Procédures modérées

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées par un paludisme murin, elles subissent des prélèvements sanguins à la queue tous les deux jours pendant un mois, une injection de bleu Evans puis une dislocation cervicale sous anesthésie, pour tester comme antipaludiques des molécules déjà employées contre d'autres maladies. Le porteur indique qu'une parasitémie élevée peut entraîner une anémie, une perte de mobilité et une perte de poids, la souche étant retenue justement parce que ces souris resistent bien à ces parasitémies. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit la complexité de l'infection et conclut à l'absence de "solution viable de remplacement".

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans un repositionnement médicamenteux. Il vise à déterminer l'efficacité de molécules initialement utilisées pour traiter la tuberculose, des fascioloses ou bien encore des helminthiases, en tant qu'antipaludiques. Lesdites molécules ont préalablement été testées in vitro et sont issues des dernières générations de molécules produites pour les infections précédemment mentionnées. Elles présentent un intérêt chimique car elles n'appartiennent à aucune des familles chimiques antipaludiques déjà utilisées. L’injection au niveau abdominale de bleu evans permet, 1H avant la mort des souris, de marquer les tissus ayant subi des dommages et de les quantifier. Ces tissus sont récupérés après l’euthanasie et soigneusement conservés dans du formamide.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus résident dans la confirmation des résultats in vitro. Une évaluation de la quantité de molécules candidates restantes dans le sang après injection totale est un point important de l'évaluation in vivo pour savoir si ces molécules sont plus ou moins éliminées pendant l'infection. Ce projet permettra de mettre en évidence l'efficacité de nouvelles molécules dans la thérapeutique antipaludique

Procédures

Un premier lot de 2 souris subit un prélèvement veineux à la queue - tous les 3 jours pendant 10 jours et à partir de 7% de parasitémie, une anesthésie et un prélèvement rétro orbitaire seront réalisés - la totalité du sang sera prélevé. Les souris seront euthanasiées (durée 30 minutes) et décapitées pour récupérer les cerveaux intacts. Un autre lot de 40 souris subiront des prélèvements veineux à la queue - tous les 2 jours à compter de J2 (post infection) pendant 30 jours accompagnés de pesée tous les 2 jours à compter de J1 (post infection) pendant 30 jours - Jour de l'euthanasie injection de bleu Evans en ip 50 µL à 50mg/kg, incubation 1h maximum puis anesthésie et dislocation cervicale permettant de collecter le cerveau, le sang et les autres organes. Cocktail kétamine xylasine pour des souris de 18g ; tel que : 100 mg/kg de Kétamine et 10 mg/kg de xylazine.

Impact sur les animaux

Les molécules évaluées sont des molécules qui ont déjà été testées sur des rongeurs ou lagomorphes pour la cytotoxicité et la reprotoxicité et ayant conduit à leur autorisation de mise sur le marché dans le cadre de traitement humain (sutézolide) et vétérinaire (triclabendazole). Les doses utilisées sont en dessous du seuil de toxicité décrits dans la littérature. L'infection par Plasmodium berghei conduit à la mort chez les BALB/c pour des parasitémies supérieures à 80% néanmoins le choix de ce modèle réside également sur le fait que ces souris résistent très bien à des parasitémies élevées en affichant un tableau clinique facile à suivre. Les nuisances correspondent à des contentions, des piqures au niveau de la queue pour prélèvement, des injections intrapéritonéales et l’injection de médicaments candidats pour l’expérience. Dans le modèle de paludisme murin, les souris auront des parasitémies qui à taux elevé (>75%) peuvent entrainer une anémie donc une perte de mobilité et une perte de poids transitoire

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées. L’euthanasie se justifie par le prélèvement de la totalité du sang infecté pour le premier lot de 2 souris - il est également justifié pour le second lot de 40 souris ce qui permet de récupérer rapidement les organes vitaux des souris et le sang pour dosage médicamenteux. Les souris ne peuvent plus être infectée en raison des restes de médicaments et de la prise de poids

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de solution viable de remplacement pour le moment. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée par la complexité de la pathologie étudiée, le paludisme. Cette infection parasitaire touche les hématies et l’augmentation de la parasitémie entraine un tableau clinique complexe au niveau des différents organes en raison de l’anémie progressive et l’inflammation croissante liées à l’infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être d’étudié dans des systèmes in vitro, ou des bioréacteurs élaborés.

Réduction

La réduction fait partie de notre stratégie d'étude. Elle repose sur une étude bibliographique pour connaitre les dernières études pharmacologiques et antipaludiques en paludisme simple. Le calcul du nombre de sujets dans des groupes de même effectif est donné par une formule mathématique, pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les deux groupes avec un risque de première espèce alpha égal à 5% et une puissance de 80% Nous prenons 8 souris, tq 4 mâles + 4 femelles par groupe afin de prévenir toute perte d'effectif qui rendrait statistiquement nulle l'expérience.

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet puisqu’ il est évalué dans notre grille de score. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Les animaux seront hébergés en conditions standard d’animalerie, avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Ils bénéficieront d’une période de stabulation de 5 jours post livraison dans l’animalerie de l’Etablissement utilisateur, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. La Kétamine (100 mg/Kg) et la Xylazine (10 mg/Kg) avec une injection de 100µL pour 20 grammes de masse corporelle seront utilisés afin de limiter la douleur, notamment pour le retro orbitaire (procédure 1) et les anesthésies avant dislocations cérébrales en fin de procédure 2. De façon générale, Des aiguilles plus fines 29 gauge pourront être utilisées en complément d’une pommade (lidocaine) si les sites d’injection en intrapéritonéal deviennent sensibles pour les souris. En cas de difficulté d'alimentation des croquettes imbibées et des biberons aux tétines plus faciles d'accès peuvent etre également mis en place.

Choix des espèces

Le modèle murin (Mus muculus) est choisi car il est un support idéal pour l'infection par Plasmodium berghei. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris BALB/C pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 60 à 70%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. la simplicité et l'efficacité du modèle {BALB/c+Plasmodium berghei} en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées d'hydrogels chargés d'anticorps puis des séances d'imagerie en fluorescence sous anesthésie, trois fois par semaine pendant 21 jours, pour comparer ce relargage continu aux injections classiques. Le porteur reconnaît que ces injections peuvent provoquer une inflammation locale, accentuée par les frottements sur le gel. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit la complexité d'un environnement sous-cutané et conclut que la souris est "nécessaire", l'intérêt annoncé étant une administration moins coûteuse.

Objectifs

L’objectif du projet est de démontrer une équivalence ou une amélioration à l'administration d’anticorps thérapeutique en utilisant une formulation à base d’hydrogels comme une alternative aux méthodes d’injections sous-cutanées actuellement utilisée en routine clinique.

Bénéfices attendus

A la fin de ces expériences, nous espérons pouvoir déterminer une méthode de relargage continue d’anticorps améliorée par rapport aux injections cumulées, offrant une nouvelle alternative moins couteuse.

Procédures

Injections sous cutanée des composées sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Imagerie en fluorescence sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris. 3x/semaine pendant 21 jours.

Impact sur les animaux

L'injection sous cutanée des composées pourrait engendrer une inflammation locale. De plus les frottements et pressions sur les hydrogels pourraient accentuer potentiellement cette inflammation. Les effets indésirables potentiels de l'anesthésie sont une irritation des voies respiratoires et une légère tendance au spasme laryngé dû à l’âcreté du produit employé, une baisse de la pression artérielle et une augmentation de la fréquence cardiaque. Ces effets potentiels ont été pris en compte dans l'établissement des points limites.

Devenir

Les animaux ayant subi ces interventions ne pourront pas servir pour d'autres expérimentations et seront mis à mort.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Les études in silico et in vitro ne permettant pas de reproduire les conditions permettant de récapituler la complexité d'un environnement sous-cutané. Le modèle animal est donc nécessaire pour récapituler le relargage sous-cutané des anticorps piégés dans des hydrogels.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente en tenant compte de la puissance du test statistique qui sera utilisé. De plus l'emploie d'un système d'imagerie en fluorescence du petit animal permettant un suivi dans le temps pour chaque animal, réduit le nombre d'animal requis et renforce la fiabilité des résultats.

Raffinement

Le protocole expérimental prend en compte l’impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Les souris sont maintenues en groupe de 5 par cage pour maintenir une interaction sociale entre individus. L’environnement d’élevage est enrichi à l’aide de nids et de carrés de cellulose pour garnir ces nids. Si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition de douleurs (réduction de la réactivité, difficulté de locomotion, fourrure non entretenue, tendance à l'isolement) un traitement par un analgésique sera effectué. Des points limites ont été établis pour anticiper toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les réplications de mouvement, frottements, pressions sur le gel qu’un humain pourrait avoir ne sont réplicables que sur un organisme vivant. La souris est l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude. De plus la souris est le modèle adéquat pour les raisons suivantes : - nombreux protocoles bien établis pour cette espèce - possibilité de comparaison de nos résultats avec ceux d’autres groupes utilisant des hydrogels de formulations différentes Des souris adultes seront utilisées car le système d'hydrogel s'adresse à ce type de populations.

470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris diabétiques développant une neuropathie, elles subissent des anesthésies répétées pour des électromyographies, des traitements chroniques par gavage et injections pendant huit semaines, puis des tests comportementaux avant une perfusion intracardiaque mortelle. Le porteur développe des candidats médicaments et conditionne la suite du projet à des "résultats positifs". Il affirme que la complexité de la neuropathie ne peut être reproduite qu'avec un modèle animal.

Objectifs

La neuropathie périphérique est un trouble fonctionnel des nerfs périphériques comprenant de nombreux syndromes. Les patients atteints de cette pathologie peuvent avoir des troubles sensitifs, des modifications du seuil douleur, de faiblesse musculaire et d'amyotrophie. La neuropathie périphérique provoquée par le diabète est l’une des complications chroniques les plus fréquentes de la pathologie. L'objectif de ce projet est de développer et de caractériser un nouveau modèle de neuropathies périphériques au sein de notre établissement afin d'évaluer, par la suite, le potentiel de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour cette maladie incurable. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.

Procédures

Les animaux seront soumis à des anesthésies répétées pour la réalisation des enregistrements électromyographiques (EMG). Les procédures incluent des traitements chroniques (quotidiens) par gavage ainsi qu’en intra-peritonéal et en sous-cutanée pendant toute la durée de l'étude (8 semaines). Les capacités motrices ainsi que les changements de sensibilité seront étudiés avec des tests comportementaux. Ces tests seront rapides (maximum 15 minutes par jour), sur une durée maximale de 7 jours, non consécutifs, mais se répèteront sur plusieurs semaines. A la fin des études, les animaux subiront une perfusion intra-cardiaque sous anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront plusieurs enregistrements electromyographiques (EMG) pouvant causer du stress et une légère souffrance. De plus, les tests comportementaux (filaments de von frey, test de l'echelle) peuvent induire une nuisance chez les souris (stress et inconfort liés aux stimuli appliqués).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (ex. histologie).

Remplacement

Les processus pathophysiologiques des neuropathies périphériques impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.

Réduction

Le nombre de souris (n par groupe) a été optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les études publiées dans la littérature scientifique suggèrent qu'un nombre de 10 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=10 souris par groupe.

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement, (ii) des approches d'analgésies quand nécessaire, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (4 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris possède un système nerveux complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude des neuropathies. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiés aux études impliquant des souris. Ce projet utilisera des souris agées 5 semaines à leur arrivée. En effet, la souche de souris db/db développe un diabète de type II à partir de 4-5 semaines d'âge. Comme les premiers signes de neuropathie apparaissent après 4 à 6 semaines de présence du diabète, nous recevrons ces animaux dès 5 semaine d'âge afin de suivre l'évolution des différents paramètres étudiés avant et après l'apparition des signes de neuropathie.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont mises à jeun, subissent des prélèvements sanguins, des épreuves de course et une mesure de force musculaire sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever leurs tissus. Le porteur mène une étude fondamentale sur un axe de signalisation mitochondrial et renvoie au conditionnel d'éventuelles orientations thérapeutiques. Il revendique un "besoin urgent" d'explorer cet axe in vivo et affirme n'avoir "pas d'autre choix" qu'un "organisme entier".

Objectifs

Dans les cellules qui composent notre corps, il existe des petites centrales énergétiques (les mitochondries) qui fournissent une grande partie de l’énergie nécessaire au fonctionnement de notre organisme. Or, des dysfonctionnements de ces mitochondries dans les muscles, le cerveau ou le système immunitaire sont responsables de nombreuses pathologies chez l’homme. Lorsqu’elles sont endommagées ou bien stressées, les mitochondries transmettent des signaux à la cellule qui adapte alors son métabolisme pour compenser le dysfonctionnement des mitochondries. C’est grâce à un axe impliquant 3 protéines (OMA1, DELE1 et HRI) que les mitochondries affaiblies communiquent avec la cellule pour qu’elle s’adapte. Jusqu’à présent, cet axe OMA1-DELE1-HRI n’a été exploré in vitro que dans des lignées de cellules en culture qui paradoxalement utilisent peu les mitochondries pour produire de l’énergie contrairement aux tissus tels que les muscles où la production d’énergie dépend largement des mitochondries. Il existe donc un besoin urgent d'explorer le rôle physiologique de cet axe OMA1-DELE1-HRI in vivo, notamment dans le muscle, et de mieux caractériser ses modes spécifiques de régulation et d'activation. C'est ce que nous proposons de réaliser dans ce projet. Ainsi, nos résultats fourniront de nouvelles informations sur les mécanismes impliqués dans la restauration du bon fonctionnement cellulaire suite à un stress mitochondrial.

Bénéfices attendus

L'hypothèse centrale de ce projet de recherche est que l'axe OMA1-DELE1-HRI contrôle l’équilibre énergétique du muscle squelettique en régulant l’activité métabolique, et contrôle ainsi les performances musculaires qui se dégradent au cours du vieillissement ou dans des maladies résultant d'un dysfonctionnement mitochondrial, telles que les myopathies mitochondriales. Bien qu’il s’agisse d’une étude fondamentale, l’exploration de l’axe OMA1-DELE1-HRI dans le contrôle de l’équilibre énergétique du muscle squelettique pourrait permettre de déterminer de nouvelles orientations thérapeutiques pour lutter contre les myopathies mitochondriales ainsi qu’améliorer les performances musculaires qui diminuent lors du vieillissement.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : - Mise à jeun de 16h ou 4h, 7 prélèvements d’une très faible quantité de sang, de 20 secondes, sur 2h, 1 fois dans la vie. - Epreuves de course, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la vitesse maximale aérobie environ 30 min, l’endurance environ 1h30 et la mesure du lactate dans le sang après une épreuve d’endurance à nouveau environ 1h30. Pour la mesure du lactate dans le sang, les animaux subiront deux prélèvements d’une très faible quantité de sang, de 20 s, l’un avant et l’autre après la course. - Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale avec analgésie forte, 1 fois dans leur vie : chaque intervention durera au maximum 1h, soit 2h30 de manipulation au total en comptant depuis la première injection d’analgésique et jusqu’au réveil complet. Toutes ces interventions seront séparées a minima de 4 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger lié à la contention, aux injections ou aux prélèvements, ou modéré lors des épreuves de course. Les injections et prélèvements pourront causer une douleur légère et brève aux animaux. A l’issue de la mesure de force sous anesthésie, les animaux pourraient ressentir une douleur légère à modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.

Remplacement

Le but de ce projet est d'explorer le rôle physiologique de l’axe OMA1-DELE1-HRI dans la réponse intégrée au stress médiée par les mitochondries in vivo, cela dans le muscle squelettique. Pour évaluer la conséquence de l’absence de Dele1 sur la fonction et la physiologie musculaire notamment suite à un effort, nous n’avons pas d’autres choix que d’étudier un organisme entier, ici la souris, dans un contexte de délétion génétique dont nous avons pu établir la pertinence.

Réduction

Grâce à nos connaissances accumulées sur les tests d’efforts chez les souris et les études ex vivo réalisées, nous pourrons optimiser le nombre de lots et le nombre d’animaux par lot pour les réduire autant que possible, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique. Nous utiliserons pour cela des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, par groupe social stable, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Le comportement des mâles est particulièrement surveillé et en cas de bagarre grave amenant à des plaies, le mâle agresseur est séparé de ses congénères et ses congénères sont pris en charge de manière adaptée (mise à mort compassionnelle si blessures trop graves, soins dans les autres cas). En dehors de ce cas, seuls les mâles reproducteurs seront maintenus isolés. Pour l’optimisation de la fonction locomotrice des animaux réalisant des tests de course, nous rajoutons une grille amovible sous le couvercle des cages. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft ou du coton, un bâton de bois à ronger et une maison en carton. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Tous les gestes seront réalisés avec une attention très forte au respect physique et émotionnel des animaux. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice, au besoin pharmacologique, et en cas d'absence de bénéfice, nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Grâce à la génération de délétion génétique de protéines d’intérêt par manipulation du génome, la souris est un mammifère particulièrement pertinent pour l’étude de l’implication d’une protéine dans les mécanismes physiologiques et physiopathologiques. La souris présente par ailleurs des atouts zootechniques (temps de reproduction court, petite taille, effectifs importants) et techniques (familiarité et facilité de manipulation). Nous utiliserons des animaux Dele1-KO et WT issus de mêmes portées entre l’âge de 2 à 9 mois. Ces âges seront pertinents pour les études réalisées car c’est à cet âge que les capacités physiques de la souris sont les meilleures.

2 400 animaux non-humains, 1 000 rats, 800 cochons d'Inde et 600 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur des animaux sains, on administre par de multiples voies des molécules de clients dont le porteur admet ignorer la nature et les effets, avant la mise à mort pour prélever des organes. L'objet est un service payant d'évaluation pharmacologique dépendant de la demande de partenaires commerciaux. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "indispensable" faute d'alternative in vitro donnant les propriétés pharmacodynamiques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets pharmacodynamiques ou les effets indésirables potentiels de nouvelles molécules. Le type d’étude ex vivo envisagé intervient précocement dans le développement préclinique de candidats médicaments. Réalisées en grande majorité sur des animaux sains, ces études permettent une première sélection de molécules d’intérêt sur un tissu cible avant leur évaluation dans des modèles physiopathologiques in vivo, plus consommateurs d’animaux. Ces études permettent la quantification des effets pharmacologiques ou indésirables de différentes molécules pour les comparer sur différents paramètres. Elles ne s’inscrivent pas dans l’établissement de données de sécurité (toxicologie) avec lesquelles elles ne sont pas redondantes. Les molécules testées par le biais de ce projet le sont majoritairement dans notre champ d’expertise que sont les pathologies de l’appareil génito-urinaire et de l’appareil digestif. Cependant, pour la nécessité de partenaires commerciaux, d’autres champs d’expertise peuvent être explorés occasionnellement.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement sur le marché pour soigner les maladies de l’appareil génito-urinaire ou digestif principalement.

Procédures

Les animaux seront principalement soumis à des administrations de composés (voies et fréquence dépendantes du protocole expérimental). Les voies per os, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intravésicale et intradermique seront utilisées. Les animaux seront donc peu manipulés.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Il sera attendu d’observer chez l’animal toutes nuisances dues à la manipulation, contention et administration de composés (stress possible, douleur possible de l’aiguille, gêne lors de la contention, réveil difficile suite à une anesthésie…).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort car des prélèvements d’organes sont nécessaires.

Remplacement

Les expérimentations in vitro permettent de connaitre les propriétés physicochimiques de la substance étudiée mais en aucun cas ses propriétés pharmacodynamiques. Ainsi le recours à l’expérimentation animale est indispensable pour une évaluation pharmacologique des effets indésirables ou pharmacodynamiques potentiels des candidats médicaments.

Réduction

Dans le cas d’études fonctionnelles ex vivo et selon la nature du tissu prélevé, plusieurs fragments d’un même tissu peuvent être analysés. Ainsi, selon l’organe cible prélevé, un animal peut fournir plusieurs fragments et limiter ainsi le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront manipulés par du personnel compétent limitant ainsi la douleur et le stress des animaux lors des administrations par exemple. Dans le cas d’études avec analyse statistique, du fait de notre expérience, le nombre de 10 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement exploitables, principalement dû à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement (tunnel, igloo, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de points limites à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure… Les animaux seront manipulés par du personnel compétent limitant ainsi la douleur et le stress des animaux lors des administrations par exemple. Toute procédure nécessitant une anesthésie sera réalisée avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, hydraté (accès plus facile à l’eau de boisson si nécessaire, réhydratation par administration de liquide physiologique en sous-cutanée, en gavage…) et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Il est admis qu'il existe des différences entre les espèces en ce qui concerne la sensibilité pharmacodynamique. Le choix de l’espèce sera donc fonction du mécanisme et/ou cible du candidat médicament. Il sera dépendant de la demande des clients. Nous utiliserons principalement des animaux adultes et matures (i.e. âgés d’au moins 6 semaines pour le rat et la souris et pesant au moins 250-300 g pour le cobaye). Très exceptionnellement des souris ou rats non matures (i.e. après sevrage et avant la puberté) pourront être utilisés. En effet, chez ces animaux l’axe hypothalamo-pituito- gonadique n’est pas encore fonctionnel donc les taux d’œstrogènes endogènes sont extrêmement faibles. Une autre méthode aurait été d’utiliser des femelles ovariectomisées mais il nous semble plus souhaitable d’éviter un traitement chirurgical à des animaux.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour une myopathie qui reste sans symptômes marqués, elles subissent des tests de force, des courses jusqu'à épuisement contraintes par de petits chocs électriques et des prélèvements sanguins répétés, avant la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur évalue deux thérapies et attend du projet de "premières preuves de concept" pour de futurs patients. Il écarte le modèle cellulaire, qui n'évalue pas la contractilité du muscle, et juge l'évaluation in vivo "indispensable".

Objectifs

Les cavéolinopathies sont des maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. Actuellement, aucun traitement n’existe. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de deux thérapies, capables d’améliorer les fonctions motrices de souris atteintes d’autres maladies du muscle et présentant des symptômes similaires.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra fournir les premières preuves de concept pour soigner des patients atteints d'une maladie rare du muscle. Elle permettra, en outre, de mieux comprendre cette maladie et les acteurs impliqués.

Procédures

Des tests de force non invasifs et durant 1 minute au maximum seront réalisés une fois par semaine entre 7 et 12 semaines. Chacun de ces tests sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 mins. Un autre test de fonction motrice consistant à faire courir la souris jusqu'à épuisement sera réalisés entre 1 et 3 fois durant la période de test des animaux et durera au maximum 1h40. L'animal sera également laissé libre dans une cage pendant 12h afin d'étudier ses mouvement spontanés. Des prélèvements de sang seront effectués toutes les deux semaines au maximum et ne dépasseront pas 10% du volume total de l'animal. Durant ces prélèvements, les souris seront maintenues dans un tube pendant moins de 5 mins afin d'avoir accès à leur queue pour la prise de sang. Des tests cardiaques seront réalisés sur des souris anesthésiées au cours de la même expérience, afin de limiter le nombre d'anesthésies. Ces tests dureront au maximum 30 mins. Un test final sera effectué sur souris anesthésiées précédant l’euthanasie des animaux pour mesurer la force musculaire des souris. Ce test dure au maximum une heure. Une biopsie auriculaire durant moins de 2 mins sera effectuée à 3 semaines afin d'identifier les animaux ainsi que leur mutation grâce à l'ADN qui sera extrait de cette biopsie.

Impact sur les animaux

Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont la contention temporaire de l’animal, la chute de l’animal dans une cage remplie de litière, l’extension de l’animal par tirement progressif de la queue par l’expérimentateur, l’isolement de l’animal dans un cage spéciale pendant 12 h, la contrainte à la course par délivrance de petits chocs électriques et l’anesthésie générale de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles nécessaires aux analyses moléculaires et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies.

Remplacement

Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique de deux thérapies sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisament proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.

Réduction

La grande majorité des tests étant non invasif, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage avant d'être hébergés en groupe. Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre ainsi que du carton, pour permettre aux souris de ronger. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 à 2 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. L’animal sera sorti de la cage à l’aide d’un tube ou les mains du manipulateur disposées en coupe pour réduire leur stress. Lors de l'évaluation des fonctions cardiaques sous anesthésie, une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Durant les mesures de force, l'animal sera anesthésié et analgésié afin d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. Pour chaque anesthésie, la température corporelle de l'animal sera maintenue au moyen d'une plaque et d'une lampe chauffante. Pour chaque expérience de phénotypage, l'animal sera tout d'abord familiarisé avec le matériel pour minimiser autant que possible son stress.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé reproduit les problèmes de dégénérescence de fibres musculaires retrouvés chez les patients. Les souris malades ne présentent cependant pas de symptômes cliniques importants et peuvent vivre aussi longtemps que des souris saines sans être handicapées au quotidien. Dès 8 semaines, on retrouve des défauts de fibres musculaires, et à 12 semaines une forte régénération des fibres. Les tests seront donc réalisés entre 7 et 12 semaines, sur souris adultes.

1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'implantation d'électrodes dans le cerveau et des injections de virus, suivies d'enregistrements pendant l'éveil et le sommeil, avec douleur post-chirurgicale, risques anesthésiques et hébergement isolé. Le porteur mène une recherche fondamentale sur les récepteurs du glutamate et renvoie au long terme d'éventuelles stratégies contre les troubles anxieux. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que la modélisation informatique de ces réseaux reste hors de portée.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux, à la fois dans un cadre physiologique et pathologique. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à l’activation et au dialogue de différentes structures du cerveau durant la veille et le sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l’activités des neurones chez des souris libres de leurs mouvements et endormies.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.

Procédures

Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones ; 2) injection de virus ; 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui permet les prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes est réalisés sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : Chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement (stress modéré).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem).

Remplacement

Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.

Réduction

Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 1360 animaux.

Raffinement

Après leur réception, les animaux sont habitués à l’animalerie de l’Institut pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés seront maintenus en isolation: la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal et ne permettant pas de récolter des données. Le maintien en isolation permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Les animaux non-implantés servent de groupe contrôle et doivent donc être logés dans les mêmes conditions que les animaux implantés. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’isolement les animaux sont maintenus dans des cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Afin de garantir la taille minimale réglementaire au sein d'un compartiment une fois la cloison installée, les cages utilisées sont des cages prévues pour des rats. Pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes et facilitera l’accès à la nourriture. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une construction de lego sera mise en-dessous du biberon d’eau pour réduire la hauteur et faciliter l’accès à l’eau. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur (utilisation de l’échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.

155 agneaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infestés par voie orale de milliers de larves de trichostrongles, dont une espèce se nourrit de leur sang, ils peuvent développer inflammation intestinale, diarrhées, perte de poids et baisse de l'hématocrite, un point limite étant fixé à 15 % de perte de poids. L'objet du projet est de produire du matériel biologique, larves et vers adultes, pour des études ultérieures sur la résistance aux antiparasitaires. Le porteur n'infeste que des mâles, jugés plus sensibles, et affirme que le passage sur l'ovin est une étape obligatoire du cycle du parasite.

Objectifs

Le projet a pour objectif de produire le matériel biologique (oeufs, larves infestantes) nécessaire pour les analyses que nous menons au laboratoire (adaptation des parasites aux anthelminthiques, à leurs hôtes ou au changement climatique). Nous inoculons aux moutons 6000 (isolat sensible) à 10000 larves (isolat résistant) de trichostrongle par voie orale (dose de larves permettant une infestation correcte sans toutefois déclencher de signes cliniques; variable en fonction de la pathogénicité de l'isolat). Le cycle de développement complet se déroule sur environ 21 jours. A partir de ce stade, les larves sont devenues adultes (mâles et femelles), se reproduisent et excrètent des oeufs dans la lumière du tube digestif qui sont expulsés avec les matières fécales hors de l'hôte. Ainsi, à partir de J+21 nous prélevons les matières fécales et réalisons des contrôles coproscopiques pour déterminer le point de départ de l'excrétion d'oeufs dans les fèces. Lorsque l'excrétion se stabilise, nous prélevons les matières fécales pour réaliser les coprocultures qui nous permettent d'obtenir des larves infestantes notamment. Différents procédés permettent de récupérer suffisamment de matières fécales : 1) lorsque nous avons un faible besoin de matériel biologique, les matières fécales sont obtenues par prélèvement rectal 2) lorsque nous avons des besoins intermédiaires et s'il s'agit d'une souche sensible de nématodes, les moutons sont équipés de harnais permettant de collecter les fèces. 3) Lorsqu'il s'agit d'isolats résistants, les moutons sont placés en cage métabolique 24 à 48h (au pic d'excrétion des oeufs de nématodes) pour collecter la totalité des matières fécales émises et limiter au maximum les risques de dispersion d'un isolat résistant. Dans ce cas les moutons peuvent être placés individuellement en cage mais ne sont jamais seul dans l'espace qui leur est dédié et ont la possibilité d'échanges visuels avec leurs congénères. 4) Lorsque les besoins sont plus importants, deux moutons sont inoculés avec le même isolat et sont placés ensemble en cage métabolique le temps de récolter suffisamment de matériel. La durée maximale de collecte pour obtenir suffisamment de matériel de travail et minimiser le nombre d'animaux utilisé est de 12 semaines.

Bénéfices attendus

Le projet vise à produire le matériel biologique de base (larves et adultes) aux études visant à mieux contrôler les trichostrongles de ruminants en i) comprenant les mécanismes de la résistance aux divers anthelminthiques, ii) en interrogeant leur capacité d'adaptation au changement climatique et iii) en recherchant de nouveaux composés naturels permettant de s'affranchir des anthelminthiques chimiques.

Procédures

Lorsque les vers adultes sont développés, nous collectons des matières fécales quotidiennement pour les mettre en culture (environ 15-30 min). Les volumes varient en fonction des besoins et sont associés a des techniques appropriées (cage métabolique ou harnais pour de grosses quantités ou prélèvement intra-rectal pour des besoins plus réduits). Le trichostrongle H. contortus se nourrit du sang de son hote. A ce titre, il est impératif de controler le niveau de perte sanguine des animaux infestés et déclarer le point limite atteint ou non. Pour ces infestations, une prise de sang de 5 mL à la veine jugulaire sera réalisée avant infestation (pour établir le niveau d'hématocrite physiologique) et 30 jours, 40j et 60j après l'infestation (mois de 5 min). Toute coproscopie supérieure ou égale à 15000 opg nécessitera un contrôle hématocrite.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont de deux ordres: 1. l'effet de l'infestation: les trichostrongles peuvent induire une inflammation intestinale (associée à une perte de poids, des diarrhées) ou une baisse de l'hématocrite. 2. la mise en cage métabolique des moutons peut engendrer un stress consécutif à l'isolement relatif des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'infestation pour collecter et stocker les vers adultes nécessaires aux tests moleculaires (compréhension de l'architecture genétique des résistances aux anthelminthiques). Par ailleurs, les isolats multi-résistants ne peuvent pas être éliminés, ni disséminer dans l'environnement.

Remplacement

De manière à obtenir le matériel biologique nécessaire à la réalisation de nos tests biologiques et moléculaires, nous avons besoin d'entretenir nos isolats sur leur hôte naturel, l'ovin. Le passage sur l'animal est une étape obligatoire du cycle parasitaire. Nous ne sommes pas en mesure de réaliser un cycle complet du parasite in vitro.

Réduction

Les effectifs sont calculés sur la base des projets en cours et des besoins passés de l'équipe (soit 155 agneaux sur 5 ans).

Raffinement

Des harnais équipés de pots de collecte ont été spécialement conçus pour que la collecte des matières fécales soit la moins invasive possible. Durant la mise en cage métabolique individuelle, les animaux gardent un contact visuel avec un autre congénère situé dans une cage adjacente. La dose infestante est minimisée pour permettre la production de parasites en limitant les effets indésirables sur l'hôte: elle est de 6000 larves infestantes pour l'isolat sensible et de 10000 larves infestantes pour les isolats résistants dont les capacités d'installation, de reproduction et de développement sont moindres. D'autre part nous limitons les infestations aux agneaux mâles car ils sont plus sensibles aux infestations parasitaires que les femelles, ce qui permet de produire plus de parasites avec moins d'animaux. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour (enrichissement social) pour détecter les signes cliniques précoces et afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites. Si une perte de poids (supérieure ou égale à 15% du poids initial), une modification de l’apparence physique (abbatu, bellements) ou une modification du comportement (animal prostré, peu mobile) est observée, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Les trichostrongles d'intéret sont inféodés à l'espèce ovine. Les agneaux auront entre 3 et 4 mois (environ 30 kg). A cet âge, le système immunitaire est développé mais reste permissif aux vers gastrointestinaux. Cela permet d'obtenir une efficacité d'installation et donc de production de matériel biologique optimum.

153 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 144 tuées et 9 réutilisées comme reproducteurs. Génétiquement modifiées, elles reçoivent une injection de vecteur viral puis subissent tests de course, de tolérance au glucose et mesures de force sous anesthésie, les mutantes pour un second gène mourant dans leur premier mois de vie. Le porteur teste une thérapie génique pour deux affections mitochondriales et renvoie les bénéfices pour les patients au conditionnel, "en cas de succès". Il affirme n'avoir "pas d'autre choix" que d'étudier un "organisme entier".

Objectifs

Les cellules de l’organisme possèdent des centrales énergétiques, nommées mitochondries, indispensables à leur fonctionnement. Un défaut de production d’énergie par les mitochondries provoque une maladie nommée affection mitochondriale. Les affections mitochondriales constituent l’un des plus grands groupes de maladies héréditaires. Pratiquement toutes sont actuellement orphelines de traitement et beaucoup sont mortelles à brève échéance. En raison de leur forte consommation d’énergie, les muscles, le foie et les reins font partie des organes souvent atteints dans ces affections. Notre groupe étudie des souris mutantes pour deux gènes dont nous avons démontré le rôle dans le fonctionnement des mitochondries. Les souris mutantes pour le premier gène constituent un modèle pertinent d’une myopathie congénitale décrite chez l’être humain et le chien. Les chiens atteints présentent une réduction de la masse et de la force musculaire assez forte, accompagnée d’une intolérance marquée à l’effort. Chez l’être humain, ces mêmes caractéristiques nécessitent le recours à une alimentation par sondage gastrique des nouveau-nés et conduisent à un important retard à l’acquisition de la marche, avec impossibilité de courir une fois la marche acquise. L’atteinte des souris mutantes est nettement plus modérée mais les mécanismes cellulaires mis en jeu sont similaires. Nous avons mis en évidence que la réduction de la masse musculaire est due à un défaut de fusion des cellules musculaires au cours du développement et qu’une dysfonction mitochondriale restreinte aux muscles est à l’origine d’une réduction de l’efficacité de production d’énergie et de la réduction des performances musculaires. Par ailleurs, nous avons pu générer une mutation pour le second gène chez la souris et montrer que cette situation est létale : les animaux meurent dans le premier mois après la naissance. Nous avons pu prouver qu’une atteinte mitochondriale était à l’origine de la mort des animaux, avec une atteinte du foie et des reins. Il s’agit donc là d’un modèle pour les formes les plus sévères d’affection mitochondriale chez l’être humain. Notre objectif est de tester une stratégie de thérapie génique pour ces deux affections mitochondriales grâce à un vecteur viral, nommé AAV.

Bénéfices attendus

L’une des missions de notre équipe est de développer des thérapies pour des maladies rares afin d’améliorer à terme la qualité de vie, voire la survie, des patients atteints, grâce à des modèles animaux. Grâce aux données poussées que nous avons pu accumuler ces dernières années sur l’atteinte mitochondriale liée à la mutation de ces deux gènes et grâce à l’avancée marquée des projets de thérapies géniques utilisant des AAV, nous sommes en mesure de proposer une stratégie de thérapie génique pour deux affections mitochondriales. En cas de succès, ce projet fournira des éléments clés aux pédiatres pour envisager une prise en charge des patients atteint de la myopathie congénitale correspondante, en particulier concernant l’importance cruciale ou non d’intervenir avant la fin de la fusion des cellules musculaires. En parallèle, en cas de succès, l’efficacité d’une thérapie commune pour les 2 mutations apportera des éléments forts pour envisager le traitement des affections mitochondriales et s’avèrera très précieuse en cas de découverte d’une mutation du second gène dans des cas d’affections mitochondriales encore orphelines de diagnostic moléculaire.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : - Une injection sous anesthésie, une fois dans leur vie. L’anesthésie sera réalisée par le froid ou par deux injections. Cette intervention durera, de l’anesthésie au réveil, de 30 min à 1h. - Mesure du lactate dans le sang par un prélèvement d’une très faible quantité de sang, de 20 s, 1 fois dans la vie. - Test de tolérance au glucose : mise à jeun de 14h ou 11h puis 7 prélèvements d’une très faible quantité de sang, de 20 s, sur 2h, 1 fois dans la vie. - Epreuves de course, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la vitesse maximale aérobie environ 30 min, l’endurance environ 1h30 et la mesure du lactate dans le sang après une épreuve d’endurance à nouveau environ 1h30. Pour la mesure du lactate dans le sang, les animaux subiront deux prélèvements d’une très faible quantité de sang, de 20 s, l’un avant et l’autre après la course. - Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale avec analgésie forte, 1 fois dans leur vie : chaque intervention durera au maximum 1h, soit 2h30 de manipulation au total en comptant depuis la première injection d’analgésique et jusqu’au réveil complet. Tous les tests fonctionnels (test de tolérance au glucose, mesure de la vitesse maximale aérobie, endurance, mesure du taux de lactate dans le sang, mesure de la force musculaire) seront séparés a minima de 4 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger lié à la contention, aux injections ou aux prélèvements, ou modéré lors des épreuves de course, minimisés par l’attention portée au respect physique et émotionnel des animaux pour le réduire autant que possible. Les injections et prélèvements pourront causer une douleur légère et brève aux animaux, minimisée par un protocole adapté et l’utilisation d’une aiguille très fine. Les animaux mutants pour le second gène, dans le groupe contrôle ou dans le groupe recevant la thérapie génique si elle ne s’avère pas suffisamment efficace, subiront une baisse de vitalité et une perte de poids sur 2 à 3 jours.

Devenir

La grande majorité des animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires. Une partie des animaux seront réutilisés comme reproducteurs.

Remplacement

A ce stade de notre étude, la mise au point d’une stratégie de thérapie génique pour deux affections mitochondriales affectant des fonctions complexes de l’organisme, et jusqu’à la survie des animaux, nous n’avons pas d’autre choix que d’étudier un organisme entier, ici la souris, dans deux contextes mutants dont nous avons pu établir la pertinence.

Réduction

Les premiers tests que nous allons réaliser sur des animaux non mutants vont nous permettre de définir la meilleure voie d’injection, la meilleure dose et le meilleur choix de vecteur pour la réalisation de la thérapie génique, ce qui nous permettra d’enrôler le moins d’animaux mutants possible lors de l’essai préclinique. De plus, grâce aux connaissances accumulées ces dernières années sur les souris mutantes et les tests réalisés, nous pourrons optimiser le nombre d’animaux utilisés pour les réduire autant que possible, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Le comportement des mâles est particulièrement surveillé et en cas de bagarre grave amenant à des plaies, le mâle agresseur est séparé de ses congénères et ses congénères sont pris en charge de manière adaptée (mise à mort compassionnelle si blessures trop graves, soins dans les autres cas). Pour l’optimisation de la fonction locomotrice des animaux réalisant des tests de course, nous rajoutons une grille amovible sous le couvercle des cages. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft ou du coton, un bâton de bois à ronger et une maison en carton. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Tous les gestes seront réalisés avec une attention très forte au respect physique et émotionnel des animaux. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice, au besoin pharmacologique, et en cas d'absence de bénéfice, nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Grâce à la génération de mutations d’intérêt par manipulation du génome, la souris est un mammifère particulièrement pertinent pour l’étude des affections humaines et notamment des affections mitochondriales, que ce soit pour l’étude des mécanismes en jeu ou la réalisation d’essais thérapeutiques. Elle présente par ailleurs des atouts zootechniques (temps de reproduction court, petite taille, effectifs importants) et techniques (familiarité et facilité de manipulation). Les animaux non mutants qui nous permettront d’établir les meilleures conditions d’injection seront utilisés soit à la naissance, soit à partir d’un mois, pour répondre aux besoins des études sur les animaux mutants. Les animaux mutants pour le 1er gène recevront l’injection d’AAV à la naissance ou à un mois, pour étudier l’efficacité respective de ces deux approches. Ils seront ensuite soumis à l’âge adulte, soit entre 2 et 9 mois, à des tests fonctionnels pour évaluer leur fonction musculaire et leur métabolisme. Les animaux mutant pour le 2° gène seront étudiés à partir de leur naissance et jusqu’à l’âge de 3 mois, si la thérapie permet leur survie jusqu’à ce stade.

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique du cerveau, des injections répétées et un régime alimentaire, parfois une restriction alimentaire qui les stresse, pour modéliser la boulimie et la frénésie alimentaire humaines et en disséquer les circuits neuronaux. Le porteur reconnaît des risques d'infection et de douleur post-opératoires, ainsi qu'un stress lié à l'isolement. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne permet d'étudier de tels comportements et que les lignées transgéniques requises n'existent que chez la souris.

Objectifs

L'obésité augmente considérablement dans le monde. Malgré des recherches approfondies et des développements dans le domaine, le problème ne cesse de s'aggraver. Les comportements de dépendance alimentaire tels que la boulimie et la frénésie alimentaire sont considérés comme des traits caractéristiques des personnes obèses. Ces comportements pathologiques sont mal connus. Ce projet dissèque les circuits neuronaux des comportements de dépendance alimentaire en modélisant la boulimie et la frénésie alimentaire chez la souris. Dans ce projet, nous concevons un paradigme pour imiter les caractéristiques comportementales de boulimie et de frénésie alimentaire chez la souris. Les objectifs de ce projet consistent à identifier les circuits hypothalamiques sous-jacents au comportement alimentaire compulsif, puis à moduler ces circuits pour arrêter le comportement. L'activité des circuits cérébraux sera imagée lorsque les souris sont impliquées dans des comportements alimentaires compulsifs. Sur la base des résultats d'imagerie, nous ciblerons des populations neuronales spécifiques dans l'hypothalamus. Les objectifs de ce projet consisteront à étudier des circuits neuronaux hypothalamiques spécifiques et à tester si leur ciblage a un potentiel thérapeutique pour développer des stratégies de ciblage de médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront de déterminer des nouvelles cibles thérapeutique pour les troubles alimentaires.

Procédures

Procédure 1 : Dans chaque groupe, les souris seront soumises à un régime alimentaire pendant 16 séances. Les souris recevront 2 injections intrapéritonéales sur animal vigile au cours de cette procédure (30 sec par injections). Procédure 2 : Dans chaque groupe, les souris seront soumises à 1 chirurgie stéréotaxique intracérébrale, 2 injections sous-cutanées et 1 injection intrapéritonéale sur animal vigile. Procédure 3 : Dans chaque groupe, les souris seront soumises à 1 chirurgie stéréotaxique intracérébrale, 2 sous-cutanées, 1 régime alimentaire et 5 injections intrapéritonéales sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Chirurgie stéréotaxique : Après la chirurgie, Il existe aussi un risque d’inflammation de la plaie, d’infection et de douleur post-opératoire. Prise alimentaire : la restriction alimentaire pourra entrainer un stress de l’animal. Cette restriction ne sera utilisée uniquement si nécessaire, lorsque les animaux n’apprendront pas à manger dans les chambres opérantes. En temps normal les souris auront libre accès à leur alimentation normale pendant toute la procédure d'expérimentation. De plus, l'isolement et la présence d'un régime riche en graisses et en sucre peuvent entraîner une augmentation du poids corporel (qui sera enregistrée lors des paradigmes comportementaux et de la procédure). Ces expériences choisies ne posent aucun risque corporel pour l’animal. Les tests de prises alimentaire sont potentiellement stressant pour l’animal car les souris seront soumises à un isolement. Les souris seront injectées en intrapéritonéale ,il y a donc la possibilité d’irritation du site d’injection.

Devenir

mise à mort pour prélèvement

Remplacement

Remplacement : Les conduites addictives alimentaires ne peuvent pas être récapitulées dans d'autres modèles cellulaires. Il est impossible d'étudier la complexité de tels comportements dans des modèles non animaux. Afin d'étudier les circuits impliqués dans le cerveau, l'utilisation d'animaux vivants est nécessaire car il n'existe actuellement aucun autre modèle où une telle expérimentation peut être effectuée. Plus précisément, dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour imager ou cibler un circuit spécifique dans le cerveau de souris comportementales. À l'heure actuelle, nous n'avons pas de stratégies ou de modèles alternatifs pour étudier le cerveau et le comportement sans utiliser d'organismes vivants.

Réduction

Réduction : Afin de réduire le nombre d'animaux dans l'étude, des souris seront consanguines et plusieurs paramètres seront testés de manière longitudinale. Nous optimiserons les conceptions comportementales et les chirurgies pour obtenir une conclusion statistiquement pertinente avec un nombre minimum de souris. Les nombres seront optimisés selon les données de la littérature, compte tenu de la variabilité interindividuelle, des groupes expérimentaux requis et des complexités procédurales.

Raffinement

Raffinement : Les souris seront maintenues dans des conditions d'hébergement optimisées dans des cages ventilées individuellement (IVC) où les souris seront logées en groupe. Chaque cage a un environnement contrôlé, enrichi d'une barre à ronger, de serviettes en papier et d'un nid. Pour réduire la douleur et l'inconfort de toutes les souris d'expérience non invasives, elles seront habituées pendant quelques jours à l'environnement et à l'expérimentateur. Pour effectuer des procédures invasives, les souris seront sous anesthésie et recevront des analgésiques. Pendant toutes les procédures invasives, la température corporelle à l'aide de tapis thermostatiques jusqu'à ce que les souris soient complètement éveillées. Les souris seront étroitement surveillées après les procédures pour la douleur et l'inconfort. Nous évaluerons le corps et le poids, la consommation de nourriture et d'eau des souris pendant les 3 à 4 prochains jours afin de déterminer si les souris se sont bien rétablies ou non de la procédure invasive. Nous utiliserons une grille d'évaluation pour déterminer la santé des souris et dans des circonstances où la santé se détériore, les souris seront euthanasiées.

Choix des espèces

Le projet étudie les circuits neuronaux sous-jacents au comportement alimentaire compulsif in vivo, et aucune alternative in vitro n'est disponible pour les expériences que nous réalisons. Les lignées transgéniques nécessaires à ce projet ne sont disponibles que chez les souris, ainsi des souris adultes sont choisies car ces comportements addictifs ont été observés chez chez l'homme adulte selon la littérature.Les caractéristiques uniques de l'approche adoptée dans mon laboratoire incluent la combinaison d'études comportementales avec des études anatomiques et biochimiques sur les mêmes animaux. Les phénomènes que nous souhaitons étudier ne se produisent pas en culture cellulaire.