Procédures modérées
Modulation métaboliques et transcriptionnelles dans la rétine au cours du processus neurodégénératif
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour étudier les atteintes de la rétine dans des maladies neurodégénératives. Elles subissent des prélèvements de larmes, des injections intrapéritonéales et des injections dans l'œil de vecteurs viraux sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever le système nerveux central. Le porteur indique que l'injection dans l'œil provoque une douleur locale et une sécheresse oculaire, traitées par gel et antalgique, et que les modèles de Parkinson restent asymptomatiques sur la période étudiée. Il affirme que le remplacement n'est pas applicable, tout en prévoyant d'approfondir ensuite les analyses sur des cultures de rétine.
Objectifs
L'impact des handicaps visuels (atrophies optiques, glaucome, dégénérescence maculaire) s’accroît dans nos pays développés avec l’augmentation de la communication visuelle et le vieillissement de la population. Des déficiences du système visuel sont également retrouvées dans des pathologies neurodégénératives, qu’elles ciblent directement le système visuel comme dans le cas de l'Atrophie Optique Dominante (AOD), ou indirectement comme la Maladie de Parkinson (MP). En effet, la patients atteints de MP subissent des troubles visuels très précocement, avant même l’apparition des premiers symptômes moteurs. De ce fait, l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires expliquant ces défaillances visuelles pourrait permettre de déterminer des facteurs prédictifs ou pronostiques de l'évolution de ces pathologies. L’AOD et la MP ont des étiologies très différentes mais présentent toutes 2 des troubles dans la physiologie de la rétine et/ou du nerf optique, liées à des défauts de l’activité des mitochondries. Ces dysfonctions mitochondriales produisent un stress cellulaire auquel les cellules tentent de répondre en modifiant leur activité métabolique et ceci passe par une reprogrammation de l’expression de certains gènes. Ainsi, notre projet vise à étudier le remodelage métabolique et transcriptionnel de la rétine et du nerf optique au cours de l’évolution des processus dégénératifs dans le but d’étudier la sensibilité particulière de la rétine dans le processus neurodégénératif et de déterminer de potentiels biomarqueurs pronostiques précoces pour ces pathologies.
Bénéfices attendus
Notre projet, validé par différentes instances scientifiques et financeurs, permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes physiopathologiques de ces maladies, notamment dans leurs étapes précoces impliquant des dysfonctionnements mitochondriaux dans les neurones. Nos résultats permettront également de définir des biomarqueurs pronostiques précoces, voire des cibles thérapeutiques pour ces pathologies pour lesquelles il n’existe encore à l’heure actuelle que très peu de prise en charge.
Procédures
Les animaux seront soumis à (1) des prélèvements non-invasifs sur animaux vigiles (larmes), de facon hébodmadaire tout au cours de lexpérimentation - ces prélèvements sont réalisés à l'aide de papier buvard (30 secondes) ; (2) injections intrapéritonéales sur animaux vigiles (1ml/100g, 5 secondes) ; (3) des procédures chirurgicales sous anesthésie : injections intravitréennes de vecteurs viraux (2ul, 1 min). Tous les animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
Les injections intravitréennes de vecteurs viraux induisent une douleur locale et transitoire qui sera gérée par l’application de d’un antalgique oculaire juste après l’injection. Une sécheresse oculaire peut également être observée dans les 2 à 3 jours qui suivent l’injections. Nous appliquerons systématiquement et quotidiennement un gel lubrifiant sur les yeux des souris les 3 premiers jours après l’injection. Les modèles de Parkinson que nous utiliserons dans ce projet sont asymptomatiques pour les périodes étudiées, les souris ne devraient donc pas présenter de stress, douleur ou de souffrance particulière en dehors des procédures d’injection et chirurgie, qui seront elles réalisées sous analgésie/anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanisés en fin de procédure car les études porteront sur les tissus frais du système nerveux central.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies et des interactions cellulaires impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Néanmoins, une fois que nous aurons validé ces points chez l’animal, l’analyse des mécanismes moléculaires sera approfondie à partir de cultures organotypiques de rétines murines que nous avons également mis en place au laboratoire.
Réduction
Nous planifierons chaque expérience pour minimiser le nombre d’animaux tout en permettant une analyse statistique fiable de nos résultats. Pour le modèle d’AOD, la déplétion d’OPA1 induite avec une injection de vecteur viral sera réalisée sur un œil, tandis que l’autre œil recevra le vecteur contrôle, minimisant ainsi à la fois le nombre de souris et le risque de variabilité inter-groupes. Les modèles d’induction de Parkinson choisis ont été déjà validés par nous-mêmes et nos collaborateurs et nous savons que des groupes de 5 souris sont en général suffisants pour pouvoir exploiter les résultats. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi rapproché quotidien des animaux dès l’initiation des différents modèles. Ce suivi nous permettra d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). L’expérimentation sera arrêtée et l’animal euthanasié en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences tenus à jour des personnes concernées.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour le développement de ces modèles pathologiques du fait de son faible coût, de sa facilité de manipulation et de son adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour être déficients en Foxo3 ou exprimer une sous unité ribosomique taguée qui n’existent que chez la souris. Enfin, les caractéristiques des modèles de MP et d’AOD utilisés dans ce projet ont été établis chez cet animal, et nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc ...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 10 semaines au début de l'expérience. A ce stade, les souris ont terminé leur croissance et possèdent un système neuronal et immunitaire mature et fonctionnel.
Fonction et potentiel thérapeutique des neutrophiles dans la maladie de Charcot
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dans deux modèles de la maladie de Charcot. Elles reçoivent des anticorps par voie intraveineuse et des prises de sang, sont suivies par des tests de motricité et de coordination, puis subissent une ponction intracardiaque sous dose létale d'anesthésique pour prélever le système nerveux. Le porteur indique que l'un des modèles perd progressivement sa masse musculaire jusqu'à des difficultés à se déplacer et que la maladie y est fatale, tout en affirmant que les souris ne montrent pas de signes de douleur. Il présente le recours à l'animal comme "indispensable" et le seul à reproduire les interactions entre système immunitaire et système nerveux.
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, fatale, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière et qui sont responsables de la contraction des muscles volontaires. La maladie de Charcot touche environ 7000 patients en France. La maladie débute généralement entre 50 et 70 ans par une faiblesse musculaire, évoluant rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire qui conduit au décès dans les 2 à 3 ans suivant l'apparition des symptômes. Malgré l'explosion des connaissances sur les processus pathologiques centrés autour du neurone moteur, d’autres faisceaux d’évidences suggèrent que la maladie met en jeu le système immunitaire. Le système immunitaire comprend de nombreux médiateurs de l’inflammation, un processus qui peut influencer les maladies neurodégénératives comme la maladie de Charcot. Les neutrophiles représentent une population de globules blancs très abondante dans le sang et la première barrière de défense de l’organisme contre les infections bactériennes. Ils ont récemment été montrés comme jouant un rôle dans la maladie d’Alzheimer. En revanche leur rôle dans la maladie de Charcot demeure inconnu. Notre objectif est de comprendre la fonction des neutrophiles dans la maladie et d’évaluer leur potentiel comme cible thérapeutique. A cette fin, nous aborderons cette problématique par une description précise des défauts de cette population de cellules immunitaires au cours du temps. Notre dernier objectif est d’évaluer une approche d’immunothérapie visant sélectivement les neutrophiles. Le but de ce projet est donc de fournir un nouvel éclairage sur la maladie en mettant en évidence la contribution d’un nouveau type cellulaire du système immunitaire et offrir de nouvelles perspectives.
Bénéfices attendus
Identifier de nouveaux acteurs cellulaires qui contribuent à la dégénérescence des neurones moteurs dans la maladie de Charcot permet d’avoir une vue plus complète de la maladie et proposer ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques. Les bénéfices de cette étude présentent donc un potentiel clinique. Ce projet propose de faire progresser nos connaissances scientifiques sur cette pathologie qui est particulièrement complexe. Notre connaissance encore incomplète de la pathologie explique pour une grande part les nombreux échecs thérapeutiques rencontrés chez les patients jusqu’à présent. Notre projet propose d’explorer une population de cellules du système immunitaire. Facile d’accès en terme thérapeutique, le système immunitaire facilite ainsi le développement des thérapies. Notre projet explore une approche d’anticorps thérapeutiques qui a un fort potentiel clinique comme l’illustre l’efficacité des anticorps médicaments dans la sclérose en plaque par exemple. L’utilisation de deux modèles différents de la maladie est un point fort de cette étude en mimant l’hétérogénéité clinique de la maladie de Charcot. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et potentielles applications dans deux modèles différents. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et potentiellement un/des dépôts de brevet.
Procédures
Le projet implique de délivrer des anticorps thérapeutiques dans la circulation sanguine des souris et de réaliser des prélèvements sanguins. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (1-2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention et celle d’une piqure. Afin de suivre l’évolution des capacités motrices des souris atteintes de la maladie de Charcot, les animaux seront suivis par des tests comportementaux simples, non invasifs, ne nécessitant pas de déprivation de nourriture. Deux tests comportementaux moteurs seront ici utilisés pour définir les capacités motrices et les propriétés de coordination motrice. Chaque test prend moins de 5 min par souris. Notre étudions le rôle de certaines populations de globules blancs dans la pathologie et leur potentiel thérapeutique. Nous avons besoin de réaliser des études d’histologie du système nerveux et de cytométrie du système immunitaire. A cette fin, une préparation des tissus est nécessaire avant de procéder à la biopsie. Nous procédons donc à une perfusion ou ponction intra-cardiaques sur des animaux anesthésiés ayant reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal. Des souris pourront se trouver hébergées individuellement, dans un environnement enrichie amplifié pour une durée de 21 jours.
Impact sur les animaux
La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable dont l’issue est inexorablement fatale. Les modèles souris que nous utilisons ont été très bien caractérisés dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation de la règle des 3Rs. Le trait commun de la pathologie chez ces deux lignées de souris est la diminution des capacités motrices. Ces modèles présentent une atteinte motrice variable, un début et une progression de la maladie différents. Les modèles de la maladie de Charcot ont été particulièrement bien décrits quant au tableau et à la chronologie clinique de la pathologie. Un des modèles présentent une réduction progressive de la masse musculaire commençant par les membres inférieurs. Cette amyotrophie se traduit par une perte de poids et des difficultés déambulatoires. Le deuxième modèle perd très lentement ses capacités à effectuer une tache motrice et présente une posture anormale (dandinement) qui est stable pour suivre un déclin normal lié à l’âge et à la prise poids. Ce modèle présente une atteinte motrice plus légère qui n’est pas associée à une espérance de vie plus courte. Les souris, comme c’est le cas chez les patients, ne présentent pas de signes de douleurs. Notre objectif est d’améliorer les symptômes moteurs par des anticorps thérapeutiques. L’administration d’anticorps thérapeutiques dans la circulation est une approche peu invasive, maitrisée et standardisée. Les animaux qui rentrent dans l’évaluation thérapeutique sont impliqués dans du comportement moteur consistant à évaluer de façon non-invasive, non-douloureuse, très peu contraignante et de courte durée la capacité à effectuer une activité motrice simple.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier les liens entre système immunitaire et système nerveux central et déterminer les paramètres histologiques en liens avec des caractéristiques cliniques et un effet thérapeutique. L’autre nécessité est liée à la pathologie elle-même, qui est fatale chez l’homme et également dans un des modèles murins utilisé ici, et rentre dans le cadre de l’étude de l’approche thérapeutique sur l’espérance de vie des souris qui auront reçu ou non le traitement.
Remplacement
La maladie de Charcot est une maladie fatale et incurable qui se caractérise par une perte des neurones qui contrôlent l’activité des muscles squelettiques. L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système intégrant la complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux. Une telle interaction qui se met en place durant des mois et qui implique d’autres cellules autres que le neurone moteur, ne peut pas être mimée in vitro. Seul les modèles expérimentaux mammifères présentent la complexité des interactions entre les cellules du système immunitaire et les cellules du système nerveux, et les barrières physiologiques comme les méninges. Cependant, afin d’explorer les mécanismes impliqués dans l’interactions neutrophiles et neurones moteurs, nous développons des systèmes de cultures in vitro entre neutrophiles et neurones moteurs. Notre objectif étant également de développer une thérapie utilisant des anticorps ciblant cette population de globules blancs, l’utilisation des modèles animaux de la maladie de Charcot est également indispensable. La validation d’une approche thérapeutique qui intervient dans la complexité de cette communication entre système immunitaire et système nerveux requiert un modèle physiologique complet que seul l’animal offre. Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour tout transfert thérapeutique potentiel vers la clinique.
Réduction
Nous avons donc déterminé pour une durée du projet de 4 années, un nombre total de 590 souris. Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Pour un premier modèle de la SLA chaque cohorte est composée de 24 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologiques, de séquençage et de cytométrie. Pour le second modèle, chaque cohorte est composée de 14 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologique, de séquençage et de cytométrie. Afin de minimiser le nombre d’animaux, ceux qui ont servi à la reproduction sont inclus dans les cohortes expérimentales. Nous utilisons également des cohortes mixtes male et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage. Notre projet inclut également une étude in vitro qui permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèles de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, igloo, lanières de papier craft et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Les points limites sont définis par le suivi régulier du poids des souris et leur capacité à effectuer une tache motrice reflexe simple. Pour chaque modèle animal de la maladie de Charcot un arbre décisionnel spécifique est défini et suivi par les expérimentateurs associés au projet. De plus une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. L’administration d’anticorps thérapeutiques est réalisée avec un anesthésique appliqué localement et les animaux sont suivis régulièrement après chaque injection. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur ou d’infection est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. Une grille d’évaluation définie par la structure du bien-être animal nous permet de suivre les animaux ainsi identifiés et de prendre rapidement des mesures adaptées.
Choix des espèces
Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité et valorisation des résultats: début précoce/tardif, progression lente/rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. L’exploration des propriétés phénotypiques et génétiques des neutrophiles au cours de la maladie ainsi que le protocole d’immunothérapie que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la pathologie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie d’immunothérapie. La complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle à la physiologie complexe qui se rapproche de celui de l’homme. Les modèles de la maladie de Charcot qui sont utilisés récapitulent les principales étapes de la maladie. Nous utiliserons 2 modèles différents qui permettent de représenter l’hétérogénéité clinique et génétique de la maladie. Afin de suivre la maladie nous utiliserons les lignées à trois stades significatifs. L’âge de chaque stade étant différent en fonction du modèle. Nous utiliserons les souris 1) au stade précédent les premiers signes moteurs, c’est le stade asymptomatique. 2) Le stade de début de la maladie ou les premiers signes moteurs sont quantifiables. 3) Un stade ou la maladie est installée, qui est le stade symptomatique. L’espérance de vie des souris est également étudiée dans une procédure thérapeutique.
Étude de l’impact du biallélisme Tlr7 sur l’immunité humorale protectrice lors de la vaccination contre la grippe H1N1 chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
349 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester si un gène du chromosome X explique la réponse immunitaire plus forte des femelles à la grippe. Des femelles portant une ou deux copies du gène TLR7, et leur descendance, reçoivent un vaccin ou une injection de virus grippal H1N1 sous anesthésie, avec des prises de sang répétées. Le porteur indique attendre les signes classiques de la grippe, perte de poids, perte de motricité, douleur et incapacité à s'alimenter, avant mise à mort pour prélèvement. Il affirme qu'une expérimentation sur animal est "nécessaire" après les travaux in vitro du projet.
Objectifs
La nature et la force de la réponse immunitaire varient entre les femmes et les hommes, ce qui entraîne des différences fondées sur le sexe dans la prévalence, la susceptibilité et les symptômes associés aux maladies infectieuses . Certains gènes du chromosome X (dont le gène appelé TLR7) constituent une ligne de défense essentielle contre les virus à ARN (dont les virus influenza, responsables de la grippe). Les femelles mammifères (XX) ont 2 copies actives du gène TLR7 par cellule, alors que les mâles (XY) n’en ont qu’une. Il a été démontré (chez la souris comme dans l’espèce humaine) que les femelles présentent des réponses immunitaires à l'infection grippale et à la vaccination supérieures à celles des mâles. Nous allons étudier la réponse immunitaire suite à une vaccination grippe ou à une injection de virus grippal chez des souris femelles ayant une ou deux copies du gène TLR7, afin d’étudier la qualité de la réponse immunitaire chez ces femelles ainsi que chez leur descendance.
Bénéfices attendus
Nous allons développer et valider de nouveaux outils génétiques chez la souris pour suivre les cellules immunitaires au cours de la réponse à la vaccination ou à l’infection par des virus de la grippe afin de déterminer si les différences de réponse immunitaires entre mâles et femelles passe bien par le gène TLR7. Globalement, notre projet fournira de nouvelles connaissances sur la nature des mécanismes responsables de la prédominance féminine dans l'immunité induite par TLR7, et pourrait ouvrir des voies pour le développement de nouvelles stratégies vaccinales contre les virus de la grippe et plus généralement contre les virus à ARN.
Procédures
prises de sang (sous anésthésie, entre 1 et 8 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; pesées (animaux vigiles, 1 à 2 par jour selon les procédures, durée 30 secondes); injections de vaccin ou serum (sous anesthésie, entre 1 et 2 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; injection de virus (sous anesthésie, 1 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes); anesthésie/euthanasie finale en fin de procédure
Impact sur les animaux
Nous attendons les signes cliniques classiques des infections Influenza A chez la souris : perte de poids, perte de motricité, douleur, incapacité à s’alimenter
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. ce sont des souris d’élevage, transgéniques, voire infectées par du virus influenza, ce qui requiert une euthanasie systématique en fin de procédure
Remplacement
Afin d’étudier l’effet du nombre de copie du gène TLR7 sur la réponse immunitaire humorale face à une infection virale, une expérimentation animale est nécessaire après les études in vitro (correspondant aux autres workpackages du projet)
Réduction
Des études statistiques seront utilisées dans cette étude afin de justifier la pertinence de nos résultats. Tenant compte de l’expérience des membres du projet ainsi que des données de la littérature, le nombre de souris nécessaire par groupe expérimental pour que nos résultats soient pertinents est déterminé de la façon suivante : 3 souris par groupe et/ou jour post infection pour les autopsies, 5 souris pour un suivi clinique de 14 jours, et 5 souris contrôles non infectées).
Raffinement
Le suivi des animaux sera effectué 1 fois par jour pendant la durée de la procédure, et 2 fois par jour au pic de l’infection. Les animaux seront euthanasiés dès qu’un des points limites sera atteint. Pour les prises de sang et injections (de serum (voie IP), de vaccin (voie IP) ou de virus (voie IN), les souris seront anesthésiées en utilisant le poste d'anesthésie gazeuse (isoflurane).
Choix des espèces
Les souris sont classiquement utilisées pour étudier la réponse immunitaire lors d’infection au virus Influenza. Par ailleurs, nous allons utiliser une lignée murine transgénique produite par notre partenaire dans le projet, et son équivalent sauvage - animaux adultes pour étudier la réponse immunitaire d’animaux en âge de reproduction, et pour obtenir une descendance. - souriceaux pour étudier l’effet des anticorps maternels contre une infection influenza chez la descendance
Rôle du transporteur des monocarboxylates 2 (MCT2) dans un modèle murin de démyélinisation du système nerveux central
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
510 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'un transporteur dans la formation de la myéline. Une partie reçoit cinq injections de tamoxifène puis subit une lésion chirurgicale de la moelle épinière sous anesthésie, l'autre, âgée de cinq jours, reçoit les injections avant d'être tuée à divers stades du développement. Le porteur signale des douleurs post-opératoires, un risque d'hémorragie et d'hypothermie et des hématomes liés aux injections répétées, avant prélèvement des tissus. Il présente les modèles murins comme "indispensables" au motif que les cultures et les invertébrés ne reproduisent pas la myélinisation.
Objectifs
Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le contrôle de la formation de la gaine de myéline qui protège les neurones dans le système nerveux central. Dans des conditions pathologiques, la formation d’une nouvelle myéline, processus appelé remyélinisation, est importante pour protéger les fibres nerveuses d’une dégénérescence et pour restaurer la conduction rapide de l’influx nerveux. La myélinisation et la remyélinisation sont des processus contrôlés par de nombreux facteurs et signaux, qui sont souvent altérés dans plusieurs maladies comme la sclérose en plaques. Notre hypothèse est que le lactate, via son transporteur, est une source énergétique importante pour la myélinisation et de la remyélinisation. L’objectif de notre projet est de déchiffrer le rôle de ce transporteur dans le processus de la myélinisation dans des conditions physiologiques et pathologiques afin de développer de nouvelles stratégies de thérapie régénérative pour les pathologies de la myéline. L’étude sera menée sur des souris portant des modifications génétiques qui perturbent le fonctionnement de ce transporteur ainsi que sur des souris contrôles. L’étude nous permettra de mieux comprendre l’implication de ce transporteur ainsi que son rôle dans la réparation des lésions de la myéline.
Bénéfices attendus
Il est nécessaire afin de mieux comprendre les mécanismes pathologiques dans les maladies demyélinisantes du système nerveux central, telle que la sclérose en plaques pour laquelle les thérapies régénératives sont encore limitées. Nos recherches pourraient ainsi contribuer au développement des nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Nous utiliserons des souris afin de déterminer le rôle d’une protéine qui semble impliquée dans le processus de myélinisation du système nerveux central. Pour cela nous réaliserons une étude du processus de réparation des lésions de la myéline ainsi qu’une étude au cours du développement du système nerveux central de la souris. Nous allons (objectif 1) réaliser 5 injections de tamoxifène (une injection par jour durant 5 jours ; volume injecté déterminé par pesée quotidienne de l’animal), puis 48h après la dernière injection, nous induirons une lésion de la moelle épinière, sous anesthésie générale et analgésie (une lésion par animal). Cette opération dure 20-30 minutes par souris. Nous utiliserons 210 animaux pour cette étude. La durée totale de la procédure sera au maximum de 30 jours. Après euthanasie des animaux, on procèdera à la récupération des tissus d’intérêt en vue de leurs analyses. Pour l’étude de cette protéine au cours du développement (objectif 2), nous utiliserons 300 animaux. Les animaux, âgés de 5 jours, recevront 5 injections de tamoxifène (une injection par jour durant 5 jours ; chaque injection durant environ 15 secondes). Ils seront ensuite euthanasiés à différents temps expérimentaux afin d’analyser l’impact de la délétion de cette protéine sur la myélinisation.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont majoritairement liées à la chirurgie (lésions démyélinisantes): hypothermie, hémorragie, risque anesthésique, douleurs post-opératoires. Un stress peut aussi être observé chez l’animal à cause de la contention quotidienne et de l’injection d’un produit. Il est notamment possible d’observer l’apparition d’hématomes dus à l’injection répétée de ce produit.
Devenir
Les prélévements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l’étude de processus biologiques complexes comme le processus de myélinisation au cours du développement ou la réparation des lésions de la myéline. Le rongeur est donc l’une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude car il présente un système nerveux myélinisé comme chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement significatives. Nous prévoyons l’utilisation de 210 animaux pour la procédure de démyélinisation focale afin d’évaluer la remyélinisation et 180 animaux pour réaliser l’étude développementale. Lors de l’étude étude développementale le génotypage des animaux ne pouvant être réalisé avant leur utilisation ; la génération des lots expérimentaux nécessitera l’utilisation de 300 animaux. Soit un total de 510 animaux sur ce projet.
Raffinement
Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage, bruit et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et matériel papier-coton, animaux hébergés en groupe), d’alimentation et de soins quand nécessaire (directive européenne 2010/63/UE) seront contrôlées. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Durant la procédure de chirurgie, les animaux seront placés sous anesthésie. Les points limites sont ceux définis en amont. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désigné. L’euthanasie de l’animal sera réalisée si l’on observe l’un de ces critères absolus.
Choix des espèces
Pour comprendre le rôle d’une protéine d’intérêt dans la réparation de lésions de la myéline, il est nécessaire de réaliser des études in vivo en condition physiologique. L’utilisation de modèles murins, reproduisant certains aspects des pathologies de la myéline chez l’homme, est donc indispensable pour évaluer la fonction de notre protéine en contexte pathologique et pour identifier de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique. Les animaux utilisés seront âgés de 12 semaines, afin d’avoir atteint une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes). De plus, à cet âge, la chirurgie est facilitée par la relative faible masse musculaire des animaux.
Etude des mécanismes d’infections à Escherichia coli productrices de shigatoxines chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le pouvoir pathogène de bactéries E. coli productrices de shigatoxines. Après un jeûne hydrique, elles reçoivent une à deux inoculations orales de bactéries puis subissent prélèvements de fèces, prises de sang et injections, le groupe infecté par des bactéries pathogènes développant faiblesse, diarrhée et déshydratation. Le porteur décrit des points limites et une mise à mort pour prélever les organes, et indique que le projet est financé par l'Argentine, où le syndrome hémolytique et urémique est le plus fréquent. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'est "suffisamment sophistiquée" pour simuler un organisme à plusieurs organes.
Objectifs
Certaines bactéries, appelées STEC, produisent des toxines particulières, qui leur confèrent la capacité à provoquer des infections chez l’homme. Les symptômes liés à ces infections vont de la diarrhée bénigne à des symptômes très graves : hémorragie intestinale, syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les principaux modes d’infection sont la consommation d’aliments contaminés, la transmission interhumaine, le contact avec des animaux porteurs. Les infections à STEC constituent un problème majeur en raison de l’extrême sévérité possible des symptômes. Le SHU est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. La mortalité est de 3-5% et plus d’un tiers des malades ont des séquelles rénales à long terme. L’Argentine a l’incidence la plus élevée au monde de ce syndrome. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique lié à ces bactéries. La toxine produite par les STEC est une protéine formée non par la bactérie mais par un virus qui infecte cette bactérie (phage). Expérimentalement, chez la souris, une STEC infectée par le phage est pathogène. A l’inverse, les STEC chez lesquelles le phage a été éliminé ne sont plus pathogènes. Lorsque les bactéries infectées par le phage se trouvent dans un organisme de mammifère et qu’un stress est induit, les phages sont libérés par la bactérie, peuvent atteindre les organes-cibles (ex : le rein), et produire la toxine qui induit des dommages. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes impliqués dans les infections causées par les bactéries STEC.
Bénéfices attendus
Les bénéfices obtenus sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC, en particulier dans la production de la toxine dans l’organisme. L’utilisation de souris dépourvues de microbiote intestinal (axéniques) permettra de s’affranchir des interférences avec les bactéries de ce microbiote à deux niveaux : en évitant la transmission possible du phage à des bactéries du microbiote intestinal ; en évitant un « effet barrière » du microbiote intestinal à l’égard des STEC, qui affaiblirait leur pouvoir pathogène. Les infections à STEC constituent un problème majeur de santé publique en raison de l’extrême sévérité de certains symptômes. La forme la plus grave, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. Si la dialyse a permis de réduire la mortalité, celle-ci reste non négligeable (3-5%) et beaucoup de ces jeunes malades conservent des séquelles rénales à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique, en particulier lors d’infection par des denrées alimentaires contaminées. Cette évaluation est très importante pour l’Argentine, qui a l’incidence de SHU la plus élevée au monde chez l’enfant, ce qui explique que le présent projet soit financé par ce pays.
Procédures
En début de procédure, les souris sont soumises à un jeûne hydrique de 4 heures, suivi d’une inoculation par voie orale. Les souris ont au maximum 2 inoculations orales à 30 min ou 24 heures d’intervalle. Puis des prélèvements de fèces sont effectués quotidiennement pendant 7 jours. Les animaux auront un prélèvement de sang qui dure 30 secondes environ. Les animaux recevront deux injections qui dureront moins de 30 secondes. Des organes et du sang seront prélevés après analgésie et anesthésie profonde (sans réveil).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues chez les groupes recevant les bactéries sans phage sont réduites. L’inoculation par voie orale sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Les injections seront également réalisées par du personnel très expérimenté. Les nuisances attendues dans le groupe recevant les bactéries avec phage, donc pathogènes, sont : faiblesse ; possible diarrhée ; possible déshydratation consécutive à la diarrhée et aggravée par la difficulté des souris à s’abreuver du fait de leur faiblesse. Des contre-mesures seront mises en place : ramequins d’aliment gélifié déposés sur la litière pour leur permettre alimentation et abreuvement sans effort physique ; surveillance 3 fois par jour pour détecter l’apparition de symptômes. Des points limites ont été identifiés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Ceci est nécessaire pour l’obtention des organes et tissus sur lesquels seront pratiquées différentes analyses.
Remplacement
L’analyse des mécanismes du pouvoir pathogène des STEC, qui se traduit par l’envahissement de différents organes par une toxine, n’est actuellement possible que chez des animaux vivants. Il n’existe en effet pas d’alternative suffisamment sophistiquée pour simuler un être constitué de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies.
Réduction
L’expérience argentine dans le domaine étudié permet de considérer que 10 souris par groupe sont un effectif suffisant pour comparer des résultats d’immunohistochimie de manière robuste entre groupes. Nous utiliserons donc 10 souris par groupe dans tous les groupes. Dans les groupes inoculés avec la bactérie pathogène, la survenue d’un syndrome infectieux pourra amener à mettre à mort des souris de manière anticipée, si les points limites définis à l’avance sont atteints. Les analyses de tissus seront tentées sur ces animaux. Mais, si l’euthanasie est trop précoce, les résultats pourraient ne pas être comparables à ceux des groupes témoins. Nous prévoyons donc 30 souris supplémentaires, qui seront utilisées si nécessaires. Au total, nous prévoyons d’utiliser 110+30=140 souris.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 5 individus par cages, sur une litière de copeaux. Croquettes de nourriture de formulation standard et eau seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, buchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher et hamac dans lequel se percher. Cet enrichissement est similaire à celui dont auront préalablement bénéficié les souris dans les cages d’élevage, elles y seront donc habituées. De plus, des ramequins d’aliment gélifié de formulation standard seront déposés sur la litière. Ce raffinement permettra aux souris de pouvoir s’alimenter plus facilement en cas de faiblesse et fatigue. De plus, du sérum physiologique stérile à 37°C pourra être injecté aux souris si elles montrent des signes de déshydratation. Les animaux seront visités 3 fois par jour après l’inoculation bactérienne pour détecter au plus vite de possibles symptômes et décider d’une euthanasie anticipée si les points limites sont atteints. Les bactéries seront administrées par voie orale à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Toutes les injections seront effectuées par du personnel expérimenté. Préalablement à l’euthanasie des souris, de puissants antalgiques et analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
La souris est un modèle établi pour l’étude du pouvoir pathogène des STEC, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des jeunes souris de 3 semaines (semaine suivant le sevrage). Chez l’être humain, les infections à STEC touchent principalement les très jeunes enfants. Nous utilisons en part égale des souris mâles et femelles car la maladie touche indifféremment les deux sexes.
Etude de l’effet du probénécide dans des modèles d’épilepsie
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Rats : 14
98 rongeurs, 84 souris et 14 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les souris reçoivent une injection de kaïnate dans l'hippocampe qui déclenche un état de mal épileptique parfois mortel puis des crises récurrentes, avec implantation d'électrodes cérébrales et gavages répétés du produit testé, avant prélèvement du cerveau. Le projet évalue le probénécide, un médicament déjà connu, comme piste de traitement des épilepsies résistantes et des crises d'absence. Le porteur affirme qu'il faut tester l'effet dans un "organisme entier représentatif" et présente les modèles souris kaïnate et rat GAERS comme les modèles de référence.
Objectifs
L’épilepsie est une pathologie neurologique concernant 0.8% de la population. Elle consiste en la récurrence spontanée de crises, reflétant un fonctionnement cérébral anormal sous forme de décharges neuronales excessives. Malgré l’existence de nombreux antiépileptiques, près d’1/3 des patients sont résistants à ces traitements, qui ont de nombreux effets secondaires du fait de leur action sur des cibles impliquées dans l’activité physiologique. Notre équipe a récemment montré que le canal pannexine 1 est une cible thérapeutique d’intérêt en épilepsie de par son rôle dans le déclenchement des crises. Cette démonstration s’est faite ex vivo avec un peptide connu pour agir sur le canal et un agent pharmacologique, le probénécide. Le probénécide est un médicament utilisé pour son action sur des canaux rénaux, mais qui est également actif sur la pannexine 1. Un premier test dans le modèle de souris kaïnate a confirmé l’intérêt du probénécide sur les crises épileptiques après administration unique. Nous cherchons à mieux caractériser son effet pour permettre son développement comme futur traitement. Pour cela, nous devons l’évaluer dans des modèles mammifères représentatifs de la pathologie, tel qu’un modèle de souris générant des crises épileptiques résistantes et un modèle de rat générant des crises épileptiques d’absence. Le modèle kaïnate est un bon modèle préclinique pour évaluer l’effet de potentiels traitements anti-épileptiques car il reproduit différents aspects cliniques et tissulaires des patients ayant une épilepsie focale. De plus il a été montré que notre cible, la pannexine 1, est surexprimée et activée dans ce modèle au moment des crises, comme ce qui est observé dans le tissu cérébral de patients épileptiques. Pour l’absence, il existe un modèle génétique bien caractérisé, le rat GAERS, et des études montrant l’intérêt de la pannexine dans ce type d’épilepsie. Ces deux modèles permettront de tester différentes doses de probénécide et d’évaluer leur effet sur les crises. La distribution du produit après administration orale dans le plasma et le cerveau sera étudiée, permettant de corréler un effet pharmacologique à une concentration spécifique. Enfin, pour mieux caractériser l’effet du traitement, nous évaluerons, l’effet du probénécide sur différents marqueurs tels que la mort neuronale, l’activation des cellules gliales et l’inflammation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’effet du probénécide sur les crises épileptiques dans un modèle d’épilepsie. Nous voulons avec ce projet évaluer la dose efficace, le temps d’efficacité d’une administration et voir quel mode d’administration (unique et répétée) serait le plus pertinent. A long-terme, ce projet permettra d’évaluer la capacité du probénécide à être développé comme un traitement potentiel des crises épileptiques focales résistantes et/ou des crises d’absence.
Procédures
1) injection d’une molécule (0,1µl/mn) durant une chirurgie réalisée (anesthésie générale) sur l’ensemble des animaux de la procédure réalisée une fois sur chaque animal, l’intervention dure environ 20 minutes par animal. 2) Chirurgie pour implantation d’émetteurs pour enregistrements et mesures de l'activité du cerveau par électroencéphalogramme (EEG) sous anesthésie générale et analgésie sur l’ensemble des animaux (40minutes par animal). 3) Gavage unique (1fois) ou répété de solution (3 fois par jour durant 4 jours), sur animaux vigiles. L’intervention dure environ 1 minute par animal. 4) enregistrement continu d’EEG sur animaux vigiles dans leurs cages allant de 3 à 5 jours consécutifs. 5) Perfusion des animaux profondément sédatés. L’intervention dure environ 40min (injection d’analgésique 30min avant, puis environ 10min de perfusion)
Impact sur les animaux
L’administration de kaïnate intra-hippocampique provoque un état de mal épileptique parfois très important, pouvant entrainer la mort de l’animal. Une fois stabilisé, il entraine surtout des crises récurrentes. L’implantation des électrodes peut entraîner des effets secondaires tels qu’une infection, un œdème, et/ou de la douleur. Aux doses utilisées (doses pharmacologiques et non toxiques) les produits administrés par voie ne sont pas connus pour être irritant et entraîner de gêne lors de l’administration. Le principal risque vient de la voie d’administration (risque de fausse route).
Devenir
Pour toutes les procédures: Euthanasie. L’objectif est de pouvoir récupérer du plasma et le cerveau pour quantifier le produit administré ou de récupérer le tissu cérébral fixé pour effectuer des études histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Le but majeur du présent projet est d’étudier l’effet du probénécide comme potentiel traitement des crises épileptiques: il est nécessaire d’évaluer cet effet dans un organisme entier représentatif, afin de tester si par la voie orale (voie clinique) le produit est capable d’assurer un effet pharmacologique au niveau du cerveau à des doses compatibles à celles administrables à l’Homme. La souris kaïnate est un modèle mammifère représentatif de l’épilepsie résistante et le rat GAERS de l’épilepsie absence.
Réduction
24 animaux seront utilisés pour étudier la pharmacocinétique aigue ou chronique. Un n de 3animaux/point/groupe. 56 animaux seront utilisés pour l’étude de pharmacologie de notre molécule soit 6 animaux par groupe. Enfin, les mêmes rats GAERS seront utilisés pour étudier tous les produits à toutes les doses, que ce soit de façon aigüe ou sub-chronique. De plus, les mêmes animaux seront utilisés en fin d’étude pour évaluer la pharmacocinétique du produit. Nous nous basons sur un groupe n=12 animaux par groupe. Un risque de perte de 15% a été pris en compte pour les trois parties du projet afin de palier aux aléas expérimentaux et de pouvoir réaliser des tests statistiques. Le nombre total d’animaux pour ce projet est donc de 98.
Raffinement
Après administration du kaïnate, les animaux seront surveillés quotidiennement. Tout animal montrant un problème de confort à la suite de l’opération sera mis sous surveillance accrue. Une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte, présente une plaie, ou montre des signes de douleurs et un comportement adapté sera mis en place. Durant la procédure de chirurgie pour l’implantation des électrodes, l’asepsie sera maintenue via l’utilisation de matériel propre et stérilisé, un champ et des gants stériles, et la désinfection locale de la plaie afin de prévenir les risques d’infection. La plaie sera surveillée et nettoyée si besoin. Les animaux seront médicamentés durant et après la chirurgie pour assurer une analgésie adéquate, et le traitement sera adapté si besoin. Après l’opération, les animaux seront isolés 7 jours afin d’assurer qu’un congénère ne vienne pas altérer la suture. Tout animal montrant un problème de confort à la suite de l’opération sera mis sous surveillance accrue. Une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte, présente une plaie, ou montre des signes de douleurs et un comportement adapté sera mis en place. L'aspect extérieur et le comportement de l'animal seront évalués après chaque administration : comportement général, niveau d'activité, déplacement et rythme respiratoire. Un animal pourra être sorti de l’étude et euthanasié s’il présente une souffrance (prostration, poil érectile, ...) ou s’il montre une souffrance respiratoire qui serait le signe d’une fausse route (administration du produit dans les poumons plutôt que par voie orale). Les points limites sont définis par des changements dans l'aspect physique/comportement ou si des blessures sont constatées. Les animaux seront euthanasiés si leur bien-être est compromis. Les animaux seront soumis à un rythme d’éclairage de 7h à 19h, avec nourriture et eau ad libitum. De plus, nous utiliserons la grille d'évaluation du bien-être animal validée par le comité éthique pour suivre quotidiennement les animaux.
Choix des espèces
Les rats et souris (rongeurs) sont des espèces mammifères qui donnent une bonne représentation des phénomènes biologiques humains. Les deux modèles utilisés ici sont des modèles reconnus de syndromes épileptiques humains et sont utilisés afin d’évaluer la pertinence d’un traitement avant que celui-ci puisse être testé chez l’Homme. L’un des objectifs du projet est d’évaluer l’effet d’un traitement dans un modèle d’épilepsie du lobe temporale pharmaco-résistante : le modèle souris kaïnate. Pour cela, les animaux seront utilisés à l’âge adulte, dès leur arrivée : 6semaines à réception dans notre laboratoire et seront gardées jusqu’à 12 ou 13 semaines en fonction des expérimentations. Ces souris étant validées comme étant un bon modèle d’épilepsie chez l’adulte, nous induisons cette épilepsie sur un cerveau mature sain, permettant d’obtenir un cerveau épileptique sans risque de remaniements lié à l’âge de l’animal Les rats GAERS sont élevés dans notre laboratoire et utilisés dès l'age de 3 mois. A cet âge, les crises généralisées qui caractérises l'épilepsie absence sont bien définies et le profil EEG bien dessiné. Il est également plus facile de faire l'experimentation sur un modèle adulte.
Etude de l’impact de l’exposition séquentielle à différents pathogènes sur les capacités fonctionnelles du système immunitaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à quatre immunisations par injection sous anesthésie et autant de prélèvements de sang, pour recréer des expositions successives à des pathogènes et étudier la maturation du système immunitaire. Le porteur annonce peu de douleur, avec une perte de poids transitoire et parfois du sang dans les fèces, puis une mise à mort pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne reproduit ce qui se passe dans un "organisme entier" et conclut au caractère "obligatoire" du recours à la souris.
Objectifs
Au cours de sa vie, l’Homme est infecté par une quantité d'agents pathogènes (bactéries, virus, etc…). Cette exposition aux microbes de l’environnement, façonne notre système immunitaire au cours du temps et modifie probablement ces propriétés. Cependant, de façon surprenante, la majorité des études sur le système immunitaire sont basés sur des souris élevées dans des conditions d’hygiène très strictes et très contrôlées. Ces animaux exemptes de pathogènes sont actuellement la référence pour les études scientifiques et pour les tests précliniques. Récemment, plusieurs travaux suggèrent que l'élevage de souris dans un environnement sans agents pathogènes a des effets importants sur l’état de maturation du système immunitaire. En effet, il a été montré que le système immunitaire des souris de laboratoire est proche de celui d’un nouveau-né, alors que le système immunitaire de souris vivants dans la nature est lui, proche et représentatif d’un humain adulte. Dans ce contexte, les différences observées entre souris de laboratoire et souris issues de milieu sauvage, font des souris de laboratoire un modèle inadapté pour les études précliniques et soulignent la nécessité de nouveaux modèles murins qui intègrent des variables environnementales. Ainsi, ce projet vise à tout d’abord à comprendre l’impact, sur le système immunitaire, d’une exposition successive à différents pathogènes qui mimerait ce que l’Homme subit au cours de sa vie. Puis, dans un second temps, ce projet permettra également mieux comprendre les maladies liées à un dérèglement du système immunitaire comme les maladies auto-immunes et le lupus en particulier.
Bénéfices attendus
Cette étude originale permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires anti-infectieuses et d’améliorer les modèles murins actuels de maladie humaine. En effet, ce projet permettra de développer un modèle murin reflétant plus justement le système immunitaire humain adulte et qui intègre des variables environnementales. De plus, les résultats obtenus permettront de mieux caractériser les dysfonctionnements du système immunitaire liés aux pathologies auto-immunes comme le lupus.
Procédures
Les animaux seront soumis à des immunisations (injections, 10 secondes) 1seule fois/animal, ou 4 fois/animal et seront réalisées sur animaux anesthésiés . Des prélèvements de sang seront réalisés sur animaux anesthésiés (10 secondes - 1 seule fois/animal , ou 4 fois/animal avec un mimimum de 14 jours d'intervalle entre les 2 prélevements).
Impact sur les animaux
Peu de douleur est attendue au cours des procédures réalisées. Peu de douleur également attendue au cours des prélèvements de sang. Cependant, une legere perte de poids transitoire peut etre observé après immunisation. De facon rare, des féces molles ou du sang dans les feces peuvent également être observé au cours de la procédure.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort afin de prélèver les organes et d'étudier plusieurs paramètres immunologiques.
Remplacement
Le but de ce projet est de comprendre comment une exposition antérieur à des pathogenes peut génerer des cellules spécifiques protectrices qui vont infiltrer les tissus et y résider de facon permanente. Il n’est pas possible de mimer cette réponse physiopathologique dans un modèle in vitro et aucune autre alternative ne peux mimer ce qui se passe dans un organisme entier, de ce fait l’utilisation d’un model in vivo est obligatoire pour comprendre ce mécanisme.
Réduction
Un nombre minimum de souris nécessaire à une analyse statistique sera utilisé en prenant en compte la variabilité inter-individuelle. Ainsi, 5 animaux par groupe seront néccessaire. Un test statistique sera réalisé permettant la comparaison de 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Des enrichissements de l’environnement (composants de nidification et igloo) seront apportées. Précautions particulières : - Immunisation par les différents pathogenes : Les immunisations sont réalisées sous brève anesthésie. Aucun signe clinique, n’est attendu suite à l’immunisation. Néanmoins, afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé, les animaux seront pesés quotidiennement les 7 jours suivant l'immunisation et feront l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’injection, le lendemain, puis chaque semaine.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le mieux adapté pour le développement de modèles immunologiques. En effet, bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Les souris seront âgées de 6-10 semaines au démarrage de l’expérience car le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Étude du rôle d’ApoE4 sur les altérations du protéome synaptique menant à la dégénérescence synaptique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 425 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les protéines des synapses dans un modèle de maladie d'Alzheimer. Une partie sert à créer et maintenir les lignées et reste vivante à l'animalerie, l'autre est tuée après biopsie de l'oreille, gavages et prélèvement du cerveau. Le porteur signale qu'environ 15 % des souris du modèle développent une paralysie des membres postérieurs vers 7 à 8 mois. Les bénéfices thérapeutiques annoncés sont renvoyés au 'moyen/long terme'.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L'apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L'isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l'hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA par l’intermédiaire des astrocytes (cellules nourricières des synapses) et des microglies (cellules immunitaires du cerveau). Nous voulons identifier comment ApoE4 et les microglies modifient les protéines dans les synapses mais également qui produit ces protéines : le neurone lui-même, ou l’astrocyte, connu pour son interaction étroite avec les synapses. Nous utiliserons des souris P301S, l’un des rares modèles de MA à reproduire la perte synaptique comme observée dans la MA. J'analyserai les protéines synaptiques spécifiquement produites par des neurones ou par des astrocytes chez ces souris. Cette étude nous permettra d'identifier précisément comment ApoE4 et les microglies modifient les protéines dans les synapses endommagées par la MA, ainsi que l'origine cellulaire de ces protéines (neurone ou astrocyte).
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4, des astrocytes et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des microglies pour préserver un échange astrocyte/synapse physiologique et qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.
Procédures
- Une biopsie rapide de l'oreille (2 secondes) - Des traitements par gavage oral 1 fois/24 h pendant 5 jours continus, et dans une diète purifiée pendant un mois et dans l'eau de boisson pendant 2 semaines) - Une euthanasie sous anesthésie/analgésie par injection (unique).
Impact sur les animaux
Le gavage oral ne se fait pas sous anesthésie mais sera fait par des experts animalier afin de réduire le stress des souris lors de la procédure et seront faites sur un temps répété relativement court de 5 jours (un gavage par jour). Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables qui seront discutés dans la procédure et pour lesquels des points limites stricts seront établis. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement ANL.
Devenir
Pour la partie du projet permettant la création et maintien de lignées de souris à phénotype dommageable, une partie des souris sera gardée afin de maintenir les lignées à l'animalerie, l'autre partie sera utilisée pour la partie du projet avec les traitements, perfusion et prélèvements des tissus. Pour la partie du projet avec les traitements, perfusion et prélèvements des tissus, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analyser.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin.
Réduction
Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l'expérience, la souris sera euthanasiée. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Pour ces points limites, l’animal sera euthanasié. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois.
Choix des espèces
Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, la dégénérescence synaptique responsable des troubles cognitifs dans la MA est très difficilement modélisable in vitro et nécessite des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. Pour étudier l’impact d’ApoE4 sur la dégénérescence synaptique, nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées (P301S) exprimant la protéine tau humaine mutée. Ces souris développent une perte synaptique et des troubles cognitifs comme chez les patients MA. Les souris P301S croisées avec des souris transgéniques exprimant les isoformes humaines ApoE2, ApoE3 ou ApoE4 dans un précédent projet, seront utilisées pour l'étude. Pour la procédure 1, les souris seront utilisées pour la reproduction dès 8 semaines. Pour la procédure 2: - Toutes les souris de la procédure 2 seront traitées par gavage à l’âge de 4 mois permettant ainsi l’expression d'une molécule par les neurones ou par les astrocytes. - Une cohorte sera utilisée à 7 mois (avec traitements 1 mois et 2 semaines avant) afin d'évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle - Une cohorte sera utilisée à 10 mois (avec traitements 1 mois et 2 semaines avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle
Etude des mécanismes de l’inflammation dans le poumon de souris atteintes de vascularite
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
1 497 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier l'inflammation pulmonaire des vascularites auto-immunes. Elles subissent des prises de sang dans le sinus rétro-orbitaire, une instillation intranasale d'un composé pro-inflammatoire et une injection rétro-orbitaire d'anticorps, une partie recevant en plus une chirurgie thoracique de 30 minutes à une heure. Le porteur indique que cette chirurgie engendre des 'douleurs importantes' respiratoires et que les dommages pulmonaires peuvent provoquer perte de poids et inactivité. Les organes sont prélevés après mise à mort.
Objectifs
Les vascularites regroupent un ensemble de maladies auto-immunes qui affectent les vaisseaux sanguins. Il existe un sous-type de vascularite lié à la présence d’auto-anticorps dirigés contres des protéines spécifiques exprimées par les globules blancs. Ces vascularites engendrent des conséquences néfastes au niveau pulmonaire notamment avec une inflammation des vaisseaux menant à de graves atteintes respiratoires. Il n’existe à ce jour aucune donnée sur la physiopathologie des atteintes pulmonaires associées aux vascularites. Il existe un modèle de souris transgénique qui exprime une protéine spécifique d'origine humaine qui permettrait de reproduire la pathologie humaine. Certaines modifications des protéines pourraient participer au developpement de la maladie ainsi que les protéines impliqués dans la production de médiateurs de l'inflammation, qui pourraient également participer aux mécanismes physiopathologiques de la maladie. Ce projet permettrait d’établir un modèle reproduisant la pathologie des vascularites autoimmunes chez la souris et ainsi mieux comprendre quels sont les mécanismes intervenant dans le développement des atteintes respiratoires de la maladie.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet in vivo permettront de comprendre plus précisément le rôle de certains globules blancs dans la réaction inflammatoire des vascularites et d’identifier de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet permettra d’établir comment les cellules sanguines participent aux dommages vasculaires dans les poumons des souris et de developper de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins au début avant induction de la maladie et au jour de la mise à mort des animaux. Ces prélèvements s'effectueront dans le sinus retro-orbital sous anesthésie gazeuse. Chaque prélèvement se fera en moins de 30secondes. Ils recevront une instillation intranasale de composant pro-inflammatoire sous anesthésie gazeuse, l'instillation est une manipulation qui ne prend pas plus d'une minute à réaliser, ainsi qu'une injection rétro-orbital d'anticorps sous anesthésie qui ne prendra pas plus de 30secondes. Certains animaux recevront une chirurgie thoracique qui durera environs 30min-1h sous anesthésie gazeuse et analgésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sur ce projet sont des douleurs respiratoires liées aux dommages pouvant avoir lieu dans les poumons. Cela pourrait entrainer une perte de poids et une inactivité des animaux impactés. De plus les injections en intraveineuse et prélèvements sanguins effectués sous anesthésie pourraient être source de stress pour l’animal. La chirurgie thoracique engendrera également des douleurs importantes respiratoire sur l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer en post-mortem les organes pour des analyses moléculaires, biochimiques et histologiques ultérieures.
Remplacement
La multiplicité des types cellulaires impliqués dans la réaction inflammatoire nécessite des études sur des animaux vivants qui sont complémentaires des études in vitro portant sur des cellules inflammatoires isolées, des cultures de lignées cellulaires et des cellules humaines isolées du sang de donneurs sains ou de patients. De plus cette étude permet d’intégrer les intéractions des cellules sanguines au sein d’un organe, le poumon au cours du temps. Cela n’est actuellement pas possible même avec l’apport de systeme de culture mimant les fonctions de certains organes. Les renseignements apportés par ces études animales permettant de les valider à l’échelle d’un organisme entier ne peuvent être obtenus par des techniques alternatives qui ne portent que sur un type cellulaire.
Réduction
Une analyse de puissance statistique préalable a été menée afin de determiner le nombre optimal d'animaux requis pour cette étude. La création de deux nouvelles lignées de souris necessitera l'utilisation de 112 souris pour vérifier que celles-ci se developpent correctement et ne présente pas de caractéristiques qui pourraient leur être dommageables. L’usage d’un total de 1260 souris permettra d’avoir des groupes de 10 souris par génotype et par conditions (basal, instillés avec du LPS, injecté ou non avec anticorps de patients ou anticorps controle) pour le modèle de vascularites. Cela nous permettra de pallier à la mortalité eventuelle et d’obtenir des résultats statisitiquement significatifs. L’étude d’imagerie intravital se limitera à des groupes de 6 souris par groupe pour un total de 125 souris utlisées.
Raffinement
Les mesures prises en compte pour réduire les nuisances sur le bien-être des animaux dans le cadre de ces procédures seront notamment l’utilisation d’une anesthésie pour chaque intervention necessitant une injection et/ou un prélèvement afin de minimiser le stress de l’animal. Une échelle de points limites a été mise en place. Un traitement avec un analgésique pourra être administré pour soulager une souffrance identifiée. De plus le modèle de vascularite se limitera à 7jours suivi d’une mise à mort afin de limiter toute souffrance de l’animal. Un traitement préanalgésique sera également administré aux souris soumises à la chirurgie thoracique. La chirurgie thoracique se fera également sous anesthésie et analgésique et les animaux seront mis à mort à la suite de l'acquisition au microscope pour éviter et limiter toute souffrance de l'animal. Les souris seront placées avec leur congénères dans la même cage, afin de respecter les interactions sociales propres à l'espèce, avec nourriture et eau ad libitum en présence de matériel de nidification.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle car elle est aujourd’hui la seule espèce possédant les mutations capables de reproduire la pathologie humaine. Le stade de développement sera adulte car le developpement de la pathologie necessite un système immunitaire et pulmonaire adulte. Des souris agées (>18mois) seront également etudiées afin d’évaluer l’effet du vieillissement sur le developpement de la pathologie.
Validation des effets bénéfiques d’ILV01, un composant du sécrétome musculaire, sur la greffe d’îlots pancréatiques.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 167 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie subissant des prélèvements sous anesthésie sans réveil. Un diabète est induit par injection, des cellules pancréatiques sont prélevées chirurgicalement puis réimplantées dans le foie, et chaque animal subit jusqu'à 148 mesures de glycémie, 84 injections d'insuline, 84 injections du traitement testé et 22 prises de sang. Le porteur décrit des douleurs post-opératoires, des nécroses de la queue et des hémorragies liées aux prélèvements répétés. Le projet teste une myokine pour réduire le nombre de pancréas nécessaires à une greffe d'îlots, étape présentée comme 'indispensable' avant la clinique.
Objectifs
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune induisant une destruction des cellules β pancréatique (sécrétant l’insuline) et une hyperglycémie. L'une des thérapeutiques proposées pour les patients DT1 est l'injection dans le foie d'îlots pancréatiques. En effet, la greffe d'îlots est une approche prometteuse permettant une quasi-normalisation du contrôle glycémique, qui prévient des évènements hypoglycémiques sévères et qui améliore significativement la qualité de vie du patient DT1. Cependant, cette thérapie se heurte à de nombreux obstacles qui la rende encore difficilement proposable à un grand nombre de patients diabétiques. En effet, durant toute la procédure de greffe, c’est-à-dire du donneur de pancréas, à l’isolement des îlots pancréatiques et jusqu’à la période post transplantation, la quantité d’îlots fonctionnelle ne cesse de diminuer. Cette perte peut s’expliquer par l’induction de mécanismes de mort cellulaire, de la perte de fonction des îlots tout au long des étapes de la greffe, par les réactions inflammatoires, par les réactions de rejets et par la trop longue période de revascularisation des îlots post greffe. Il en résulte qu'en moyenne 4 pancréas sont nécessaires pour greffer un patient et améliorer sa régulation glycémique. Ainsi, il est important de développer de nouvelles stratégies pour améliorer cette approche thérapeutique et réduire ce trop grand nombre de pancréas à utiliser afin de la proposer à un plus grand nombre de patients DT1. Dans cet optique, nous nous sommes intéressés aux myokines, qui sont des molécules sécrétées par le muscle et régulées par l’exercice physique. Parmi celle-ci, nous avons identifié ILV01. Lors d'une étude précédente, nous avons montré que cette myokine représentait un candidat d’intérêt pour améliorer l’efficacité de la greffe d’îlots car, in vitro, elle améliore la survie et la fonction des îlots pancréatiques (Rat et humain) et in vivo (Rat), elle améliore la fonction du greffon, elle permet une prise rapide et durable dans le temps de la greffe. Ainsi pour la suite du projet, nous souhaitons, dans un premier temps, déterminer si ILV01 permet de diminuer la quantité d’îlots à greffer pour réverser le diabète. Dans un second temps, en fonction des données obtenues lors de l’étape précédente, nous souhaitons valider in vivo ILV01 dans le cadre d’une greffe d’îlots humain chez le Rat immunodéficient. Enfin, ce projet est indispensable avant de passer en essai clinique.
Bénéfices attendus
La transplantation d'îlots est un traitement prometteur pour le diabète de type 1 car elle assure la stabilisation du métabolisme du glucose, une diminution significative des épisodes hypoglycémiques sévères, la normalisation des niveaux d'hémoglobine glyquée et permet de retarder ou d’atténuer les complications du diabète. Par ailleurs, cette approche thérapeutique est déjà approuvée et remboursable via divers systèmes nationaux de santé dans plusieurs pays, dont le Canada, l'Australie, le Royaume-Uni, la Suisse, l'Italie et la France. Néanmoins, actuellement, en moyenne 4 pancréas sont nécessaires pour réverser le diabète dû à la grande perte de la masse fonctionnelle d'îlots au cours des différentes étapes du processus de la greffe. Au vue de la grande pénurie d'organe, cette approche est encore difficilement proposable à tous les patients diabétiques nécessitant un greffe (raison vitale). Nos premières études in vitro et in vivo ont démontré qu’ILV01 améliorait considérablement la survie et la fonction des îlots chez le rat. Ce nouveau projet a tout d'abord pour objectif de déterminer si le traitement avec ILV01 permet de réduire la quantité d'îlots à injecter pour normaliser la glycémie du rat diabétique. Au vu de nos premiers résultats, nous supposons qu'avec notre traitement nous pourrions transplanter plus de patient que ce qui est possible aujourd'hui et ce projet pourra répondre à cette hypothèse. Par ailleurs, cette étude permettra de valider in vivo l'efficacité de notre ILV01 sur les îlots humain grâce à un modèle de rat immunodéficient. Enfin, ce projet sera le tremplin vers une étude clinique.
Procédures
Le diabète sera induit par injection pharmacologique réalisée sur animal vigile (1 injection/animal, durée une minute). Les cellules pancréatiques seront prélevées par approche chirurgicale sous anesthésie/analgésie profonde sans réveil (durée 5 minutes) et seront ensuite réimplantés 24h plus tard dans le foie par approche chirurgicale sous anesthésie et analgésie profonde (durée 10 minutes par animal). Tout au long de l’étude, la glycémie sera mesurée sur animal vigile à l’aide d’un glucomètre (durée de quelques secondes) afin d’évaluer l’efficacité de la greffe (148 fois/animal). Une partie de l’évaluation de l’efficacité de la greffe nécessitera de réaliser une injection de glucose aux animaux (8 injections/animal sur 84 jours, durée 1 minute). De plus, les animaux recevront au maximum 84 injections d’insulines si la glycémie reste élevée après greffe (durée 1 minute). Par ailleurs, 296 animaux de l’étude recevront en plus de ce qui est décrit ci-avant 1 injection quotidienne de notre traitement soit 84 injections/animal (durée 1 minute). Enfin, afin d’évaluer l’efficacité de notre traitement sur la greffe, 22 prélèvements sanguins seront réalisées par animal sur l’ensemble de l’étude (sous anesthésie locale, 2 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de notre traitement et d'insuline. - Douleurs post-opératoires à la suite des chirurgies (laparotomie puis injection intraportale d'îlots pancréatiques). - Risque d’infection post-greffe. - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie post section de la queue. - Inflammation au point d’injection due aux injections répétées. - Répétition des interventions durant toute la durée de l’étude (Mesures de glycémie, injections, prises de sang). - Périodes de mise à jeun.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.
Remplacement
Nous souhaitons valider notre traitement sur la fonction d'une greffe d'îlots pancréatique chez un sujet diabétique. Or, la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’étudier la fonction d'un greffon d'îlots, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à la cellule à insuline isolé mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent. Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux nécessaire pour la réalisation des groupes que nous avons indiqué correspond au nombre nécessaire d’animaux à utiliser afin d’obtenir des résultats statistiques. De plus, ce nombre est basé sur les différences interindividuelles des animaux et des préparations d’îlots humains que nous isolerons mais aussi sur notre longue expérience obtenue au cours des nombreuses études métaboliques réalisées sur des rats rendus diabétiques dans le cadre de transplantation d’îlots pancréatiques. Cette étude nécessitera 1167 rats.
Raffinement
Le raffinement intervient au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Concernant les animaux immunodéficients, ceux-ci seront hébergés en cage ventilée. Par ailleurs, la litière, les cages, les éléments d’enrichissement seront stérilisés avant utilisation. De même, il sera utilisé de la nourriture irradiée et de l’eau filtrée. Toute intervention sur ces animaux sera réalisée sous hotte stérile (changes et expérimentations), avec du matériel stérile et une surveillance augmentée par rapport à des animaux standards sera effectuée (au moins 2 fois par jour). Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés voir la mise à mort en cas d’atteinte de points limites. En accord avec cette grille, des points limites prédictifs ont été déterminé afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales en cours d’étude. Les actes chirurgicaux et les prélèvements terminaux seront réalisés sous anesthésie analgésie profonde. De plus, la chirurgie et les tests d’évaluation d’efficacité de notre traitement, ne seront effectués que 2h après avoir placé les animaux dans la salle où aura lieu l’expérimentation, afin de diminuer le stress. Enfin, tout acte sur l’animal sera réalisé par du personnel expérimenté afin de réduire au maximum la durée des interventions et le stress des animaux.
Choix des espèces
Le Rat est la principale espèce utilisée dans de nombreuses études sur le diabète et la transplantation d’îlots pancréatiques. En effet, les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme. De plus, les rats ont été préférés aux souris à cause de leur taille permettant une aisance de manipulations et facilite les interventions chirurgicales. Les rats pour cette étude seront âgés de 8 semaines, coïncidant avec un poids d'environ 200g. Poids idéal pour le prélèvement des pancréas, la réalisation des chirurgies et de nos tests d’évaluation d’efficacité de notre traitement.
Rôle de l’hépatokine FGL1 dans le foie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
4 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le rôle d'une protéine du foie dans les maladies hépatiques et la surcharge en fer. Elles subissent régime gras, injections intrapéritonéales, gavages, prélèvements de sang par amputation du bout de la queue, ponctions au plexus oculaire, irradiation et injections pour créer des chimères. Le porteur ne décrit qu'une 'douleur légère de courte durée' malgré ces gestes répétés, et justifie l'effectif par la variabilité biologique. Les modèles murins sont présentés comme la 'seule solution' pour obtenir des données pertinentes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la physiopathologie des maladies hépatiques (NAFLD, NASH, hépatocarcinome) et de l’anémie afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. La stéatopathie non alcoolique ou NAFLD (Nonalcoholic fatty liver disease) est une manifestation hépatique du syndrome métabolique qui affecte 25% des adultes dans le monde. Cliniquement, la NAFLD se définit par une accumulation de lipides dans plus de 5% des hépatocytes (les principales cellules du foie) en l’absence d’atteintes hépatiques et une cascade pathologique d’une stéatose asymptomatique vers une stéatohépatite ou NASH (nonalcoholic steatohepatitis). La NASH associe la stéatose à une inflammation, une ballonisation des hépatocytes et des processus cicatriciels conduisant à une fibrose hépatique, une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire (CHC). Alors que les stades NAFLD et NASH sont réversibles, le stade de cirrhose est irréversible et menace le pronostic vital du patient. A ce jour, il n’existe pas de traitement pharmacologique efficace contre le CHC. Des niveaux élevés de FGL1 (Fibrinogen like 1 protein) ont été observés chez des patients atteints de NAFLD et les taux sériques de FGL1 sont corrélés à un mauvais pronostic chez les patients atteins de cancers. En effet, FGL1 favoriserait la progression tumorale et l’échappement immunitaire dans de nombreux cancers (prostate, poumon, mélanome…). L’invalidation de Fgl1 chez la souris conduit au développement d’une obésité associée à une intolérance au glucose. Cependant, le rôle de FGL1 dans l’installation et la progression de la NAFLD et la carcinogenèse hépatique est inconnu. Le premier objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de FGL1 dans la stéatose et la carcinogénèse hépatique. D'autre part, FGL1 joue un rôle majeur dans la régulation du métabolisme du fer. Une augmentation de la synthèse de FGL1 contribuerait à l’installation d’une surcharge en fer dans le foie et le cœur avec pour conséquences des dommages tissulaires irréversibles chez les patients atteints de thalassémies. Cette surcharge en fer constitue la première cause de mortalité chez ces patients et il n’existe pas de traitement efficace à ce jour. Le second objectif du projet est de confirmer le rôle de FGL1 dans la régulation du métabolisme du fer et de tester le potentiel thérapeutique de son inhibition dans un contexte thalassémique.
Bénéfices attendus
On estime que 1 million de personnes seront atteintes d’un cancer du foie en 2025 dont 90% de CHC. De même, des centaines de milliers de personnes souffrent de thalassémie dans le monde. Face au manque de traitement efficace, il est nécessaire d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou diagnostiques. Ce projet explorera pour la première fois la contribution de FGL1 au cours du développement de la stéatose vers le CHC et au cours de l'installation de la surcharge en fer en contexte thalassémique. La manipulation de FGL1 pourrait constituer une nouvelle stratégie thérapeutique pour ces pathologies.
Procédures
Stéatose: régime western diet . Hépatocarcinome: Injection intra-péritonéale hebdomadaire + régime western diet. Mise à jeun : aucun traitement. Traitement FGL1 : injection intra-péritonéale. Tolérance au glucose : gavage oral et prélèvement sanguin par amputation distale de la queue. Tolérance à l’insuline : injection intra-péritonéale et prélèvement sanguin par amputation distale de la queue. Tolérance au pyruvate : injection intra-péritonéale et prélèvement sanguin par amputation distale de la queue. Sécrétion des lipoprotéines hépatiques : injection intra-veineuse et prélèvement de sang par amputation distale de la queue. Clairance des triglycérides : gavage oral et prélèvement de sang par amputation distale de la queue. Phlébotomies : prélèvement au plexus oculaire et injection intra-péritonéale. Chimères hématopoïétiques : Irradiation et injection intra-veineuse. Mises au point ASO : injection intra-péritonéale. ASO thérapie : injection intra-péritonéale.
Impact sur les animaux
Les animaux seront traités par injection intrapéritonéale, IV, gavage ou prélèvement sanguin et ressentiront potentiellement une douleur légère de courte durée.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire.
Remplacement
Le développement et la mise en place de la NAFLD et de la surcharge en fer chez l’Homme est un processus long et complexe mettant en jeux de nombreux facteurs génétiques et environnementaux. Les modèles murins génétiquement modifiés miment les pathologies humaines et sont la seule solution actuelle pour obtenir des données avec une pertinence physiologique correcte. Pour atteindre les objectifs de nos études, il est nécessaire d'utiliser des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées. Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives à ces études in vivo. L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques (thalassémie, NAFLD, NASH ou CHC). Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles. Aucune autre espèce d'animaux n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux (anticorps, protéines recombinantes) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans chaque expérience a été calculé à minima en tenant compte de la variance biologique des résultats obtenus. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tous les échantillons prélevés sont stokés à -80°C et dans une banque de données. Ils peuvent être réutilisés ou servir de témoins dans des expériences ultérieures.
Raffinement
Les souris ont accès à la nourriture et l’eau de boisson ad libitum. Elles ont du papier ou du coton comme enrichissement. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Des analgésiques, des antalgiques ou des anti-inflammatoires risquent d'interférer avec le cours de notre expérimentation. Néanmoins, nous avons mis en place des critères d'arrêt par rapport à la souffrance potentielle des souris durant l'expérimentation. Les souris sont contrôlées tous les jours, voire deux fois par jour. Les critères suivants sont pris en compte : - perte de poids est supérieure à 20% du poids initial - activité extrême (grattage ou léchage anorml) - posture prostrée - aspect (amaigrissement, déshydratation, poils hérissés, salissures et écoulements) - absence de toilettage et diminution de l'appétit - anomalies de la respiration (rythme et mouvements) - hypo ou hyperthermie Si l'un de ces critères est atteint, l'expérimentation est immédiatement arrêtée et les souris sont euthanasiées. Un suivi quotidien est assuré par les membres de la SBEA (Structure en Charge du Bien-Etre Animal).
Choix des espèces
L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques (thalassémie, Obésité, NAFLD, NASH et CHC). Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l'utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles. Aucune autre espèce d'animaux n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux (anticorps, protéines recombinantes) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.
Evaluation de l’efficacité et de l’impact sur la réponse immunitaire de l’association de radiothérapie avec des immunothérapies, des nanoparticules radiosensibilisantes et/ou de chimiothérapies sur plusieurs modèles de tumeurs syngéniques murines
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour optimiser des combinaisons de radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et immunothérapie. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et des prises de sang sous anesthésie, les tumeurs pouvant former des nécroses et ulcérations douloureuses. Le porteur indique qu'environ 75 % des souris seront tuées après un point limite ou une progression tumorale dès la première procédure, le reste à l'issue de la seconde. Le modèle de souris immunocompétente est présenté comme 'indispensable' pour reproduire un 'organisme entier'.
Objectifs
Nous proposons d’optimiser les combinaisons à base de Radiothérapie avec des Nanoparticules et/ou des immunothérapies et/ou des chimiothérapies. L’efficacité de ces traitements sera évaluée par suivi du volume des tumeurs traitées et par étude de la réponse immunitaire à partir d’échantillons sanguins. L’objectif de ces expérimentations est de constituer des bases solides nécessaires aux développements d’essais cliniques en évaluant l’efficacité des combinaisons présentant les meilleurs efficacités en préclinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont cliniques avec l’optimisation et la sélection des meilleurs schémas de combinaison à base de radiothérapie, nanoparticules et ou immunothérapies pour traiter des cancers localisés ou métastatiques.
Procédures
- Injection sous cutanée de cellules tumorales - Prélèvement sanguin sous maxillaire - Ces deux types d’interventions seront réalisés sous AG gazeuse (Isoflurane 2.5%)
Impact sur les animaux
Les tumeurs formées par certains types de cellules peuvent former fréquemment des nécroses/ulcération en surface qui peuvent entrainer une douleur évaluable par palpation de la tumeur Aucun effet secondaire ou nuisance dû aux prélèvements sanguins en sous maxillaire n’est attendu. Ce geste est couramment réalisé par les membres de notre équipe.
Devenir
A l’issue de la procédure N°1 : environ 75% des animaux auront été mis à mort après atteinte d’un point limite ou parce que leur tumeur est en progression. Les 25 autres pourcents des animaux seront pris en charge dans la procédure N°2 A l’issue de la procédure N°2 : tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Etant donné que nous allons évaluer l’effet de la radiothérapie sur l’activation de cellules immunitaires, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux présentant un système immunitaire actif. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur des cellules en culture nous a permis de nous affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)
Réduction
La formation de tumeur par les types de souris qui seront utilisés dans ce projet, se fait de façon homogène, permettant l’utilisation d’un nombre d’animaux relativement réduit pour répondre aux questions scientifiques posées. Afin de pouvoir traiter dans un même groupe des tumeurs de tailles comparables, il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules de cancer de souris permet de pouvoir travailler avec des souris au système immunitaire actif sans entrainer de rejet des tumeurs. Ainsi, nous pouvons étudier les effets de nos traitements à la fois sur la croissance des tumeurs mais aussi sur les cellules immunitaires. Afin de garantir la fiabilité de nos résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations 3 fois.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe dans des cages de taille adaptées et en présence d’enrichissement (matériel leur permettant de constituer un « nid »). Les combinaisons des traitements par radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et/ou immunothérapie ont déjà été réalisées dans ces conditions dans notre équipe sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur aux animaux seront réalisées sous anesthésie générale. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le modèle de souris est indispensable car les expérimentations sur cellules en culture ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme entier, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La formation de tumeur par les souris qui seront utilisées dans ce projet est homogène et maitrisé par notre équipe. Ceci permet de limiter la quantité de souris injectées par des cellules tumorales pour constituer des groupes de traitement avec un volume de tumeur comparable. Les souris utilisées seront de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature.