Procédures modérées

390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une microchirurgie de 45 minutes, avec ablation d'un rein puis clampage de l'artère et de la veine du rein restant pendant 30 minutes pour provoquer une ischémie, suivie de prélèvements sanguins et de traitements quotidiens pendant sept jours. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner des douleurs, une perte de poids et la mort sous anesthésie chez les animaux âgés, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il affirme que la complexité physiologique ne peut être reproduite in vitro et présente ce modèle comme un moyen de réduire l'échec des candidats médicaments en clinique.

Objectifs

10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale conduisent à la perte de fonction de l’organe et des décès prématurés due à des problèmes cardiovasculaires. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face à un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un nouveau modèle expérimental de souris afin d'évaluer l'efficacité de médicaments ciblant les lésions rénales aïgues. Le modèle de souris développé dans ce projet permettra d'améliorer la prédiction d'efficacité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.

Bénéfices attendus

La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques.

Procédures

Chaque animal subira : - 1 seule procédure de microchirurgie d'une durée totale d'environ 45 min: Laparotomie, ablation du rein droit, puis clampage de l'artère et de la veine rénale du rein gauche pendant 30 minutes (ischémie). Déclampage puis suture de l'abdomen (muscle et peau). - prélèvements sanguin quotidien (sur 7 jours) de 20 à 100 ul de sang par légère incision au niveau de la queue ou via une ponction de la veine faciale (durèe environ 1 min par animal). - traitements quotidien par les candidats médicaments pendant 7 jours consécutifs (durèe inférieure à 1 min par animal).

Impact sur les animaux

Les animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à la procédure de microchirurgie. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure d’ischémie reperfusion. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à clamper - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux âgés - Perte de poids après chirurgie - Lésions vasculaires au niveau du clamp pouvant entraîner une mauvaise reperfusion de l’organe

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort et disséqués afin de collecter le rein pour des analyses histologiques.

Remplacement

En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), nous travaillons au développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques aux candidats médicaments ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Les procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Sur la phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure de traitement. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés : - Pour des données uniques en fin d'expérimentation, il seront analysés par ANOVA 1-way ou par le test de Kruskal-Wallis (en fonction de l'analyse des variances). - Pour des données enregistrées en longitudinales, celles-ci seront analysées par ANOVA 2-way + Bonferonni’s post-test.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, les procédures de microchirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (Kétamine 100mg/kg +Xylasine 10mg/kg) en IP. L’animal recevra aussi une dose d’analgésique Buprénorphine (1mg/Kg) pour réduire les douleurs au réveil. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture ainsi qu'un enrichissement adéquat dans les cages d'hébergement (igloo polycarbonates autoclavables et réutilisables + carton) . Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et mis à mort. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable, et que le risque d'effets secondaires liés au traitement est minime. De plus, l'étude sera conduite par des personnels qualifiés et formés au respect des conditions du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion. L’avantage de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure d’uninephrectomie + ischémie-reperfusion et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, les souris ne présentent pas de risque d’infection post-opératoire. La procédure sera réalisée sur des animaux disponibles auprès d’élevages agrées (Charles River). Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines

2920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélèvement d'organes et une vingtaine réutilisées dans un autre projet. Chaque souris reçoit sous anesthésie deux injections intradermiques dans les oreilles, un anticorps IgE puis l'antigène, provoquant une inflammation de l'oreille, suivies d'administrations de candidats médicaments et de prélèvements sanguins répétés. Le porteur décrit ce modèle d'anaphylaxie cutanée passive comme un outil de "screening" de molécules pour les maladies auto-immunes et indique n'avoir pas relevé de signe de douleur au-delà de l'inflammation locale. Il affirme qu'un modèle substitutif in vitro n'a pas abouti et revendique le recours à l'"organisme" complet de la souris.

Objectifs

L’objectif de cette demande d’autorisation est de mettre en place un modèle d’anaphylaxie passive cutanée (PCA : Passive Cutaneous Anaphylaxis) permettant d’étudier rapidement l’impact de candidats médicament sur la dégranulation des cellules mastocytes in vivo, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto immunes. Pour cela un anticorps au format IgE dirigé contre un antigène du non soi est injecté sous anesthésie générale dans le pavillon de l’oreille en intradermique pour sensibiliser la souris, puis quelques heures plus tard l’antigène (et un colorant physiologique et indolore pour la souris permettant de suivre la perméabilité vasculaire) est injecté provoquant dans les minutes qui suivent un gonflement de l’oreille et une coloration bleue de l’oreille (deux paramètres que nous suivrons) due à une activation des cellules mastocytes qui vont relarguer de nombreux granules comme l’histamine notamment. L’évaluation de candidats médicaments dans ce type de modèle vise à évaluer si le traitement par ces candidats permet de diminuer l’anaphylaxie (réaction allergique survenant rapidement après contact avec l’agent inducteur) observée au niveau cutané, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto-immunes. Dans le processus de développement d’un candidat médicament, ce type d’étude se situe en aval des études in vitro et in silico. Il permet de sélectionner les candidats sur la base de leur capacité à diminuer l’activité du système immunitaire dans le domaine des maladies auto-immunes et également d’étudier la biodisponibilité de ces candidats (distribution de la molécule dans le corps durant les traitements). Les études incluses dans ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes terminaux pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces prélèvements sont adaptés en termes de volume/fréquence conformément aux standards éthiques et réalisés avec les méthodes les moins contraignantes possibles (ex : prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir évaluer l’impact de nos candidats médicaments sur la dégranulation des mastocytes dans un modèle préclinique en amont de toute étude clinique.

Procédures

Selon la phase de développement du modèle et la procédure expérimentale associée mise en oeuvre : -chaque souris reçoit deux injections intradermiques (une dans chaque oreille) réalisées sous anesthésie générale (moins d'une minute) ; +/- 23h plus tard et selon la phase de la mise au point : administration du véhicule, composé de référence ou candidat médicament en per os, Intra veineuse, sous cutanée ou intra péritonéale sur souris vigile (moins de 30 secondes) ; suivi 1 heure plus tard d’une injection en intraveineuse en vigile (moins de 30 secondes) ; photographies de la coloration de l’oreille et mesures de l’épaisseur de l’oreille par pied à coulisse sur souris vigile (au maximum 4 mesures - moins d'une minute à chaque mesure) ; Durée totale des études de 48h heures maximum.Tout au long de l’étude chaque souris pourra se voir prélever un petit volume de sang par µsampling (prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène - moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

Inflammation locale de l’oreille de la souris durant de la durée de l’étude (1 heure à 24 heures) -Administration de composés candidats médicaments selon les voies classiques intra-péritonéale intra-veineuse sous-cutanée ou per os

Devenir

Les souris incluses dans la première phase de mise au point de ce modèle ne nécessitant pas de prélèvements de tissus pourront être réutilisées dans le cadre d’un autre projet. A l’issue de chaque procédure, les animaux seront sinon euthanasiés pour collecte des organes et tissus et analyses in vitro des échantillons (immohistochimie, etc).

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. L’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est donc pas possible de modéliser complètement in vitro. Seules les molécules les plus abouties et les plus avancées dans leur développement sont administrées in vivo. Dans le cadre plus spécifique de ce projet, les tentatives de mise en place d’un modèle substitutif à ce modèle in vivo n’ont pour l’instant pas abouti et nous ne disposons pas d’un modèle de dégranulation in vitro suffisamment fiable et permettant le même niveau de prédictibilité que celui mené dans l’organisme de la souris avec toute sa complexité et l’intégralité des différents composants du système immunitaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera affiné au fur et à mesure de la mise en place de ce modèle. Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle très communément réalisé. Un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour les procédures 2 et 3 à l'aide d'un t test. De plus pour les premières phases chaque animal sera son propre contrôle, une seule des deux oreilles recevant l’agent inducteur et la seconde étant le contrôle.

Raffinement

L’administration de l’antigène par voie systémique va entrainer une inflammation locale du pavillon de l’oreille ayant reçu l’anticorps au forma IgE de cet antigène. Dans le cadre de cette DAP les doses utilisées du couple Anticorps/Antigène sont basées sur une analyse bibliographique et pour lesquels il n’a pas été relevé de souffrance ou de signes de douleur (si ce n’est l’inflammation locale de l’oreille qui est le paramètre étudié dans ce modèle) Des prélèvements de sang répétés en cinétique sont réalisés à différents temps afin de mesurer les paramètres biologiques d’intérêt et/ou le taux plasmatique du médicament. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique du « multisampling » à la veine latérale de la patte, méthode systématiquement privilégiée par rapport aux autres techniques usuelles car rapide, réalisable plusieurs fois sur un même individu, et respectant les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude Les administrations intradermiques dans chaque oreille sont réalisées sous anesthésie générale. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Ce suivi permettra d’identifier tout signe de souffrance et d’appliquer les mesures nécessaires au soulagement des souris en cas d’atteinte de points limites prédéfinis. Les souris seront hébergées en groupes sociaux et disposeront de matériel de nidification dans leur cage d’hébergement.

Choix des espèces

La souris présente certains traits caractéristiques similaires à l’Homme dans la biologie des réactions immuno-inflammatoires rendant ainsi pertinente son utilisation. De nombreux modèles ont montré un fort parallélisme dans les différents médiateurs mis en jeu lors des maladies auto-immunes (auto-anticorps, cellules du système immunitaire, cytokines, …). Par ailleurs l’utilisation de candidat médicament comme les anticorps nécessitent souvent l’utilisation de modèles murins dits humanisés, dans lesquels le gène cible a été remplacé par manipulation génétique par le gène cible humain sans incidence sur le phénotype. La protéine humaine exprimée pourra alors être détectée par le ou les anticorps candidats Idéalement, les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 8-9semaines, soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments.

1280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des nouveau-nés reçoivent des cellules souches humaines pour reconstituer un système immunitaire humain, puis les souris subissent des greffes de peau avec deux greffons suturés en environ 90 minutes, des greffes d'îlots pancréatiques, l'induction d'un diabète par injection d'alloxan et une imagerie intravitale répétée. Le porteur indique que ces greffes peuvent provoquer des douleurs postopératoires et une perte de poids. Il affirme que l'efficacité de la thérapie cellulaire ne peut être évaluée qu'in vivo et présente les bénéfices pour les patients au conditionnel et à terme.

Objectifs

Aujourd'hui, la greffe d'organe est souvent le dernier recours pour les patients dont les organes vitaux sont défaillants. La greffe permet de retrouver une qualité de vie et d’améliorer la survie des patients. Néanmoins, les traitements anti-rejet ont de nombreux effets secondaires (infections et cancers). Le but de ce projet de recherche, prévu sur une période de 5 ans, est de développer une thérapie cellulaire et génique pour supprimer le besoin en anti-rejets. Il s’agit de modifier génétiquement les cellules régulatrices du système immunitaire du receveur pour qu’elles neutralisent la réaction de rejet. L’efficacité in vitro et in vivo de ces cellules régulatrices modifiées a été établie. Il est désormais indispensable de démontrer et d'optimiser leur efficacité dans des modèles précliniques de greffe pour mieux garantir un effet protecteur à long terme, une étape nécessaire pour son utilisation future chez l'homme. Seul un modèle murin de transplantation est capable de récapituler la complexité des phénomènes de rejet. Quatre types de modèles murins seront utilisés pour tester et optimiser l'utilisation d’immunothérapies dont les CAR-Tregs : 1- un modèle de greffe de peau chez des souris 12 semaines après la reconstitution de leur système immunitaire par des cellules souches humaines (souris humanisées) 2- un modèle de greffe de peau chez des souris 12 semaines après la reconstitution partielle du système immunitaire par des cellules mature humaines (souris semi-humanisées) 3- un modèle de greffe d’ilots chez des souris 12 semaines après la reconstitution de leur système immunitaire par des cellules humaines (souris humanisées) et 4-un modèle de maintien de la tolérance immune avec deux greffes de peau successives chez la souris humanisée. Au total, deux lignées immunodéprimées seront utilisées.

Bénéfices attendus

A terme, ces expériences permettront : - de démontrer la synergie d'une immunothérapie ciblant les cellules dirigées contre les greffons et de CAR-Tregs - de montrer la possibilité d’expandre les CAR- Tregs in vivo, - et d'établir l'efficacité des CAR-Tregs à prévenir le rejet aigü et chronique de greffe de peau et d’ilots dans des modèles précliniques de souris humanisées. Cette nouvelle stratégie thérapeutique ambitionne d’améliorer la prévention des rejets en transplantation d’organe, tout en s’affranchissant de la toxicité des drogues immunosuppressives administrées au long cours. La prévention des réactions de rejet dans ces trois modèles complémentaires serait un argument préclinique très robuste et convaincant pour porter cette nouvelle stratégie vers une utilisation clinique.

Procédures

Injection des cellules souches: Des nouveaux nés recevront des cellules souches humaines par voie intrahépatique sans anesthésie. Ce geste est réalisé une fois et dure quelques secondes. Injection et prélèvement sanguin: réalisés dans le sinus rétro-orbitaire en alternance sur chacun des yeux sous une courte anesthésie gazeuse

Impact sur les animaux

Les greffes de peau et d’îlots peuvent induire chez les animaux des douleurs les jours suivant la chirurgie accompagnée d’une perte de poids (>10%) et une perturbation de la mobilité par le bandage. L’injection d’alloxan risque d’induire une hypoglycémie transitoire avec une augmentation du taux d’insuline plasmatique due à la destruction du pancréas.

Devenir

A l’issus de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour le prélèvement d'organes.

Remplacement

Des études fonctionnelles in vitro ont été réalisées avec des cellules humaines afin d’optimiser la préparation de la thérapie cellulaire. Toutes les étapes visant à améliorer l’efficacité de la modification génétique des cellules régulatrices ont été mises au point in vitro. Toutefois, les expériences in vitro ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, des CAR Trégulateurs dans les différents organes, ou leur capacité à migrer dans les greffons, et à induire une tolérance. En effet, lorsque les cellules sont greffées, elles se transforment en réponse à leur environnement, en particulier l’environnement inflammatoire induit pas la réaction de rejet, ce qui peut complètement modifier leur persistance et leur activité tolérogène. L’efficacité des approches de thérapie cellulaires ne peut être évaluée in fine que in vivo dans un modèle mimant la maladie humaine. Les expériences sur l’animal sont donc justifiées avant leur application chez l’homme.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés. Le suivi par imagerie intravitale permet un suivi longitudinal des animaux et donc une réduction de leur nombre. Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les résultats seront partagés avec la communauté scientifique pour éviter les doublons.

Raffinement

Afin de limiter la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques (buprénorphine) sont prévues. Une grille de score permettant d’évaluer objectivement les éventuelles souffrances, douleurs et détresses a été établie pour définir des points limites permettant d’anticiper l’administration d’analgésiques ou la mise à mort de l’animal si nécessaire. Une anesthésie gazeuse sera pratiquée pour chaque geste invasif (injection iv, prélèvement sanguin, chirurgie). Pour toute anesthésie prolongée, les animaux seront placés sur une plaque thermostatée permettant de maintenir leur température corporelle et du gel oculaire sera appliqué. La contention nécessaire pour l’imagerie in vivo sera accompagnée d’une anesthésie sous forme gazeuse par isoflurane. Dans le cas de l’anesthésie gazeuse, la vigilance de l’animal sera surveillée par pincement de la palme plantaire, mobilité des vibrisses et suivi du mouvement thoracique respiratoire et ce, jusqu’au réveil complet de l’animal. Pour réduire le stress éventuel engendré par la procédure, les animaux seront hébergés dans un environnement exempt d’organisme pathogène, enrichi à l’aide de coton (pour la nidification), de tunnels de polycarbonate (pour les activités journalières) et de bâtons en bois (pour développer leurs exigences naturelles comme ronger, grimper et se cacher). Les souris seront élevées en communauté. Cependant si cela n’est pas possible (agressivité entre deux souris par exemple), d’autres outils seront disponibles à la demande pour éviter l’ennui si des animaux se retrouvant seuls dans les cages. Pour réduire le nombre de manipulations et limiter le stress des animaux, l’imagerie in vivo sera faite en même temps la mesure du score.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé car sa génétique est proche de celle de l’homme et elle permet d’avoir des nombres d’animaux suffisants pour faire des tests statistiques. De plus, la souris est un modèle permettant d’effectuer des modifications génétiques relativement facilement. Ces modifications nous permettent d’avoir des modèles immunodéficients nécessaires pour la création de lignée dites humanisées, qui se rapprochent du système immunitaire humain. Pour la constitution des souris humanisé par injection de cellules souche humaines, les animaux seront âgés de 1 à 3 jours car c’est une période durant laquelle la greffe de cellule humaine est la plus efficace. Concernant les greffes de peau/ilots, elles seront réalisées 14 semaines post injection des cellules humaines pour permettre une reconstitution complète du système immunitaire humain. Pour le modèle de greffe d'ilots sur souris partiellement humanisées, les animaux seront greffés à l’âge de 8 à 12 semaines.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces femelles reçoivent une injection intramusculaire d'un vecteur AAV puis passent dix séances d'imagerie de bioluminescence et dix prises de sang sous anesthésie, pour mettre au point un médicament vétérinaire stérilisant présenté comme une alternative à la castration chirurgicale des chiens et chats. Le porteur inscrit le projet dans une démarche de "bien-être animal" et affirme que les souris remplacent chiens et chats aux étapes précoces, tout en prévoyant la mort des 750 souris utilisées. Il affirme qu'aucune méthode substitutive ne permet d'identifier une dose efficace et sûre.

Objectifs

Nous souhaitons réaliser des essais d’efficacité et d’innocuité chez la souris en vue de développer un médicament vétérinaire permettant une alternative à la castration chirurgicale des animaux de compagnie. L'enjeu de cette demande d’autorisation de projet s’inscrit dans un contexte de développement d’une solution alternative à une mutilation inutile et s’inscrit dans une démarche globale favorisant le bien-être animal. Outre le fait d’éviter la souffrance animale, la solution développée permettra de prévenir le recours à des euthanasies inutiles effectuées aujourd’hui sur des chiens et chats errants. Dans le respect de la règle des 3R : Afin de limiter au maximum le recours aux animaux durant ce projet, les premiers tests de sélection des candidats médicaments ont été/seront réalisés in vitro en laboratoire. Néanmoins, l'absence de méthodes substitutives à l'utilisation d'animaux permettant d’identifier aux mieux une dose efficace et sécurisée pour les animaux de compagnie font que des essais chez la souris sont justifiées. L’emploi de souris permet de remplacer l’emploi de chiens et de chats à des étapes précoces du développement. Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur réception à leurs morts : condition d'élevage des animaux adaptée, présence d'enrichissement dans les cages, visite quotidienne par du personnel qualifié. Une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée entre la réception des animaux et le début de la procédure. De plus lorsque cela est nécessaire les animaux seront anesthésiés et surveillés. De même, certains prélèvements pourront être effectués sur animal mort. Pour l'ensemble de la procédure, des critères d'arrêt par rapport à la souffrance strictes seront appliqués. Nous demandons pour réaliser l'ensemble de ces essais 750 animaux au total sur une période de 5 ans.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de trouver une alternative à la castration chirurgicale qui est traumatisante pour les animaux.

Procédures

Injection intramusculaire : une fois pour un temps de 1 min Imagerie de bioluminescence : 10 fois pour un temps de 20 min avec 15 jours à 1 mois d'espacement. Prélévement de sang : 10 fois apour un temps de 1 min avec 15 jours à 1 mois d'espacement.

Impact sur les animaux

L'injection intra-musculaire d'AVV peut provoquer une inflammation en locale. La manipulation des souris et notamment l'imagerie réalisée nécessite des anesthésies gazeuses.

Devenir

Les animaux utilisés présentent un risque modèrés pour l'homme ou pour l'environement.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent pas encore être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments biologiques mis en œuvre.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire par lot a été défini statistiquement. Il est ici de 15.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, de la douleur et/ou de l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront suivies quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter d’éventuels signes cliniques ou de mal-être. Les animaux sont hébergés dans le respect de la législation. Les conditions d’hébergements sont adaptées au statut sanitaire de ces animaux (cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. ). En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des souris femelles de 5 semaines (démarrant l’expérimentation à 7 semaines après 2 semaines d’acclimatation). De plus, les femelles sont plus aisément manipulables que les mâles et que nous pouvons nous limiter au genre femelle pour réduire le nombre d’animaux (dans le respect des 3R). Les hormones de reproduction étant similaires chez la souris et chez les animaux de compagnie, cette espèce est adaptée à notre étude. Les souris seront utilisées à l'âge de 7 semaines, âge pour lequel elles sont reconnues comme pubères et fertiles et dont on pourra confirmer l’induction d’une stérilisation biologique et après 2 semaines d’acclimatation.

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes puis des jeunes reçoivent par voie orale des composants du cannabis pendant dix à trente-cinq jours, pour tester l'hypothèse d'un lien entre cette exposition et le cancer du testicule. Le porteur signale le stress de l'administration orale et un risque de fausse route pouvant conduire à euthanasier l'animal, et met à mort les souris pour prélever le sang et les testicules. Il indique disposer de lignées cellulaires et de cultures d'organes humains mais affirme qu'elles ne remplacent pas l'animal.

Objectifs

Le cancer du testicule constitue le cancer le plus fréquent chez l’homme entre 15 et 40 ans. L’étiologie de ce cancer est encore mal comprise. Les données épidémiologiques convergent pour indiquer que l’exposition à des facteurs environnementaux pendant certaines fenêtres de vulnérabilité, telles que le développement et la puberté, est impliquée dans la tumorisation des cellules germinales testiculaires. Récemment, la consommation de cannabis, substance illicite la plus consommée par les adolescents et les femmes en âge de procréer, a été corrélée au développement de tumeurs du testicule chez de jeunes consommateurs. Il a été établi que le développement de ce type de cancer affecte la fertilité. Dans ce contexte et sur la base de nos résultats préliminaires, nous postulons que les cannabinoïdes (CA), molécules contenues dans le cannabis, favorisent l'apparition du cancer du testicule en perturbant la maturation des cellules souches germinales. Le but de ce projet est donc d’évaluer si une exposition aux principes actifs du cannabis pendant la vie fœtale et/ou la puberté affecte la différenciation et la fonction testiculaire et pourrait ainsi favoriser le développement de tumeurs germinales.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettrait de mettre en exergue les conséquences d'un cumul d'exposition auxquelles les populations les plus vulnérables sont soumises, et ce en comparaisons avec une exposition uniquement gestationnelle ou uniquement pubertaire.

Procédures

Traitement par administration orale repetée (pendant 10 jours ou pendant 35 jours). Ce geste est rapide (10 à 20 secondes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont le stress induit par l'administration orale des souris gestantes pendant 10 jours ainsi que des souris prépubères pendant 35 jours. La possibilité de fausse route est également un risque induit par ce traitement. Bien que les doses utilisées ici sont des doses utilisées en thérapie humaine, nous ne pouvons exclure un effet néfaste des cannabinoïdes utilisés sur le développement pré- ou postnatale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les organes ainsi que les matrices biologiques à investiguer dans le cadre de notre étude. Il s'agit du sang, des testicules, de l'épidyme et du foie.

Remplacement

Alternativement aux modèles animaux, il existe des lignées de cellules cancéreuses testiculaires humaines. Nous utiliserons ces dernières afin de travailler sur les voies de signalisation spécificiques modulées en présence de CBD et/ou THC. Nous utilisons également des modèles de cultures organotypqiques de testicules adultes et foetaux humain pour investiguer la réponse de l'organe aux traitements. Ces modèles ne permettent pas d'obtenir la réponse de l'organisme, contrairement aux modèles animaux, et notamment de prendre en considération les interactions mère-foetus tout comme l'effet des traitements sur l'axe hypothalamo-hypophysaire, axe régulant la fonction reproductive. Ils restent complémentaires mais ne peuvent se substituer à l'utilisation d'animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental sera de 6 pour nous permettre de mener à bien des études statistiques et de prendre en compte la "réduction" de la règle des 3R.

Raffinement

Pour réduire au maximum le stress des animaux, les traitements seront administrés par voie orale par des personnes expérimentées en présence de musique qui, nous l'avons constaté, a pour effet de relaxer les animaux comme l'expérimentateur. Les animaux seront observé quelques minutes après le traitement pour vérifier l'absence de fausse-route. Si une fausse-route s'avérait constaté, l'animal serait euthanasié. Plusieurs paramètres du bien-être des animaux (mobilité, poids,activité de toilettage) sont particulièrement surveillés pendant la procédure et des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

Nous avons choisis la souris Swiss ici pour sa fertilité élevée et sa facilité d'élevage et de traitement. Les animaux seront utilisés du stade embyonnaire jusqu'à 8 mois.

1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à trois chirurgies, ovariectomie, implantation d'un comprimé d'hormonothérapie, injection de cellules tumorales ou curage ganglionnaire, précédées d'injections de tamoxifène, pour étudier l'effet des œstrogènes sur le microenvironnement d'une tumeur mammaire et sur le lymphœdème. Le porteur qualifie de modérées les douleurs liées aux chirurgies et au développement des tumeurs, et prélève les organes en fin de vie. Il affirme qu'aucune stratégie de remplacement ne permet d'étudier ces processus et que la souris est le seul modèle disponible.

Objectifs

L'hormonothérapie est un des premiers traitements du cancer du sein exprimant le récepteur des oestrogènes (dit ERα-positif) et a permis de réduire largement le nombre de récidives chez les patientes et ainsi d'augmenter la survie chez ces femmes. Or, l'impact de ce traitement sur le micro-environnement de la tumeur, de tumeurs dites ERα-négatives (n'exprimant pas le récepteur des oestrogènes), est encore mal connu, alors qu'une certaine efficacité a été observée dans les premiers essais cliniques . De plus, de nombreuses résistances apparaissent, ainsi que des lymphoedèmes secondaires qu'il reste à mieux comprendre pour mieux le traiter. Le lymphodème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer et qui est souvent associée à ces traitements d'hormonothérapie. Ce projet cherche donc à mieux caractériser l'impact de cette hormonothérapie sur le micro-environnement tumoral dans le cadre du cancer du sein, pour trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce travail est un travail qui étudie les mécanismes d'actions spécifiques du récepteur des oestrogènes ERα dans la réponse à un traitement d'hormonothérapie par les SERMS (Selective Estrogen Receptor Modulators) sur les cellules endothéliales, non seulement sur les cellules endothéliales vasculaires mais aussi sur les cellules endothéliales lymphatiques. Cette étude permettra à terme de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les cancers ERα négatives , en particulier là où les autres stratégies anti-angiogéniques ont échoué. De plus, cette étude de l'impact d'ERα dans la réponse à l'hormonothérapie sur le réseau lymphatique permettra de mieux comprendre le développement du lymphoedème secondaire à la chirurgie du cancer du sein afin d’améliorer les traitements et la qualité de vie des patientes ayant subi un curage ganglionnaire.

Procédures

Les animaux pourront subir jusqu'à 3 chirurgies (ovariectomie (durée 20 min),implantation petit comprimé pour traitement par l'hormonothérapie (durée 5 min), injection de cellules tumorales (durée 5 min) ou curage ganglionnaire ( durée 30 min)) après 5 injections consécutives de Tamoxifène pour induire la Cre-recombinase sur les animaux transgéniques génétiquement modifiées. Toutes ces procédures sont espacées de 2 à 3 semaines pour laisser à l'animal le temps de récupérer des chirurgies et du stress éventuel occasionné. Tous les prélévements sont effectués en phase terminale, sans réveil.

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes (tumeurs, poumons, pattes, utérus, foie) et réaliser des analyses immunohistochimiques et/ou moléculaires

Remplacement

Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de l'hormonothérapie (anti-oestrogènes) dans le cadre du traitement du cancer du sein. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de la réponse à l'hormonothérapie . De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel l’invalidation génique du récepteur aux oestrogènes a été générée. De plus, c'est le seul modèle où l'on peut avoir un suivi de la croissance tumorale avec formation de métastases.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules, elles subissent des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces, et un tiers reçoit dans l'eau un produit qui enflamme l'intestin pendant sept jours, provoquant selon le porteur une douleur intestinale croissante et des diarrhées avant la mise à mort. Le projet étudie la rupture de l'équilibre entre l'hôte et son microbiote induite par un régime pauvre en fibres. Le porteur affirme l'impossibilité de modéliser cette dynamique in vitro ou in silico.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies non transmissibles (maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. Ces maladies sont associées à des signaux déclencheurs provenant de notre environnement (microorganismes de l’intestin, alimentation) et se caractérisent par une inflammation locale de l’intestin. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Ces maladies de longue durée résultent de l’association combinée de plusieurs facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux dont la nutrition et l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein de cet organe. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des altérations de la composition du microbiote intestinal chez des patients atteints de maladies non transmissibles. Cette altération de la symbiose hôte-microbiote est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du système immunitaire de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies non transmissibles, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par la diminution du potentiel fonctionnel du microbiote intestinal et de son hôte. Notre projet consiste à évaluer la mise en place et le maintien à long terme d’une rupture de symbiose hôte-microbiote induite par un régime pauvre en fibres et à déterminer les conséquences de ce changement de régime alimentaire sur la symbiose lors d’un stress inflammatoire aigu. L’objectif final de nos travaux est de caractériser la rupture de symbiose et d’en évaluer les conséquences sur la santé dans un modèle animal afin d’identifier des leviers, à la fois côté hôte et côté microbiote, qui permettraient de retarder, prévenir et/ou traiter sa survenue, son installation et sa persistance chez l’individu.

Bénéfices attendus

Les maladies non-transmissibles, qui sont en constante augmentation, sont une préoccupation majeure de santé publique. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. De nombreux travaux témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal due à un régime alimentaire appauvri en fibres. Notre projet amènera à une meilleure compréhension des mécanismes de la rupture de la symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire appauvri en fibre s ; compréhension qui permettra d’identifier de nouvelles solutions de dépistage et de traitement.

Procédures

Tous les animaux seront hébergés en cage indivuduelle tout au long de l'expérimentation. Les deux tiers des animaux recevront un régime appauvri en fibres pendant une durée de 4 semaines. Tous les animaux recevront une solution par gavage au minimum 2 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de contention sera de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux auront au minimum 1 et au maximum 3 prises de sang. Le temps de collecte, contention comprise, sera de 30 secondes à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans la procédure. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. Un tiers des animaux recevra dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin pendant sept jours consécutifs en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition à un régime inflammatoire, ce qui pourra entrainer une perte de poids. Les prises de sang engendrent une douleur modérée de courte durée et un stress léger dû à la contention. De même, les gavages seront réalisés par un expérimentateur confirmé à l’aide d’une sonde gastrique et engendreront un stress léger dû à la contention de quelques minutes mais ne causeront pas de douleur. L’absorption du produit inflammatoire entraine une douleur intestinale croissante pendant les 7 jours de traitement occasionnant des diarrhées avant la mise à mort des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de reproduire/modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.

Réduction

D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 120 animaux pour le groupe contrôle et 240 animaux pour les groupes expérimentaux sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement composé d'un abri en propylène rouge et d’un Mouse Swing et d'un abri en propylène rouge afin de répondre au mieux à leurs besoins comportementaux naturels et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les cages seront transparentes afin que les animaux gardent un contact visuel avec leurs congénères et n’auront pas de couvercles filtrants afin de maintenir le contact sonore et olfactif. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur le poids, l’apparence des animaux et leur comportement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris qui sont largement utilisées pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes pauvres en fibres en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc une référence pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

194 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être transférées vivantes vers le laboratoire d'un collaborateur pour la suite de l'étude. Ces souris porteuses d'une mutation liée au syndrome de Hermansky-Pudlak subissent deux prélèvements sanguins à six et huit semaines, pour analyser leurs plaquettes et leur système immunitaire. Le porteur indique un risque de saignement prolongé chez ces animaux dont la mutation affecte la coagulation. Il affirme que la lignée cellulaire in vitro ne suffit pas et que le modèle souris reste "indispensable" à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

L’étude des maladies rares d’origine génétique permet aujourd’hui de décrire les gènes, des protéines et des mécanismes biologiques fondamentaux pour la compréhension du vivant et celle de maladie plus fréquente. Nous avons identifié chez des patients atteints du syndrome de Hermansky-Pudlak (SHP) qui est une maladie multisystémique caractérisé par un albinisme oculo-cutané et un terrain hémorragique. Une mutation d'un gène qui pourrait être à l’origine du déficit immunitaire global ainsi que d’anomalies sanguines principalement thrombopénie (déficit des plaquettes) avec des dysfonctionnements de la fonction plaquettaire. Notre projet et l’étude de la modification de ce gène impliqué dans la pathologie complexe observée chez les patients, grâce au modèle de souris portant la mutation de notre gène d'intêret. Plus précisément, nous souhaiterions étudier les paramètres hématologiques et particulièrement les plaquettes et leur physiologie. Pour cela des prélèvements de sang seront réalisés chez des souris contrôles et mutantes, afin d’être analysés. Au total 194 souris seront nécessaires pour valider notre question biologique et obtenir des résultats statistiquement valides.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre projet et l'étude de systeme immunitaire et la fonction plaquettaire dans le cadre d'une maladie rare le syndrome de Hermansky-Pudlak , nous souhaiterons comprendre les mecanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène et son effet sur la thrombopenie (deficite plaquettaire)

Procédures

Les souris seront soumises à 2 prelevements sanguins (vigiles) à l'age de 6 et 8 semaines. Nous avons également un groupe de 7 mois.

Impact sur les animaux

Comme la mutation chez l’homme induit une dysfonction de la fonction plaquettaire et de la thrombopénie, un risque de saignement prolongé au moment de la prise de sang pourrait être observé sur notre modèle de souris mutantes.

Devenir

Tous les animaux seront transferés dans le laboratoire de notre collaborateur pour completer l'étude immunologique.

Remplacement

Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et est étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal (souris) reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystemique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en gardant s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Etant donné le manque de donnée concernant cette nouvelle lignée, l’analyse de puissance sera revue en fonction des données générées. En effet, en fonction du phénotype observé, on pourrait être amené à réduire le nombre d'animaux tout en cherchant à atteindre une puissance statistique de 80%. Un maximum de 194 souris sera nécessaire. Comme on s'attend à avoir le même phénotype chez les mâles et les femelles, nous utiliserons pour chaque série l'un des 2 sexes (selon la production), ce qui éviterait de dédoubler les effectifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation et son euthanasie. Les animaux seront observés toutes les semaines avec une grille de suivi du bien-être, en plus du suivi quotidien habituel. Afin d’éviter toute perte de sang excessive (hémorragie), le site de ponction sera comprimé avec un hémostatique local afin d’atteindre l’hémostase.

Choix des espèces

Le modèle souris est très pertinent et est necessaire pour étudier de la modification de notre gène d'intêret à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystemique ; de plus, le modèle de souris est très étudié et largement utlisé pour analyser la fonction plaquettaire. Les animaux seront étudiées à l'âge de 6 et 8 semaines à fin d'étudier les 2 stades avant l'age adulte et à l'age adulte. Nous avons également un groupe de souirs de 7 mois afin comparer l'effet de l’âge dans ce groupe.