'autogreffe. A titre d'exemple, dans le cadre de la pose d’un implant dentaire, il est souvent nécessaire de régénérer l’os manquant pour stabiliser ce dernier. Cette régénération peut employer différents dispositifs médicaux tels que : (i) des matériaux de comblement qui remplacent l'os ou favorisent la régénération osseuse et/ou (ii) des membranes qui jouent un rôle barrière pour prévenir l’infiltration cellulaire des tissus mous et préserver les cellules osseuses pour régénérer l’os. L’objectif de ce projet est de synthétiser des substituts osseux d’origine naturelle qui vont favoriser la cicatrisation de l'os et par conséquent, favoriser la formation de nouveaux vaisseaux sanguins.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouveaux dispositifs médicaux implantables favorisant la néovascularisation et la régénération osseuse.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie d'implantation sous-cutanée (acte chirurgical unique d'une durée maximale de 10 minutes).

Impact sur les animaux

L'implantation en site sous-cutané peut entraîner une gêne voire une douleur légère. De rares complications post-opératoires sont à envisager : infection au site de l'incision ou ré-ouverture des points de suture. Pour toute complication, un nettoyage du site opératoire par l’application d’un antisesptique sera réalisé. La rupture d'un point de suture entraînera éventuellement une reprise de ce dernier en fonction de la cicatrisation de la plaie. Cette opération sera réalisée sous anesthésie et avec application d’un analgésique. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie.

Devenir

Après les temps pré-définis (T0, 2 et 4 semaines après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider la biocompatibilité et le pouvoir angiogénique du biomatériau étudié.

Remplacement

La cytotoxicité des matériaux utilisés aura au préalable était évaluée in vitro selon les recommandations de la norme NF EN ISO 10993. Brièvement, les matériaux sont incubés dans du milieu de culture pendant 72h à 37°C. Deux tests sont employés pour évaluer la cytotoxicité des matériaux par contact indirect. Leur potentiel à favoriser la formation de vaisseau sanguins aura également était analysé. Les produits destinés à être implantés chez l'homme doivent au préalable être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro qui permettrait d’évaluer simultanément la formation osseuse et la vascularisation. Ces matériaux doivent au préalable être testés dans un modèle de petit animal (ici la souris). Si les résultats obtenus sont satisfaisants d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré in vitro une absence de cytotoxicité, et une seule lignée de souris sera utilisée. Trois temps expérimentaux sont envisagés pour récolter les données permettant la mise en évidence de l'inflammation aigüe, de la reconnaissance de corps étrangers, de la fibrose, et des différents processus de vascularisation et d’ostéo-induction. Pour chaque temps expérimental : - un groupe témoin négatif : poche sous-cutanée laissée vide, pour évaluer l’impact de la lésion seule ; - un groupe de référence : matériau sans principe actif, pour tester la capacité du matériau seul à induire et soutenir le processus d'ostéo-induction ; - 2 groupes expérimentaux : matériau avec le principe actif incorporé de différentes manières. Enfin, 6 échantillons par condition expérimentale doivent être analysés pour permettre une analyse statistique des données (avec le test de Kruskal-Wallis). Ces échantillons explantés à l'issue des temps expérimentaux seront utilisés pour plusieurs types de marquages et détections, permettant de collecter un maximum d'informations sur les animaux utilisés. Deux implantations seront réalisées par souris, en tenant compte de la taille du matériau et de la taille des animaux, ce qui permet de diviser par deux le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse des animaux, une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux (5 souris par cage). Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toute source de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. La chirurgie se déroulera sous anesthésie générale à l’isoflurane. Afin de réduire la souffrance des animaux, des analgésiques seront utilisés lors de l’opération, puis de nouveau en cas de douleur après l’opération. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, la souris reviendra dans sa cage d’origine. Ensuite, un suivi hebdomadaire sera effectué pour chaque animal en complétant une grille de score pour évaluer son bien-être. Concernant les compétences des expérimentateurs, ceux-ci possèdent les qualifications nécessaires, la formation réglementaire et des formations continues (formation à l'expérimentation animale de niveau expérimentateur et/ou concepteur). La maîtrise de la contention et des différents types d'injections à appliquer sont également maîtrisés par les expérimentateurs. Le personnel de l'animalerie possède toutes les compétences pour s'assurer du bienêtre et du suivi des animaux au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, présence de litière en copeaux de peupliers et des jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.

Choix des espèces

L’espèce C57BL/6 est connue pour son fond génétique uniforme permettant une meilleure reproductibilité au sein d’une même condition. Ces souris sont courrament utilisées et décrites dans la littérature ce qui permettra de comparer les données obtenues avec celles de la littérature. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines (25-30 g) afin de faciliter leur manipulation pour l´implantation en sous-cutanée

872 amphibiens vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les grenouilles vertes relâchées et les xénopes tués. Des adultes capturés dans la nature reçoivent une injection d'hormone sous anesthésie pour obtenir des pontes, puis les têtards sont soumis à des tests de comportement face à un prédateur, en cages flottantes ou en mésocosmes. Les 436 grenouilles vertes et leurs têtards sont relâchés, tandis que les 436 xénopes et leurs têtards reçoivent une surdose d'anesthésique, cette espèce classée envahissante ne pouvant être remise dans le milieu. Le porteur présente l'étude comme utile à la conservation de la grenouille verte, quasi menacée, et affirme qu'aucun modèle ne peut remplacer l'observation directe des interactions.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’apporter des éléments de connaissance sur la sensibilité des populations d’amphibiens autochtones comme la grenouille verte à des changements environnementaux majeurs auxquels l’espèce est confrontée. Si les études scientifiques sur l’écologie de la grenouille verte sont nombreuses, l’impact de la présence de potentiels compétiteurs et/ou prédateurs invasifs sur la dynamique des populations de grenouille verte restent très mal documentés. L’étude se propose ici de tester l’impact de la présence des têtards de xénopes lisses Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis une vingtaine d’années dans les mares, cours d’eau et rivières. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet visera à étudier l’impact de la présence du xénope sur la croissance (durée de la période larvaire), la survie, la taille à la métamorphose et le comportement de la grenouille verte. Pour ce faire, il est nécessaire d’obtenir des pontes de grenouilles vertes et de xénopes à partir d’adultes capturés en milieu naturel puis injectés à l’aide d’une hormone. Une fois les pontes obtenues les adultes de grenouilles vertes seront relâchés et les adultes de xénopes seront mis à mort (dû à son statut d’espèce exotique envahissante) puis les têtards seront soit placés en cages flottantes dans une mare, soit en mésocosmes placés en laboratoire. Dans les deux situations, les têtards seront placés sous des conditions de compétition différentes (intra- et interspécifique) et sous une ou deux densités différentes (1 et 3 têtards.L-1). Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé.

Bénéfices attendus

Ce projet s’insère dans les problématiques de conservation et gestion de la biodiversité. Il s’inscrit dans le défi scientifique actuel visant à comprendre les mécanismes en lien avec la sensibilité des organismes à l’altération spatio-temporelle de leur habitat dont la présence des espèces exotiques envahissantes est annoncée comme l’une des principales causes de l’érosion de la biodiversité. Ce projet nous permettra de tester pour la première fois l’impact de la présence du xénope sur la croissance, la survie, la taille à la métamorphose et le comportement des grenouilles vertes. Nous émettons l’hypothèse que la présence de têtards de xénope dans le milieu de vie des grenouilles vertes pourrait induire une diminution de leur croissance et survie en affectant des fonctions écologiques vitales chez la grenouille verte. D’un point de vue comportemental, nous émettons l’hypothèse que la présence de xénope induirait des comportements anti-prédateurs. Ces résultats permettraient une meilleure compréhension de la biologie et de l’écologie de ces deux espèces et plus encore sur leur interaction. De manière plus globale, cette étude permettra d’apporter des éléments scientifiques qui viendront enrichir les discussions sur les stratégies de gestion/conservation de ces espèces à l’échelle du territoire notamment depuis que le xénope a colonisé beaucoup de zones humides du Maine-et-Loire.

Procédures

Le transport durant 30 minutes sera assuré dans une double boite réduisant les risques de chocs. Femelles et mâles seront injectés d’hormones pour induire l’ovulation et stimuler l’accouplement. Avant l’injection, les amphibiens seront anesthésiés dans un bain de sédatif (endormissement en 15 minutes, réveil en 10 minutes). Après l’accouplement et l’ovulation, les œufs seront laissés dans les bacs et les adultes seront déplacés dans un autre mésocosme avec les mêmes conditions environnementales. Une partie des têtards obtenus (n=250 têtards de grenouilles vertes et n=250 têtards de xénopes) seront répartie dans les cages flottantes dans la mare et une autre partie des têtards obtenus (n=180 têtards de grenouilles vertes et n=180 têtards de xénopes) seront répartis en mésocosmes sous conditions contrôlées. Ces têtards élevés en milieu contrôlé seront au bout de trois jours (stade 25) passés en tests de comportement. Ces tests seront au nombre de trois (avec 48h entre chaque test), deux face à un prédateur (xénope adulte et grenouille verte adulte) et un face à un contrôle (grenouille en plastique). Les tests seront filmés et dureront 30 minutes (15 minutes d’acclimatation puis 15 minutes de test). Chaque groupe expérimental passera une fois le test dans chacune des trois conditions. Une fois les tests passés, les adultes et les têtards seront replacés dans le milieu naturel pour les grenouilles vertes après avoir été pêchés de leur bac d’élevage, placés dans une double boite de transport puis rapportés sur leur site d’origine après 30 minutes de transport. Les xénopes ne pouvant pas être libérés dans la nature seront en revanche placés dans un bain de sédatif pour être anesthésiés puis une surdose d’anesthésiant sera ajoutée pour la mise à mort des xénopes adultes.

Impact sur les animaux

Il est envisageable qu’un individu soit blessé lors de la capture ou de la manipulation et par conséquent développe une maladie. L’effet indésirable le plus probable est le stress lié au transport et aux conditions d’hébergements. De plus, à leur arrivée dans le laboratoire, certains animaux pourraient ne pas s’acclimater à leur environnement.

Devenir

Les six grenouilles vertes adultes et les 180 têtards seront remis en liberté avec une acclimatation à leur milieu naturel en ouvrant les boites de transports à côté de leur mare d’origine. Les animaux seront observés le temps qu’ils sont visibles après l’ouverture des boites afin de s’assurer de leur bonne acclimatation à leur milieu. Les six xénopes adultes et les 180 têtards seront mis à mort avec une surdose d’anesthésiant après une anesthésie en balnéation car il est impossible de relâcher dans le milieu naturel cette espèce classée comme espèce exotique envahissante. Les 250 têtards de xénope placés dans les cages seront après métamorphose mis à mort avec une surdose d’anesthésiant et les 250 têtards de grenouille verte après métamorphose seront libérés dans la mare.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant d’étudier la survie, la croissance et le comportement des premiers stades de vie de la grenouille verte face à la présence d’un compétiteur et d’un prédateur, il n’est pas possible de remplacer les animaux prévus pour cette expérimentation. Il est donc nécessaire de recourir à des animaux. De plus, il est impossible de modéliser les réponses des têtards face à la compétition et face à la prédation car c’est la première fois que cette question sera posée pour ces deux espèces dans un contexte semi-contrôlé et en testant la compétition indirecte. Par conséquent, aucun modèle ne pourra permettre de prédire ce qu’il va se passer.

Réduction

Les trois couples de grenouilles vertes et les trois couples de xénopes soit trois femelles et trois mâles Pelophylax spp. et trois femelles et trois mâles Xenopus laevis seront amenés au laboratoire et injectés d’hormones permettant d’induire la ponte et de stimuler l’accouplement. Les trois couples de chaque espèce sont le minimum pour assurer la quantité d’œufs et donc la quantité de têtards nécessaire pour l’expérimentation en cages flottantes et en mésocosmes. Pour l’étude sur les têtards en mésocosmes, les trois réplicats par modalité (grenouilles vertes ; xénopes ; grenouilles vertes – xénopes) sont le minimum pour obtenir des résultats statistiques viables (modèle linéaire permettant d’étudier les interactions statistiques sur le comportement des individus testés). Par ailleurs, la densité de têtards (3 têtards.L-1), nous semble appropriée pour pouvoir observer des interactions entre les individus. Les triplicats permettent de rendre compte de la variabilité interindividuelle existante au sein des groupes tout en obtenant une moyenne au plus proche de la réalité.

Raffinement

Le transport de la zone de prélèvement en milieu naturel vers le laboratoire sera effectué dans des bacs fermés à l’abri de la lumière pour limiter le stress des animaux. Les amphibiens étant des espèces proies, il est important de leur fournir un abri. Des tuyaux en plastiques et des objets flottants seront disposés dans les bacs permettant aux amphibiens de se cacher. De plus, afin d’apporter un environnement plus complexe aux amphibiens, des pierres seront disposées dans les bacs. Avant, l’expérimentation, la qualité de l’eau (dureté et chlore) sera testée. Chaque jour, une personne habilitée et formée sera en charge de vérifier le comportement des amphibiens avant et après l’injection d’hormones (en dehors des périodes de nourrissage). La qualité d’eau, c’est-à-dire les paramètres physico-chimiques sera mesurée une fois par semaine. En cas de mauvaise qualité d’eau (au-delà des seuils précités), un changement d’eau sera effectué puis une mesure deux jours après sera reprise pour s’assurer que les amphibiens sont dans un environnement stable. Enfin, l’anesthésie en balnéation avant l’injection d’hormone permettra de limiter tout stress. Les différentes phases de réveil seront surveillées ainsi qu’un retour à l’alimentation 24h après l’injection. Pour la phase expérimentale en mésocosme, le transport de la zone d’élevage à la zone expérimentale sera effectué dans des bacs couverts permettant de placer les individus dans le noir limitant le stress des amphibiens lors du transport. Une mauvaise qualité d’eau reportera le test prévu jusqu’à ce que la qualité d’eau revienne aux seuils exigés ci-dessus. Enfin, les tests de comportement seront toujours précédés d’un temps d’acclimatation (15 minutes) au dispositif afin que les individus puissent revenir à un taux d’activité normal après le transfert des mésocosmes vers le dispositif de test. Il est prévu également un repos de 48h entre chaque test. Le bien-être sera évalué par une grilles déterminant les points limites à la continuité du projet. Infections, blessures, comportement, dépigmentation et prise alimentaire seront évalués grâce à une échelle de score donnant un score global compris entre 0 (normal – aucune action) à supérieur à 7 (mise à mort de l’amphibien avec une surdose d’anesthésique).

Choix des espèces

Les deux espèces choisies sont : la grenouille verte Pelophylax spp. et le xénope Xenopus laevis. L’objectif de cette étude est de comprendre l’impact de la présence des têtards de xénopes lisses Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis quelques années dans les mares, cours d’eau et rivières de Maine-et-Loire. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé. Aujourd’hui, il apparaît donc nécessaire de comprendre l’impact de la colonisation du xénope dans sa globalité dès les plus jeunes stades de vie.

20 furets vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre moitié confiée pour adoption. Tous reçoivent un implant crânien lors d'une chirurgie de quatre à six heures, puis une cinquantaine de séances d'enregistrement cérébral sous contention, motivées par une privation d'eau. Dix furets sont tués pour analyse histologique du cerveau, les dix autres explantés lors d'une seconde chirurgie puis remis à des organismes d'adoption. Le porteur justifie l'usage du furet par son cortex plissé et une gamme auditive proche de celle de l'humain, et retient les femelles 'en raison de leur petite taille'.

Objectifs

Écouter dans des situations réalistes est un processus actif qui engage nos capacités de perception et de réflexion. Cela donne du sens à la parole, permet à la musique de nous émouvoir et aux sons de notre environnement d'avoir de l'importance. Grâce à notre écoute, nous, les humains et les autres animaux, sommes capables de naviguer à travers des paysages sonores complexes, de distinguer des sources sonores mélangées, de comprendre des messages et d'évaluer leur signification pour nos comportements. Ces compétences sont vraiment remarquables et nous dépassent souvent. Même les systèmes d'ingénierie audio les plus sophistiqués n'arrivent pas encore à égaler ces performances étonnantes. Le projet de recherche a pour objectif d'étudier une nouvelle approche de l'audition qui considère l'écoute comme un processus interactif entre nos facultés sensorielles et notre réflexion. Nous voulons intégrer la cognition (c'est-à-dire notre façon de penser et de prendre des décisions) comme une partie essentielle du traitement de l'information sonore, ce qui peut être étudié au niveau de notre activité cérébrale. En d'autres termes, nous cherchons à comprendre comment notre cerveau s'adapte rapidement lors de l'écoute, tant au niveau des neurones individuels que des groupes de neurones travaillant ensemble. Ce processus d'adaptation rapide est appelé "plasticité rapide". Il se manifeste à différents niveaux de notre système auditif, depuis l'oreille interne (cochlée) jusqu'au cortex auditif et préfrontal de notre cerveau. En résumé, ce projet de recherche explore comment notre cerveau traite les sons de manière active et flexible, en utilisant à la fois nos facultés sensorielles et cognitives. En comprenant mieux ces mécanismes, nous pourrons élargir nos connaissances sur l'écoute et développer de nouvelles avancées dans le domaine de l'audition.

Bénéfices attendus

Le projet s'appuie sur les travaux des chercheurs en charge du protocole réalisés lors de la dernière décennie sur la physiologie et la modélisation informatique de ces phénomènes. Ces efforts ont abouti à la découverte de plasticité rapide dans le cortex auditif, au niveau du neurone unique et de populations de neurones. Ils ont aussi conduit à l'élaboration d'un modèle neuromimétique de traitement auditif qui ont mené à des percées technologiques et à des applications concrètes. Ils ont enfin permis d’utiliser une technologie de neuroimagerie large-champ chez le furet. Ce projet étendra ces recherches et intégrera de nouveaux paradigmes psychophysiques puissants pour sonder l'écoute active chez l'homme. S'appuyant sur ces domaines très complémentaires et plusieurs innovations techniques (reconstruction de stimulus à partir d'enregistrements de neurones à grande échelle chez les animaux réalisant une tâche de comportement, nous espérons promouvoir une vision nouvelle de la perception auditive et de la cognition. Cela contribuera également de manière significative à des avancées significatives dans le domaine du traitement du signal pour les prothèses auditives cliniques, étant donné que de nombreuses limitations actuelles ne sont pas technologiques, mais plutôt conceptuelles.

Procédures

Tous les animaux (n=20) sont équipés d'un implant crânien lors d'une première chirurgie qui se fait sous anesthésie et analgésie (durée 4-6h). Cet implant permet ensuite de réaliser des enregistrements neuraux en électrophysiologie ou en neuroimagerie fonctionnelle par ultrasons (procédures répétées autour d'une cinquantaine de fois en moyenne par animal, entre 3 et 5 fois par semaine, durée moyenne d'enregistrement 3h). Une partie de la cohorte sera euthanasié (sous sédation et anesthésie ; n=10). L'implant crânien est retiré des animaux qui ne sont pas euthanasiés (n=10 - voir 5.8 + 5.9), lors d'une seconde chirurgie sous anesthésie et analgésie (durée 3h).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale se faisant sous anesthésie, un risque anesthésique est présent. Au long-terme, il existe aussi un risque infectieux. Par ailleurs, les enregistrements neuraux se font chez l'animal en situation de contention. La contention des animaux est nécessaire dans le cadre des enregistrements et pourra être génératrice de stress et d’inconfort pour l’animal. De plus, le comportement sera motivé par une privation hydrique qui pourra entraîner une sensation de soif de courte durée chez l’animal.

Devenir

L'euthanasie est nécessaire pour réaliser une analyse post-mortem des tissus cérébraux. Cette méthode n'est utilisée que pour les animaux dont la localisation des injections ou des enregistrements électrophysiologiques aigus par histologie post-mortem est nécessaire (n=10). Pour l'ensemble des autres animaux (n=10), nous retirons l'implant crânien à la fin de l'expérimentation quand cela est possible, afin de les confier à des organismes chargés de trouver des particuliers qui souhaitent adopter nos animaux.

Remplacement

Afin de pouvoir comprendre le traitement de l'information sensoriel dans les cortex auditifs, visuels et frontaux, il est nécessaire d'avoir recours à des animaux vivants pour pouvoir enregistrer l'activité neurale, que ce soit de neurones uniques en électrophysiologie ou les flux hémodynamiques en imagerie large-champ. Ce type d'enregistrement n'est pas réalisable chez des êtres humains. Par ailleurs, le furet constitue un animal modèle nécessaire à la compréhension de la perception auditive dans un contexte de prise de décision. En effet, il est capable d'apprendre des tâches complexes et de percevoir des sons dans une gamme auditive similaire à celle de l'être humain. Son cerveau à cortex plissé permet aussi d'étudier le rôle fonctionnel des plis corticaux, ce qui n'est pas possible chez le rongeur ou primate à cortex licencéphale.

Réduction

Le type d'expérimentation que nous réalisons permet de réaliser de nombreux enregistrements dans un nombre réduit d'animaux (20 maximum). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance par exemple et qu’il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies en jouets et tunnels divers et régulièrement mis tous ensemble dans une aire de jeu. Durant les week-ends, les animaux ne doivent pas effectuer de tâche comportementale. Leur état de santé est suivi en permanence, en collaboration avec un vétérinaire. Deux réunions du comité de suivi du bien-être animal sont faîtes chaque année, avec un suivi des recommandations du comité dans la durée (durée d'expérimentation, protocole de chirurgie, méthodes d'enregistrement…). Le comportement est motivé par une privation hydrique, raison pour laquelle nous suivons au plus près le poids des animaux ainsi que les marqueurs de bien-être suivants : + Poids – avant et après le week-end ; plus souvent si nécessaire. + État général de l'animal (activité, état global : fourrure, yeux...) – tous les jours. + Observation de l'état général des animaux – hebdomadaire – grâce à une méthode de scoring durant un examen clinique. L'évaluation de l'état général de chaque animal s'appuie sur la grille d'évaluation suivante : - le furet se cache ou de tente de mordre les expérimentateurs (comportement) - le furet cesse de s'alimenter (perte de poids) - le furet cesse de se nettoyer ou gratte de manière excessive un endroit de son corps (aspect du pelage) - état d'hydratation de l'animal (test du pli cutané) - état de l'implant crânien. Le protocole de chirurgie inclut l’administration d’anti-inflammatoire et d’anti-douleur en pré- et post-opératoire et les opérations sont réalisées sous analgésie et anesthésie. Sur le plan expérimental, un effort constant nous pousse vers le raffinement des différentes étapes de nos procédures. Tout d’abord nous portons un grand soin à l’habituation préalable à la contention chez les animaux implantés. Nous développons la pose de systèmes d'enregistrements chroniques chez les animaux pour obtenir des sessions d'enregistrements plus courtes. Enfin nous explantons un grand nombre d'animaux, quand cela est possible, à la fin de l'expérimentation, afin de les replacer.

Choix des espèces

Les furets apprennent rapidement une tâche ; ils ont par ailleurs une large gamme auditive, similaire à celle de l'homme. Leur cerveau est assez grand pour utiliser des électrodes avec 200 contacts. De plus leur cortex est convolué ; ces plis corticaux ne sont pas présents chez le rongeur à l’inverse de nombreux primates. Le furet permet d’étudier un putatif rôle fonctionnel de ces plis. Les individus femelles sont préférés en raison de leur petite taille. Les animaux ont entre 6 mois et 1 an quand ils arrivent au laboratoire, âge auquel ils sont adultes ; ce stade est choisi car le développement du cerveau est alors terminé.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles subissent une chirurgie de 25 minutes avec incision de la peau et exposition répétée du muscle au froid, sur chaque patte antérieure, avant d'être tuées pour prélèvements. Le porteur étudie le rôle de la protéine PARP3 dans la régénération musculaire, à partir de résultats déjà obtenus in vitro. Il présente la validation in vivo chez la souris comme nécessaire et renvoie les molécules thérapeutiques au 'plus long terme'.

Objectifs

Le projet concerne l’étude de PARP3 (i.e Poly(ADP-ribose) polymérase 3), une protéine qui joue un rôle déterminant dans la réparation des cassures dans l’ADN. Des expériences réalisées avec des modèles cellulaires révèlent un rôle important de cette protéine dans la différenciation de cellules souches musculaires en myotubes, un évênement clé de la régénération musculaire qui permet de réparer un muscle endommagé. Les objectifs du projet sont de vérifier ce rôle in vivo chez la souris.

Bénéfices attendus

La régénération musculaire est altérée dans plusieurs pathologies musculaires comme la dystrophie musculaire. De plus chez un sujet sain, la capacité de régénération musculaire diminue au cours du vieillissement. Notre projet qui vise à comprendre comment la protéine PARP3 intervient dans la régénération musculaire, va permettre à plus long terme de concevoir des molécules thérapeutiques agissant sur PARP3 pour activer la régénération musculaire.

Procédures

Les souris anesthésiées sont soumises à une procédure chirurgicale qui implique une incision de la peau du Tibialis antérieur, une exposition répétées du muscle squelettique au froid (3X). La plaie est ensuite suturée avec une colle chirurgicale. Au total, les animaux subissent une chirurgie d’une durée de 25 minutes qui est réalisée sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

La procédure mise en oeuvre conduit à une plaie suturée sur chaque patte antérieure de l’animal qui cicatrise en moins de 24h. Une nécrose du tissu musculaire ne peut pas être écartée mais est un évênement rare.

Devenir

Les souris sont mises à mort après la chirurgie pour prélèvements.

Remplacement

Des expériences préliminaires réalisées in vitro avec des modèles cellulaires ont permis d’identifier une protéine appelée PARP3 dans la régénération musculaire. La validation de ces résultats nécessite des approches in vivo chez la souris. La procédure que nous proposons est classiquement utilisée dans le domaine.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux nécessaire à ces approches in vivo a été très précisément réfléchi. Les questions in vivo entreprises dans ce projet reposent sur des données in vitro déjà bien caractérisées. Il ne s’agit donc pas d’une étude exploratoire chez la souris mais de la validation in vivo d’un résultat existant. Le nombre d’animaux indiqué est calculé sur la base d’une validation statistique. Pour réduire le nombre d’animaux, des groupes de 6 souris seront utilisées pour chaque condition expérimentale permettant des études statistiques précises. Nous effectuerons d’abord une première série d’expériences (1 replicat) et analyserons toutes les données avant de réaliser le 2ième replicat. Celui-ci ne sera réalisé que si des résultats pertinents sont observés avec le premier replicat.

Raffinement

La procédure est réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux peuvent être maintenus en groupe et un enrichissement des cages est mis en place (papier kleenex pour nidification, bâtonnets de bois, rouleau en carton). Des points limites précoces et sur le temps de la procédure ont été définis, une grille de score a été établie avec des actions à mener permettant de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus pertinent pour ce projet en raison des similitudes décrites dans la littérature entre les pathologies musculaires de la souris et celles de l’homme. De plus, ce projet repose sur l’utilisation de souris déficientes en PARP3 générées au laboratoire. Des jeunes adultes (6-8 sem) et souris âgées (12/18 mois) sont utilisées pour évaluer l'impact du vieillissement.

300 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein triple-négatif humain leur sont injectées dans les tissus mammaires sous anesthésie, pour étudier le rôle du gène HLF dans l'infiltration des tumeurs par les cellules immunitaires. Le porteur annonce une douleur légère au réveil et une gêne liée à la croissance tumorale qu'il dit limitée, puis une mise à mort pour analyses post-mortem. Il affirme que seul 'un animal vivant, entier' permet d'étudier ces interactions et juge le recours à la souris 'indispensable', les applications thérapeutiques restant hypothétiques.

Objectifs

Le cancer du sein est devenu en 2020 le type de cancer le plus fréquent à l’échelle mondiale, avec plus de 2 millions de nouveaux cas diagnostiqués chez les femmes. Le cancer triple négatif (TNBC pour Triple-negative breast cancer) est l’une des formes les plus agressives et est associé à des rechutes plus précoces, plus fréquentes et à un mauvais pronostic vital. Il a été montré qu’un niveau élevé d’infiltrats lymphocytaires intra tumoraux après chimiothérapie chez les patients TNBC est corrélé à un excellent pronostic, suggérant que la surveillance immunitaire anti-tumorale joue un rôle crucial dans l’évolution des cancers TNBC. Grâce à des analyses bioinformatiques, nous avons identifié un gène dont l’expression pourrait inhiber l’attraction des cellules immunitaires dans les tumeurs et donc, potentiellement être utilisé comme cible thérapeutique dans le traitement de ce type de cancer. Nous avons supprimé ou diminué son expression et donc ses fonctions dans des lignées tumorales humaines TNBC. Des travaux réalisés in vitro nous ont confortés dans le rôle joué par notre gène d’intérêt dans l’infiltration des tumeurs par les cellules immunitaires et souhaitons maintenant déterminer son influence dans l'organisme. Pour se rapprocher du modèle humain, nous injecterons des cellules tumorales humaines TNBC parentales ou inactivées pour le gène étudié dans les lignées de souris immunodéficientes.

Bénéfices attendus

Ce projet transversal est issu d’observations cliniques indiquant que lorsque le gène HLF est surexprimé dans les cellules tumorales de patientes souffrant de cancer de type TNBC, une inhibition de la réponse immunitaire, en particulier de l’activation d'un sous-type de globules blancs est observée et corrélée à un mauvais pronostic. Des études in vitro en cours nous suggèrent que ce gène est bien impliqué dans la régulation de mécanismes moléculaires et cellulaires associés à l’attraction et la fonction de ces cellules blanches. L’étude dans l'organisme de l’infiltration des tumeurs TNBC exprimant ou non HLF est indispensable afin de confirmer le rôle joué par ce gène dans la réponse immunitaire anti-tumorale au sein du microenvironnement et en particulier dans la régulation des fonctions des cellules impliquées dans la lutte anti-tumorale. Ces connaissances fondamentales sont également essentielles pour passer à la phase suivante de recherche plus translationnelle et de déterminer si le gène HLF pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ce type de cancer très agressif de mauvais pronostic. Des inhibiteurs de ce gène identifiés par criblage à haut débit sont actuellement en cours de caractérisation in vitro au laboratoire.

Procédures

Injection de cellules tumorales au niveau des tissus mammaires après anesthésie générale: une fois par animal, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances seront liées aux injections: légère douleur au réveil après injection des cellules tumorales et à la gêne physique induite par la croissance des tumeurs: limitées car la taille des tumeurs sera très limitées. Ces tumeurs n'entraînent pas d'autres nuisances.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des tumeurs et leurs extensions éventuelles. Nous avons de solides résultats préliminaires in vitro qui suggèrent que notre gène d’intérêt joue un rôle important dans le recrutement et l’activation de certaines cellules blanches dans la lutte anti-tumorale dans les cancers du sein de type triple négatif. Il est indispensable pour notre projet de tester nos hypothèses in vivo dans un modèle de souris immunodéficientes greffées par des tumeurs humaines ayant conservé sa population de cellules blanches, ou dans un modèle murin humanisé pouvant être reconstitué avec des cellules humaines, et recevant des greffes de tumeurs humaines.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance. Pour certaines expériences, une étape de sélection de lignées triple-négatif sauavges et déplétées pour le gène d'intérêt à étudier seront réalisées in vitro afin de réduire au maximum le nombre de souris. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un triatement. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. L'eau et la nourriture leurs sont proposés à volonté et lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire adapté leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

Nous avons développé des lignées de cancer triple-négatif humaines inactivées ou non pour le gène d'intérêt qui seront injectées chez des souris immunodéficientes. Nous avons choisi l'espèce souris car ces souris immunodéficientes permettent d'étudier les tumeurs humaines sans rejet. Ces souris présentent également l’avantage d’avoir conservé la production des globules blancs sur lesquels nous avons centré notre projet. Le cancer étudié apparaissant chez les adultes, les animaux auront entre 7-15 semaines au début des procédures.

2100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une crème inflammatoire est appliquée chaque jour pendant onze jours pour induire un psoriasis, après tonte ou épilation, avec deux prélèvements sanguins, avant la mise à mort pour analyser peau, rate et ganglions. Le porteur précise qu'aucun analgésique ne sera administré car il fausserait la réponse immunitaire étudiée, alors que l'inflammation peut provoquer des plaques cutanées et, dans les cas les plus graves, une atteinte articulaire gênant les déplacements. Il décrit ces expériences comme des prestations réalisées pour des laboratoires privés et publics cherchant à valider des modèles génétiquement modifiés.

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact d’une inflammation cutanée sur le système immunitaire suite à la modification de gènes cibles. Les maladies inflammatoires de la peau telles que la dermatite atopique et le psoriasis touchent près de 3% de la population mondiale. Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui se manifeste par des plaques rouges présentant des squames. Il s'agit le plus souvent d'une maladie bénigne, mais il existe des formes sévères (environ 20% des cas), associées à une atteinte généralisée et/ou à des douleurs articulaires. Bien que la pathogenèse ne soit pas entièrement comprise, d'intenses recherches sont en cours pour explorer les mécanismes sous-jacents impliqués. L’objectif de ce projet est d’évaluer la réponse immunitaire après l’induction de psoriasis de souris contrôles ou d’animaux génétiquement modifiés. Le modèle de souris traité via une crème inflammatoire est l’un des modèles les plus largement utilisé pour étudier le psoriasis. Ainsi, nous utiliserons ce modèle et nous appliquerons localement de la crème inflammatoire sur la peau des souris au niveau du dos ou des oreilles afin d’induire une dermatite de type psoriasis pour évaluer la réponse immunitaire suite à la modification de gènes cibles.

Bénéfices attendus

Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative la capacité d’un modèle murin à répondre à une inflammation cutanée.

Procédures

Pour induire une inflammation cutanée de type psoriasis, les souris seront soumises à plusieurs interventions : 1) La préparation de la peau par tonte d’une durée de 30 secondes en vigile ou par épilation d’une durée de 15 minutes par anesthésie générale gazeuse en fonction de la demande du partenaire. La préparation de la peau se fait qu’une seule fois au début de l’expérimentation. 2) L’application quotidienne de crème inflammatoire d’une durée de 3 minutes par anesthésie générale gazeuse, et ce, sur une période de 11 jours maximum. 3) Deux collectes de sang d’une durée de 30 secondes sur souris vigiles par voie submandibulaire à l’aide d’une lancette pour recueil du sérum. 4) Des pesées un jour sur deux d’une durée de 30 secondes, et ce, sur une période de 11 jours maximum. 5) A la fin de l’expérimentation les souris sont mises à mort pour l’analyse de la peau, la rate et les ganglions.

Impact sur les animaux

L’induction de psoriasis par application quotidienne de crème inflammatoire cause une inflammation localisée sur la peau des souris. Cette inflammation se reflète par des érythèmes (léger à très marqué) ainsi que des plaques cutanées, et ce, sur une durée de 11 jours maximum. Dans les cas les plus grave, une atteinte articulaire peut être observée pouvant causer des difficultés à se déplacer pour se nourrir et s’hydrater. Ces signes cliniques ne pourront être soulagés par la prise d’analgésique car nous étudions la réponse immunitaire et toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Lors de l’expérimentation les animaux sont suivis quotidiennement et une grille de score et des points limites sont préalablement établis afin de réagir rapidement face aux premiers signes de souffrance chez la souris. L’ajout de Gel Diet / pâtée SAFE Energy et d’hydrogel pourront améliorer les conditions de vie des animaux. Les manipulations des souris pour la tonte, le recueil de sang ou pour l’application quotidienne de la crème inflammatoire peuvent générer du stress chez la souris mais sont indolores. Nous veillerons dans chacun de nos actes au respect du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’experience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire ou pour l’histologie.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.

2 766 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des gavages, des injections sous anesthésie, jusqu'à une trentaine de prélèvements sanguins et une irradiation, pour étudier le rôle d'une protéine, TET2, dans le développement de lymphomes B. Le porteur indique qu'un tiers des souris dont ce gène est inactivé développe une maladie proche d'une leucémie, qu'il décrit comme asymptomatique. Il reconnaît mener des approches in vitro en parallèle mais conclut que le recours à l'animal reste "indispensable" pour tenir compte du micro-environnement et du système immunitaire.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de déterminer le rôle de la déficience en une protéine impliquée dans les hémopathies malignes chez l'Homme (TET2) dans la production de lymphocytes à l'origine des anticoprs et en particulier dans les lymphomes de type B. Nous avons montré, avec d'autres, que la déficience en Tet2 murine affecte la maturation terminale des lymphocytes B, en altérant leur différenciation . Ce blocage de la différenciation est associé à plusieurs caractéristiques des lymphomes B, en particulier ceux présentant des mutations inactivatrices de TET2. Le but de ce projet est donc de mieux comprendre le rôle de TET2 dans la maturation lymphoïde B, lors de la réponse immunitaire adaptative, ainsi que les mécanismes à l'origine du développemment des lymphomes B chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mieux comprendre le rôle de TET2 dans la maturation lymphoïde B lors de la réponse immunitaire adaptative ainsi que les mécanismes à l'origine du développement des lymphomes B chez l'Homme. Il pourra y avoir des applications sur la prise en charge des patients porteurs de ces tumeurs, par une meilleure compréhension de la maladie et l'identification éventuelle de cibles thérapeutiques

Procédures

Gavages : nombre= 3, durée = 30 secondes. Injections (une à trois) :durée 5 minutes sous anesthésie générale. Prélèvements de sang :1 à 30 : durée 5 minute sous anesthésie générale. Irradiation (non léthale) à dose moyenne: durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les interventions sur les animaux (gavages, injections, irradiations et prélèvements de sang) induiront des nuisances temporaires et transitoires de type douleur légère. L’inactivation de Tet2 n’entraîne pas de conséquence notable avant 6-9 mois. Lorsque Tet2 est absent dans les cellules souches, une fraction (1/3) des souris développe alors une maladie de type leucémie myélomonocytaire chronique asymptomatique. Quand Tet2 est inactivé spécifiquement au cours de la différenciation lymphoïde B, la même fraction des souris montre une accumulation de lymphocytes B1a, sans aucun symptôme associé.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédure pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Nous utilisons en parallèle des approches in vitro, qui permettent de reproduire une partie de la maturation lymphoïde B. il s'agit de stimulation des lymphocytes B naïfs triés à partir de suspension cellulaires de rate, par diverses molécules pour mimer la maturation T-indépendante, CD40L + IL4 pour mimer la maturation T-dépendante des lymphocytes B. nous avons aussi développé une approche plus complexe, qui s'approche un peu plus des conditions in vivo, sur des cellules certains gènes en présence d'une cytokine. ces approches permettent d'obtenir beaucoup de cellules pour certaines analyses biochimiques, donc de réduire les analyses in vivo, qui restent néanmoins indispensables. L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est en effet indispensable car il est important de pouvoir prendre en compte l’ensemble des interaction des cellules mutées (et tumorales) avec l’organisme, du micro-environnement au système immunitaire complet. Ces aspects ne peuvent pas être reproduit in vitro.

Réduction

Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés et nous privilégierons toute étude in vitro sur modèles cellulaires établis, ou sur cellules primaires de patients, nous permettant de valider nos hypothèses de travail. Le nombre d'aimaux nécessaire et suffisant a été déterminé par calcul de puissance. Les résultats seront analysées par des méthodes statistiques.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour examen clinique, et dès l'apparition d'un signe de contrainte ou de douleur, les animaux recevront un traitement ou des mesures palliatives. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. L'eau et la nourriture leurs sont proposés à volonté et lorsque les animaux présentent une faiblesse, un aliment adapté leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’animal vertébré le plus adapté et utilisé dans la recherche translationnelle sur les cancers et les tests de toxicité, aussi bien qu'en recherche fondamentale. Cela se traduit par un accès à une quantité importante de publications scientifiques et de techniques détaillées essentielles à nos études. Des animaux adultes seront utilisés au vu des pathologies concernées.