Procédures modérées

300 oiseaux, poulets, dindes et canards, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit jusqu'à trois administrations de vaccins et jusqu'à trois prises de sang, avant mise à mort pour récolter un maximum de sang. Le porteur décrit une douleur liée aux injections intramusculaires et aux prélèvements, et prévoit d'euthanasier tout animal en détresse, l'objectif étant de produire des sérums pour étudier l'échappement des virus aviaires. Sur le remplacement, il affirme que la variété d'anticorps recherchée ne peut s'obtenir qu'en immunisant des oiseaux de l'espèce concernée.

Objectifs

L’équipe de recherche étudie les maladies virales ou bactériennes des volailles ainsi que l’évolution des agents responsables de ces maladies. Les anticorps produits suite à la vaccination des volailles jouent un rôle prépondérant dans les mécanismes immunitaires de défense contre les pathogènes ciblés, mais ils sont également impliqués dnas la sélection de variants antigéniques des mêmes agents pathogènes. Il est donc important de pouvoir étudier cette réponse anticorps chez les volailles. Le présent projet vise à produire des sérums immuns contenant des anticorps spécifiques d’agents pathogènes chez du canard, du poulet ou de la dinde. Ces sérums seront utilisés à des fins de recherches menées par l'unité de recherche dans le cadre de ses missions et projets de recherche portant sur les viroses aviaires. Pour ce faire, des dindes, canards ou poulets recevront des vaccins avec une autorisation de mise sur le marché (AMM) ou une autorisation temporaire d'utilisation (ATU) en France. Suivant l’objectif spécifique de la procédure un maximum de 3 administrations (soit une primo-vaccination puis deux rappels) pourront être réalisées afin d’obtenir des concentrations sanguines en anticorps élevées à très élevées et/ou permettant de reconnaître plusieurs agents viraux d'une même espèce mais aux caractéristiques antigéniques distinctes. Juste avant les éventuelles seconde et troisième administrations, des prises de sang seront effectuées pour mesurer la quantité d’anticorps présents dans le sang des animaux et décider de la pertinence ou non de l’administration de doses de rappel. Les valeurs-objectifs des titres anticorps dépendront des virus considérés et des techniques sérologiques mises oeuvre. A titre indicatif, seront recherchés des titres: - d’un minimum de 64 en inhibition d’hémagglutination pour les virus influenza ou de la maladie de Newcastle - d’un titre neutralisant minimum de 160 par séroneutralisation pour des virus tels que les réovirus ou le virus de la bursite infectieuse aviaire - d’un titre comparable à celui des témoins positifs employés dans les kits diagnostiques commerciaux d'ELISA.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir des sérums riches en anticorps spécifiques qui seront utilisés dans des projets de recherche et permettront, notamment, d’étudier comment des virus échappent à la neutralisation médiée par des anticorps issus d’animaux vaccinés. L'observation d'un tel échappement par un agent pathogène indique qu'une mise à jour du contenu antigénique du vaccin peut être nécessaire pour contrôler plus efficacement la maladie.

Procédures

Les animaux recevront les préparations vaccinales : ils seront soumis à un maximum de trois administrations (durée de quelques minutes) par les voies prévues par le résumé des caractéristique du produit (RCP) pour les vaccins disposant d'une AMM ou d'une ATU. Les animaux seront soumis à un maximum de 3 prises de sang (prélèvements effectués en quelques instants) d'un volume maximal calculé selon leur poids.

Impact sur les animaux

Les préparations utilisées pour immuniser les animaux seront des vaccins (inactivés ou à agent vivant atténué) disposant d’une autorisation de mise sur le marché ou d'une ATU, pour lesquels des données d’innocuité sont disponibles. Ces derniers seront utilisées selon les modalités (âge des animaux, voie d’administration, précautions particulières …) décrites dans le résumé des caractéristiques du produit. Aucun effet indésirable grave n’est donc attendu chez les animaux au-delà de la douleur due à une injection intra-musculaire et des prises de sang en vue d'analyses sérologiques. Lors de chaque intervention (prise de sang ou injection), une pesée individuelle des animaux sera effectuée. Une surveillance quotidienne selon une grille d’évaluation clinique des animaux sera néanmoins réalisée et tout animal présentant des signes cliniques témoignant d’une souffrance ou d’une blessure sévère (observation de prostration, incapacité à se déplacer, à s’abreuver ou à se nourrir, signes de détresse respiratoire, signes nerveux qui constitueront un point-limite éthique), signes qui correspondent au point-limite éthique, fera l’objet d’une euthanasie.

Devenir

La mise à mort de tous les animaux est nécessaire pour atteindre les objectifs du projet (récolte d'un maximum de sang pour analyses).

Remplacement

La production de sérums immuns ne peut pas être réalisée sur des modèles alternatifs. Ces sérums contiennent en effet une variété d’anticorps reconnaissant divers constituants de l’agent utilisé pour l’immunisation. Ainsi, dans le cas d’une vaccination contre un virus, différents types d’anticorps dirigés contre diverses protéines constituant le virus sont produits. La variété des anticorps produits est importante pour étudier la réponse immunitaire des animaux. Cette variété ne peut être obtenue, à ce jour, qu’en immunisant des animaux de l'espèce considérée.

Réduction

Un maximum de 10 animaux par procédure sera employé. Ce nombre permet de produire un volume de sérum suffisant pour couvrir la plupart des projets scientifiques tout en offrant une diversité des réponses individuelles.

Raffinement

Les procédures seront menées dans le respect des normes d’hébergement (taille des cages, densité etc.) spécifiées dans la directive 2010/ 63/ UE et spécifiques de chaque espèce. Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, les mesures suivantes sont appliquées : - Respect des normes d’hébergement (taille des cages, densité etc.) spécifiées dans la directive 2010/63/UE - Application de conditions d’ambiance en accord avec l’âge et l’espèce (température, éclairage, hygrométrie) ; - Enrichissement du milieu (cordelettes avec jouet (bouchon suspendu), aires de perchage), possibilité pour les canards d’exprimer un comportement de toilettage à l’aide des dispositifs d’abreuvement. - Fourniture d’eau et d’aliment (adapté aux besoins d’entretien ou de croissance des oiseaux) sans restriction ; - Suivi clinique quotidien selon grille de notation clinique - Manipulation et contention des oiseaux par du personnel qualifié, notamment lors des interventions (injections ou prises de sang) - mise en place de points-limites.

Choix des espèces

Les espèces choisies représentent les espèces-cibles des maladies étudiées. L’âge des animaux en début de procédure correspondra à l’âge d’administration des vaccins sur le terrain.

50 chiens vont être utilisés sur trois ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une trentaine étant tués à l'issue, dix réutilisés et dix adoptés. Ils reçoivent des candidats médicaments anticancéreux par voie orale ou par perfusion, avec des prélèvements répétés d'urine, de sang et de fèces, et peuvent présenter des troubles digestifs et des atteintes des paramètres sanguins. Le porteur indique que la mise à mort sert le plus souvent à prélever des organes, le maintien en vie n'étant possible que si aucun prélèvement n'est nécessaire et si la molécule n'est pas disséminée dans l'environnement. Il affirme qu'un "organisme complet et vivant" est "indispensable" pour évaluer ces traitements avant des essais cliniques vétérinaires, parfois humains.

Objectifs

Notre projet a pour objectif l'évaluation chez le Chien, de nouveaux composés à visée thérapeutique vétérinaire, et parfois humaine, dans le traitement de pathologies cancéreuses (sureté, données de toxicité, détermination de dose optimale, excrétion d'OGM, etc...). Ces études permettront: - de développer des traitements anti-cancéreux pour les chiens, avec une application clinique rapide sur des patients canins, permettant ainsi la prolongation de leur durée de vie. - d'évaluer (rarement) des traitements destinés à l'Homme: le chien est considéré comme un modèle pertinent pour certains cancers, cela nous permettra d’obtenir des données supplémentaires pour des applications en clinique humaine.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'obtention de données permettant un passage rapide à des essais cliniques chez le Chien, permettant la mise en place de nouveaux traitements anticancéreux, mais également l'exploration de nouvelles voies thérapeutiques chez l'Homme.

Procédures

Les animaux recevront une ou des administrations de médicaments, par voie orale ou parentérale. La fréquence dépendra du médicament évalué, l'administration en elle même durera généralement quelques secondes à 1 minute. Dans certains cas, une perfusion pourra être effectuée, pour une durée maximale d'1h. Des prélèvements seront réalisés: prélèvement d'urine directement dans la vessie (env. 2 minutes, maxi 1x/jour), prélèvement de sang (env. 2 minutes, maxi 1x/jour), écouvillons nasaux/buccaux/cutanés (env. 1 minute, maxi 1x/jour), prélèvements de feces (quelques secondes, maxi. 1x/jour)

Impact sur les animaux

Les animaux recevront les traitements de la même façon que ces derniers seront utilisés en clinique: ils sont donc susceptibles de ressentir des effets secondaires associés à ces traitements, le plus souvent des désordres digestifs (nausées, vomissements), mais également possibilité d'apparition de petits boutons sans gravité sur la peau et perturbations transitoires des paramètres hémato-biochimiques.

Devenir

Les animaux devront le plus souvent être euthanasiés pour prélever des organes et du sang afin de faire des analyses (analyses histologiques, dosages du produit administré, etc...) Par ailleurs, beaucoup des produits évalués sont des molécules qui ne doivent pas être disséminées dans l'environnement. Le maintien en vie des animaux ne sera donc possible qu'à la condition: que les prélèvements précédemment cités ne soient pas nécessaires ET que des données de non excrétion de la molécule administrée soient disponibles. Ce maintien en vie pourra parfois nécessiter l'autorisation d'autorités réglementaires/sanitaires.

Remplacement

Les produits que nous souhaitons tester ont pour finalité d’apporter de nouvelles solutions thérapeutiques dans la lutte contre le cancer chez le Chien, et dans certains cas, chez l'Homme. Il est nécessaire, bien que des tests de toxicité aient été réalisés in vitro et sur d'autres modèles animaux, d’étudier l'administration de ces produits chez le Chien avant de démarrer des études cliniques chez des animaux spontanément malades. L'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable dans le cadre de l'évaluation de traitements anti-cancéreux, car la complexité des réactions immunitaires, inflammatoires, ainsi que les effets secondaires sur les organes ne peuvent être reproduits par des méthodes de substitution

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera d'au maximum 50 chiens sur 3 ans, pour l'évaluation de plusieurs candidats thérapeutiques. Le nombre d'animaux a été réduit au minimum permettant d'avoir des résultats scientifiquement exploitables et permettant un passage sans risque sur des patients canins malades.

Raffinement

Durant tout le projet, une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux, notamment en conservant l'hébergement en groupe autant que possible en fonction du candidat vaccin testé, par la mise à disposition de jouets régulièrement renouvelés, et par des interactions fréquentes avec les personnes en charge des soins (jeux, caresses, récompenses lors des pesées et examens cliniques…). Si les animaux doivent être hébergés individuellement, pour compenser cet isolement, ils seront hébergés dans des box attenants avec contact olfactif et visuel. Des effets secondaires sont susceptibles d'apparaitre suite aux traitements anti-cancéreux: ils feront l'objet de traitements symptomatiques comme c'est le cas en clinique. Des points limites adaptés seront mis en place afin de limiter l'inconfort des animaux en cours d'étude. Les animaux seront pris en charge par du personnel formé et habilité, et un suivi vétérinaire sera effectué de façon très régulière.

Choix des espèces

Le chien est l'espèce cible pour la plupart des produits qui seront évalués, l'objectif principal étant de vérifier l'innocuité de ces produits avant un passage en essai clinique sur patients canins. Si des thérapies à destination humaine sont évaluées chez le Chien, cela se fera sur la base de publications scientifiques sur le sujet. Les chiens ont en commun avec l'Homme certaines voies de signalisation et récepteurs cellulaires impliqués dans la mise en place du cancer et sont donc un modèle pertinent pour des objectifs scientifiques précis. Les animaux utilisés seront adultes, voire âgés, en raison de la manifestation généralement tardive des cancers.

21 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce dossier reprend le même protocole qu'une autre demande du lot, une injection virale dans le cerveau pour induire une maladie de type Parkinson, deux IRM de deux heures sous anesthésie, des gavages et des isolements de vingt-quatre heures, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur affirme que la chirurgie n'induit ni souffrance ni troubles hors de la maladie, tout en reconnaissant plus loin une douleur possible, une perte de poids et une hypothermie. Sur le remplacement, il affirme que l'étude du lien entre microbiote et système nerveux ne peut se faire que chez l'animal.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : - de valider un modèle rat parkinsonien sur la souche axénique exclusivement employée dans notre établissement utilisateur, souche permettant de contrôler le microbiote des rats. - de caractériser finement les conséquences de la maladie tout au long de l’axe cerveau/intestin par différentes méthodes. - de connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont : - de disposer d'un modèle rat parkinsonien sur la souche employée en conditions axéniques dans notre établissement utilisateur. - de caractériser finement les conséquences de la maladie par des méthodes multisytémiques. - choisir la technique d'IRM non invasive capable de détecter les signes de la maladie au niveau cérébral. - connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie. Si nous constatons une modification du microbiote en lien avec le développement de la maladie de Parkinson, nous proposerons de poursuivre cette étude en modifiant le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration du phénotype de la maladie (transplantation fécale issue de microbiotes de patients humains, introduction de prébiotiques dans l'alimentation). L’objectif à terme de ce projet serait de proposer de potentiels prébiotiques qui pourraient améliorer la qualité de vie des malades atteints de la maladie de Parkinson ou ralentir la progression de la maladie.

Procédures

- L’injection intracérébrale sera effectuée 1 fois pour chaque animal sous anesthésie, cette chirurgie dure environ 1h. - L’IRM du cerveau du rat est effectuée sur un équipement dédié aux investigations chez le rat sous anesthésie à l’isoflurane. Les rats sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Les explorations IRM seront réalisées 2 fois pour chaque animal à 9 semaines d’intervalle. - Les prélèvements de fèces pour l'analyse du microbiote et la mesure du temps de transit sont effectués dans les cages, sans intervention sur les animaux. - Le test appréciant le comportement moteur des rats est effectué toutes les 2 semaines (de la semaine 4 à la semaine 14), il dure environ 20 min. - La mesure du temps de transit par gavage de spores sera réalisée 2 fois, en semaine 7 et semaine 13, il nécessite un isolement durant 24 h en cage individuelle.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale a pour but d’induire une maladie chronique. En dehors de ce dommage durable, le geste chirurgical n’induit ni souffrance, ni altérations comportementales (en dehors de celles directement en rapport avec la maladie de Parkinson). Cependant, les rats peuvent présenter des effets indésirables liés à cette intervention chirurgicale, douleur, perte de poids, hypothermie. L’hébergement individuel des rats pendant 24 h toutes les 7 semaines pour les mesures de temps de transit induit un stress.

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques participant à la validation du modèle de maladie de Parkinson chez cette souche de rat.

Remplacement

L’étude du système nerveux, de par sa complexité d’organisation, de développement, de plasticité et de fonctionnement, demande à être effectuée au sein de l’organisme entier. Seules des approches menées in vivo chez un modèle animal peuvent améliorer la connaissance du cerveau et de son fonctionnement, et ainsi aboutir au traitement de ses pathologies humaines comme la maladie de Parkinson. L'objectif de ce projet est de modifier le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration de la maladie, aussi l’étude du couplage microbiote/système nerveux ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour apporter des résultats statistiques à l’étude. L’imagerie par IRM est un outil non invasif et indolore qui permet le suivi du développement d’une pathologie sur un même animal.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant 7 jours à leur arrivée et lors du transfert entre les 2 animaleries, de l’enrichissement sera mis à disposition dans les cages. Au préalable à chaque procédure, les animaux seront amenés pendant 60 min dans la pièce de l’intervention afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Après chaque anesthésie, que ce soit pour la chirurgie ou l’IRM, les animaux seront placés dans une cage de réveil réchauffée par une plaque chauffante. Ils seront surveillés régulièrement par l’expérimentateur pendant les heures qui suivent l’intervention jusqu’à ce que l’animal ait pleinement récupéré. Pour analyser le temps de transit chez l’animal, une suspension de spores est administrée par gavage orogastrique, technique pour laquelle la douleur et le stress sont limités pour l'animal lorsque le geste est réalisé par des intervenants formés et expérimentés (mise en place d'un conditionnement "pré-contention" avec manipulation régulière des animaux). Toutefois, une surveillance accrue est mise en place à la suite de l'exécution de la technique pour détecter d'éventuels signes de mal être suite à l'intervention.

Choix des espèces

La littérature scientifique montre que le rat est une espèce de choix pour l'étude du fonctionnement cérébral dans la Maladie de Parkinson. Nous pourrons ainsi confronter les données de la littérature utilisant les modèles classiques avec les résultats obtenus grâce à notre nouveau modèle dans le cadre de ce projet. Nous utiliserons des rats jeunes adultes (environ 200 g en début d'étude), afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur les coordonnées des différentes structures cérébrales dans l’espace.

21 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection dans le cerveau sous anesthésie pour induire une maladie chronique de type Parkinson, puis deux séances d'IRM de deux heures et des gavages, avec des isolements de vingt-quatre heures, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur reconnaît des effets liés à la chirurgie, douleur, perte de poids et hypothermie, et un stress lié à l'isolement, tout en décrivant par ailleurs le geste comme sans souffrance en dehors de la maladie induite. Sur le remplacement, il affirme que l'étude du couplage entre microbiote et système nerveux ne peut se faire que chez l'animal.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : - de valider un modèle rat parkinsonien sur la souche axénique exclusivement employée dans notre établissement utilisateur, souche permettant de contrôler le microbiote des rats. - de caractériser finement les conséquences de la maladie tout au long de l’axe cerveau/intestin par différentes méthodes. - de connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont : - de disposer d'un modèle rat parkinsonien sur la souche employée en conditions axéniques dans notre établissement utilisateur. - de caractériser finement les conséquences de la maladie par des méthodes multisytémiques. - choisir la technique d'IRM non invasive capable de détecter les signes de la maladie au niveau cérébral. - connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie. Si nous constatons une modification du microbiote en lien avec le développement de la maladie de Parkinson, nous proposerons de poursuivre cette étude en modifiant le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration du phénotype de la maladie (transplantation fécale issue de microbiotes de patients humains, introduction de prébiotiques dans l'alimentation). L’objectif à terme de ce projet serait de proposer de potentiels prébiotiques qui pourraient améliorer la qualité de vie des malades atteints de la maladie de Parkinson ou ralentir la progression de la maladie.

Procédures

- L’injection intracérébrale sera effectuée 1 fois pour chaque animal sous anesthésie, cette chirurgie dure environ 1h. - L’IRM du cerveau du rat est effectuée sur un équipement dédié aux investigations chez le rat sous anesthésie à l’isoflurane. Les rats sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Les explorations IRM seront réalisées 2 fois pour chaque animal à 9 semaines d’intervalle. - Les prélèvements de fèces pour l'analyse du microbiote et la mesure du temps de transit sont effectués dans les cages, sans intervention sur les animaux. - Le test appréciant le comportement moteur des rats est effectué toutes les 2 semaines (de la semaine 4 à la semaine 14), il dure environ 20 min. - - La mesure du temps de transit par gavage de spores sera réalisé 2 fois, en semaine et semaine 13, il nécessite un isolement durant 24 h en cage individuelle.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale a pour but d’induire une maladie chronique. En dehors de ce dommage durable, le geste chirurgical n’induit ni souffrance, ni altérations comportementales (en dehors de celles directement en rapport avec la maladie de Parkinson). Cependant, les rats peuvent présenter des effets indésirables liés à cette intervention chirurgicale, douleur, perte de poids, hypothermie. L’hébergement individuel des rats pendant 24 h toutes les 7 semaines pour les mesures de temps de transit induit un stress.

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques participant à la validation du modèle de maladie de Parkinson chez cette souche de rat.

Remplacement

L’étude du système nerveux, de par sa complexité d’organisation, de développement, de plasticité et de fonctionnement, demande à être effectuée au sein de l’organisme entier. Seules des approches menées in vivo chez un modèle animal peuvent améliorer la connaissance du cerveau et de son fonctionnement, et ainsi aboutir au traitement de ses pathologies humaines comme la maladie de Parkinson. L'objectif de ce projet est de modifier le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration de la maladie, aussi l’étude du couplage microbiote/système nerveux ne peut être réalisée que chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour apporter des résultats statistiques à l’étude. L’imagerie par IRM est un outil non invasif et indolore qui permet le suivi du développement d’une pathologie sur un même animal.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant 7 jours à leur arrivée et lors du transfert entre les 2 animaleries, de l’enrichissement sera mis à disposition dans les cages. Au préalable à chaque procédure, les animaux seront amenés pendant 60 min dans la pièce de l’intervention afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Après chaque anesthésie, que ce soit pour la chirurgie ou l’IRM, les animaux seront placés dans une cage de réveil réchauffée par une plaque chauffante. Ils seront surveillés régulièrement par l’expérimentateur pendant les heures qui suivent l’intervention jusqu’à ce que l’animal ait pleinement récupéré. Pour analyser le temps de transit chez l’animal, une suspension de spores est administrée par gavage orogastrique, technique pour laquelle la douleur et le stress sont limités pour l'animal lorsque le geste est réalisé par des intervenants formés et expérimentés (mise en place d'un conditionnement "pré-contention" avec manipulation régulière des animaux). Toutefois, une surveillance accrue est mise en place à la suite de l'exécution de la technique pour détecter d'éventuels signes de mal être suite à l'intervention.

Choix des espèces

La littérature scientifique montre que le rat est une espèce de choix pour l'étude du fonctionnement cérébral dans la Maladie de Parkinson. Nous pourrons ainsi confronter les données de la littérature utilisant les modèles classiques avec les résultats obtenus grâce à notre nouveau modèle dans le cadre de ce projet. Nous utiliserons des rats jeunes adultes (environ 200 g en début d'étude), afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur les coordonnées des différentes structures cérébrales dans l’espace.

1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur, des administrations orales de bactéries et d'acide rétinoïque, une injection dans un ganglion et un prélèvement de sang, avant mise à mort pour prélever tumeur, foie, intestins, ganglions et rate. Le porteur décrit une gêne modérée liée aux tumeurs sous la peau et un inconfort lors des administrations, l'objectif étant de restaurer l'efficacité des immunothérapies en cas de déséquilibre du microbiote. Sur le remplacement, il affirme que seul un animal vivant et "entier" permet d'étudier l'immunité antitumorale, impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant un déséquilibre de la flore intestinale ou dysbiose. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements au cours d’une dysbiose intestinale suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin (MAdCAM-1). L’altération de l’expression de cette protéine conduit donc à une accumulation de ces cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. De plus, il a été montré que l’acide tout trans rétinoïque (ATRA, all tran retinoic acid) (dérivé de la vitamine A utilisé pour traiter des leucémies) augmente l’expression du ligand de MAdCAM-1 sur les lymphocytes et réprime l’induction de certaines cellules néfastes. Cette surexpression de ce ligand permettrait une meilleure captation des cellules immunitaires intestinales vers l’intestin en cas de dysbiose. Pour comprendre ce lien entre l’ATRA et la réponse anti-tumorale, nous souhaitons dans un contexte de dysbiose supplémenter nos souris en ATRA pour comprendre son effet sur le MI, sur l’effet des immunothérapies, sur l’expression de MAdCAM-1 et de son ligand et sur la migration des cellules immunitaires entre l’intestin et la tumeur. Pour cela, nous voulons administrer l’ATRA par voie orale. Le rationnel de ce projet est de confirmer l’effet bénéfique de la supplémentation en ATRA sur la réponse anti-tumorale aux immunothérapies en cas de dysbiose en capturant les cellules néfastes au niveau de l’intestin permettant ainsi la recirculation des cellules immunitaire bénéfiques vers la tumeur.

Bénéfices attendus

Nous voulons ainsi montrer la restauration de l’efficacité des immunothérapies post traitement par l’ATRA (all trans retinoic acid) malgré le contexte de dysbiose intestinale. (dérégulation de la flore) Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunitaires néfastes de l'intestin vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, l’ATRA, déjà disponible dans la pharmacopée humaine semble être une bonne molécule pour atteindre cet objectif.

Procédures

Les interventions seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (une fois, durée 1 minute) sous anesthésie locale, l’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’ATRA (maximum 4 fois, durée 1 minute), l’utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire (1 fois, 5min) sous anesthésie locale, et prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 1min) sous anesthésie locale ou générale suivant les prélvèement..

Impact sur les animaux

Les contraintes pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acide tout-trans-rétinoïque (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons définis un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes entre eux. Ce résultat statistique sera basé sur l'expression tissulaire de MAdCAM-1 ou sur la différence de taille tumorale entre les groupes. Enfin, les dernières procédures envisagées se seront réalisées que si les premières procédures donnent les résultats attendus.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être, avec enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement (prostration, auto-agressions, etc). Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines. Les souris seront donc adultes ce qui permettra un passage plus aisé à l'Homme dans la suite de l'étude.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réparties en six groupes de doses, elles reçoivent un candidat médicament par voie orale puis subissent des prélèvements de sang à la queue, avant mise à mort pour examiner leurs organes et doser l'accumulation du produit. Le porteur indique qu'une toxicité peut apparaître aux fortes doses, avec des signes d'inconfort, l'objectif étant de fixer la dose maximale tolérée avant des essais réglementaires puis cliniques contre la maladie de Huntington. Sur le remplacement, il affirme que les études de toxicité sont obligatoirement menées sur l'animal et "indispensables" avant le passage en clinique.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Il a été identifié une molécule capable de restaurer le transport neuronal, défaut primaire associé à la maladie de Huntington, dans les neurones humains et murins. Il a ensuite été démontré qu’un traitement sous cutané d’un mois avec ce candidat médicament permettait d’améliorer les défauts moteurs et psychiatriques dans un modèle souris de la maladie de Huntington. Afin de développer le candidat médicament pour des patients atteints de la maladie de Huntington, l’équipe de recherche suit les directives de l’agence européenne du médicament parmi lesquelles figurent l’obligation de réaliser des études de sécurité non-clinique (nommées « études réglementaires ») en amont des études cliniques (voir la guideline européenne ICH M3(R2). Le projet a donc pour objectif de préparer ces études réglementaires pour 1/ aider à identifier la dose maximale tolérée et 2/ réaliser une première évaluation de la marge de sécurité du candidat médicament. Le candidat médicament cible une voie thérapeutique jamais évaluée auparavant, et n’a jamais été utilisé chez l’homme, cette étude préliminaire permet donc d’orienter la conception des études réglementaires notamment en termes de choix des doses.

Bénéfices attendus

Il a été démontré avec des premiers résultats preuve de concept l’intérêt thérapeutique de la molécule dans un modèle souris de la maladie. Il est nécessaire maintenant d’identifier la dose maximale tolérée afin de borner le choix des doses à utiliser pour les études de toxicité réglementaire en dose répétée, études préconisées par l’agence européenne du médicament avant le passage en clinique. L’identification d’une dose maximale tolérée élevée et éloignée de la dose efficace connue permettra également de rassurer quant au profil de sécurité du candidat médicament pour les études cliniques

Procédures

Le traitement sera administré par voir orale. Le geste permettant l’administration orale dure 10 secondes. Un prélèvement sanguin sera réalisé à l'extrémité de la queue de l'animal à trois temps différents après administration du traitement. 30 secondes seront nécessaires au prélèvement sanguin. Ces actes expérimentaux n'impliqueront que des nuisances mineures chez l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris d’âge adulte. Les prélèvements de plasma peuvent aboutir à une légère déshydratation. Une toxicité d’une dose unique et rapide induite par le traitement est possible aux fortes doses, se traduisant par des signes d’inconfort chez l’animal.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'observer visuellement l'aspect des différents organes après administration du traitement ainsi que de doser l’éventuelle accumulation du produit dans les organes cibles.

Remplacement

Les études de toxicité sont obligatoirement réalisées chez l’animal. Elles sont indispensables à la validation du profil de sécurité du médicament avant d’envisager le passage en clinique. Notre étude permet de documenter le profil de sécurité du médicament in vivo et les résultats seront utilisés pour concevoir les études de toxicités réglementaires.

Réduction

Pour cette procédure, nous limitons au maximum le nombre d’animaux afin de pouvoir réaliser des analyses quantifiables et reproductibles. Au final, les animaux seront répartis dans 6 groupes différents (différentes doses). Ces effectifs seront suffisants pour calculer les valeurs de concentrations du médicament dans le plasma ainsi que pour écarter le risque de conclure à une toxicité macro ou micro qui serait due au hasard.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites, et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement oral et les prélèvements de plasma seront réalisés par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ces deux gestes. Les prélèvements de plasma peuvent aboutir à une légère déshydratation palliée par une injection de liquide physiologique en sous cutané.

Choix des espèces

Les études preuves de concept et pharmacocinétique précédemment réalisées avec notre candidat médicament ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter notre corpus de données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à définir la dose maximale tolérée et donc à préparer les études de toxicité réglementaire qui seront réalisées sur animaux adultes, notre étude sera également réalisée sur des animaux adultes.

Les souris de ce projet sont génétiquement modifiées pour étudier deux mutations d'un gène du développement cérébral, LKB1, et certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies du développement. 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie d'électroporation in utero, puis leurs souriceaux, triés dès la naissance par la fluorescence visible à travers le crâne, sont étudiés au sevrage ou à 90 jours. Après les accouplements, la majorité des mâles se battent et sont alors hébergés seuls. Le porteur présente les tests de comportement social comme "bien établis chez la souris", sans dire si ce projet en fait passer ni lesquels. Toutes les souris sont tuées : les souriceaux pour des prélèvements, les reproducteurs âgés "réformés" faute de replacement, et les femelles opérées, que le porteur dit ne pas soumettre à une nouvelle procédure "pour raison éthique".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.

Remplacement

Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.

Choix des espèces

Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.