Procédures modérées

1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une société privée sous-traitant ici l'irradiation et l'imagerie de souris porteuses de tumeurs. Elles subissent l'implantation de cellules tumorales par diverses voies, des traitements répétés et un suivi par imagerie sous anesthésie, avant d'être renvoyées vers l'établissement d'origine. Le résumé précise que ces souris sont considérées en "utilisation continue" et réaffectées à une autre autorisation, sans que leur mise à mort soit établie dans ce projet. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que la souris est l'espèce la plus adaptée à ce modèle d'évaluation de médicaments anticancéreux.

Objectifs

Une société privé réalise des prestations vis-à-vis de ses clients (industries pharmaceutiques, biotechnologies, ect..) quant à l'évaluation de l'efficacité et de l'innocuité de nouveaux traitements anticancéreux en développement. La réalisation de ces études implique l'utilisation d'animaux notamment souris. Pour certaines phases des études mises en oeuvre au sein de l'animalerie de la société, celle-ci sollicite des plateformes d'expérimentation animal pour la réalisation d'étapes clefs (application des traitements par radiothérapie et imagerie par Bioluminescence et IRM).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles murins pertinents de différents cancers (sous-cutanées, intra-péritonéal, intra-veineux, intra-cérébraux, ovariens, intra-prostatiques, coliques, hépatiques, pulmonaires, osseux ou encore mammaires). Ces modèles devant être représentatifs des tumeurs humaines et permettre d’évaluer au mieux l’effet bénéfique de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Une implantation de cellules tumorales par voie intraveineuse (1x 1min), ou intrapéritonéale (1x 1min), ou sous-cutanée (1x 1min), ou intracérébrale (1x 1min), ou intra-cérébrale (1x 30 min), ou intra-ovarienne (1x 15 min), ou intra-prostatiques (1x 15 min), ou coliques (1x 15 min), ou hépatiques (1x 15 min), ou pulmonaires (1x 1min), ou osseuse (para-tibiale ou intra-fémorale) (1x 5 min) ou encore mammaires (1x 5 min). L'application d'un traitement de référence ou novateur administrés classiquement 1 à 5 fois par semaine pendant 1 à 4 semaines par voies locale ou systémique (orale (2 min), intrapéritonéale (1 min), sous-cutané (1 min), intramusculaire (2 min) ou intraveineuse (1 min) (Il est a noter qu'un même lot d’animaux ne subira qu’une seule voie d’administration). Un suivi par imagerie réalisé une à deux fois par semaine sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne = 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min). Des prélèvements sang limité à 1 par semaine (Volume maximal prélevé = 10% du volume circulatoire).

Impact sur les animaux

Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: perte de poids). De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les procédures chirurgicales d'implantation induiront des douleurs suite à l'incision et à la cicatrisation. Les effets de la radiothérapie, notamment sur les aspects digestifs (diarhée, saignement).

Devenir

Les animaux sont inclus dans une autre demande d'autorisation d'expérimentation déposé par la société. A la fin des expérimentations ils réintégreront cette autre demande d'autorisation. Dans ce contexte les animaux sont considérés en utilisation continue et non en réutilisation.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ces études sont réalisées chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) permettant de répondre aux objectifs scientifiques des études. A noter qu'avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris fait partie des espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques : 10 animaux / par groupe. L’analyse statistique sera de façon générale la suivante : • Comparaison du groupe véhicule avec le groupe produit de référence.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses incluant les étapes d'anesthésies • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites Les expériences de radiothérapie et d'imagerie par Bioluminescence et IRM sont faites en assurant le confinement des animaux pour éviter les contaminations. Pour les analyses IRM, l’examen étant d’une durée de 30 à 60 min, la fréquence respiratoire des animaux est suivi tout au long de la procédure. Après les manipulations, les animaux sont replacés dans leur cage et observés jusqu’au réveil complet. Après la réalisation des expérimentations les souris sont ramenées au sein de l’établissement d’origine où le suivi tumoral est assuré.

Choix des espèces

Les souris font partie des espéces les plus couramment utilisé dans les études visant à évaluer l'efficacité et l'innocuité de nouveaux candidats médicaments Animaux adultes (généralement 6 à 18 semaines). Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

30 bovins, veaux et génisses, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent deux vaccinations intramusculaires, sept prises de sang et trois prélèvements par poche, puis des écouvillonnages nasaux, pour tester un candidat vaccin contre le virus respiratoire syncytial bovin. À la fin, tous sont tués pour prélever des tissus lymphoïdes et du sang. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour évaluer la réponse vaccinale et relie l'intérêt du projet à la réduction des antibiotiques en élevage.

Objectifs

La vaccination contre le virus respiratoire syncycial (VRS) bovin a été identifiée comme une priorité en élevage en raison de la prévalence de cette infection virale (qui touche les veaux dans leur première année) et de la morbidité et mortalité qu’elle occasionne. De plus, le VRS bovin peut favoriser la survenue de surinfections bactériennes et pour prévenir ce risque, les éleveurs traitent fréquemment avec des antibiotiques dès l’apparition de troubles respiratoires dans leur troupeau. Un vaccin efficace dès le plus jeune âge en élevage aura un impact fort sur la santé et le bien-être des veaux. Un enjeu majeur de la vaccination contre le VRS chez le veau est d’induire une immunité protectrice dans les premières semaines de vie, en présence des anticorps d’origine maternelle (acquis par la buvée du colostrum). Notre candidat vaccin est une protéine virale, la protéine de fusion F, produite in vitro sous une forme stabilisée dite préfusion (preF). Un candidat vaccin similaire est également en cours de développement pour protéger contre le virus respiratoire syncytial humain responsable des bronchiolites infantiles. Or il a été montré chez l’homme que les déterminants antigéniques portés par cette protéine preF qui sont reconnus par les anticorps neutralisant l’infection virale, diffèrent entre les nouveau-nés (0-2 mois) et les enfants plus âgés (6 mois et au-delà). Pour les bovins, nous avons déjà fait la preuve de l’efficacité du vaccin preF pour protéger contre l’infection virale après une seule administration par voie intramusculaire avec un adjuvant vétérinaire classique. Le projet actuel a pour premier objectif d’identifier les déterminants antigéniques qui sont dominants en réponse au vaccin preF chez les veaux de 2-3 semaines et qui sont mineurs chez les veaux plus âgés (6-9 mois). Notre deuxième objectif est de concevoir un nouveau candidat vaccin ne comportant que ces déterminants antigéniques dominants en période néonatale puis de l’évaluer chez des veaux de 1 mois pour son efficacité meilleure par comparaison avec preF en présence des anticorps d’origine maternelle.

Bénéfices attendus

- Un vaccin efficace contre le VRS dès le plus jeune âge en élevage aura un impact fort sur la santé et le bien-être des veaux qui sont fortement affectés par des infections respiratoires. Un vaccin efficace réduira l’utilisation des traitements antibiotiques par les éleveurs lorsque des troubles respiratoires apparaissent dans leur troupeau et que les éleveurs veulent prévenir le risque de sur-infections bactériennes. - Comprendre comment élaborer des vaccins efficaces dans la période néonatale en présence des anticorps d’origine maternelle est une avancée majeure en vaccination pour les animaux d’élevage, de compagnie et aussi pour le nourrisson.

Procédures

Les 30 animaux du projet seront soumis aux 3 gestes techniques suivants : 1) Vaccination 2 fois en intramusculaire J0 et J30 post-vaccination et moins de 5 minutes par animal. 2) Prise de sang/poche : 7 prises de sang une fois par semaine en moyenne et 3 poches de sang à 20 jours d'intervalle entre 5 à 10 minutes par animal. 3) Ecouvillonage nasal non invasif et moins de 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les vaccins évalués dans ce projet sont de type protéique sous-unitaire (inerte, non réplicatif) et adjuvés avec un adjuvant vétérinaire classiquement utilisé pour les bovins. De ce fait les réactions locale et systémique attendues sont faibles (évenutellement douleur locale et fièvre), et la durée de la phase inflammatoire sera limitée à quelques heures. Il est possible que cette zone soit douloureuse localement dans les 24 à 48 heures. Une réaction cliniquement détectable de plus de 24 h entrainerait la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire. La contention de l’animal pour les prises de sang engendre du stress et que la prise de sang peut également engendrer un hématome.

Devenir

Tous les animaux (n = 30) seront mis à mort à la fin de l’étude. Des tissus lymphoides seront prélevés et des poches de sang pour collecter pour récupérer les cellules immunitares.

Remplacement

Il n'a pas de modèles in vitro alternatifs pour évaluer la réponse vaccinale.

Réduction

Des effectifs de 5 génisses de 6-9 mois et 5 veaux mâles ou/et femelles de 3-4 semaines seront suffisants pour isoler des lymphocytes B du sang ou des ganglions en réponse à la vaccination. Des expériences antérieures nous ont en effet permis de valider la quantité d’antigène preF, l’adjuvant et la voie de vaccination pour générer des réponses anticorps robustes. Trois individus dans chaque groupe avec les réponses les plus fortes seront sélectionnées pour l’analyse des répertoires. Ce sont également nos données antérieures qui nous ont permis de déterminer le n=5 par groupe de veaux de 2-3 semaines pour avoir des comparaisons statistiquement significatives. Ce nombre d’animaux permettra de réaliser des tests statistiques non paramétriques. Les bovins pourront recevoir un traitement si nécessaire lors de la vaccination car il y a un risque de réponse inflammatoire locale modérée avec une légère fièvre pendant 24h.

Raffinement

Les bovins sont hébergés en groupe dans une animalerie conventionnelle fermée, avec un environnement enrichi (pierre de sel, brosse, paille, aire d’exercice). Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour (enrichissement social) pour détecter les signes cliniques précoces et afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites. Les bovins pourront être traités avec des anti-inflammatoires ou des antalgiques en cas de réaction à la vaccination. Une réaction cliniquement détectable de plus de 24 h entrainerait la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire à base de méloxicam (voie sous-cutanée), éventuellement répétée après 48h. Il sera mis en place une récompense positive, type céréales ou boucons de paille, après chaque prise de sang.

Choix des espèces

Le bovin est l'hôte naturel du virus respiratoire syncytial bovin et le veau doit être protégé par la vaccination. Veaux de 2-4 semaines : période néonatale avec présence d’anticorps circulants spécifiques du virus respiratoire syncytial bovin et d’origine maternelle. Génisses de 6-9 mois : stabilisation d’un répertoire B de type adulte

150 chevreuils sauvages vont être utilisés, puis relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés au filet et anesthésiés, les brocards subissent une collecte de sperme par électro-stimulation, un prélèvement de sang à la jugulaire et des prélèvements de fèces et de poils, une fois par an. Le porteur reconnaît des risques de blessures, de stress de capture et de myopathie de capture pouvant être mortelle. Il justifie l'étude de la sénescence de reproduction par la nécessité d'une population sauvage suivie de longue date, qu'aucune population captive ne pourrait remplacer.

Objectifs

La sénescence de reproduction - le déclin des performances de reproduction avec l'âge - est un processus biologique très répandu dans le vivant, associé à de profondes implications biologiques, démographiques et sociétales. Pourtant, très peu d’études se sont intéressées à la sénescence de reproduction des mâles en milieu naturel. L’objectif de notre projet est donc d’identifier les facteurs biologiques (ex : effort de reproduction en début de vie, santé des individus) et écologiques (ex : qualité des ressources, exposition à des polluants) qui modulent les performances de reproduction au cours de la vie des mâles, en milieu naturel. Pour mener à bien ce projet, il est par essence indispensable de travailler sur une population animale sauvage pour laquelle les individus sont suivis de la naissance à la mort. En outre, il est nécessaire que les trajectoires individuelles des mâles qui seront échantillonnés soient déjà disponibles (données sur la croissance ou la santé des individus). Nous analyserons les causes évolutives de la sénescence de reproduction des chevreuils mâles (brocards) dans une population française de chevreuil. Nous organiserons des captures estivales afin de collecter de nouvelles données sur les traits pré-copulatoires (ex : morphologie des bois) et post-copulatoires (ex : qualité des spermatozoïdes) pendant la période du rut. Nous testerons ensuite des prédictions issues des théories évolutives du vieillissement, en examinant si une forte allocation à la croissance et à la reproduction en début de vie est associée à une sénescence de reproduction plus précoce ou plus marquée. De plus, nous explorerons si ces associations sont modulées par les conditions environnementales et par une dégradation de santé des individus (évaluée par divers marqueurs de la sénescence, tel que l'âge épigénétique). Basé sur une combinaison unique de données comportementales, physiologiques, génétiques et de traits d’histoire de vie, ce projet permettra d’obtenir une compréhension fine des causes et conséquences évolutives de la senescence de reproduction. Ces travaux menés chez un mammifère longévif en milieu naturel ouvriront de nouvelles perspectives de recherche aussi bien pour la biologie évolutive que pour la biogérontologie. Les individus qui composent la population d'étude sont suivis individuellement depuis plus de 40 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’identifier des marqueurs phénotypiques (ex : taille des caractères sexuels secondaires) et moléculaires (ex : âge épigénétique) de la sénescence de reproduction des mammifères mâles. A terme, ce projet permettra d’identifier les mâles souffrant d’une fertilité réduite par des mesures bien moins invasives que l’électro-stimulation (ex : par simple mesure phénotypique ou dosage sanguin). Ainsi, l’identification plus aisée des mâles les plus fertiles permettra d’affiner les protocoles de gestion des populations. La majeure partie de nos connaissances actuelles sur le vieillissement est basée sur des expériences menées sur des modèles animaux à courte durée de vie dans des environnements contrôlés (par exemple des rongeurs de laboratoire), ce qui rend difficile l'extrapolation des résultats à des espèces à longue durée de vie comme l'humain. Dans ce contexte, notre projet est porteur pour la recherche biomédicale car le chevreuil présente un cycle de vie lent (c'est-à-dire une faible fécondité annuelle et un taux de survie élevé à l'âge adulte) plus proche de celui de l'homme que de nombreux organismes de laboratoire. En outre, il se concentre une population naturelle, et pour laquelle les individus sont suivis de la naissance à la mort et les échantillons biologiques couvrant toute la vie des individus déjà disponibles. De plus, il fournira des informations essentielles sur le rôle joué par les conditions environnementales sur le déclin des capacités reproductrices masculines. En effet, les perturbations écologiques actuelles sont susceptibles d'avoir des conséquences néfastes sur la fertilité des mâles, et pourraient être déjà impliquées dans la détérioration inquiétante de la santé reproductive des hommes comme actuellement documentée dans la plupart des populations humaines du monde entier. À plus long terme, ce projet pourra également fournir des connaissances fondamentales sur l'étiologie des maladies reproductives masculines. Jusqu'à présent, les études sur le vieillissement reproductif masculin dans les sciences vétérinaires et biomédicales n'ont pas intégré de considérations éco-évolutives. Pourtant des approches similaires, réalisées dans des populations sauvages de mammifères longévifs ont déjà conduit à des percées dans notre compréhension de la santé reproductive des femmes.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : pose de boucles auriculaires à la première capture (si non marqué - durée 1 min), pose d'une puce d’identification injectable à la première capture (si non marqué - durée 1 min), une anesthésie, une collecte de sperme par an (durée 20 min maximum), 1 prélèvement de sang dans la jugulaire (14 ml mL maximum) (durée 1 min), un prélèvement de fèces au niveau rectal (durée 2 min), 1 prélèvement de ~100mg de poils au niveau du miroir (durée 1 min), 1 prélèvement de touffes de poils au niveau des glandes interdigitales et métatarsales (durée 2 min).

Impact sur les animaux

Les deux effets indésirables principaux sont i) les risques de blessures superficielles et de traumatologie (fractures extrêmement rares mais possibles lorsque l’animal se prend dans le filet) et ii) le stress causé par la capture (phase de course qui précède la capture au filet puis démaillage et mise en sabot). Contrairement aux captures hivernales, le stress lié à la contention sera atténué puisque les animaux seront anesthésiés. La conséquence la plus fréquemment observée de ce stress de capture est une réduction de l’activité locomotrice journalière dans les jours suivant la capture, dont la durée a été évaluée à 14 jours chez le cerf de Virginie. Plus rarement peut survenir une hyperthermie liée au stress et à la contention, ou une myopathie de capture, s’exprimant essentiellement soit sous la forme d’un choc post-capture (dans les 6 heures suivant la capture, avec risque mortel) soit sous la forme d’un syndrome d’ataxie-myoglobinurie (dans les heures ou jours suivant la capture). Les prélèvements d’échantillons seront réalisés sur des animaux anesthésiés et analgésiés. Ainsi, le stress associé aux protocoles d’échantillonnage sera limité (collecte de fèces, prise de sang, pose de boucles auriculaires et d'une puce d'identification injectable, éléctro-stimulation), et l’inconfort et les douleurs associées (potentiellement détectées par des vocalisations) au protocole seront modérées, de courte durée et ne persisteront pas au-delà de la manipulation. L’inconfort qui pourrait émaner de ces protocoles sera réduit au minimum par l’administration d’un analgésique à action centrale. Aucun des prélèvements n’est à même de provoquer une douleur qui persisterait une fois l’animal réveillé et relâché.

Devenir

Les animaux seront remis en liberté.

Remplacement

Ce projet de recherche sur le chevreuil repose sur le suivi individuel de brocards. Il vise en particulier à explorer les trajectoires d’allocation dans la reproduction des brocards au cours de la vie et de comprendre comment celles-ci sont modulées par les conditions environnementales (ex : niveau de pollution, conditions climatiques) à la naissance ou au cours de la vie adulte et influent la survie des individus à long termes. Ce projet est dans la lignée des suivis à long-termes en écologie basés sur le suivi le plus long et le plus complet possible des individus au cours de leur vie en milieu naturel. Il n’existe donc, par essence, aucune méthode substitutive à notre protocole de recherche. Les approches in vitro ou in silico, ne permettent pas d’étudier simultanément les réponses des individus aux variations de conditions environnementales de manière intégrée (prises en comptes du spectre complet de traits reproducteurs, morphologie des bois, sécrétions odorantes, quantités et qualité des spermatozoïdes) au niveau individuel ainsi que les conséquences à long terme sur la valeur sélective des individus. En outre, une compréhension fine du rôle de l’environnement sur la sénescence nécessite, par essence, de se focaliser sur des populations sauvages. Nous avons en effet démontré que les conditions de captivités modifient les patrons de sénescence. Les populations de mammifères captives ou de laboratoire ne constituent donc pas une alternative pertinente à l’utilisation de populations sauvages lorsqu’il s’agit d’étudier le rôle de l’environnement sur le processus de sénescence. Notre protocole est calibré pour que toutes les quantités de tissus prélevées soient en adéquation avec des objectifs prédéfinis précis. Toutefois, si certains échantillons s’avéraient non utilisés (en particulier les échantillons de sperme pour lesquels nous ne pouvons pas contrôler de manière précise la quantité que nous allons collecter) ou si une amélioration des protocoles de biologie moléculaire permettait de réduire la quantité de tissus à utiliser pour la quantification d’un paramètre donné, les échantillons supplémentaires et restants seraient mis à disposition de notre réseau de collaboration (et participerait ainsi à du remplacement pour des projets futurs).

Réduction

Notre objectif est de réaliser le protocole sur un total de 30 brocards (d’âges connus ou non), lesquels seront recapturés annuellement le temps de la durée du projet. Ce nombre de 30 individus est le nombre minimal pour pouvoir utiliser les outils statistiques appropriés à l’étude de la sénescence en milieu naturel (ex : modèle linéaire mixte généralisé avec un effet aléatoire de l’individu sur l’intercept du modèle. Dans cette étude nous ciblerons, lors des mini-traques, des mâles déjà marqués lors de captures hivernales précédentes (pour lesquelles le comité d’éthique a déjà rendu un avis favorable) et pour lesquels une partie des trajectoires individuelles est déjà connue. Ce ciblage permet de limiter la capture de nouveaux individus tout en se concentrant sur ceux ayant le plus de valeurs scientifiques. Si un animal venait à être capturé une seconde fois au cours du même été, aucun prélèvement ne serait pris et l’animal serait immédiatement relâché sur son site de capture. Toutes les femelles et les individus de moins de 1 an (faons de l’année) seront également immédiatement relâchés. Le nombre et la quantité des échantillons prélevés seront minimisés lors des captures estivales. La quantité de sang prélevée passera notamment de max 1 ml/kg (volume max= 20ml) à 14 ml (individus >20kg) afin de quantifier uniquement les paramètres physiologiques qui seront mis en lien avec les traits reproducteurs (ex : morphologie des bois, sécrétions odorantes, quantités et qualité des spermatozoïdes) et la santé des brocards. Les fèces collectés en amont de l’électro-stimulation avant de vider le rectum seront conservés pour des analyses d’éco-physiologie. La réduction des prélèvements est également anticipée par le stockage des échantillons non utilisés et leur mise à disposition pour notre réseau de collaborations. Les données collectées sur les 6-8 individus capturés au cours des trois jours de tutorat seront utilisées dans les analyses (avec ajout d’un facteur ‘phase pilote’ dans l’analyse) et contribueront donc à réduire le nombre d’individus capturés (ces brocards feront parties des 30 individus prévus dans le projet).

Raffinement

Le respect du bien-être animal est une préoccupation majeure du programme chevreuil. Afin de minimiser l’inconfort et la douleur des individus, plusieurs dispositions ont été prises. - Les protocoles ont déjà été travaillés en amont pour limiter les nuisances pour les animaux. Par exemples, l’ajout d’un analgésique (butorphanol 0.2 mg/kg) a déjà été rajoutée au protocole d’anesthésie afin de limiter de façon substantielle les possibles douleurs associées à l’électro-stimulation. - Les protocoles d’anesthésie et d’électro-stimulation seront optimisés en fonction des réponses du chevreuil aux protocoles initialement définis (ex : diminution de la tension maximale si trop de vocalisation, voir ci-après). D’autres alternatives qui pourraient le cas échéant être envisagées ont également été listées, comme par exemple la collecte de sperme par pharmaco-induction si l’électro-stimulation s’avérait trop inconfortable pour les animaux. - Des points limites spécifiques à la réalisation du protocole, l’anesthésie et l’électro-stimulation ont déjà été établis (voir section ci-après). - L’équipe technique sera tutorée (6 personnes tutorés: 3 pour l’anesthésie et 3 pour l’électro-stimulation) par des vétérinaires experts de l’anesthésie et de l’électro-stimulation. Pour les années suivantes, les experts reviendront le premier jour des captures pour revalider les compétences de l’équipe technique et éventuellement raffiner les protocoles en fonction des progrès et avancées réalisées dans le domaine. - Les manipulations seront effectuées dans un local réservé à cet effet par du personnel qualifié afin de minimiser le stress pour les animaux capturés. Les brocards auront les yeux couverts d’un tissu le temps que les prélèvements soient réalisés. Une fois manipulés, les brocards seront remis dans un sabot (caisse de contention adaptée à la morphologie du chevreuil et permettant un déplacement rapide des animaux) de façon à être immédiatement relâchés au plus près de leur territoire (sur la parcelle où ils ont été capturés).

Choix des espèces

Le chevreuil est pertinent pour l’étude de la sénescence reproductive masculine puisqu’il s’agit d’une espèce longévive et que les brocards allouent de façon complexe à la reproduction (ex : territorialité, pousse des bois, émission de molécules odorantes). La population ciblée revêt en de nombreux avantages pour ce projet. Dans cette population, clôturée et très faiblement chassée, les individus sont suivis individuellement de la naissance à la mort depuis bientôt 50 ans. Les animaux d'âge connu sont suivis de près tout au long de leur vie grâce à des captures hivernales et des observations sur le terrain. De nombreuses données (ex : démographiques, phénotypiques, génétiques) sont donc déjà disponibles pour plus de 50% des individus de la population, notamment ceux qui seront ciblés en priorité pour ce projet de recherche. De plus le recours à des populations captive ou de laboratoire ne permettrait pas de répondre aux objectifs de notre projet. Le projet repose sur l’étude de la reproduction des mâles. Les études antérieures sur les brocards ont révélé que les mâles étaient sexuellement matures à 9-10 mois ou un peu plus tard (14 mois environs, c’est à dire le second été suivant leur naissance). Nous inclurons donc dans notre étude, uniquement des mâles ayant au moins 14 mois. Au cas où un mâle plus jeune (c’est à dire un faon de l’année) se ferait piéger dans les filets au moment des captures, il serait relâché aussitôt.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intramusculaire puis jusqu'à deux injections intrapéritonéales par jour pendant dix jours, et un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie avant leur mise à mort. Le porteur indique un inconfort et un stress liés aux injections répétées, sans attendre d'autre effet des molécules testées. Il affirme que le modèle murin est le seul modèle préclinique adapté pour étudier la réponse immunitaire après une greffe de poumon.

Objectifs

BOB1 est un facteur exprimé dans les lymphocytes. Dans des travaux antérieurs de l’équipe il a été montré que chez des patients transplantés le niveau d’expression de BOB1 dans les lymphocytes est associé au risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire. Pour étudier la fonction de BOB1, nous développons des petites molécules inhibitrices qui font l’objet d’une demande de dépôt de brevet. Nous avons démontré que le ciblage de BOB1 réduit les réponses des lymphocytes in vitro. L’inhibition de BOB1 devrait permettre de « calmer » les lymphocytes activés qui devraient moins agresser le greffon.. Un des axes de ce projet consiste à développer différents petits inhibiteurs de BOB1, à les valider in vitro et finalement à étudier in vivo l’effet de l’inhibition spécifique de BOB1 par ces molécules sur la réponse immune allogénique (qui se met en place après une greffe). Pour cela, nous utilisons un modèle murin de réponse immune allogénique, que nous avons mis au point et déjà utilisé dans d’autres travaux. Les petits inhibiteurs qui seront validés in vitro feront l’objet d’une étude pharmacocinétique in vivo chez la souris au préalable. Basés sur ces résultats, nous souhaitons les utiliser dans le modèle murin de réponse allospécifique afin d’étudier le rôle de BOB1 dans ces mécanismes et le potentiel bénéfice thérapeutique qui pourrait y être associé, pour des patients ayant subi une greffe de poumons.

Bénéfices attendus

D’un point de vue cognitif, la compréhension du rôle de BOB1 dans la réponse allo-spécifique est le premier bénéfice attendu de ce projet. Au delà, l’identification d’inhibiteurs de cette voie est très prometteuse dans le but de développer des approches thérapeutiques pour prévenir le risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire, chez des patients transplantés.

Procédures

Les animaux recevront une injection intra-musculaire (durée 1 minute, animal anesthésié). Certains lots d’animaux recevront jusqu’à 2 injections intra-péritonéales par jour pendant 10 jours (durée 30 secondes chaque, animal vigile). Un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procèderons à des injections intra-péritonéales répétées, et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine), pourra être ressenti par les animaux. De plus la répétition de ces injections sur une durée de 10 jours pourrait engendrer un certain stress des animaux. Les différents inhibiteurs auront tous été validés pour une absence de toxicité in vitro, et in vivo dans une étude de pharmacocinétique. Nous n’escomptons pas d’effets indésirables de ces molécules par elles-mêmes ou comme conséquence de l’inhibition de la réponse immune spécifique. Toutefois, comme il s’agit de molécules nouvelles, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive au cours du traitement.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les premières études des conséquences de l’inhibition de BOB1 ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire des inhibiteurs. De plus tous auront fait l’objet d’une étude de pharmacocinétique in vivo au préalable. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 1200 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 200 lots de 6 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables, et à l'aide de tests statistiques. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si certains des inhibiteurs, parmi les 10 étudiés ne passent pas les étapes préalables de toxicité cellulaire et d’étude pharmacocinétique in vivo. Dans un but de réduire le nombre d’animaux, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les solvants et les concentrations sont les mêmes pour plusieurs inhibiteurs et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il nous permet d’étudier un processus complexe tel que la réponse immune allo-spécifique, à notre connaissance il n’y a pas d’autre modèle pertinent. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 6 à 8 semaines, car le système immunitaire est mature. A des âges plus avancés le système immunitaire peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de l’immunité et dans son inhibition.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses humaines du sein ou du pancréas sous la peau, les tumeurs étant ensuite fragmentées et regreffées sur d'autres souris, puis des injections répétées d'une molécule à base de fer dans la queue. Le porteur indique que la croissance tumorale et les injections répétées peuvent provoquer douleur et lésions. Il conclut que ces études précliniques restent nécessaires au dépôt de brevet et à la poursuite d'essais cliniques.

Objectifs

Malgré les progrès dans leur diagnostic et traitement, les cancers du pancréas et certains cancers du sein ont encore un pronostic défavorable. Ainsi il est primordial de trouver de nouveaux traitements. Ce projet a pour but d’étudier le pouvoir anti-cancéreux d’un nouveau produit à base de fer (à une dose déjà montrée comme non toxique pour les souris) sur des souris ayant reçus une greffe au niveau du flanc, sous la peau, de cellules cancéreuses humaines (pancréas ou sein).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet à court termes sont de prouver que la molécule a un effet anticancéreux dans un modèle animal (souris). A long terme, cela permettrait de réaliser d’autres essais pré-cliniques voir cliniques et in fine améliorer le traitement des patients atteints du cancer du pancréas et du cancer du sein.

Procédures

Les animaux recevront une injection unique de cellules cancéreuses (mammaires pour une partie et pancréatique pour une autre partie) au niveau du flanc sous la peau. Une fois les tumeurs développées, elles seront fragmentées pour être greffées sur de nouvelles souris et ce à deux reprises. Cela permet d’obtenir un modèle tumoral fiable. La durée de cet acte est approximative car cela dépendra du temps que mettent les cellules à former une tumeur à chaque étape. 14 souris seront nécessaires pour cette étape (7 par modèle de cancer : sein et pancréas). Ensuite, aura lieu les greffes des fragments obtenus lors de la dernière transplantation, aux 66 souris nécessaires pour l’injection du composé. Une fois les tumeurs obtenues, les souris seront réparties en groupes pour les injections. Pour chaque modèle (cancer du sein et cancer du pancréas), il y aura 3 groupes de 11 souris , 1 groupe contrôle et deux groupes recevant 2 modalités d’injections de la molécule différentes. Pour chaque groupe, 4 souris seront mises à mort en cours d’expérimentation (étude de l’effet précoce de la molécule sur la tumeur) et les 7 autres en fin d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Durant les actes expérimentaux, les souris seront soumises à différents injections. Elles seront également soumises à une chirurgie légère. A la suite de ces actes, les souris pourront ressentir une soif ou/et une faim moins importante que d’habitude. Les injections répétées de la molécule au niveau de la queue peuvent entrainer une douleur et une atteinte des tissus au niveau du site d’injection, afin d’éviter cela, nous injecterons à différents endroits de celle-ci. Le développement des tumeurs peut entrainer une douleur et une gêne, au fur et à mesure de la croissance de la tumeur. Les animaux seront donc susceptibles de gratter la zone de greffe ou d’injection. Après tout acte chirurgicaux ou injections, les animaux seront isolés le temps qu’ils récupèrent toutes leurs facultés mais seront rapidement remis en cage collective afin d’éviter un stress lié à l’isolement de l’individu.

Devenir

Pour la première partie de l’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort en cours de procédures pour récupérer au fur et à mesure les tumeurs et les fragmenter / regreffer. Pour la deuxième partie de l’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et étudier l'effet des différentes injections à un temps précoce ou à l'issu de l'expérimentation (temps tardif)

Remplacement

Aucune méthode alternative de remplacement ne permet de satisfaire l’objectif de Remplacement à notre connaissance. Ces études précliniques chez l’animal restent nécessaires au dépôt de brevet concernant son effet anticancéreux sur les animaux et à la poursuite d’études cliniques pour exploiter pleinement les capacités antitumorales de la molécule AIM3 dans le traitement de cancer du pancréas et du cancer du sein triple négatif

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre de souris, nous avons décidé d’éviter un quatrième groupe contrôle (ne recevant qu’une injection de la solution dans lequel est repris le composé). Nous utiliserons donc un seul groupe contrôle pour les comparaisons aux deux groupes traités.

Raffinement

Les expériences seront réalisées afin de minimiser le stress et l’apparition de douleurs chez les animaux. Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés afin de limiter le stress engendré par la contention. La présence d’enrichissement dans les cages (frisure de papier kraft, de bûchettes et/ou tunnel) est un critère de raffinement. Des critères d'arrêt anticipés de l'expérimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifiés. Dès qu’un des points limites est atteint la souris en question sera écartée du protocole et mise à mort par dislocation cervicale à la suite d’une anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le modèle de souris « nude » du fait de sa déficience en système immunitaire est le modèle animal le plus approprié pour des études en cancérologie expérimentale car il permet d’injecter chez l’animal des cellules cancéreuses d’origine humaine sans risque de rejet. La taille de la tumeur de la souris est suffisante pour l’analyse de la distribution de la molécule d’intérêt. 8 semaines : adulte, poids d’au moins 20 g. La veille bibliographique réalisée sur les études in vivo établies à partir de modèle de cancer du pancréas et de cancer du sein démontrent l’utilisation de souris femelles « nude » sans système immunitaire âgées de 8 semaines.

2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une neurochirurgie d'environ une heure pour implanter des électrodes d'enregistrement cérébral, puis des stimulations sonores et des injections de composés pouvant aller jusqu'à deux par jour pendant vingt-huit jours. Le porteur, qui travaille pour un donneur d'ordre, veut identifier des marqueurs cérébraux transposables à l'humain pour tester des molécules contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Il affirme que ces mécanismes complexes ne peuvent pas être reproduits par des modèles cellulaires ou informatiques.

Objectifs

Les maladies neurologiques et psychiatriques représentent un enjeu majeur de santé publique et touchent de plus en plus de personnes du fait de la croissance et du vieillissement de la population mondiale. Consciente des limites des traitements actuels, l’industrie pharmaceutique investit du temps et de l’argent pour tenter de mettre sur le marché de nouvelles thérapies du Système Nerveux Central avec un axe prioritaire sur les troubles de la mémoire, de la perception ou encore les troubles psychiatriques (en 2013, 287 molécules en développement pour la maladie d’Alzheimer et 110 molécules pour la Schizophrénie). L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des composés sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Cela signifie d’appréhender cette problématique par une approche consistant à utiliser les données existantes de la recherche clinique pour construire de nouvelles solutions de recherche préclinique et se baser sur des marqueurs biologique des pathologies utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères montrant le fort potentiel translationnel de cette méthode. Dans ce projet, nous étudierons les activités électriques cérébrales spontanées et évoquées chez des animaux contrôles et des animaux reproduisant des symptômes de pathologies humaines.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux médicaments est très coûteux et prend beaucoup de temps. Afin d’optimiser ce développement et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, la priorité est donnée à la découverte et utilisation de marqueurs d’évaluation d’efficacité quantifiables, fiables et facilement transposables entre les études précliniques et cliniques. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des souris afin de modéliser des pathologies neurologiques et psychiatriques. Nous cherchons à mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques sur des modèles animaux de pathologies neurologiques. Ces marqueurs biologiques translationnels nous permettront également de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal vigile une à deux fois par semaine. Lors des tests pharmacologiques en courte durée, un protocole de stimulation sonore sera appliqué avant et après une administration d’un composé médicamenteux. Lors des tests pharmacologiques en administration longues durée, les injections peuvent être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir une neurochirurgie d’environ une heure comprenant la période d’anesthésie. Afin de prévenir toute douleur lors de cette neurochirurgie, une injection d'antidouleur sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores une à deux fois par semaine. Il est possible que les animaux aient un léger sursaut à la première stimulation sonore mais les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress à long terme sur les animaux. Certains animaux subiront également des traitements pharmacologiques ; l'injection peut induire un stress, une douleur au site d’injection mais sur un temps très bref de quelques secondes. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées. Lors des expériences, les animaux seront installés dans des isoloirs, ils seront libres de leurs mouvements mais dans un espace réduit.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électroencéphalographiques. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle adresse des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Dans ce projet, les changements des activités cérébrales enregistrées par éléctroencéphalogramme seront mesurés pour les activités de base. Pour les activités cérébrales induites par des stimulations sonores, nous évaluerons les réponses électriques enregistrées. Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Il a été estimé selon notre expérience antérieure nous ayant permis d'obtenir un nombre suffisant d’animaux enregistrés pour réaliser les tests statistiques précédents.

Raffinement

Après une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement, les souris subiront une neurochirurgie. Une injection d'antidouleur sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et de définir les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton, maison en carton). Pour les expériences d’enregistrements évoqués, les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des souris. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques spontanées et induites et ils peuvent être utilisés pour le développement de nouveaux médicaments. La sélection de la souris est aussi basée sur des études précédentes réalisées par le client. Les animaux sont manipulés au minimum à l'âge de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, les circuits électriques du cerveau sont matures et présentent des caractéristiques matures.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 20 reproducteurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris transgéniques reçoivent une inoculation intracérébrale d'extraits de cerveaux de patients atteints d'Alzheimer, puis cinq séances d'ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons sous anesthésie, avant un test de mémoire. Le porteur indique que ces souris développent une paralysie des membres postérieurs et un amaigrissement, et que la chirurgie intracérébrale peut provoquer une douleur. Il affirme qu'aucune alternative non animale ne peut se substituer à ces souris transgéniques.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable qui est devenue un impact majeur de santé publique. La maladie d’Alzheimer est caractérisée par l’accumulation anormale de différentes protéines dans le cerveau des patients. Une de ces protéines est nommée Abéta et se dépose sous forme de plaques appelées plaques amyloïdes. De nombreux essais cliniques, chez l’animal et chez l’homme, montrent une élimination de la protéine Abéta du cerveau des patients mais sans effet sur les symptômes. Une autre protéine, la protéine tau, s’accumule également dans le cerveau des patients. Tau s’agrège à l’intérieur des neurones et fait l’objet de nombreuses recherches cliniques et pré-cliniques, notamment parce qu’elle est fortement liée au déclin cognitif des patients. Un obstacle majeur au développement de thérapies efficaces dans la maladie d’Alzheimer repose cependant sur l’existence d'une barrière « sang-cerveau » qui contrôle les entrées et sorties entre le cerveau et l’extérieur. Cette barrière a pour rôle de protéger le cerveau. Cependant, la barrière sang-cerveau rend aussi difficile la pénétration des molécules thérapeutiques dans le tissu cérébral. Ces dernières années, un moyen d’ouvrir cette barrière a été décrit. Il s’agit de l’utilisation d’ultrasons appliqués sur la surface du crâne, associée à l’injection intraveineuse de microbulles (produits de contraste échographique couramment utilisés) qui permettent de distendre, de manière transitoire et sans effet secondaire, les parois de la barrière et ainsi autorisent la pénétration des molécules thérapeutiques. Cette technique a déjà été appliquée avec succès dans le traitement par chimiothérapie des tumeurs cérébrales. Concernant la maladie d’Alzheimer, il a été montré chez l’animal des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière seule sur l’élimination des protéines pathologiques (Abéta et tau). Cependant, les effets de l’ouverture de barrière sur la propagation des lésions dans le cerveau ne sont pas connus. En particulier, est-ce que l’ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau permet de freiner la progression des agrégats de protéines tau en empêchant leur passage d’une aire cérébrale à une autre ? Cette question constitue l’objet de notre travail. Celui-ci sera réalisé sur des souris génétiquement modifiées pour reproduire les accumulations de protéine tau caractéristiques de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Plusieurs études récentes ont montré des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière via l’association des ultrasons avec les microbulles chez l’animal avec une diminution de l’accumulation de la protéine Abéta et de la protéine tau dans le cerveau. Le ou les mécanismes par lesquels l’ouverture seule de la barrière (non associée à l’injection de molécule thérapeutique) permettrait ces effets thérapeutiques restent à ce jour non connus. Par ailleurs, d’autres études ont montré que l’inoculation intra-cérébrale d’extraits de cerveaux d’individus atteints de maladie d’Alzheimer provoquait expérimentalement, chez l’animal, une augmentation de la propagation de la pathologie. Ainsi, notre projet a pour visée de déterminer l’effet de l’ouverture de la barrière par ultrasons sur la propagation de la pathologie tau. Notre hypothèse est que l’ouverture de barrière permettra de freiner la dissémination-propagation des lésions. Au long terme, ces recherches pourraient permettre le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques innovantes et, parallèlement, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les animaux transgéniques sont un modèle de maladie d’Alzheimer avec des lésions cérébrales et des signes cliniques (paralysie, perte de poids) qui peuvent être précoces. Pour cette raison, les animaux feront l’objet d’un suivi rapproché pendant toute la durée de l’étude (examen et pesée 1-2 fois par semaine). Pour les animaux, il y aura au maximum 3 étapes expérimentales : La première consiste en l’inoculation intra-cérébrale des extraits de cerveaux de patients présentant une Maladie d’Alzheimer. Celle-ci est réalisée, chez 130 souris, sous anesthésie générale. Cette chirurgie est unique, d’une durée d’environ 30 minutes, et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). Par la suite (15 jours plus tard), aura lieu la seconde étape (ouverture de la barrière par ultrasons). Cinq séances d’ouverture de la barrière par ultrasons (en externe, sans ouverture du crâne) seront réalisées à un rythme d’une séance par semaine. Lors de chacune de ces séances, les souris seront anesthésiées. La durée d’une séance pour chaque animal est d’environ 10 minutes. Au bout de 5 semaines de traitement par ouverture de barrière, 80 des 130 animaux seront finalement évalués par un test de mémoire non-invasif (observation du comportement spontané dans une enceinte carrée pendant 2x10 minutes). Le test sera réalisé 72 heures après la dernière séance de sonication. A la fin de l’étude, l’examen du cerveau des souris sera effectué en postmortem afin d’explorer l’effet de l’ouverture de la barrière sur la propagation de la pathologie chez les souris. Pour produire les 130 souris nécessaires au projet, nous utiliserons les animaux reproducteurs de notre colonie (20 mâles transgéniques). Le nombre total d’animaux est donc de 150.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées dans cette étude présentent un phénotype dommageable et développent vers l’âge de 7 mois (parfois plus tôt) des lésions des voies motrices entraînant une paralysie des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement lié aux difficultés d’accès à la nourriture et à la boisson. Comme nous utiliserons des souris jeunes (4-6 mois) nous ne devrions pas observer ces phénotypes dommageables. Les deux manipulations chirurgicales de ce projet (inoculations intracérébrales et ouverture de la barrière hémato-encéphalique) sont associées aux risques anesthésiques habituels. Ceux-ci comprennent le risque d’hypothermie lors de l’anesthésie, le risque de déshydratation et le risque de d’anomalies cardiaques et respiratoires liées au produit anesthésique. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie si celle-ci est correctement réalisée (chirurgie courte, utilisation de produits anti-douleurs). Concernant l’étape d’ouverture de la barrière, il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. En effet, celle-ci n’implique pas d’ouverture cutanée. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané de l’animal, sans restriction d’accès à l’eau ou à l’alimentation, sans menace pour l’animal, et impliquant un stress modéré lors de la manipulation (sortie de la cage) et du placement dans un nouvel environnement.

Devenir

A l’issue de la procédure, l’ensemble des animaux expérimentaux (n = 130) sera ensuite euthanasié pour prélèvement de leurs cerveaux à visée d’analyse. Les animaux transgéniques servant à la reproduction (n = 20) seront euthanasiés.

Remplacement

L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale. Ce modèle de souris est le modèle le plus couramment utilisé dans les études précédentes sur le sujet.

Réduction

Le nombre d’animaux produits et maintenus sur site est réduit au maximum. La taille des groupes d’animaux (10-20 souris par groupe expérimental) produits pour les futures études est définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature afin de permettre de générer des données fiables. L’ensemble des animaux seront produits sur site (colonie implantée depuis plusieurs années). 7 lots expérimentaux seront utilisés : Expérience 1 (étude pilote) – Effet de l’ouverture de la barrière sur la propagation des lésions cérébrales 3 lots d’animaux (normaux ou transgéniques) recevront une inoculation intracérébrale couplée (ou pas) à une ouverture de la barrière. Ces 3 lots serviront à l’évaluation du traitement sur la cible principale (lésions tau dans le cerveau). Expérience 2 (plan expérimental complet) - Effet de l’ouverture de la barrière sur les fonctions cognitives et les lésions cérébrales 4 lots d’animaux (normaux ou transgéniques) recevront une inoculation intracérébrale (« Alzheimer » ou « contrôle ») couplée à une ouverture de la barrière. Les animaux seront ensuite testés dans un test de mémoire. Ces 4 lots permettront une description complète (clinique, neuropathologique et biochimique) des effets du traitement (inoculation intracérébrale + ouverture de la barrière). Au total, 130 souris seront utilisées pour les expériences et 20 souris transgéniques seront utilisées pour la production des animaux expérimentaux.

Raffinement

L’établissement utilisateur où sont hébergés les animaux étant agréé, les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées quotidiennement. Les animaux sont hébergés par groupes de 4 ou 5 souris et bénéficient également d’un enrichissement matériel (coton ou kraft pour faire un nid, maisons en cellulose). Nous avons déjà mis en place un programme qui vise au suivi rapproché de la lignée de souris modèle de maladie d’Alzheimer afin de détecter l’apparition de symptômes dommageables. Ce suivi sera réalisé pendant toute la durée de l’étude, de la naissance à la mort, et permettra de détecter les animaux avec des signes cliniques et de prendre des mesures adaptées (prise en charge de la douleur, aménagement environnement, euthanasie). Les deux étapes du projet (inoculation intracérébrale et ouvertures de la barrière hémato-encéphalique) sont associées aux risques anesthésiques habituels (hypothermie, deshydratation, sur- ou sous-dosage) pour lesquels plusieurs mesures seront mises en place (tapis chauffant, réhydratation avant la chirurgie, surveillance rapprochée de la sédation). Une surveillance post-opératoire sera également mise en place. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie chez l’animal mais nous avons prévu de prévenir celle-ci par l’administration d’anti-douleurs (analgésiques) avant et après la chirurgie associée à l’anesthésie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie. Concernant les étapes d’ouverture de la barrière « sang-cerveau » et d’évaluation comportementale, il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané de l’animal, avec accès à l’eau et l’alimentation, sans renforcement aversif, et n’impliquant à priori pas de stress majeur chez l’animal (si ce n’est la manipulation et le placement dans un nouvel environnement). Le suivi rapproché des animaux au cours de la phase d’élevage et d’expérimentation permettra d’identifier l’atteinte de points limites et d’intervenir pour minimiser toute souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris transgéniques qui développent des lésions similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle autre que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du présent projet. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal à l’âge adulte. Les injections intracrâniennes seront effectuées sur les animaux jeunes adultes (âgés de 4 mois), âge auquel les lésions de type Alzheimer ne sont pas encore importantes et la boite crânienne est mature et stable, autorisant une chirurgie stéréotaxique précise. Les traitements d’ouverture de barrière seront initiés à l’âge de 4.5 mois (début des lésions) sur une durée d’un mois et demi avant évaluation comportementale et l’euthanasie des animaux. L’évolution des lésions à 6 mois pourra ainsi être évaluée et leur régression après traitement mesurée.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, puis une injection intratumorale de nanoparticules d'or suivie d'une irradiation laser sous anesthésie, un groupe subissant à la place l'ablation chirurgicale de la tumeur. Le porteur indique que l'hyperthermie du traitement peut provoquer une douleur, gérée par anesthésie et analgésie. Il justifie le recours à l'animal par un microenvironnement tumoral trop complexe pour de simples cellules en culture.

Objectifs

Nous travaillons sur le développement de nanoparticules (NP) d'or pour le traitement par PTT (photothermie plasmonique) de carcinomes basocellulaires. En excitant les NP avec un laser émettant dans l'infra-rouge, on génère une hyperthermie suffisamment importante pour détruire les cellules par apoptose. Des études in vitro et in vivo ont déjà été menées sur nos NP et ont permis de démontrer une efficacité : induction de mort cellulaire, régression partielle ou totale des tumeurs. L'objectif de cette étude est d'optimiser les paramètres du traitement afin d'obtenir la meilleure efficacité possible de notre traitement (idéalement 100% de régression totale) sur ce modèle et d'effectuer une comparaison avec le traitement de référence actuel qui est la chirurgie. Si la chirurgie est relativement efficace pour ce type de cancer, elle a l'inconvénient de laisser des cicatrices inesthétiques. Or comme ce cancer se produit généralement sur les zones exposées au soleil et donc visibles telles que le visage, cela peut avoir un impact important sur la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seront de valider le schéma thérapeutique qui pourra être appliqué en clinique et apporter la démonstration aux cliniciens que la PTT peut être utilisée en remplacement de la chirurgie.

Procédures

Tous les animaux subiront une greffe de cellules en sous cutanés (100μl sur le flanc droit sous anesthésie gazeuse d'une durée d'une à deux minutes). Une dizaine de jours plus tard, les animaux de 7 groupes subiront une injection intratumorale sous anesthésie gazeuse d'une durée d'une à deux minutes suivi 30 minutes plus tard d'une irradiation laser (10 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d'un analgésique en sous cutané), et ce, 1 ou 2 fois à 3 ou 14 jours d'intervalle. Un groupe d'animaux subira une résection chirugicale du volume tumoral. Toutes ces manipulations seront réalisées sous anesthésie gazeuse couplée à une injection d'anlagésique (buprénorphine injectée en sous cutanée).

Impact sur les animaux

Il est possible que l'hyperthermie générée lors du traitement soit la cause d'une douleur, c'est pourquoi le traitement se déroulera sous anesthésie gazeuse et un analgésique sera injecté quelques minutes avant le traitement. Si nécessaire d'autres injections d'analgésiques seront réalisées. Pour les animaux subissant la chirurgie il est possible que les sutures générent un inconfort ou une douleur, si tel est le cas des injections d'analgésiques seront réalisées et des granulés mouillés seront disposés au fond des cages pour faciliter l'accès des animaux à l'eau et la nourriture.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude car elles seront soient porteuses de tumeurs soient présenteront une régression compléte qu'il faudra confirmer en histologie.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées en amont pour démontrer l'efficacité d'un tel traitement mais le microenvironnement tumoral étant plus compliqué que de simples cellules en culture il est nécessaire de passer sur des modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au strict minimum nécessaire pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Les conditions à tester ont pu être limitées grâce aux études précedemment réalisées.

Raffinement

Lors de l'irradiation et de la chirurgie, les souris seront anesthésiées par voie gazeuse et un analgésique sera injecté quelques minutes avant l'irradiation au cas où l'hyperthermie engendrerait une douleur. Par ailleurs, des points limites ont été établis, entrainant la consultation d'un vétérinaire qui décidera soit de la mise à mort anticipée de l'animal si nécessaire ou des soins à lui apporter.

Choix des espèces

Afin de pouvoir évaluer de nouvelles thérapies, les modèles animaux sont un passage obligatoire après l'évaluation in vitro (sur des cellules en culture). Le rongeur est le modèle le plus utlisé actuellement pour l'évaluation de nouvelles thérapies. Le modèle retenu pour cette étude est un modèle murin car il a déjà été documenté et pour le choix des souris il s'agit de souris Athymic nude qui sont immunodéprimées et ne vont ainsi pas rejeter les cellules tumorales humaines qui vont leur être greffées. Pour finir, l'étude ne portera que sur des souris femelles car aucun effet sexe n'a été observé précedemment et ce seront des animaux adultes de 6 à 8 semaines seront utilisés car les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes.