Procédures modérées

15 600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée sous la peau sous anesthésie, puis ils reçoivent des traitements pouvant aller jusqu'à deux administrations par jour pendant plusieurs semaines, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine jusqu'à un diamètre de 20 mm chez la souris et 40 mm chez le rat. Ce dispositif sert au criblage in vivo de molécules anticancéreuses candidates, sur l'un des effectifs les plus élevés du lot. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit ces procédures et qualifie le recours à un "organisme entier" d'"indispensable".

Objectifs

Le cancer affecte des millions de personnes chaque année. Cette pathologie a donc des impacts sociaux et économiques majeurs sur les patients et le système de santé. Les thérapies actuellement disponibles pour traiter le cancer ont une efficacité limitée pour certaines indications comme le cancer du pancréas ou le cancer du poumon et les effets secondaires des traitements limitent considérablement leur utilisation. Il y a donc un besoin urgent de trouver des molécules efficaces nouvelles ou en repositionnement ayant un effet anti-cancéreux démontré. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte du cancer avec la mise en place de modèles avec greffe de cellules cancéreuses par voie sous-cutanée chez la souris ou le rat. L’objectif est d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels ou de molécules en repositionnement sur la croissance tumorale. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de nouvelles molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, ces études permettront de trouver potentiellement de nouveaux médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes. Ce projet a déjà été déposé en 2018.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet sur la croissance tumorale. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments anticancer sur différents types de tumeurs dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes.

Procédures

Tous les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane pendant 3 minutes afin d’injecter, en sous-cutanée, les cellules cancéreuses (excepté le groupe 1 qui reçoit du PBS) au niveau du flan. Au cours de l’expérience, les animaux recevront des traitements (véhicule, molécule à tester ou molécule de référence). La voie d’administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, par voie orale ou par voie sous-cutanée, sur animaux vigile. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée Cela pourra être une à sept fois par semaine, jusqu’à 2 fois par jour pendant plusieurs semaines. Sur animal vigile pris en contention, la taille des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse jusqu’à la fin de l’étude. La technique non invasive du laser doppler pourra être utilisée une fois par semaine pour une vingtaine de minutes par animal, après une anesthésie par isoflurane. Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour déterminer les scores des points limites.

Impact sur les animaux

Du fait de l’implantation de cellules cancéreuses, l’animal va développer une tumeur solide en sous-cutanée qui va grossir au cours du temps. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

Euthanasie pour récupérer les tumeurs et différents organes pour analyses

Remplacement

Ce projet se focalise sur un modèle intégré d’étude du développement tumoral et/ou de l’angiogenèse (mesure du flux sanguin intra-tumoral) nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ce système est indispensable pour reproduire la physiologie d’un organisme entier permettant la formation de la tumeur. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant ces procédures expérimentales. Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux pour pouvoir tester l’effet du traitement sur la croissance tumorale dans un contexte physiologique.

Réduction

Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique. Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des lignées cancéreuses qui auront répondu au traitement lors d’études in vitro préliminaires afin de limiter l’utilisation des animaux.

Raffinement

La procédure d’implantation en sous-cutanée des cellules cancéreuses se fera sous anesthésie générale afin de bien maîtriser le geste et que la tumeur soit placée à un endroit qui ne gêne pas l’animal. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude. Ainsi, les animaux seront surveillés au moins une fois par semaine puis au moins deux fois par semaine une fois que les tumeurs seront palpables. Une surveillance plus fréquente peut être nécessaire lorsqu'une croissance tumorale rapide est attendue, lorsque les tumeurs approchent du point final ou si l'état de l'animal commence à se détériorer. De nombreux paramètres seront enregistrés, au niveau physique et comportemental. Les animaux montrant une douleur sévère et montrant des signes de détresse (dyspnée, convulsions, plégie…) seront mis à mort immédiatement. Les points limites sont définis selon les Directives de l’OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : une perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, une hypothermie, une absence prolongée de réponse volontaire à un stimulus externe comme le bruit, des problèmes ambulatoires empêchant l’animal d’accéder à la nourriture ou à l’eau/anorexie prolongée, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou ulcération de la peau etc. De plus, la taille de la tumeur sera mesurée 2 fois par semaine et est limitée un diamètre maximal de 20 mm pour la souris adulte et de 40 mm pour le rat adulte, sous réserve d’euthanasier pour raison éthique. L’état et l’emplacement de la tumeur seront également inspectés régulièrement pour déceler par exemple la présence de nécrose ou ulcération importante au sein de celle-ci ou si la tumeur est mal placée pouvant gêner les mouvements de l’animal. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés (voir annexe 2). Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques. Lors des prélèvement de sang terminaux, une analgésie de l’animal sera effectuée (buprénorphine ou lidocaïne respectivement pour un prélèvement intra-cardiaque ou rétro-orbital).

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, du fait de leurs tailles et leurs spécificités, ils permettent l’étude et le suivi du développement tumoral d’un point de vue morphologique, histologique et moléculaire. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études en cancérologie en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Différentes souches pourront être utilisées en fonction des espèces (voir tableau récapitulatif en annexe 1). Un animal immunodéficient (comme la souris ou le rat Nude ou la souris SCID) sont classiquement utilisés pour ce type d’étude, ce qui permet l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Il s’agit d’un modèle non dommageable à l’état basal. Si les cellules greffées sont d’origine murine, des animaux immunocompétents seront utilisés. Ce sont des modèles de laboratoire bien connus avec suffisamment de données historiques. Ces projets permettront le suivi de l’impact de traitement sur le développement tumoral de cellules greffées. Les animaux seront âgés de 5 à 8 semaines au moment de l’injection des cellules tumorales, à un stade de jeune adulte où le pouvoir prolifératif des cellules reste important sans avoir à toucher au développement normal de l’animal.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie du cerveau sous anesthésie pour y injecter des virus, d'autres un jeûne de 24 heures, des injections répétées et un régime gras destiné à les rendre obèses, afin d'étudier le rôle d'une protéine dans la prise alimentaire. Le porteur décrit la découverte récente d'un gène jusque-là inconnu et renvoie les applications contre l'obésité et le diabète à un horizon lointain. Il affirme avoir déjà validé son approche in vitro mais conclut au "besoin" de la souris, seule à réunir les organes en jeu dans la régulation énergétique.

Objectifs

Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel autour d'une constante. Une dérégulation du système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont fortement associées comme le diabète. Nous avons récemment mis en évidence une fonction inattendue d’une protéine dans la régulation de l’appétit. Nos données mettent en évidence le rôle d’un variant génétique associé au diabète de type 2. Toutefois le mécanisme moléculaire sous-jacent à cette découverte reste incomplet. Nous avons récemment identifié un nouveau gène jusqu’alors inconnu qui pourrait contribuer à la régulation de l’appétit chez la souris. Nos données préliminaires confirment que cette nouvelle cible pourrait représenter un nouveau mécanisme favorisant l'obésité. Par conséquent, ce projet vise à comprendre comment cette protéine est impliquée dans l’homéostasie énergétique.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'une nouvelle protéine clé dans la régulation neuronale de la prise alimentaire et du comportement alimentaire. Cette étude est pertinente et innovante pour plusieurs raisons. Nous avons déjà montré le rôle spécifique de cette voie de signalisation dans le contrôle de la prise alimentaire, une fonction qui n'avait jamais été mise en avant jusqu’à présent. Comme le contrôle de la prise alimentaire est très complexe, les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage le mécanisme moléculaire impliqué dans la prise alimentaire et le gain de poids. Cette étude nous permettra de déterminer si cette protéine jusqu'alors inconnue est une nouvelle cible thérapeutique dans l’obésité.

Procédures

320 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Les 320 animaux (+160 pas de stéréotaxie) seront soumis à des tests métaboliques (1 test par semaine - 2 tests prévus). Pour chaque test ils subiront 4 injections IP (1inj/jour pendant 4 jours - durée 10 sec/inj). 240 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids.

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou shRNA. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post- chirurgicale. Différents tests métaboliques sont décrits dans ce projet: Le premier est un test de sensibilité à la ghréline (hormone de la faim). Une habituation des animaux sera nécessaire. Pour ce faire, une injection IP de NaCl 0.9% sera réalisée quotidiennement pendant 3 jours. Le jour du test les animaux subiront une injection IP de ghréline qui stimulera leur appétit. Le deuxième est un test de réalimentation après un jeûne de 24H. L'effet de la mise à jeun sera la stimulation de leur appétit et une perte de poids passagère. Une diète riche en gras pour créer un environnement obésogène sera mis en place chez les souris, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

Toutes les validations experimentales in vitro ont été réalisées. Nous avons ainsi apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Pour tester nos hypothèses, nous avons besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 480 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les chirurgies stéréotaxiques potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formée spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

Pour l'étude du métabolisme, la souris est un modèle animal déjà validé. D’autre part, l’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées. Les chirurgies stéréotaxiques pour l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux âgés de 18 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-nasales répétées, jusqu'à 44 par animal sur cinq mois, puis passent des tests de locomotion, de mémoire de reconnaissance et de localisation d'objets et de mémoire spatiale, pour mesurer si un dérivé de plastique, le DEHP, aggrave une maladie du cerveau. Le porteur qualifie l'inconfort de bref, limité au stress de la contention, tout en admettant que les animaux pourraient présenter des signes de détresse en cas de forte toxicité. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative cellulaire ne convient et présente la souris comme un "outil unique" pour cette étude.

Objectifs

Les molécules comme le DEHP (phtalate) sont des produits chimiques synthétiques largement utilisés dans de nombreux produits plastiques de consommation courante. Ils ne sont pas chimiquement liés aux polymères plastiques et sont facilement libérés dans l'environnement. Des études récentes rapportent pour la première fois une contribution potentielle du DEHP à une maladie du cerveau chez l’Homme (la maladie à corps de Lewy). L’objectif de ce projet est de déterminer si les dérivés de plastiques (comme le DEHP) représentent un facteur de risque d’une maladie du cerveau, en tant que polluants environnementaux. Cette maladie est modélisée chez le rongeur (souris), et ce projet vise à tester l’effet du DEHP sur le comportement des animaux et d’étudier les mécanismes mis en jeu. Nous avons choisi le mode d'administration intra-nasal car nous pensons que l'entrée par la voie respiratoire imitera mieux l'influence environnementale de la toxicité du DEHP chez les humains. De plus, il a été démontré que ce mode d'administration permet d'obtenir une délivrance rapide et concentrée au cerveau. Une étude pilote visera tout d’abord à définir la dose de phtalate qui sera administrée aux souris saines ou modèles de la maladie, permettant la détection cérébrale de ces produits (et dérivés) dans le cerveau après injection. Un phénotypage comportemental et un phénotypage moléculaire et cellulaire seront ensuite réalisés suite à l’administration chronique de DEHP. Les objectifs sont de comprendre si le DEHP aggrave la maladie en touchant des paramètres impliqués dans la progression de la pathologie, ainsi que les fonctions de mémoire.

Bénéfices attendus

En utilisant des modèles animaux de pathologies humaines, cette étude permettra de mettre en évidence si l’administration d’une molécule dérivée de plastique présent dans de nombreux produits usuels, le DEHP, représente un facteur de risque dans une maladie du cerveau (maladie à Corps de Lewy). De plus, nos études montreront également si cette molécule affecte le cerveau de l’animal sain. La mise en évidence d’un lien de cause à effet permettra de comprendre certains aspects cliniques chez l’Homme. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles permettront d’adapter de nouvelles thérapeutiques chez l’Homme. En apportant des bases mécanistiques à leur mode d’action, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet toxique de ces molécules sur le cerveau. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes pour la mise en garde contre certaines toxicités environnementales. Elles permettront de mettre en place des politiques de prévention. Enfin, ce projet comprend les analyses sur les souris mâles et femelles. Le DEHP est un perturbateur endocrinien et a des effets différents sur les deux sexes, avec notamment une baisse de la testostérone chez le mâle. En apportant une analyse complète des différences entre mâles et femelles, ce projet apportera donc un bénéfice sur la compréhension de mécanismes spécifiquement liés au sexe, dans la toxicité cérébrale de DEHP, mais aussi dans les facteurs de risque de la maladie.

Procédures

72 souris vigiles adultes (6 mois) recevront des injections (5 secondes) à raison de 1X/jour pendant 6 jours. 216 animaux vigiles recevront des injections (5 secondes) à raison de 2X/semaine pendant 5 mois (22 semaines), soient 44 injections par animal. Comportement réalisé sur 72 animaux vigiles sur une période de 41 jours/animal, période durant laquelle les animaux sont hébergés en cage individuelle pour tester leur locomotion (2 nuits et 3 jours), leur mémoire de reconnaissance et de localisation d’objets (15 minutes par essais, 2 essais/jours, 5 jours) et enfin test de mémoire spatiale à long terme (1 minute/essai, 4 essais/jours, 6 jours) suivis d’1 test après 24h (1 minute/animal) et 21 jours (1 minute/animal). Les souris transgéniques modèle de maladie développent des déficits mnésiques à l’âge de 12 mois.

Impact sur les animaux

Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger liées au stress de la contention des souris au moment de l’administration de molécule. L’inconfort ne durera que très peu de temps, juste pendant et après l’injection. Selon notre hypothèse que le DEHP représente un facteur de risque de la MCL, nous attendons une aggravation de la pathologie. Les animaux pourraient présenter des signes de détresse si une forte toxicité du DEHP devait se répercuter au niveau systémique. Cependant, la littérature ne documente pas ce type d’effet aux doses testées dans ce projet chez des souris adultes..

Devenir

Tous les animaux (288) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un traitement pharmacologique, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 18 souris/groupe (9 mâles et 9 femelles) pour le comportement et 12 souris/groupe (soit 6 mâles et 6 femelles) pour les approches moléculaires et 24 souris/groupe (soit 12 mâles et 12 femelles) pour l’imagerie cérébrale. L’efficacité de chaque traitement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ceux-ci bénéficieront de soins appropriés pour optimiser le bien-être des souris, tels que des éléments d’enrichissement (matériel de construction du nid, barre à ronger) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux, sauf pour la durée des tests de comportement où ils seront isolés (1/cage). Dans ce cas, plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Les souris seront manipulées à l’aide de tubes spécifiques pour réduire le stress lors des changes (permet de nettoyer les cages sans toucher la souris). Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir après l’administration de molécule DEHP: la surveillance des souris se fait à chaque instillation, soit 2X par semaine (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et elles sont pesées avant chaque administration de molécule, permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors de l’administration des molécules. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront utilisés à l'âge de 7 mois au début du projet et seront analysés à l'âge adulte de 12 mois, ce qui correspond environ à la moitié de la vie d’une souris en laboratoire. Nos études antérieures ont montré que cela correspond au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ces modèles. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées avec de la moelle osseuse, reçoivent des cellules tumorales ou un agent favorisant les tumeurs suivi d'un irritant de l'intestin dans l'eau de boisson, la croissance des tumeurs étant mesurée jusqu'à la fin. L'objet est de comprendre l'épuisement des défenses immunitaires face au cancer, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques restant au conditionnel. Le porteur affirme que le microenvironnement tumoral ne peut être reproduit in vitro, ce qui l'oblige à recourir aux souris.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires (aussi appelé exhaustion). Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’une exhaustion des globules blancs au cours du vieillissement. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer le rôle de ces protéines sur l'exhaustion des réponses immunitaires dans le cadre du cancer.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de préciser le rôle de ces protéines inflammatoires sur les acteurs de la réponses anti-tumorale, notamment sur leur fonction. In fine, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.

Procédures

Irradiation (4 minutes par souris), une injection intraveineuse rétro-orbitaire de cellules de moelle osseuse sous anesthésie générale (15 sec/souris). Pour certaines souris, une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par échographie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).

Impact sur les animaux

L'irradiation peut occasionner une souffrance en cas de mauvaise reconstitution des cellules de la moelle osseuse. L'injection intraveineuse, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever les organes et la tumeur pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale au niveau du tube digestif en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux. Chaque animal chimère permet d'analyser les cellules de deux génotypes différents au sein d'un même animal.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Tous les gestes invasifs réalisés sur les animaux seront faits sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet (pesée et surveillance deux fois par semaine après l'irradiation, mesure de la croissance tumorale trois fois par semaine après l'injection de cellules tumorales, suivi régulier par échographie pour certains animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certaines voies de signalisation dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.

Procédures

Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

200 poules pondeuses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 80 d'entre elles tuées pour l'étude de leur cerveau et 120 replacées ensuite. Elles sont exposées un mois à une lumière faible et à un remaniement de groupe, le picage étudié pouvant occasionner des blessures entre individus. L'objet est de repérer des traits de comportement liés au picage pour fournir aux éleveurs une grille d'identification des poules prédisposées. Le porteur situe ce travail face à l'épointage du bec, pratique qu'il décrit lui-même comme douloureuse et "de plus en plus controversée", et affirme qu'aucun système alternatif ne permet d'étudier le comportement.

Objectifs

Les poules sont des animaux pour qui l’exploration de l’environnement, à la fois physique et social, consiste en une de leurs activités journalières principales. A l’aide de leur bec, en picorant, les poules peuvent mieux connaître leur environnement et interagir avec leurs congénères. Toutefois, si ce picorage devient répétitif et est fréquemment dirigé vers les plumes ou la peau d’autres individus, ce comportement, alors nommé "picage", peut devenir un problème majeur de bien-être animal et, dans des cas extrêmes, entrainer l’apparition de cannibalisme et une augmentation de la mortalité en élevage. Afin de limiter les dégâts causés par le picage, différentes pratiques et stratégies ont été adoptées et testées en élevage au cours des dernières années. Actuellement, la pratique la plus courante contre ce comportement délétère est l’épointage du bec, une pratique douloureuse, de plus en plus controversée. Les autres stratégies consitent en l’ajout d’enrichissments, de changements de lumière ou nutritionnels qui interviennent tous une fois le picage sévère installé. Malheureusement, au mieux, ces stratégies ne font que limiter modérément les conséquences néfastes du picage, lorsque celui-ci est largement répandu. Le présent projet vise à adopter une nouvelle stratégie, basée sur des études récentes, qui indiquent que le picage serait un trait de comportement stable provenant de quelques individus. Ensuite, il se répandrait au sein des élevages par mimméstisme. L’objectif de ce projet est donc de mieux caractériser ce trait de comportement, pour, à terme, être capable de mieux le prédire voire l’anticiper.

Bénéfices attendus

Identifier des traits de comportement qui sont liés au picage chez la poule domestique. Cette étude s’inscrit dans un projet, permettant l’établissement d’une grille de comportements à destination des éleveurs, pour leur permettre un suivi plus précis en élevage en identifiant des animaux ayant une forte prédisposition à exprimer le picage.

Procédures

Les animaux âgés de 10 mois seront exposés à une intensité lumineuse de 20 lux pendant un mois associée (ou non) à un réallotement.

Impact sur les animaux

Le picage peut engendrer des blessures chez l’animal piqué.

Devenir

20 poules piqueuses et non piqueuses de chaque lignée recevront une dose létale d’un euthanasiant pour des études neurobiologiques (comparaison du cerveau de poules piqueuses vs. non piqueuses), soit 80 au total. Les 120 poules restantes seront replacées.

Remplacement

Les études de comportement ne sont pas réalisables in vitro, ni par modélisation. Les comportements étudiés dans ce projet, comme tout comportement, ne s'expriment et ne peuvent se mesurer que sur animal vigile. Il n'existe pas de système alternatif à ces études.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit à son strict minimum tout en permettant d'observer des liens significatifs entre les comportements observés sur la base de nos expériences précédentes sur la personnalité chez cette espèce.

Raffinement

Nous avons fait le choix d’élever les animaux dans des parquets de 10 individus plutôt qu’en grand groupe. Ce choix facilite le suivi du comportement de chaque animal. Il fournit aussi un environnement d’élevage enrichi et confortable (groupe de petite taille et stable, présence de perchoirs, copeaux au sol, nombre importants de nids par poule). De fait il assure aussi un suivi facilité de l’état de santé des animaux (petit groupe d’individus par parquet). Chaque parquet dispose en plus d’une « infirmerie » permettant d’isoler de façon temporaire (avec eau et nourriture) un animal qui le nécessiterait. En cas de perte de poids supérieure à 15%, de prostration ou d’apathie, le responsable du bien-être animal sera informé directement afin de traiter l'animal (retrait dans l’infirmerie, analgésiques et/ou antiseptiques en cas de plaie, ajout de nourriture appétente). Si le traitement ne fonctionne pas, l'euthanasie de l’animal sera réalisée par électronarcose suivie d’une saignée pour confirmer la mort. Pour les observations comportementales les animaux seront habitués au préalable à l’expérimentateur pour éviter que sa présence ne perturbe leur comportement.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’étudier deux lignées de poules qui sont deux lignées génétiques très répandues en élevage de poules pondeuses. Les animaux seront élevés depuis leur éclosion jusqu’à l’âge de 10-12 mois (âge adulte) soit quelques semaines après le pic de ponte. Cette durée permet de réaliser un suivi longitudinal du comportement, indispensable pour l’établissement du répertoire comportemental des animaux.

28 rats vont être utilisés, tous tués à cinquante-six jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une section chirurgicale du ligament croisé du genou provoque une arthrose, puis huit injections de cannabidiol sont faites dans l'articulation, la douleur ne pouvant être soulagée par anti-inflammatoires sous peine de fausser le modèle. L'objet est de tester si le cannabidiol freine les lésions arthrosiques, dans le contexte d'une consommation croissante par les patients. Le porteur affirme qu'aucune méthode in silico ne reproduit ces lésions et juge le modèle rat "indispensable".

Objectifs

L'arthrose est la maladie articulaire la plus répandue. Actuellement en France, 10 millions de personnes souffrent de cette pathologie. L'arthrose est une maladie complexe et sevère qui altère fortement la qualité de vie des patients. Elle se caractérise par une destruction du cartilage qui s'étend à toutes les structures de l'articulation, notamment à l'os et au tissu synovial. À ce jour, il n'existe que des traitements qui visent à soulager la douleur. Face aux douleurs liées à l'arthrose, de plus en plus de patients consomment ou sont tentés de consommer soit du cannabis ou des cannabinoïdes. Plusieurs études cliniques sont en cours concernant la consommation des cannabinoïdes dans les douleurs liées à l'arthrose notamment au Canada et aux États-Unis. En revanche, malgré le nombre important de produits qui apparaissent sur le marché avec différents modes d'administration, leur potentielle efficacité sur les lésions du cartilage n'est pas encore évaluée. Seules des études in vitro ont montré que le système endocannabinoïde est capable de jouer un rôle dans l'arthrose et que les récepteurs aux endocannabinoïdes sont exprimés au sein de l'articulation (cartilage et membrane synoviale). Dans une nécessité d'améliorer les données in vivo sur le rôle des cannabinoïdes dans l'arthrose et leur potentielle utilisation dans le traitement des lésions arthrosiques, nous souhaitons donc étudier l'impact du cannabidiol sur le cartilage sain et sur les lésions du cartilage observées au cours de l'arthrose chez le rat mais également sur le degré d'inflammation de la membrane synoviale. Pour l'exploration de cette nouvelle piste thérapeutique, nous souhaitons injecter directement du cannabidiol dans l'articulation afin de cibler les lésions articulaires et de limiter par ailleurs la diffusion dans l'organisme, chez des rats ayant subi une section du ligament croisé antérieur. La section du ligament croisé antérieur chez le rat est un modèle d'arthrose très utilisé puisqu'il présente les mêmes signes cliniques que ceux observés dans l'arthrose humaine.

Bénéfices attendus

L'arthrose du genou (OA) est un problème majeur de santé publique à travers le monde. Des études basées sur la population révèlent que l'arthrose symptomatique du genou est présente dans 20 à 30% de la population âgée de plus de 65 ans et sa prévalence augmente en partie à cause du vieillissement de la population. En ciblant le système endocannabinoïde dans la pathologie arthrosique, l'injection intra-articulaire de cannabidiol pourrait donc permettre de soulager les patients mais également de retarder l'évolution des lésions arthrosiques, évitant ou retardant la mise en place d'une prothèse (seule technique thérapeutique efficace pour le moment).

Procédures

Tous les animaux subiront une procédure chirurgicale à J0 d'une durée d'environ 20 minutes qui sera réalisée sous anesthésie gazeuse générale. Pour minimiser la douleur post-opératoire, les rats seront traités par un antidouleur une heure avant l'intervention chirugicale. Durant cette procédure chirurgicale, la section du ligament croisé le ligament croisé antérieur sera sectionné afin d'induire une arhrose expérimentale par instabilité. La section sera vérifiée par un mouvement sépcifique de genou (présence d'un tiroir). Le plan musculaire et le plan cutané seront ensuite suturés. Les rats seront ensuite placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Ils seront ensuite replacés dans leur cage par groupe de 3 ou 4. Ils seront également surveillés de façon assidue pendant les 48 heures qui suivent l'opération. Tous les animaux subiront ensuite 8 injections intra-articulaires à J3, J7, J14, J21, J28, J35, J42 et J49 de CBD après l'opération chirurgicale d'une durée de moins d'une minute chacune. Les injections intra-articulaires réalisées sous anesthésie générale d'excipient ou de CBD dont la compositon et la dose ont été choisies sur la base de la littérature (dose antalgique chez le rat), n'induisent pas de douleur "post-injection".

Impact sur les animaux

Ce modèle d'arthrose expérimentale par section du ligament croisé est un modèle très connu et parfaitement maïtrisé par les personnes en charge de la réalisation des procédures expérimentales et tout particulièrement en termes de douleur. La douleur engendrée ne peut cependant pas être prise en charge par des anti-inflammatoires car ces molécules auraient une influence sur l'inflammation et l'apparition des lésions arthrosiques, essentielles dans notre modèle. Les nuisances attendues sur les animaux sont donc une douleur de niveau modérée liée à l'inflammation initiale suite à la chirurgie puis liée au développement de la pathologie arthrosique. Enfin la dernière nuisance considérée comme légère concerne les anesthésies gazeuses à l’isoflurane hebdomadaires pour la réalisation des 8 injections intra- articulaires. La dose de CDB utilisée est la dose antalgique décrite dans la littérature et n'engendre donc aucune douleur.

Devenir

À la fin de l'étude, les rats seront mis à mort selon la méthode réglementaire, 56 jours après l'induction du modèle d'arthrose expérimentale. Chaque genou (droit et gauche) sera prélevé afin de réaliser les études macroscopiques, histologiques et immunohistologiques pour évaluer les lésions articulaires et osseuse à l'aide de scores quantitatifs en comparaison avec le cartilage natif du genou controlateral. La membrane synoviale sera également prélevée pour l'analyse du degré d'inflammation en histologie, en immunohistochimie.

Remplacement

Face à la consommation absolument non cadrée de cannabidiol par les personnes souffrant d'arthrose et afin d'étudier l'impact de la prise de molécules sur les tissus abarticulaires et de tester également leur efficacité dans le traitement de l'arthrose (atteintes des tissus cartilagineux et degré d'inflammation de la membrane synoviale), des études pré-cliniques sont requises pour évaluer l'impact de cette substance sur les tissus et sur l'évolution des lésions. Il n'existe pas de méthode "in silico" permettant de remplacer un organisme vivant pour obtenir un modèle de lésions diffuses qui reproduit les lésions arthrosiques observées chez l'homme. En effet, ce modèle animal est indispensable pour évaluer l'impact de la prise de ce produit dans un modèle d'arthrose expérimentale chez le rat.

Réduction

Dans un souci d'éthique, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum et est nécessaire et suffisant pour les études statistiques. De plus, seul le côté droit sera opéré de façon à préserver le genou gauche comme témoin. Tous les scores histologiques seront réalisés en double aveugle avec moins de 5% d'erreurs entre les deux observateurs expérimentés.

Raffinement

Les rats seront hébergés par 3 ou 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce, en accord avec la législation envigueur, au sein de notre animalerie conventionnelle. De plus, plusieurs éléments plaident en faveur d'une expérimentation en milieu conventionnel en plus de l'expérience historique que nous avons sur ce modèle depuis plus d'une vingtaine d'années, puisque l'envirionnement microbien (microbiote) est particulièrement susceptible d'être impliqué dans le developpement de maladies inflammatoires et/ou dégénératives de l'articulation. L'enrichissement se fera par un tunnel dans la cage et la distribution quotidienne de quelques céréales sucrées. Cet enrichissement ne modifie en rien notre étude et apporte une distraction non négligeable à l'animal et renforce également positivement la relation expérimentateur-animal. Les injections intra-articulaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Ce modèle d’arthrose expérimentale par section du ligament croisé antérieur est un modèle bien connu et maîtrisé au laboratoire en termes de douleur. par ailleurs, une antalgie peropératoire par buprénorphine (0,05 mg/kg) sera réalisée. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Si des anomalies du comportement (vocalisation, pilo-érection, cachexie), pouvant traduire une douleur intense et/ou une perte pondérale supérieure a 20% sur 3 jours étaient observés, les animaux concernés seraient mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. L’apparition éventuelle d’une infection au niveau du site d'injection nous obligerait également à mettre à mort l’animal.

Choix des espèces

Le rat est couramment utilisé dans l'arthrose et ce modèle dit mécanique reste une alternative à l'utilisation du chien. Les animaux seront livrés à l'animalerie à l'âge de 6 semaines et auront une semaine d'acclimatation. Ils seront opérés à l'âge de 7 semaines pour être en accord avec la littérature. La mise à mort sera ensuite réalisée en fin d'expérimentation 56 jours après l'intervention chirurgicale pour réaliser des explorations macroscopiques, histologiques et immunohistochimiques des lésions arthrosiques et déterminer le degré d'inflammation de la membrane synoviale.

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à huit ou neuf semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles reçoivent des injections de virus dès les premiers jours de vie, puis huit tests dont l'immersion de la queue en bain chaud et la plaque chauffante pour mesurer leur sensibilité à la douleur, et une mesure musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur vise une "preuve de concept" de thérapie génique présentée comme une étape vers les essais cliniques, bénéfice formulé au conditionnel. Il affirme que les effets sur les nerfs et les muscles ne s'évaluent que sur l'organisme entier, hors de portée d'une culture de cellules.

Objectifs

Le but de ce projet est de consolider une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques d’injections de virus adéno-associés, couramment utilisés dans la recherche médicale.

Bénéfices attendus

Le succès de ce projet fournira une première stratégie thérapeutique pour certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et constitue une étape essentielle vers les essais cliniques. Ce travail pourrait être bénéfique pour le traitement d’autres formes génétiques de CMT si un lien moléculaire ou mécanistique entre les différentes formes est découvert. Ce projet permettra également de déterminer si une myopathie coexiste avec la neuropathie chez les patients.

Procédures

Une partie des animaux (10) sera utilisée pour un entrainement à une technique d’injection. Les autres animaux (320) seront injectés (durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés. 80 animaux seront injectés entre le 3ème et 5ème jour après la naissance et 240 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 9 semaines, les animaux seront soumis à une série de 8 tests comportementaux : - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x20s max en tout), -mesure de réactivité sur plaque chauffante (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse ; et, -mesure des propriétés contractiles musculaires in situ, sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil) pour évaluer la force musculaire développée.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le second modèle utilisé dans cette étude présente des défauts histologiques au niveau du nerf à 24 jours. Le phénotype général des souris n’a pas été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale de même que la mesure de force musculaire in situ.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 ou 9 semaines après caractérisation comportementale, les tissus affectés seront prélevés pour étude histologique.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage et leur souffrance sera évaluée quotidiennement : capacité à se retourner/à se mouvoir, couleur de la peau. Après le sevrage, les animaux seront hébergés à plusieurs par cage, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et la température sera maintenue constante. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson/nourriture. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. La zone d'injection sera observée quotidiennement (couleur/gonflement) pendant les 3 jours suivant l'injection afin de prévenir l’apparition d’une infection. Afin de réduire le stress lié à certaines expériences, une session de familiarisation avec le matériel sera effectuée. Pour la mesure d’électromyographie, l’animal aura une anesthésie gazeuse tout au long de la procédure afin de supprimer le stress lié à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale et celle-ci sera contrôlée à l’aide d’une sonde rectale. Un produit sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. De même lors des mesures de force, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, la température de l’animal sera maintenue par une plaque chauffante, sa respiration surveillée et l’animal sera mis à mort avant son réveil pour prélèvement et analyse des tissus. En cas de douleur au cours de l’étude, un analgésique sera administré. En revanche, si l’animal devait réaliser des tests sensitifs, les antidouleurs risquant de perturber les résultats aux tests, il sera mis à mort prématurément.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice, la conduction nerveuse et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous testerons différentes conditions d’une thérapie génique (prévention ubiquitaire, réversion ubiquitaire et réversion tissu-spécifique). Nous étudierons les effets de ces injections à 8 ou 9 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts histologiques des tissus et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si les différentes modulations sont bénéfiques.

6 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est irradiée puis reçoit une greffe de moelle osseuse, toutes reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau et, pour certaines, des chimiothérapies ou immunothérapies pendant plusieurs mois, la tumeur pouvant se nécroser et s'ulcérer. Le projet étudie comment la cellule cancéreuse échappe au système immunitaire, la pertinence clinique d'inhibiteurs étant annoncée comme un espoir. Le porteur affirme que les études in vitro ne reproduisent pas les voies d'un modèle intégré et que le remplacement n'est "pas applicable".

Objectifs

La cellule tumorale a besoin de s'adapter rapidement à un environnement dynamique, parfois hostile, afin de continuer à se multiplier et à survivre. Notre système immunitaire est initialement capable de reconnaître une cellule cancéreuse et de l’éliminer. Toutefois la cellule cancéreuse est capable de s’adapter et de devenir invisible afin de ne pas être éliminée par ce système de défense. Un des mécanismes impliqués dans l’adaptation rapide de la cellule cancéreuse, permet la production de protéines spécifiques qui rendront la cellule cancéreuse invisible au système immunitaire. Une des nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du cancer consiste à utiliser des molécules qui inhibent la production des protéines. Etudier ce mécanisme d’adaptation de la cellule cancéreuse qui empêche le système immunitaire d’être efficace et définir l’impact des inhibiteurs de ce mécanisme sur le développement de la tumeur et les propriétés des cellules cancéreuses et immunitaires sont les objectifs principaux de ce projet.

Bénéfices attendus

La dynamique d’interaction entre les cellules cancéreuses et immunitaires font intervenir des mécanismes d’adaptation rapide qui impliquent la production de protéines spécifiques. Analyser cette dynamique au niveau de la production des protéines est particulièrement innovant et important car il existe des études pré-cliniques montrant l'intérêt d'utiliser des inhibiteurs de la production des protéines dans le traitement de certains cancers. Alors que nous comprenons de mieux en mieux comment ces inhibiteurs affectent la cellule tumorale, peu d’études portent sur les effets de ces inhibiteurs dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Enfin, la pertinence clinique de l'utilisation de ces inhibiteurs sera évaluée au regard des thérapies conventionnelles, d’autres thérapies ciblées et immunothérapies utilisées en clinique, en espérant définir de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Certaines souris seront irradiées. Dans les 24 heures suivant l'irradiation, les souris seront anesthésiées puis recevront de la moelle osseuse par voie intraveineuse (injection dans la veine retro-orbitale). 6 semaines après l’irradiation, ces souris seront anesthésiées afin de réaliser un prélèvement de sang et d’analyser la reconstitution de la moëlle osseuse. Toutes les souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales et les tumeurs seront mesurées au minimum 3 fois par semaines pendant 3 à 22 semaines en fonction du modèle de tumeur. Certaines souris recevront un traitement (Chimiothérapie conventionnelle, thérapie ciblée, immunothérapie) dès que le volume tumoral atteint 50 mm3. Ce traitement sera administrés per os ou par voie intrapéritonéale. La fréquence des traitements dépend de leur nature et s’étend de 5 fois par semaine à tous les 21 jours et ce pendant 21 à 154 jours selon le modèle de tumeurs.

Impact sur les animaux

Le modèle syngénique de tumeurs sous-cutanées chez la souris qui consiste à injecter des cellules tumorales murines de même fond génétique que les souris réceptrices immunocompétentes, est communément utilisé pour l’évaluation de l’efficacité d’une thérapie dans de nombreux types de cancers. Au cours du développement de la tumeur sous-cutanée, aucune nuisance ni effet indésirable n’est observé chez la souris. Si toutefois les tumeurs grossissent très rapidement, il peut arriver qu’elles se nécrosent au centre et commencent à s’ulcérer ou à saigner. Dans ce cas, c’est un point limite et les souris seront sacrifiées. Aussi, la santé des souris et l’aspect des tumeurs seront surveillés 3 fois par semaine après injection des cellules tumorales puis tous les jours lorsque l’on se rapproche de la taille tumorale maximale. La chimiothérapie conventionnelle est bien tolérée chez la souris, les effets secondaires sont faibles et les plus fréquents sont des diarrhées. Les effets indésirables les plus fréquents associés à l’immunothérapie sont d’ordre cutanés (rash, prurit dans 15 à 25% des cas) ou gastro-intestinaux (diarrhées dans 15 à 30% des cas), dans les deux cas ces atteintes sont bénignes et réversibles dès l’arrêt du traitement. Ces effets indésirables sont les mêmes dans le cas de traitements avec des inhibiteurs de la voie des MAPK. Une photosensibilité cutanée est également souvent observée dans le cas de traitements avec certains inhibiteurs de cette voie de signalisation. Aucun effet indésirable n’a été reporté dans le cas de traitements des tumeurs chez la souris avec des inhibiteurs de la traduction. Il est important de noter que les effets indésirables observés en monothérapie sont les mêmes que ceux observés en thérapie combinée.

Devenir

18 lots de souris (soit 432 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 90 lots de souris (soit 2160 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 6 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 144 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 30 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 720 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Ce projet fait suite à des nombreuses expériences réalisées in vitro dans des modèles cellulaires. Malheureusement le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiopathologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine et l’évaluation de l’efficacité des traitements pour cette pathologie.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Les résultats préliminaires ont permis de valider que des lots de 8-10 souris selon les paramètres à évaluer permettent d’acquérir des données fiables.

Raffinement

Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine dès l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, que nous aurons définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.

Choix des espèces

Nous disposons de souris knockout (KO) présentant des altérations de la voie des MAPK. Ces souris immunocompétentes seront utilisées pour générer des modèles syngéniques de tumeurs sous-cutanées. Ces modèles sont communément utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement tumoral et pour évaluer l’efficacité des thérapies anti-cancéreuses car ils reproduisent la complexité des tumeurs observées chez l’homme. Nous réaliserons des chimères hématopoïétiques qui présenteront des altérations de la voie des MAPK uniquement dans les lymphocytes B et T. La comparaison des résultats obtenus dans les deux modèles, KO total vs. chimères, permettra d’établir si l’impact des altérations de la voie des MAPK sur la croissance tumorale, le phénotype et la réponse aux traitements est extrinsèque et/ou intrinsèque aux lymphocytes. Enfin des altérations de la voie des MAPK seront réalisées uniquement dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8 ayant un récepteur permettant la reconnaissance spécifique d'antigène présent à la surface des cellules cancéreuses.

4 022 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant six mois un régime riche en gras et en sucre, des gavages et injections quotidiens pouvant atteindre 210 gestes, une coupure de la queue pour les prises de sang et un isolement en cage individuelle que le porteur décrit comme stressant. L'objet est de comprendre le rôle du microbiote intestinal dans le diabète et la stéatose, avec des pistes thérapeutiques annoncées pour une "préoccupation majeure de santé publique". Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne simule le lien entre microbiote, intestin et organes, et juge le recours aux souris "nécessaire".

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elle sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme le diabète ou stéatose hépatique non alcoolique. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans des conditions physiologiques (individus sains) et pathologiques (individus malades). Des travaux suggèrent que certaines bactéries du tube digestif et produits bactériens sont responsables de dérèglements métaboliques chez l’hôte. L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes, d’identifier le rôle des bactéries et les cellules associées impliquées dans ces dérèglements dans trois modèles murins de maladies métaboliques (prédiabète, diabète et stéatose hépatique non alcoolique).

Bénéfices attendus

Les maladies métaboliques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Les maladies métaboliques sont associées à un régime alimentaire déséquilibré et à l’obésité. De nombreux travaux étudiant l’obésité témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal et d’une augmentation des réponses inflammatoires dans les intestins ou dans les organes périphériques, associées à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients obèses, la persistance de l’inflammation et d’une perturbation du microbiote conduisent souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier les mécanismes impliqués pour proposer des solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies métaboliques. Ce projet amènera une meilleure compréhension de l’implication du microbiote dans la réponse inflammatoire liée à l’obésité et de ses effets sur les maladies métaboliques comme le diabète et la stéatose et ainsi proposer de nouvelles voies thérapeutiques permettant le traitement et la prévention de ces maladies.

Procédures

Pendant une durée maximale de 30 semaines, les souris recevront un régime alimentaire riche en gras, en sucre ou en cholestérol susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids. Les souris seront soumises à des injections (quelques secondes) ou des gavages (quelques secondes) quotidiens pour une période comprise entre 12 et 30 semaines soit 210 au maximum. Deux gavages et 1 injection seront aussi réalisés en fin de protocole au cours de deux tests qui seront espacés d’une semaine chacun, ainsi qu’une petite coupure à l’extrémité de la queue (1 seconde) et massage (quelques secondes). Nous effectuerons 2 collectes de fèces lors de l‘émission naturelle en début et fin de protocole. La durée maximale de la collecte est estimée à 30 min maximum. Un prélèvement de sang de la joue sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 15 à 20 secondes.

Impact sur les animaux

Pour étudier l’impact du microbiote qui est différent entre les individus et suivre la prise alimentaire qui est une donnée essentielle à nos études, les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Les prélèvements fécaux (émission naturelle de fèces par la souris en début et en fin de protocole) et pesées des animaux (une fois par semaine) seront réalisées sur tous les animaux dans des pots de récolte ou de pesée, ce qui entraine un stress léger. Les animaux seront soumis à des gavages et des injections quotidiens tout au long du protocole. Bien que chaque action engendre un stress léger et de très courte durée (moins de 10 secondes), cette répétition de gestes engendre un stress requalifié de léger à modéré. La procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie (OGTT, IPGTT) et l’insulinémie (ITT) présente une douleur légère car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'expérimentateur lors du premier prélèvement du test. . Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'expérience. Ces trois tests nécessitent une mise à jeun de 6 heures. Afin d’éviter une période de jeûne trop drastique lors de ces tests, ceux-ci ne seront pas réalisés durant la phase nocturne mais en phase diurne. Un délai minimum d’une semaine séparera deux tests (OGTT/IPGTT/ITT). Les bactéries (pro-ALPK1) et molécules (ADP-H, agonistes et antagonistes) administrées n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux. Pour les souris soumises aux régimes riches en graisse, la prise de poids associée à ces régimes sur la durée d’exposition n’affecte pas leur mobilité.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure pour le prélèvement de leurs organes et tissus utilisés pour des analyses nécessaires à ce projet.

Remplacement

Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, les tissus périphériques (foie, tissus adipeux) et la régulation de la glycémie. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal en lien avec les données biologiques obtenues à partir des différents tissus.

Réduction

Le choix des molécules et bactéries testées dans ce projet l’ont été préalablement sur des systèmes cellulaires in vitro. Ainsi, nous avons sélectionné les bactéries et molécules les plus intéressantes et les plus activatrices pour réduire le nombre de molécules et bactéries à tester in vivo. Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. Nous allons tester 2 bactéries ou molécules en même temps ce qui permettra de diminuer le nombre de contrôles entrant dans le protocole expérimental. Chaque lignée de souris provient d’élevages indépendants.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Afin de palier au stress induit par l’isolement, les cages seront en plexiglass transparentes et mises côte à côte pour permettre les interactions visuelles, sonores et olfactives entre les animaux. Ces enrichissements permettent d'assouvir au mieux les comportements naturels de l'animal. Les animaux seront observés chaque jour (surveillance visuelle) et plus précisément deux fois par semaine au moment de la prise alimentaire quantifiée (par pesée de l’aliment) et de la prise de poids des animaux. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et euthanasié. Les souris dormant le jour, nous réaliserons les mises à jeun pendant la journée afin de limiter la sensation de faim.

Choix des espèces

Les animaux auront 8 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur les maladies métaboliques, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques et metaboliques. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. De plus, les délétions de gènes spécifiques dans un type de cellules donné sont uniquement présent dans ce modèle.