Procédures modérées

894 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles sont mises en reproduction, échographiées chaque semaine sous anesthésie puis isolées en cage individuelle jusqu'à la mise bas sous surveillance vidéo, et une soixantaine subit un prélèvement sanguin et une amniocentèse avant d'être tuée, pour repérer les régions chromosomiques liées à la durée de gestation. Le porteur ne déclare comme atteinte que le stress lié à la manipulation et à l'isolement, alors que l'effectif dépasse largement les animaux décrits dans les procédures. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut étudier cette question.

Objectifs

Les anomalies de la durée de la gestation compliquent plus d’un quart des grossesses dans l’espèce humaine. La prématurité est la première cause de morbi-mortalités périnatales et dans les premières années de vie, et de handicaps dans la petite enfance. Le dépassement du terme est associé à une incidence accrue de mortinatalité ou de décès néonatal et de dysmaturité fœtale, ainsi qu’un taux accru d’accouchements par césarienne qui sont associés à un risque plus élevé de morbidité maternelle aiguë sévère. Chez la souris, les lignées de laboratoires présentent des différences de durée de gestation qui sont génétiquement fixées. Nous utiliserons deux souches consanguines murines (FVB/N et Balb/c) montrant plus de 30h d’écart dans la durée de gestation pour identifier des régions chromosomiques affectant la durée de la gestation. Nous obtiendrons également des données de l’expression des gènes à l’interface fœto-maternelle chez les cas les plus extrêmes avec des technologies de dernière génération. La combinaison de ces deux analyses et la puissance de la génétique de la souris ouvrent la possibilité d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans le déterminisme de la durée de la gestation, question non résolue actuellement dans de nombreuses espèces de mammifères, incluant l’espèce humaine.

Bénéfices attendus

L’étude des déterminants génétiques de la durée de la gestation chez la souris nous permettra de mieux connaitre les mécanismes de la cascade de la parturition. Une meilleure connaissance de ces mécanismes pourrait permettre d’identifier des déterminants du déclenchement du travail dans l’espèce humaine et de mieux comprendre la physiologie de l’accouchement à terme et la physiologie de l’accouchement prématuré.

Procédures

Toutes les souris (414 souris) : - seront mises en accouplement - auront une échographie par semaine pour la détection de la gestation (deux fois pendant la gestation). Pour cet acte, les souris seront sous anesthésie générale et rechauffée par une platine chauffante. La durée de l’échographie est d’environ 5 minutes. - seront mises seules dans un cage si elles sont gestantes, dans la mesure où nous avons besoin de connaître précisément la durée de gestation de chaque femelle. Une surveillance vidéo en continu (Infra-rouge, non invasive) de la cage permettra de dater précisément la mise bas. Les souris seront isolées dès le diagnostic de gestation par échographie et jusqu’à la mise bas. Pour quelques souris seulement (60 souris): En fin de gestation, un unique prélèvement sanguin (200μl prélevés à la veine sous-mandibulaire avec une lancette, ainsi qu’un unique prélèvement de liquide amniotique (amniocentèse) seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie, avant la mise à mort. L'analgésie se fera par injection d'un traitement antidouleur. L'injection dure quelques secondes et les effets antidouleurs plusieurs minutes. Le prélevement sanguins durent moins d'une minute et le prélèvement de liquide amniotique dure environ 1 minute par unité foeto-placentaire. Il est prévu un total de 15 minutes pour effectuer le prélèvement sanguin et le prélèvement de liquide amniotique

Impact sur les animaux

Stress potentiel due à la manipulation et à l’isolement.

Devenir

Mise à mort des animaux en fin de procédure afin de limiter la souffrance animale potentielle.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle alternatif (organoïde, culture cellulaire) pour étudier la durée de la gestation et ses déterminants génétiques.

Réduction

Utilisation de croisement de différentes lignées de souris dont le fonds génétique est stable. Utilisation de l’échographie pour le suivi de gestation qui permet de détecter les gestations de façon précoce et de diminuer le nombre d’animaux à utiliser dans la phase d’élevage. Les gestations courtes et le fait qu’il y ait une dizaine de petits par portée permet de réduire aussi le nombre de croisement nécessaire pour obtenir les effectifs nécessaires pour les études statistiques. Les données de la littérature permettent de réduire le nombre d’animaux pour la deuxième génération. Des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données et ont été utilisés pour ajuster le nombre minimal d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les animaux disposent de rouleaux de cartons et du coton compacté comme enrichissement. Les femelles gestantes sont surveillées en continu par des cameras infrarouges. Les échographies sont réalisées sous anesthésie générale. Les souris endormies sont placées sur une plaque chauffante et leur température sera surveillée pendant toute la durée de l'échographie (durée de 5 minutes). Un traitement antidouleur sera administré avant le prélèvement sanguin et de liquide amniotique.

Choix des espèces

Une meilleure connaissance du déclenchement du travail permettrait de mieux prédire, voire de contrôler l'accouchement, afin de limiter la prématurité. Une des difficultés d'étude cette question dans l’espèce humaine est l'impossibilité pratique d'établir le moment exact de la parturition et ainsi d'effectuer des études longitudinales chez la femme. Nous pouvons lever cette barrière en utilisant des modèles de souris, où nous pouvons surveiller avec précision la progression de la gestation à l'aide de mesures par échographie et prédire et enregistrer l'accouchement. Des composants de la cascade de la mise en travail et de l'accouchement sont partagés chez la souris et l'homme, comme l’inflammation sans infection, dont l’origine est inconnue. De plus, la durée de gestation est génétiquement déterminée dans les souches consanguines, ce qui favorise l'étude de la génétique chez la souris. Nous utiliserons des souris sexuellement matures, à savoir dès 8 semaines de vie.

72 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de l'oreille interne d'une à deux heures sous anesthésie, une injection de vecteur viral, des prises de sang et des prélèvements de liquide cérébrospinal, pour tester une thérapie génique de la surdité avant un passage chez l'Homme. Le porteur indique des effets possibles comme une perte d'équilibre et un nystagmus transitoires, et décrit ce projet comme "indispensable" au dossier réglementaire de première administration humaine. Il affirme que la souris ne permet pas cette translation et conclut à la "nécessité" du primate.

Objectifs

Le projet est réalisé pour vérifier et optimiser la transduction du vecteur viral (soit le composé d’intérêt de la thérapie génique développée), d’en évaluer l’impact sur la fonction auditive ainsi que sa sécurité chez le PNH afin de préparer, chez l’Homme, la restauration de la fonction auditive, en cas de surdité profonde héréditaire, à l’aide du vecteur précédemment sélectionné. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme et fait partie des dossiers présentés aux autorités.

Bénéfices attendus

Suite à ce projet, le traitement pourra être testé en clinique, avec l’objectif ultime de palier la surdité tout en préservant la structure de l’oreille interne, laissant ainsi la possibilité pour le patient d’avoir ultérieurement un autre traitement tel que la pose d’un impant cochléaire par exemple.

Procédures

Chirurgie : sur animaux sous anesthésie générale, tous les animaux de l’étude, selon les protocoles d’usage vétérinaire. Considérant que la procédure chirurgicale commence avec l’anesthésie de l’animal et se termine au réveil de l’animal, la durée de chirurgie est estimée entre 1 heure (traitement unilatéral) et 2 heures (traitement bi-latéral). Prises de sang : sur animal vigile, tous les animaux de l’étude, contention manuelle, nombre de prélèvements selon les études mais toujours 1) dans le respect du volume maximal prélevable et 2) avec un temps de récupération des animaux entre 2 prises de sang. Les prises de sang, incluant la durée de contention de l’animal, sont de courte durée (environ 1 à 2 minutes) Liquide de l’oreille, liquide cerebrospinal : sur animal sous anesthésie générale ou à la nécropsie, tous les animaux de l’étude, 1 prélèvement par occasion, au maximum 2 occasions par animal (à la chirurgie et à la nécropsie)

Impact sur les animaux

Les nuisances correspondent essentiellement à la chirurgie et aux conséquences de la chirurgie. Suite à la chirurgie, et selon sa durée (si traitement uni- ou bi-latéral, durée entre 1h et 2h), les animaux peuvent présenter une phase de réveil plus ou moins longue (variabilité inter individuelle), toujours sous surveillance étroite des techniciens et l’appui des vétérinaires. Il est possible qu’après la chirurgie, les animaux présentent une baisse légère et ponctuelle de leur prise alimentaire et de leur poids. Les effets indésirables potentiels sont une perte d’équilibre et/ou un nystagmus (mouvement d'oscillation involontaire et saccadé du globe oculaire) transitoire(s). Dans tous les cas, une analgésie et une surveillance péri-opératoire sont mis en place (ex : les animaux sont suivis quotidiennement avec plusieurs examens quotidiens sur au moins 10 jours post-chirurgie avec contrôle vétérinaire).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la collecte de tissus, fluides pour évaluer la toxicité du test item, la biodistribution du test item.

Remplacement

Il n'existe pas de système in vitro à l'heure actuelle pour la validation de l’efficacité et de la sécurité de la transduction des différents sérotypes de vecteurs viraux présélectionnés dans le modèle murin. Nécessité d’optimiser la chirurgie, la dose et le sérotype viral chez le PNH afin de pouvoir ensuite transférer cette stratégie à l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux est estimé en fonction de la variation attendue concernant les différents paramètres explorés : transduction du vecteur dans les cellules ciliées, modification des seuils en PEA. Cette estimation du nombre a été déterminée pour permettre la détection d'une différence de 10% minimum de transduction virale entre les cellules ciliées des cochlées et pouvoir détecter une éventuelle variation de 10 dB à deux fréquences sur les PEA des oreilles injectées et non injectées afin de vérifier l'absence d'effets indésirables de la technique et/ou du virus pouvant causer une perte de l'audition. Les tests statistiques seront choisis en fonction des paramètres comparés. Cette procédure permet d'optimiser le nombre d'animaux utilisés dans chaque série, soit en utilisant les deux oreilles avec une condition différente pour chacune, soit en utilisant à chaque fois l'oreille controlatérale comme témoin expérimental.

Raffinement

Pendant la phase pré-opératoire et de réveil et ensuite pendant au moins 10 jours après la chirurgie, sont surveillés étroitement : l’activité et la mobilité dans les volières des animaux, les interactions sociales et les expressions faciales, l’apparence physique (aspect de la fourrure traduisant les phases de toilettage entre congénères, poils drus), les éventuels écoulements nasaux et/ou oculaires, les postures inhabituelles, la réponse aux stimuli, la consommation alimentaire, le poids, le clignement des yeux/mobilité des paupières (signes cliniques de paralysie faciale, en raison de la chirurgie intracochléaire), par les techniciens avec l’appui des vétérinaires. A chaque paramètre évalué est associé un score de sévérité. La somme permet de définir un score total. Selon le résultat, le vétérinaire est consulté pour mise en place des soins pour soulager l’animal (ex. traitement anti-inflammatoire). Par exemple, en cas de dessèchement de l’oeil, une pommade (Ocrygel ou équivalent) sera utilisée. Egalement, suite à la chirurgie, des rations additionnelles de fruits et de légumes peuvent être proposées aux animaux pour favoriser la prise alimentaire dès 24 heures après la chirurgie afin d’éviter la perte de poids, et les animaux peuvent être regroupés dès leur réveil complet après chirurgie pour permettre les interactions physiques entre congénères et favoriser le retour au comportement physiologique, dont la consommation de fruits/légumes. S’ajoute également le suivi quotidien de la fréquence cardiaque et de la température corporelle sur ces 10 jours (et plus si l’état de l’animal l’exige). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se feront sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. Leur état de santé sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.Les animaux seront hébergés au minimum par deux et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Les études préalables menées chez la souris ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’Homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’oreille comparable à celle de l’Homme. Le choix de macaca fascicularis est justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système auditif, une dimension et une structure de l’oreille moyenne et interne comparable à celles de l’Homme. Des études préalables ont également mis en évidence une différence morphologique critique entre l’oreille moyenne de souris et celle de macaque. Seuls ces derniers présentent une structure de la fenêtre ovale similaire à ce que l’on retrouve chez l’Homme (absence d’artère stapédienne qui existe chez la souris) et permet de rendre possible la translation de la technique d’injection locale dans l’oreille interne à l'Homme. Animaux (2 à 6 ans). La nécessité de travailler avec des animaux de cet âge est de pouvoir avoir un système auditif bien développé au moment de l’étude.

442 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont rendus diabétiques puis gavés quotidiennement pendant cinq semaines, avec une quinzaine de prélèvements sanguins, avant prélèvement des tissus. L'objectif est de tester deux plantes de la tradithérapie tunisienne comme antidiabétiques. Le porteur affirme que l'équilibre énergétique et le dialogue entre organes ne sont pas modélisables in vitro et que le rongeur reste un "modèle de référence".

Objectifs

Le diabète de type 2 (DT2) touche 90% des personnes diabétiques, principalement au-delà de 40 ans, souvent en surpoids ou obèse, qui ont un régime alimentaire déséquilibré (trop riche en gras et en sucres) et/ou dont l’activité physique est insuffisante. Cette maladie métabolique est caractérisée par un excès chronique de sucre dans le sang Parmi les nouveaux axes de recherche pour traiter le DT2, émergent des alternatives thérapeutiques, préventives et curatives. Parmi ces alternatives thérapeutiques, la tradithérapie offre un panel de substances naturelles méconnues dont les effets n’ont été que très peu caractérisés de façon préclinique et clinique, bien qu’elles soient, localement, couramment utilisées par l’Homme. Ainsi, deux plantes médicinales ont été identifiées comme ayant des caractéristiques phytochimiques intéressantes pour prévenir et traiter le DT2 (ces plantes sont nommées ici MA et AA pour des raisons confidentielles). Spécifiquement, le but du projet sera d’établir chez l’animal diabétique: 1) Si le traitement par MA ou AA présente un effet-dose sur l’amélioration de la glycémie et de comparer ce traitement chronique à des anti-diabétiques déjà sur le marché. 2) Si une unique dose de la plante est suffisante pour améliorer la tolérance au glucose 3) Si les fractionnements successifs des composés de la plante reproduisent les effets anti-diabétiques observés, en vue d’isoler le(s) principe(s) actif(s).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser un nouvel antidiabétique issu de plantes pris par voie orale et d’isoler le (les) principe(s) actif(s)

Procédures

Les animaux seront soumis au traitement antidiabétique par gavage : un par jour pendant 5 semaines, avec un volume de 250 µl/souris ou un volume de 1,5 ml chez le rat. des prélèvements de sang seront effectués : un par semaine afin d'évaluer l'effet du traitement, 5 les jours de test : soit 15 prélèvements au total pour 3 tests.

Impact sur les animaux

Les nuisances dues aux déifférents traitements seront : Au début du traitement par gavage : du stress, Une douleur locale et passagère lors de l'injection intrapéritonéale ainsi que lors des prélèvements sanguins.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car les tissus gluco-sensibles seront prélevés pour divers dosages

Remplacement

L’étude des variations de la glycémie, de l’insulinémie ne peut être réalisée que sur des animaux vivants, ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. L’étape de caractérisation des effets sur la sécrétion d’insuline a déjà été faite sur des lignées de cellules pancréatiques mais les effets sur les autres organes insulino-sensibles sont indispensables à caractériser. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. L’étude du métabolisme implique plusieurs organes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ce projet sera réalisé chez la souris mais aussi chez le rat, qui constituent des modèles de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques.

Réduction

Nous utiliserons des tests statistiques permettant de détecter les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimum d’animaux pour calculer l’échantillon représentant la population, et suffisant pour détecter des différences. Chaque fois que ce nombre pourra être réduit, le nombre d’animaux utilisé sera diminué. Chaque fois que cela est possible, les mêmes animaux seront utilisés afin de réduire le nombre d’animaux : tous les tests métaboliques sont faits chez les mêmes animaux après un temps de repos et de récupération.

Raffinement

Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton pour les souris ou des bâtonnets de bois et rouleaux de carton pour les rats qui permettent l’expression de comportements innés. Ils seront répartis à quatre par cage pour les souris et à deux pour les rats. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Les animaux seront manipulés quotidiennement avant les expériences de manière à diminuer leur stress et inconfort au moment des expériences. Le poids corporel et la prise alimentaire seront également contrôlés quotidiennement de manière à s’assurer du bon état de santé des animaux. Douleur et/ou souffrance des animaux sont rendues tolérables lors des prélèvements de sang en effectuant une application d’anesthésique local avant une incision minimale puis désinfection à l’eau oxygénée qui a un fort pouvoir coagulant (en plus d’être un antiseptique). Un animal présentant une perte de poids (

Choix des espèces

Le rongeur est l’animal le plus fréquemment étudié dans les études métaboliques précliniques avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisé. Les animaux, rats et souris spontanément diabétiques et ceux au régime gras et sucré seront âgés de 14 semaines.

956 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines développent spontanément des tumeurs mammaires, d'autres subissent l'ablation du coussin adipeux et une greffe sous anesthésie, puis des traitements, avant prélèvement des échantillons. L'objectif est d'étudier les modifications épigénétiques précoces de la tumeur du sein triple négatif. Le porteur affirme utiliser en priorité des cultures d'organoïdes mais conclut que celles-ci ne reproduisent pas le développement tumoral complet in vivo.

Objectifs

Le cancer du sein est une maladie qui touche 1 femme sur 8, en France. Un des sous-types le plus agressif est le cancer du sein triple négatif (TNBC), qui représente 17% des cancers du sein. Des raisons génétiques peuvent être la cause du développement de ce cancer mais l’analyse des gènes ne permet pas à elle seule d’expliquer l’initiation et la progression de la maladie. Une mutation peut empêcher ou activer l’expression d’un gène. Mais d’autres mécanismes peuvent également perturber l’expression de ces derniers : ce sont les mécanismes épigénétiques. Ils régulent la structure de l’ADN (la chromatine), modifiant ainsi son état de compaction et donc la capacité d’un gène d’être exprimé ou non. Notre projet consiste à étudier les modifications du paysage épigénétique dans les cellules pré-tumorales et tumorales, afin d'étudier leur potentiel rôle dans la transformation des cellules saines en cellules cancéreuses au cours de la tumorigenèse. Plusieurs applications cliniques peuvent découler de ce projet, identifier et caractériser les cellules pré-tumorales est en effet un enjeu majeur pour améliorer la prise en charge et le diagnostic des patientes à risque. Ce projet présente un défi majeur : comment étudier une population de cellules rares avant l’apparition de tumeur ? L'accès à des échantillons pré-tumoraux humains est évidemment très rare, il est donc indispensable de travailler sur un modèle murin qui développe des TNBC. En prélevant des échantillons à différents moments de la croissance tumorale, nous pourrons alors cartographier l’identité des cellules à chaque stade de la tumorigenèse (avant apparition de tumeur, pendant transformation des cellules saines en cellules tumorales, à différents stades de croissance de la tumeur). L’objectif général est donc de caractériser et d’identifier les modifications non génétiques – i.e les modifications sur la chromatine et d’expression des ARNs - qui participent à tumorigenèse du cancer du sein triple négatif.

Bénéfices attendus

Notre projet va permettre une compréhension détaillée de la mise en place des tumeurs mammaires depuis les premières altérations d’une cellule d’origine à la formation d’une tumeur entière qui déstructure le tissu. Ces étapes initiatrices sont inaccessibles chez la femme, car les patientes arrivent à l’hôpital avec un cancer déjà apparu. L’étude moléculaire complète à haute résolution temporelle de la tumorigénèse mammaire chez l’animal va nous permettre de déterminer les éléments clefs qui mènent à la formation des tumeurs dans la glande mammaire. A plus long terme, ce projet pourrait ouvrir des perspectives pour l’interception et la détection des tumeurs mammaires de manière extrêmement précoce. Grâce à nos études chez l’animal, nous espérons à long terme avoir un impact sur la prise en charge et le traitement du cancer du sein triple négatif. En effet, un objectif est d’identifier des marqueurs de transformation précoce, pouvant servir de biomarqueurs de détection, ainsi que des voies de signalisation activées dès les premières étapes de la transformation mammaire, pour proposer de les cibler par des approches thérapeutiques chez les femmes à risque.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet sera injectée (1 fois) dans l’abdomen (injection intrapéritonéale sur animaux vigiles) avec un produit non toxique et non douloureux (durée du geste inférieur à 10 sec). Une autre partie des animaux sera anesthésiée puis opérée (ablation du coussin adipeux mammaire puis injection de cellules mammaires ou de fragments fragments mammaires) (durée de l’anesthésie inférieure à 20 minutes). Une autre partie des animaux recevront un traitement test anti-cancéreux par voie orale ou directement dans l’abdomen. En fonction des molécules le traitement pourra être administré de 1 fois toutes les 3 ou 4 semaines à 1 fois par jour pendant 3 à 6 semaines (durée du geste inférieure à 10 sec)

Impact sur les animaux

Les 4 lignées d’animaux transgéniques vont spontanément développer des tumeurs mammaires sous-cutanées (1 ou plusieurs). Des méthodes non invasives seront utilisées pour évaluer l’apparition de ces tumeurs. Les nuisances expérimentales se limiteront aux stress de la contention et de la manipulation des animaux et les nuisances modérées sur les animaux seront donc la conséquence de l’apparition des tumeurs Les animaux greffés avec des cellules tumorales dans la glande mammaire développeront des tumeurs qui seront mesurées quotidiennement. Les nuisances attendues suite à l’injection de produits dans l’abdomen des animaux sont les douleurs liées à la piqûre.

Devenir

Toutes les souris sont mises à mort au terme de l’expérience pour récupérer les échantillons d'intérêt.

Remplacement

Nous avons développé différents systèmes d’analyse en culture cellulaire de la glande mammaire et des cellules tumorales (système de culture organoïde – où les cellules de la glande mammaire se cultivent en 3D et s’organisent en mini-glandes - ces cultures sont mises en place à partir d’échantillons de glandes mammaires pré-tumorales ou contrôles). Ces essais permettent d’obtenir des informations très importantes sur les capacités de prolifération et de différenciation des cellules saines et tumorales. Nous les utilisons en priorité par rapport à l’expérimentation in vivo, notamment pour faire tous les tests fonctionnels. Toutefois, aucun d’entre eux ne permet d’analyser dans leur ensemble les processus complexes du développement et transformation de l’épithélium mammaire à partir de cellules isolées ou de fragment tissulaire, comme il est possible de le faire après transplantation dans le coussin adipeux de souris hôtes. De la même façon, seuls les modèles transgéniques permettent d’analyser in vivo l’impact de la perturbation de molécules régulatrices sur le développement et la tumorigénèse mammaire.

Réduction

Pour l’étude du développement tumoral dans les lignées transgéniques, la stratégie d’accouplement a été optimisée pour obtenir le maximum de souris de génotype adéquat et ainsi réduire l’élevage. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Nous limitons également le nombre d’animaux utilisés en réalisant les expériences fonctionnelles ex vivo, à partir de culture organoïdes de la glande mammaire animale.

Raffinement

Pour limiter le stress, les femelles sont regroupées à raison de 6 femelles maximum par cage. Les souris transgéniques pour lesquelles le développement de tumeurs est attendu seront surveillées 2 fois par semaine. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux. Les animaux qui subiront des procédures chirurgicales recevront des anesthésiques et analgésiques. La chirurgie et le réveil seront réalisés sur plaque chauffante pour éviter tout risque d’hypothermie. Des aliments gélifiés seront mis à disposition des animaux pendant les 2 semaines suivant l’opération. Les animaux seront surveillés 2 fois par semaine pendant 8 à 12 semaines après la transplantation. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point-limite, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Notre programme de recherche nécessite l’utilisation de mammifères. Le modèle souris est le plus approprié à l’expérimentation sur la glande mammaire, en biologie du développement comme en cancérogenèse. Les souches murines sont parfaitement définies et permettent l’obtention de modèles génétiquement modifiés. L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez la femme. Les souris génétiquement modifiées pour lesquelles le développement de tumeurs est attendu seront utilisées à l’âge adulte (stade de développement des tumeurs). Les souris utilisées dans les expériences de transplantation sont des femelles prépubertaire âgées de 3 semaines, âge nécessaire car à ce stade l’épithélium mammaire est très peu développé, on peut donc l’éliminer par microchirurgie et transplanter les cellules du donneur dans la partie du coussin adipeux resté intact.

8 furets, quatre mâles et quatre femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis proposés à l'adoption. Ils subissent des anesthésies générales répétées pour des prélèvements sanguins, des prélèvements de semence par électrostimulation et des inséminations, l'induction d'ovulation pouvant favoriser une pathologie utérine. L'objectif est de mettre au point une insémination artificielle transposable au vison d'Europe, espèce menacée. Le porteur affirme qu'il n'est "pas envisageable" d'expérimenter d'abord sur une espèce devenue rare et qu'aucune modélisation ne peut remplacer le vivant.

Objectifs

Le vison d’Europe (Mustela lutreola) est une espèce de mustélidés vivant encore à l’état sauvage dans le Sud-Ouest de la France mais classée « en danger critique » sur liste rouge de l’Annexe I établie par l’UICN depuis 2011. Elle se reproduit très mal en captivité. Il existe une petite population captive en France. Le projet vise à développer une méthode de reproduction assistée en captivité pour renforcer les élevages conservatoires de l’espèce en vue de relâcher des individus dans le milieu naturel. Pour cela on expérimentera sur une espèce proche par son anatomie et sa physiologie, le furet domestique (Mustela putorius furo). Lorsque la méthode sera opérationnelle (obtention de naissances chez le furet) , elle pourra être utilisée dans des parcs hébergeant des visons d’Europe afin de maximiser le nombre de naissances en captivité tout en veillant à conserver un bon niveau de diversité génétique (travail en lien avec le programme d’élevage européen – EEP), renforçant ainsi les capacités de renforcement des populations sauvages, action prioritaire du 3ème Plan national d’action en faveur du Vison d’Europe dont l’OFB est animateur technique et scientifique.

Bénéfices attendus

Le projet est une étape indispensable pour maîtriser par la suite l’insémination artificielle du vison d’Europe. Il n’était pas envisageable d’expérimenter sur des individus d’une espèce qui devient rare et de ce fait précieuse, d’autant que les visons captifs stressent facilement. Lorsque la méthode sera opérationnelle (obtention de naissances chez le furet) , elle pourra être utilisée dans des parcs hébergeant des visons d’Europe afin de maximiser le nombre de naissances en captivité tout en veillant à conserver un bon niveau de diversité génétique (travail en lien avec le programme d’élevage européen – EEP), renforçant ainsi les capacités de renforcement des populations sauvages, action prioritaire du 3ème Plan national d’action en faveur du Vison d’Europe dont l’OFB est animateur technique et scientifique

Procédures

Prélèvement sanguin sous anesthésie générale chez les furettes, renouvelé 2 fois à 15 jours d’intervalle, et éventuellement d’autres fois à 2 mois d’intervalle en cas de non gestation. Insémination sous anesthésie générale (durée 30 minutes). Nous ferons au maximum 3 essais d’insémination par femelle, seulement en cas de non-gestation. En cas de succès, la femelle ne sera pas mise à la reproduction une seconde fois. Prélèvement de la semence des mâles sous anesthésie générale (durée 30 minutes) 2 fois par semaine jusqu’à obtention d’une technique répétable (normalement en moins de 2 ou 3 semaines ce devrait être obtenu).

Impact sur les animaux

La seule partie pouvant être considérée comme une nuisance est la nécessité d’anesthésies répétées chez les furets. La technique d’électro-stimulation pour le prélèvement de la semence est utilisée chez l’homme paraplégique et chez les animaux. Chez le chat, elle a fait l’objet d’une étude publiée pour confirmer qu’elle ne générait pas d’inflammation rectale. La technique de sondage urétral a été décrite chez le furet à pied noir et il n'a pas été décrit de complication. Il est toutefois possible qu'une irritation de l'urètre puisse se produire, nécessitant un traitement anti-inflammatoire. La technique d’insémination intra-utérine par voie vaginale et cathétérisme du col de l'utérus est couramment pratiquée chez la chienne sans sédation ni anesthésie et est non douloureuse et considéree comme modérée. L'induction de l'ovulation entraîne chez la femelle une sécrétion de progestérone qui peut, dans de très rares cas, promouvoir l'apparition d'une pathologie utérine (pyomètre).

Devenir

Les procédures sont modérées, sans préjudice ni répercussion sur l’animal. Ces animaux sont d’espèce domestique et après l’étude ils seront adoptés en famille. Aucun produit dangereux ne sera administré aux animaux.

Remplacement

Il n’est pas possible de se passer d’essais préalables sur une espèce modèle pour mettre au point une technique d’insémination artificielle chez le vison d’Europe. Il n’est pas envisageable d’expérimenter d’abord sur des individus d’une espèce qui devient rare et de ce fait précieuse, d’autant que les visons captifs stressent facilement. D’autre part, la méthode de prélèvement ne peut pas être modélisée ou simulée, et doit être faite sur du vivant, et doit par la suite être transposable sur l’espèce en danger critique d’extinction.

Réduction

Nous avons choisi d’expérimenter (étude pilote de faisabilité) chez 4 mâles et 4 femelles tous adultes. Des essais préliminaires effectués aux USA ont montré un taux de gestation de 79% (19/24) donc avec 4 femelles nous devrions aboutir à 2 à 3 gestations. Toutefois, notre étude utilise un équipement d’insémination très différent de cette étude américaine. Nous allons tenter d’inséminer par vidéo-endoscopie qui est une technique modérée.

Raffinement

Les méthodes utilisées sont modérées, et se pratiquent presque toutes sous anesthésie générale. Toutefois, une gestion de la douleur (anti-inflammatoires non stéroïdiens) pourra être préconisée si la procédure a été plus longue que prévue. Au niveau de l’hébergement, un enrichissement du milieu (hamacs, jouets…) est prévu pendant toute la période. L’ hébergement se fera en groupes sociaux, pour les femelles en cages, avec hamac, construction en carton et pour les mâles dans une pièce séparée au sol (la taille des cages n’étant pas suffisante pour les mâles nous avons choisi l’option au sol), avec hamac, tapis, cachettes, jouets, structure en carton pour jouer et se cacher.

Choix des espèces

Le vison d’Europe (Mustela Lutreola) est inclus dans le groupe des grandes belettes et est l’animal le plus proche phylogénétiquement du groupe des furets (M. furo, M. putorius, M. eversmanii). Le furet est la forme domestiquée du putois. Or le putois est capable de se reproduire (hydridation) avec le vison d’Europe. C’est donc une espèce très proche et un modèle expérimental idéal. Animaux pubères de plus d’un an (doivent être en âge de se reproduire)

2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à dix injections, avec adjuvant de Freund, et douze prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever la rate, les ganglions et la moelle osseuse. L'objectif est commercial, produire des anticorps humains à partir de souris génétiquement modifiées pour remplacer les produits d'origine humaine dans des kits de diagnostic. Le porteur affirme qu'une réponse immunitaire in vivo est "nécessaire" et présente une "offre sur mesure" à ses clients.

Objectifs

Le but est de générer des anticorps humains à l’aide de souris génétiquement modifiées et de les mettre à disposition pour la clinique humaine. A ce jour, les kits cliniques détectent un anticorps spécifique d’une cible donnée (bactérie, virus, allergène…). Ils nécessitent un sérum humain et des anticorps de référence pour contrôler la qualité des kits. Pour des raisons légales et éthiques, la production d’anticorps à partir de produits d’origine humaine a pour but d’être supprimé. La limite est aussi l’absence de standardisation car le taux d’anticorps varie d’un patient à l’autre. De plus, les besoins croissants en produits d’origine humaine sont aujourd’hui difficilement pourvus. Pour certaines pathologies, il est parfois difficile d’obtenir un sérum humain ayant la spécificité souhaitée. La production d’anticorps humains permettrait : - une absence de contamination d’agents pathogènes - une production robuste et respectueuse des contraintes règlementaires - une évolution dans la production d'anticorps au vu de la suppression des produits d’origine humaine - une standardisation garantissant de reproductibilité des tests - une offre « sur mesure ». Afin d’obtenir des anticorps ayant la plus forte affinité pour l’antigène, une réponse immunitaire in-vivo est requise. Après une première réponse immunitaire in-vivo chez l’animal, nous prélèverons les organes d’intérêt et effectuerons ensuite la production d'anticorps entièrement in vitro. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour reproduire une réaction immunitaire humaine et obtenir des anticorps très proches de ceux des patients. 3 lignées seront utilisées pour cibler entre autres les pathologies suivantes : otite, sinusite, bronchite, pneumonie, infections pulmonaires chroniques, allergies, diarrhée chronique, maladies auto-immunes, maladies gastro-intestinales, rhinite, asthme et infections parasitaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise au point de la production de larges lots d’anticorps humains à partir de souris. Chez la souris nous pourrons moduler la réponse immunitaire pour permettre la génération d’anticorps spécifiques au traitement de maladies infectieuses et utiles dans le cadre d’auto-immunité, d’inflammations chroniques, de cancers, d’allergies, voire de troubles hématologiques.

Procédures

Les animaux subiront au maximum 10 injections intrapéritonéales (ou intramusculaire ou intra-veineuse dans de rares cas), durée moins de 30 secondes. 12 prélèvements sanguins maximum seront aussi effectués, chacun durant environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

La répétition des injections intrapéritonéales (ou intramusculaire ou intra-veineuse dans de rares cas) pourrait engendrer un léger inconfort chez les souris. De plus, un adjuvant de Freund sera utilisé lors des injéctions d'antigène.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin de procédure afin de collecter des cellules de la rate, des ganglions ou de la moelle osseuse pour créer les banques d'anticorps.

Remplacement

Une réponse immunitaire in-vivo est nécessaire afin d’obtenir des anticorps spécifiques. Des anticorps de synthèse seraient à l’inverse moins spécifiques. C’est pourquoi l’utilisation de la souris est nécessaire. Les souris génétiquement modifiées permettent de reproduire une réaction immunitaire équivalente à ce qui est observé chez l'Homme et donc d’avoir des anticorps très proches de ceux retrouvés chez des patients.

Réduction

Nous utiliserons 10 souris par projet, en immunisant 2 lots successifs de 5 souris, afin de garantir la production des livrables dans le cadre de projets de prestation de service. Ce nombre théorique pourra être réduit si au moins une souris parmi le premier lot de 5 développe la réaction immunitaire souhaitée. Nous prélèverons les organes d'intérêt et pour ensuite réaliser la production de l'anticorps in vitro. Ainsi, les animaux seront utilisés seulement pour la phase de développement initiale. Une fois les anticorps créés, l’utilisation d’animaux ne sera plus requise. Nous évaluerons la production d’anticorps chez toutes les souris en fin de protocole. La méthode ne vise pas le calcul d’une valeur précise d’anticorps et n'implique donc pas d'analyse statistique, mais repose uniquement sur la présence ou non d’anticorps chez les animaux.

Raffinement

Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les antigènes seront injectés sur des animaux vigiles afin de réduire au minimum le nombre de manipulations sur les animaux. De plus, les tests préalablement faits avec ces antigènes ne mettent pas en évidence de dommage quelconque subi par les animaux.

Choix des espèces

La génétique ainsi que le système immunitaire des souris sont bien caractérisés. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux comme la souris permettra d’induire une réponse immunitaire caractéristique et facilement identifiable. Nous utiliserons des souris adultes entre 2 et 12 mois. Durant cette période, le système immunitaire est bien développé et fonctionnel et son efficacité de production d’anticorps n’est pas impactée par l’âge des animaux. De plus, cette large fenêtre d’utilisation nous permettra d’éviter la surproduction d’animaux pour le maintien des lignées.

500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'établissement produisant des rats privés de thyroïde et de parathyroïdes pour d'autres laboratoires. Chaque rat subit l'ablation chirurgicale de ces glandes sous anesthésie, avec des risques de saignement, de mauvaise cicatrisation et de chute de calcémie pouvant provoquer une tétanie. Le résumé indique que la majorité des rats jugés aptes sont expédiés vivants vers des laboratoires clients, les autres étant tués. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'évaluer les réactions du "corps vivant entier" et ne fournit aucune justification statistique du nombre d'animaux.

Objectifs

Les rats font partie des animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent un modèle animal de choix dans les domaines tels que les maladies endocriniennes. Ce projet a pour but de fournir des rats sans thyroïde, ni parathyroïde, cela va agir sur le poid, la masse musculaire, la solidité des os, le cholestérole, la glycémie, la température corporelle, le rythme cardiaque, en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année : 100 rats par an.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Chaque animal subira une ablation de la thyroïde et des parathyroïdes sous anesthésie d'une durée maximale de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie et celle en post-opératoire, le risque de saignement continu et une mauvaise cicatrisation. Et également les problématiques liées à l'absence de thyroïde et parathyroïdes (perte de poids, diminution du rythme cardiaque, risque d'une chute importante de la calcémie avec risque de tétanie...).

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés. Les autres animaux seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans les études expérimentales.

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.Les animaux sont supplémentés en lactate de calcium 2% dans l’eau de boisson pendant au moins 5 jours préopératoires et au moins 10 postopératoires, pour pallier a l'hypocalcémie.

Choix des espèces

Les rats sont une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 5 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet. Puis, 10-15 jours après l'opération, les animaux lui seront envoyés après un examen vérifiant la bonne récupération des animaux de la chirurgie.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections abdominales et intraveineuses au niveau de l'œil, des prélèvements sanguins sous anesthésie, puis sont infectées par un virus provoquant une perte de poids temporaire, avant prélèvement de la rate et du foie. Il s'agit d'étudier le rôle d'une protéine de l'inflammation dans la réponse antivirale des lymphocytes T. Le porteur affirme que les interactions entre cellules immunitaires ne peuvent pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

Les lymphocytes T, qui sont une population de cellules du système immunitaire, jouent un rôle essentiel dans la défense contre les infections virales aigües (telles que la grippe) et chroniques (comme les hépatites B ou C). La compréhension des mécanismes régissant ces fonctions a donc un fort intérêt fondamental et thérapeutique. Des données de la littérature, indiquent qu’une protéine de l’inflammation pourrait jouer un rôle majeur dans l’élimination des virus, via son rôle dans les lymphocytes T. Nous souhaitons ainsi tester sa fonction in vivo, dans un modèle d’infection virale aigüe et un modèle d’infection chronique, qui reflètent fidèlement le déroulement de ces maladies chez l’homme. La charge virale et la réponse immunitaire seront ainsi mesurées après infection de souris témoins et déficientes pour la protéine d’intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait nous permettre de mettre en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la fonction des lymphocytes T dans le contexte des réponses anti-virales, donnant ainsi des indices sur la physiopathologie des infections aigues et chroniques chez l’homme.

Procédures

-Injections dans l’abdomen : 1 injection sur 20 animaux vigiles, 2 à 3 secondes/injection. -Injections intra-veineuses au niveau de l’oeil: 1 injection sur 20 animaux sous anesthésie générale gazeuse, 5 secondes/injection sous anesthésie générale gazeuse de 1 minute environ. -Prélèvements sanguins au niveau de l’oeil : 1 prélèvement sur 20 animaux, 10 secondes/prélèvement sous anesthésie générale gazeuse de 1 minute environ. 2 prélèvements à 10 jours d’intervalle, sur 20 autre animaux : 10 secondes/prélèvement sous anesthésie générale gazeuse de 1 minute environ.

Impact sur les animaux

Certaines procédures peuvent induire une douleur légère à modérée (injections intraveineuses et abdominales, prélèvements sanguins). Le protocole d’injection et de prélèvement que nous suivrons est bien établi pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. L’injection dans l’abdomen peut éventuellement provoquer une inflammation locale temporaire. L’injection intraveineuse et les prélèvements sanguins peuvent éventuellement provoquer une inflammation au niveau de l’oeil. Une perte de poids limitée et temporaire (4 jours) est attendue suite à l’infection virale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever les rates et foies. L’objectif est d’analyser la charge virale et le phénotype immunitaire. Ceci permettra de documenter la fonction de la protéine d’intérêt non seulement dans l’élimination du virus mais également sur le type de réponse immunitaire mis en place.

Remplacement

Un certain nombre d'expériences in vitro, suggérent un rôle d’une protéine de l’inflammation dans la fonction anti-virale des lymphocytes T. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour mesurer la fonction de la protéine d’intérêt dans un contexte physiologique pertinent. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la bio-informatique, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Une taille d'échantillon de 10 souris/groupe est calculée. Ces éxpériences n’ont jamais été réalisées, et il n’y a pas de double emploi des animaux.

Raffinement

Le protocole d’injection et de prélèvement que nous suivrons est bien établi pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. Les injections et prélevements par voie intraveineuse seront accompagnées de l’appication d’une goutte d’anesthésique local pour limiter la douleur, et seront effectués en alternance sur chaque oeil. De plus l’utilisation de l’anesthésie générale gazeuse, un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le comportement, le poids, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience, et l’altération d’un de ces paramètres entraînera une surveillance accrue. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence d’un modèle transgéniques nous permettant de mesurer le rôle de la protéine d’intérêt dans les réponses immunitaires, et l’existence de virus modèles, reflétant le déroulement des infections virales comme la grippe ou les hépatites B et C chez l’homme. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 30 semaines.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer du sein leur sont greffées sous la peau, puis elles reçoivent des traitements par voie orale, sous-cutanée ou par gavage pendant plusieurs semaines, la tumeur étant prélevée à la mise à mort. L'objectif est de comprendre la résistance à l'hormonothérapie du cancer du sein via une protéine. Le porteur affirme que les travaux in vitro ne reproduisent pas l'activité de cette protéine dans la tumeur et qu'un modèle de greffe chez la souris est requis.

Objectifs

Les patientes atteintes de cancer du sein qui présentent une tumeur exprimant un récepteur aux estrogènes sont traitées par hormonothérapie. En clinique les traitements de ces patientes par hormonothérapie diminuent le taux de rechute et améliorent la survie des patientes. Néanmoins l’efficacité de ces thérapies est limitée par la résistance à ces traitements, car jusqu’à 40% récidivent. C’est pourquoi de nouvelles molécules sont en cours de développement. Le problème majeur est qu’il n’existe pas de marqueur prédictif de réponse à ces traitements. Récemment, il a été identifié une protéine, dont la présence dans le noyau cellulaire participe à l'activité anti-tumorale des traitements. L’objectif du projet est de comprendre le rôle de cette protéine dans la réponse des patientes aux différentes hormonothérapies et de restaurer la sensibilité aux hormonothérapies dans des modèles résistants, en régulant la bonne localisation de cette protéine. Pour ceci, un modèle murin développé à partir de greffe de cellules cancéreuses humaines permettra de reproduire la réponse anti-tumorale observée chez les patientes sensibles ou résistantes aux traitements hormonaux, et d'étudier le rôle de cette protéine.

Bénéfices attendus

L'utilisation de ce modèle murin de xénogreffes qui mime la tumeur des patientes hormono-sensibles permettra de mieux comprendre la résistance au traitement par des hormones et donc d'identifier des biomarqueurs de la sensibilité des patientes à l’hormonothérapie, d’adapter les traitements des patientes ayant un cancer du sein hormonosensible et donc d'entrevoir de nouvelles thérapies.

Procédures

Des cellules humaines de cancer du sein sont injectées sous la peau des souris. Pour effectuer ce geste, la souris est endormie durée 4 min, une seule injection de 0.1 ml, durée 20 sec. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine au maximum, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. Les composés sont administrés par voie orale dans l’eau de boisson (à partir de l’entrée des souris en protocole jusqu’à la mise à mort),ou par injection sous cutanée (1x/semaine, 10 sec, pendant 4 semaines maximum), ou par gavage (1x/sem à 5 x/sem selon le composé, 45 sec, pendant 4 semaines maximum).

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané entrainera le développement de tumeur, en réponse à la stimulation par l'estrogène dans l’eau de boisson. Un surdosage d'estrogène pourrait induire un gonflement abdominal (jamais observé dans les conditions utilisées). Tumeur : nécrose ou un gêne à la locomotion (très rare). Injections répétées peuvent entrainer une irritation. Multi-contentions peuvent engendrées un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car la tumeur sera prélevée pour des analyses immunohistochimiques, biochimiques et moléculaires.

Remplacement

Nos travaux menés in vitro dans des cellules de cancer du sein suggèrent l'activité bénéfique d'une protéine dans la réponse aux antiestrogènes ches les patientes atteintes d'un cancer du sein hormonosensible. Ces travaux in vitro ne permettant pas de reproduire l'activité de la protéine telle qu'elle est observée dans les tumeurs chez la patientes. Des études in vivo seront faites grâce à un modèle de greffe de cellules humaines de cancer du sein, chez la souris. Ce modèle murin mime ainsi la tumeur mammaire humaine et est nécessaire à l'observation des caractères de la tumeur chez les patientes.

Réduction

La formation de tumeur chez les souris est d'environs 80% dans ce modèle murin de cellules de cancer du sein. Nous étudierons l'inhibition de la croissance entre les souris traitées et les souris non traitées. Pour mesurer une différence significative des traitements, sur la croissance des tumeurs, entre les groupes de souris traitées et celles ne recevant pas le traitement, il faut greffer 10 souris par groupe.

Raffinement

Les analyses de croissance des tumeurs seront non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant. De l'aliment humidifié en fond de cage sera disposé si un animal présente une gêne de la mobilité due à la croissance tumorale ou une irritation lors de gavage (très rare). Les traitements seront planifiés, en fonction de leur fréquence, de façon à ce qu'un animal recoive un seul traitement par gavage par jour. La greffe des cellules sera faite sous anesthésie. Une anesthésie locale par application de crème sera réalisée lors de l'indentification des animaux

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est couramment utilisée en oncologie car l’inoculation de cellules tumorales humaines n’induit pas le rejet de la greffe dans cette espèce. Les études concernent le cancer du sein, c'est pourquoi l'expérimentation sera réalisée avec des souris femelles de 8 semaines, car à cet âge, l’ensemble des fonctions est mature.

4 224 souris opérées sous anesthésie, la tête fixée dans un dispositif qui repère les coordonnées du cerveau pour y injecter un virus, et 864 autres injectées dans une veine de la queue, éveillées et sous contention après chauffage : 5 088 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort par injection à l'issue. Des prises de sang sont prévues toutes les deux semaines pendant huit semaines pour mesurer leur réponse immunitaire. Le projet doit cartographier les régions du cerveau qu'atteignent de nouveaux vecteurs viraux de thérapie génique selon la voie d'injection, avant des essais sur des lignées de souris atteintes de maladies neurodégénératives. Le porteur présente ce tri comme un moyen de réduire le nombre d'animaux non-humains utilisés plus tard, et écrit que sa stratégie "permet de limiter le nombre d'animaux utilisés (5088)".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de définir de nouveaux vecteur médicaments pouvant atteindre différentes structures du cerveau, selon différentes voies d’injection. La thérapie génique par vecteur virale (AAV) a démontré durant la dernière décennie son efficacité pour le traitement des maladies d’origine génétique. Ainsi, de nouveaux médicaments ont reçu leur autorisation de mise sur le marché . Néanmoins, de nombreux défis restent à relever. Premièrement, selon la maladie ciblée il est important de redessiner une stratégie. En effet, les essais cliniques nous montrent que la même stratégie par AAV peut avoir des effets opposés et cela même si les maladies sont proches. Deuxièmement, concernant le traitement de maladies du cerveau, le type d’injection (dans le cerveau ou dans le sang) affecte la dispersion du produit et donc, les cibles atteintes. Des études préliminaires ayant démontré l’amélioration de la distribution d’un AAV modifié pour les structures cérébrales en injection locale chez la souris, nous évaluerons l’efficacité de nos autres candidats selon différentes voies d’injections. Ces résultats permettront d’utiliser les meilleurs vecteurs dans les meilleures conditions d’injection lors des études de preuves de concept pour le traitement de différentes maladies neurodégéneratives, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats robustes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les nouveaux vecteurs médicaments. Ainsi, lors des études de preuve de concept dans des modèles de maladies neurodégénératives, seuls les AAVs atteignant les cibles d’intérêt de manière adéquate (temps et quantitativement) seront injectés via la route d’injection la plus pertinente, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à la définition des conditions thérapeutiques. Ce projet permettra in fine le développement de médicaments innovants pour les maladies neurologiques.

Procédures

Injection locale dans le cerveau : réalisée sur animal préalablement anesthésié et analgésié et maintenu sous anesthésie. La tête de l’animal est maintenue en position par un dispositif permettant d’établir des coordonnées précises du cerveau. Geste réalisé sur 4224 animaux, une seule fois par animal. Durée totale de la chirurgie : 1h30 pour les phases de pré-chirurgie et chirurgie, puis jusqu’au réveil de l’animal. Injection par voie veineuse : réalisé sur un animal vigile sous contention après dilatation préalable des veines de la queue (chauffage). Geste réalisé sur 864 animaux, une seule fois par animal. Durée totale : maximum de 5 minutes sous contention. Prélèvements sanguins permettant de mesurer la réponse immuniaire : 1 fois toutes les 2 semaines pendant 8 semaines.

Impact sur les animaux

-Chirurgie : risque anesthésique, saignement, risque hypothermique, risque d’assèchement des muqueuses, déshydratation, perte de liquide céphalorachidien, infection. - Injection intraveineuse de l’AAV (voie caudale) : saignement, contention - Prélèvements sanguins multiples : contention, hématome

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par injection

Remplacement

Le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation d’un virus médicament pour véhiculer un gène médicament jusqu’aux cellules à traiter. Les interactions entre le virus médicament et les différentes composantes de l’organisme (système immunitaire par exemple) ne peuvent pas être toutes reproduites simultanément dans les modèles cellulaires ou informatiques. De plus, le système nerveux est un système complexe ayant une structure tridimensionelle particulière, ne pouvant être reproduite. Parallèlement à l’utilisation d’animaux, nous mettons en place des cultures de tissus qui nous permettront de réaliser une première sélection de nos virus médicaments, limitant ainsi le nombre d’animaux injectés.

Réduction

La stratégie choisie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés (5088). Seuls les virus médicament ayant été décrits comme efficaces dans le cerveau seront testés, réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. Par ailleurs, des mâles et des femelles seront inclus dans les études afin d’obtenir la meilleure représentativité des réponses biologiques et de réduire le nombre d’animaux sans introduire de biais et permettant ainsi d’optimiser l’élevage des animaux achetés chez les éleveurs agréés. Ces résultats seront ensuites utilisés pour alimenter les programmes d’essais de thérapie génique dans les modèles de maladies neurodégénératives. Ainsi le nombre d’animaux présentant un phénotype délétère dans les prochaines études pourra être réduit.

Raffinement

Des études pilotes permettront de déterminer la dose optimale de virus médicament, la vitesse d’injection et le nombre de points d’injection nécessaires et suffisant pour assurer le meilleur traitement. • Condition de vie des animaux : les animaux seront hébergés en groupes sociaux avec du matériel de nidification et un abri dans chaque cage afin de limiter le stress. Une période d’acclimation de 7 jours minimum sera respectée. Les souris seront pesées avant injection puis toutes les semaines afin de suivre les variations de poids. Les souris sont manipulées régulièrement pour s’habituer à l’utilisateur • Procédure d’injection locale : les animaux seront traités avec des anesthésiques et analgésiques avant et jusqu’à 3 jours après la chirurgie. Toute suspicion de souffrance animale sera soumise à un examen du vétérinaire présent à l’animalerie qui validera la nécessité de mise à mort ou non de l’animal. • Procédure d’injection systémique : les animaux seront placés dans un appareil de contention, sous lampe chauffante afin de maximiser la dilatation des veines de la queue et de réduire le temps de contention. • Approche statistique : Basé sur les connaissances actuelles dans le domaine de la thérapie génique, nous avons alors utilisé un test statistique définissant un nombre de 6 souris par groupe.

Choix des espèces

Il a été démontré précédement que la souris est un modèle prédictif du potentiel thérapeutique chez l’homme. De plus, les différents modèles de maladies neurodégénératives étants murins, il est nécessaire de valider les différents paramètres dans cette espèce afin de réaliser de façon efficace et optimale le développement de nouveaux traitements. Des animaux de 8 à 10 semaines seront utilisés. Ce stade correspond à un plateau dans le développement du cerveau de la souris couplé à un système immunitaire mature. De plus, la taille des animaux à cet âge est adequate avec un taux de récupération post-chirurgie plus élevé (moins de surcharge pondérale et de maladies métaboliques réduisant ainsi les risques liés à l’anesthésie et à l’analgésie)