Procédures modérées

160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre moitié transférée vivante vers un autre établissement pour la suite du projet. Les animaux subissent des séances de course ou de marche imposées, des pesées répétées, une injection intraveineuse sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle du lactate musculaire dans le vieillissement du cerveau. Le porteur affirme que seul un protocole in vivo reproduit la complexité des interactions muscle-cerveau et juge le modèle animal "nécessaire". Il annonce des tests comportementaux d'apprentissage et de mémoire sans en préciser le détail.

Objectifs

La population mondiale vieillit de plus en plus, et a tendance à avoir un mode de vie de plus en plus sédentaire. Ces deux facteurs constituent ensemble la recette parfaite pour l'une des plus grandes menaces pour la santé dans un avenir proche : les troubles cognitifs liés à l'âge. Nos fonctions cognitives se détériorent avec l'âge. L'exercice physique pourrait ralentir l'altération métabolique du cerveau au cours du vieillissement. En effet, différents métabolites sont sécrétés par les muscles squelettiques pendant l'exercice, dont le lactate. Il a été suggéré que le lactate a un effet protecteur qui retarde le vieillissement du cerveau. Des études suggèrent que le lactate pourrait être nécessaire pour l’apprentissage et le maintien de la mémoire à plus ou moins long terme. De plus l'exercice physique pourrait avoir des effets protecteurs sur le cerveau en raison de sa capacité à générer du lactate dans les muscles et le cerveau. L'objectif est donc d’évaluer le rôle du lactate et de son transporteur musculaire durant un exercice physique d’abord sur la performance musculaire elle-même, puis sur le comportement des animaux (capacité d'apprentissage et mémoire). Des tests de comportement permettront d'examiner les fonctions cognitives et la mémoire de l'animal. L'hypothèse est que l’inhibition du transport de lactate provenant des muscles réduirait l’apport du lactate vers le cerveau, induisant des différences de comportement mesurables en raison d'une moindre disponibilité d'énergie pour les neurones du cerveau, sans réduction significative des performances à l’exercice.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus vont nous permettre de mieux comprendre la communication biologique de l’axe muscle-cerveau, dans le but d’établir des stratégies neuroprotectrices afin de limiter les troubles de la mémoire liés à l'âge. À plus long terme, cela nous permettra de mieux prévenir ou guérir les troubles cérébraux causés par différentes pathologies chez l’homme.

Procédures

Sur animaux vigiles : 14 à 16 pesées par animal, acte d’une durée de 1 minute. 4 à 7 séances d’activités physiques (course ou marche) par animal, séance d’une durée de 5 à 30 minutes. Sur les animaux sous anesthésié générale + anesthésie locale : 1 injection intraveineuse par animal, acte d’une durée de 1 minute. 0 à 2 prélèvements sanguins par animal, acte d’une durée de 1 minute.

Impact sur les animaux

L’acte de pesée sur animal vigile peut induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale et l’injection intraveineuse, l’effet indésirable attendu est un inconfort très transitoire au réveil. Suite à l’inhibition partielle du transport du lactate provenant des muscles, les effets indésirables attendus sur les animaux sont : une difficulté à apprendre une tâche cognitive complexe et à se remémorer cette tâche, ainsi qu’une fatigue musculaire plus précoce suite à un exercice physique prolongé et imposé. Les exercices physiques imposés aux animaux vigiles peuvent induire un léger stress ou une fatigue musculaire de l’animal lorsque soumis à un exercice physique prolongé, ces effets seront transitoires et « corrigés » par une période de repos prévue après l’exercice physique.

Devenir

La moitié des animaux seront mis à mort. Des prélèvements de tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses métaboliques, biochimiques, moléculaires et histologiques. Et la moitié des animaux seront gardés en vie pour poursuite du projet dans un autre établissement utilisateur.

Remplacement

Seul un protocole in vivo peut reproduire la complexité des interactions entre le muscle et le cerveau et permettre l'étude du comportement. A ce jour, il existe des modèles in silico ou in vitro permettant de recréer les interactions entre des cellules musculaires et les neurones, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire parfaitement les interactions entre le muscle et le cerveau, en effet les muscles et le cerveau ne se limitent pas simplement à des cellules musculaires et à des neurones, chacun de ces tissus est constitué de différents types cellulaires. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux, défini pour répondre aux différentes questions du projet, est réduit au minimum pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les tissus prélevés sur les animaux seront placés dans une banque d'organes/tissus murins afin de mutualiser les échantillons au sein du laboratoire.

Raffinement

Durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement). et des « actions » seront mises en place en cas de « problème(s) » observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Les injections intraveineuses seront réalisées en asepsie stricte sous anesthésie générale et locale. Les prélèvements sanguins seront réalisés en asepsie stricte sous anesthésie locale. Durant toute la procédure, les animaux seront manipulés par la même personne afin de diminuer leur stress (personnel compétent et expérimenté à l’expérimentation animale).

Choix des espèces

Le choix du modèle de souris est basé sur les critères suivants : 1. Les tests physiologiques musculaires et les évaluations des tests comportementaux dans cette espèce sont des procédures validées et adaptées pour répondre aux objectifs. 2. La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. La procédure débutera chez des souris mâles et femelles âgées de 2 mois minimum. Puis 4 semaines après, des tests d’activité physique/musculaire et de comportement seront réalisés chez ces mêmes animaux. Ces tests d’activité physiques et ces tests de comportement se dérouleront pendant 2 à 15 semaines. Cela correspond à un âge et un poids adulte, qui sont appropriés pour les expériences.

192 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'environ vingt minutes pour greffer des cellules tumorales sous la capsule du rein, puis des anesthésies répétées tous les deux jours pour suivre la tumeur par imagerie, la moitié recevant en plus des injections hebdomadaires d'anticorps. Le porteur décrit une chirurgie "invasive" entraînant douleur et stress, un risque de décès au réveil et des douleurs liées à la croissance tumorale et aux métastases. Il affirme que la souris humanisée est le "seul modèle pertinent" et que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité".

Objectifs

Dans le cadre général de notre projet d'immunothérapie du cancer chez la souris humanisée, nous prévoyons d'implanter des lignées tumorales génétiquement modifiées dans le site primaire d'origine de la tumeur étudiée, à savoir le rein. Après greffe sous la capsule rénale, la croissance de la tumeur ainsi que son éventuelle dissémination metastatique sera mesurée par bioluminescence sur animaux anesthésiés. Ces expériences seront réalisées dans des lignées de souris immunodéficientes ou dans cette même souche de souris préalablement humanisées par transfert de cellules progénitrices humaines. Ces souris dites humanisées régénerent un système immunitaire humain complet et fonctionnel après quelques semaines. L'objectif du projet est donc d'évaluer la croissance sous la capsule rénale de lignées tumorales génétiquement modifiées en l'absence ou en présence d'un système immunitaire humain. La comparaison de la croissance des tumeurs exprimant ou non les molécules d'intérêt dans des souris humanisées ou non va nous renseigner sur le rôle intrinsèque de la molécule étudiée sur la qualité de la réponse immunitaire associée et sur l'impact de celle ci sur le contrôle de la croissance de la tumeur.

Bénéfices attendus

La comparaison des croissances tumorales dans différents groupes nous renseignera sur le rôle biologique d'une molécule exprimée par la tumeur sur la qualité de la réponse immunitaire contre la tumeur dans un modèle de souris humanisées. Un anticorps monoclonal est développé pour bloquer l'interaction entre cette molécule et son récepteur pour des applications thérapeutiques chez l'homme, après la validation de son efficacité dans des souris humanisées. En cas de résultats favorables, le bénéfice attendu du projet est donc de proposer un nouveau traitement pour le cancer du rein.

Procédures

La procédure implique une chirurgie sous anesthésie générale pour implanter les tumeurs sous la capsule rénale dans 192 animaux. La durée de l'acte est de 20 minutes par souris environ. Les souris sont traitées avec un analgésique 2h avant et deux fois après la chirurgie (24 et 48h). La procédure implique aussi que les souris greffées soient anesthésiées par voie gazeuse pour mesurer la croissance de la tumeur grâce à une injection dans le péritoine d'une molécule pour visualiser les tumeurs greffées et mesurer leur volume. Cet acte est de 10 minutes par souris. Il sera répété tous les 2 jours pendant un maximum de 45 jours. Tous les animaux de la procédure seront greffés et injectés avec la molécule permettant de visualiser les tumeurs. Dans la moitié des souris, soit 96 souris, une immunothérapie sera évaluée. Pour cela, les anticorps seront injectés une fois par semaine pendant 3 semaines en commencant 7 à 10 jours après la chirurgie pour une durée maximum de 45 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux sont opérés avec une chirurgie invasive, entrainant douleur et stress. Il existe des risques infectieux suite à la chirugie. L'anesthésie présente des risques tels que hypothermie, difficultés respiratoires pouvant aller jusqu'à l'arrêt cardiaque. Le réveil de l'anesthésie est une étape critique avec un risque certain de décès. La croissance des tumeurs sous la capsule rénale pourrait entrainer douleurs et perte de poids liées soit à la croissance de la tumeur localement, soit à la dissémination métastatique de la tumeur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de période de maintien ou avant si un point limite est atteint afin de réaliser les prélèvements et analyses nécessaires dans le cadre de ce projet.

Remplacement

Ce projet étant basé sur l'observation in vivo des croissances tumorales, il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale par d'autres types d'expériences. Seul le modèle des souris humanisées permet de répondre aux questions du projet sur la fonction de molécules ciblées sur la réponse immunitaire contre la tumeur et d'obtenir des résultats potentiellement transposables à la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet (n=192) est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de croissance tumorale entre souris, nous utiliserons six animaux par groupe pour toutes les procédures et on répétera l’expérience 2 fois. Les différents groupes expérimentaux seront réalisés simultanément, réduisant le nombre d'animaux contrôles nécessaires. Chaque souris sera inclus dans un protocole d'analyse complet, allant de la mesure de la croissance tumorale aux analyses cellulaires et moléculaires subséquentes.

Raffinement

L’état général des animaux sera suivi de manière journalière par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs habilités de l'équipe de recherche. Une grille de score sera remplie à chaque visite pour évaluer l'état général des souris tout au long du maintien. Tout animal atteignant un point limite défini dans la procédure sera immédiatement euthanasié. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (administration d'analgésiques, euthanasie ou arrêt du protocole). Les animaux sont anesthésiés avec des anesthésique injectables ou gazeux dans les différents actes de la procédure. Les souris sont traitées avec un analgésique vétérinaire en pré et post opératoire. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du papier et une maison pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales chez l'animal décrites dans le projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. La souris humanisée est le seul modèle pertinent in vivo d'une réponse immunitaire de cellules humaines contre des tumeurs humaines in vivo. A ce titre, il permet la transposition des résultats à la situation physiologique chez l'homme mais aussi d'évaluer l'efficacité de molécules thérapeutiques destinées à la clinique, ce que ne permettent pas les modèles habituels. Nous travaillons depuis de nombreuses années avec les souris humanisées, ce qui nous a permis de proposer et de valider une nouvelle combinaison d'immunothérapie et de chimiothérapie dans le cancer du sein. Les souris humanisées sont livrées par le fournisseur entre 20 et 25 semaines d'âge. Ce temps est nécessaire pour le développement complet des cellules immunitaires chez la souris. Pour les animaux non humanisés, nous utiliserons des souris de 8-10 semaines.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes sont exposées à la fumée de cigarette deux heures par jour, sept jours sur sept, de l'accouplement jusqu'à la mise bas, et leurs petits, dont certains reçoivent des injections, sont mis à mort pour prélever leurs poumons. Le porteur indique que les souriceaux exposés naissent avec un retard de croissance et une fonction pulmonaire diminuée, l'objectif étant d'étudier la régénération pulmonaire in vitro à partir de ces poumons. Il affirme que l'effet d'une molécule sur un organe "aussi complexe que le poumon" ne permet pas encore le recours à des méthodes de remplacement.

Objectifs

L'exposition au tabagisme actif et passif génère des coûts de santé importants à court et long terme. L'exposition au tabac perturbe la croissance globale et pulmonaire des foetus. Le tabagisme actif pendant la grossesse est un facteur de risque de certaines anomalies congénitales et est associé à un risque accru de mort foetale in utero. Le tabagisme passif pendant la grossesse est associé à un risque de prématurité avec une relation dose-effet. Le tabagisme maternel est aussi associé aux morts inattendues du nourrisson et à une diminution de la fonction respiratoire chez les enfants avec une augmentation de la susceptibilité aux infections respiratoires virales. On sait depuis quelques années que la croissance pulmonaire dans l'enfance impacte la fonction pulmonaire à l'âge adulte. Une croissance perturbée augmente le risque de bronchopneumopathie chronique obstructive à l'âge adulte. L'identification des mécanismes permettant la régénération de la structure pulmonaire chez les fœtus et nouveau-nés exposés au tabagisme passif dès la période in utero est essentielle dans un contexte où aucune thérapie n'est disponible. Nous supposons que la consommation de tabac par la mère pendant la grossesse module les différentes populations de cellules pulmonaires fœtales du micro-environnement . Les capacités du poumon à se réparer seraient altérées conduisant à un développement alvéolaire et bronchique pulmonaire anormal. Ceci serait lié à une altération du contenu en graisses et de son utilisation par les tissus pulmonaires qui contiennent des cellules souches. L'administration de médicaments stimulant ces voies métaboliques reprogrammerait ces cellules. Ceci pourrait contribuer à créer un environnement favorable à la croissance et la multiplication des cellules pulmonaires nécessaires pour induire la régénération alvéolaire chez les fœtus exposés en prénatal au tabac. L’objectif principal est donc de comparer les capacités de régénération alvéolaire des cellules pulmonaires de souris exposées ou non au tabagisme passif, en évaluant leur capacité à former du nouveau tissu pulmonaire in vitro. Dans les objectifs secondaires, nous espérons favoriser la régénération alvéolaire in vitro grâce à des traitements médicamenteux ciblés .

Bénéfices attendus

Nous espérons mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à une diminution de la construction de nouvelles alvéoles et tenter de corriger ce défaut avec des médicaments stimulant le métabolisme et l’assimilation des lipides.

Procédures

Les animaux seront exposés à la fumée de cigarettes ou à de l'air filtré. Les animaux du groupe d’exposition à la cigarette sont exposés à la fumée filtrée grand public avec une machine à fumer. Les animaux sont placés dans une boîte, et les cigarettes sont délivrées de manière cyclique afin d’imiter de près le comportement tabagique typique dans la mesure du possible. Une procédure similaire est utilisée pour les animaux témoins, sauf qu’ils sont exposés à l’air ambiant filtré plutôt qu’aux cigarettes. L’exposition aux cigarettes ou à l’air filtré est faite pendant 2 heures/jour, 7 jours/semaine, en commençant 2 semaines avant l’accouplement et sont poursuivies pendant les 3 semaines de gestation jusqu’à l’accouchement. Des souriceaux seront exposés durant leur "adolescence" aux mêmes procédures. Les souriceaux vigiles pourront recevoir dans les premiers jours de vie une injection intra-péritonéale de médicaments (durée

Impact sur les animaux

L'exposition anténatale au tabac a déjà été réalisée et a montré que la fertilité était la même chez les souris exposées ou non au au tabac. Les portées sont équivalentes en nombre. Les souriceaux dont les mères étaient exposées au tabac lors de leur gestation ont un retard de croissance intra-utérin. Le rattrapage pondéral est complet en trois semaines. Les souriceaux dont les mères ont été exposées au tabac lors de leur gestation ont une diminution de leur fonction pulmonaire sans anomalie du nombre d'alvéoles. Certains animaux vont recevoir des injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale.

Devenir

Les souris adultes seront mises à mort au moment où leurs petits seront sevrés. Les souriceaux seront mis à mort pour prélever leurs poumons qui seront étudiés en totalité pour analyse des cellules pulmonaires ou pour des analyses biochimiques.

Remplacement

Le tabagisme pendant la grossesse est associé à un risque accru de faible poids de naissance et de retard de croissance intra-utérin. L'exposition au tabac secondaire a un impact direct sur le développement pulmonaire et la morbidité respiratoire. La manière dont la fumée de cigarette affecte le développement pulmonaire et induit des conséquences à long terme reste à déterminer. Cependant, la consommation de tabac isolée induit rarement chez l’Homme une mort in utero. Le fœtus étant alors souvent porteur d’autres pathologies ce qui rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. D’autre part, les prélèvements pulmonaires humains sont difficilement accessibles dans l’enfance. Dans cette étude, le tabagisme passif chez la souris permettra d’étudier des lésions directement et uniquement liées au tabagisme passif. Les souris adultes seront exposées pendant la gestation exposant les souriceaux dès la période in utero. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.

Réduction

Les souris gestantes seront exposées pendant toute la gestation au tabac ou à un air filtré (contrôle). Les souriceaux issus de ces souris seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J21 ou J49 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Un seul animal sera utilisé pour répondre à plusieurs questions en utilisant diverses technologies et notamment les cultures cellulaires. A partir des poumons de souris exposées ou non au tabac, nous récupérerons des fibroblastes et des pneumocytes de type 2 pour générer des organoïdes alvéolaires en culture cellulaire. Nous prélèverons aussi des poumons pour effectuer des analyses biochimiques. Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées pour ces cultures, les cellules seront congelées à chaque fois que cela sera possible, permettant ainsi de réutiliser les cellules d'une même souris à plusieurs reprises et de multiplier par ce fait les expériences sans nécessité de réaliser de nouvelles mises à morts. Le nombre de souris et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour nos études immunohistochimiques et moléculaires.

Raffinement

Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect (général et vivacité), la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect (trophique et vivacité) et la mesure quotidienne du poids pour les souriceaux. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. En cas de mal-être, les souriceaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point d'animaux génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Les souris ont à la naissance un développement pulmonaire très immature sans alvéole,. Ainsi, l'alvéolisation chez la souris se déroule pendant les trois premières semaines de vie post-natale ce qui en fait un modèle de choix pour l'étude de leurs poumons. Les souris adultes seront étudiées à partir de l’âge de deux mois. Les souriceaux seront étudiés dès la période anténatale et jusqu’à la fin de l’adolescence.

1 500 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules cancéreuses humaines sur le flanc, puis des injections intraveineuses répétées d'anticorps et des prélèvements sanguins, pour sélectionner un candidat destiné à des essais cliniques. Le porteur reconnaît qu'un test in vitro existe et s'est révélé "probant" sur les anticorps concernés, mais affirme que le modèle animal reste "indispensable et non substituable" avant tout passage chez les patients. Les tumeurs des groupes témoins non traités sont laissées croître jusqu'à la fin de l'expérience.

Objectifs

Les objectifs du projet sont d’évaluer l’efficacité et la sécurité d’anticorps thérapeutiques ou des anticorps bispécifiques correspondants dans un modèle de souris greffées en sous cutanée avec des cellules de cancers humains Cette possibilité de combiner les anticorps ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients. Les versions chimériques (= anticorps toléré chez la souris) de ces anticorps ont déjà été testés lors de précédents projets dans un modèle de souris syngénique optimisé et ont prouvé leur efficacité et leur bonne tolérance dans ce modèle. Dans ce projet, nous allons utiliser un modèle de souris immunodéficientes afin de tester les versions humanisées (= anticorps toléré chez l'Homme) de ces anticorps thérapeutiques sur des modèles de tumeurs xénogéniques.

Bénéfices attendus

Le meilleur anticorps thérapeutique sera sélectionné et développé pour des essais cliniques. Ces nouvelles biothérapies (anticorps humanisés, anticorps bispécifiques) sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.

Procédures

Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Implantation de la tumeur sur animal vigile : 1 injection, maximum 1 minute/ animal Injection intraveineuse anticorps sur animal vigile (8 injections, 3 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + injection, soit 24 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (5 prélèvements, 2 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + prélèvement, soit 10 minutes au total). Mesure de la tumeur tous les 2 jours sur environ 5 semaines (18 mesures, maximum 1 minute / animal = 18 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liés à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration de la tumeur puis des traitements (injections sous-cutanées puis intraveineuse). Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation d’une tumeur sur le flanc de l’animal, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités par les anticorps (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe attachée à cette demande de projet.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements pour évaluer l’efficacité thérapeutique des anticorps et de réaliser également des analyses complémentaires.

Remplacement

Il existe à ce jour un test in vitro nommé ADCC (Test de cytotoxicité à méditation cellulaire) qui permet de contrôler que l’anticorps peut reconnaitre et lier la cellule cancéreuse cible et provoquer sa destruction via des cellules effectrices. Nous avons réalisé ces tests sur les candidats anticorps humanisés notifiés dans cette saisine et les résultats se sont avérés probants. Cette étude nécessite impérativement un tissu tumoral en place dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. L’optimisation du modèle syngénique dans un précédent projet et le développement du modèle par notre partenaire, nous a permis d’optimiser les injections, les prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites sévères qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 5 souris maximum par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application de lidocaïne sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé, est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe partenaire a déjà évalué des traitements à base d’anticorps et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 8 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses. De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 8 semaines avaient également été utilisées dans des traitements similaires avec d’autres anticorps.

65 saumons atlantiques sauvages vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de moins de cinq minutes pour implanter dans leur cavité abdominale un capteur de fréquence cardiaque, puis sont relâchés en rivière avant d'être mis à mort après leur reproduction pour récupérer le matériel et les données. Le projet est décrit comme une étude de faisabilité visant à mesurer la réponse physiologique de l'espèce au réchauffement des cours d'eau. Le porteur relativise la mise à mort en indiquant que 90 % des saumons de cette population meurent de toute façon après la reproduction, jugeant l'effet "marginal" sur la population locale.

Objectifs

Les populations sauvages de saumon atlantique Salmo salar ont chuté de 70% depuis les années 1970. De nombreux facteurs sont incriminés parmi lesquels le réchauffement climatique. Le saumon atlantique est une espèce d’eau froide, et les températures observées dans les cours d’eau et en mer et celles prédites pour les décennies à venir sont suspectées être au-delà de l’optimum physiologique pour différentes étapes du cycle biologique. Les données disponibles sur la réponse physiologique aux températures élevées sont très éparses mais néanmoins nécessaires pour mieux prédire le devenir des populations et mieux les gérer. Les développements technologiques de ces dernières décennies, en matière de miniaturisation des capteurs notamment, permettent de réaliser des mesures physiologiques sur les animaux in situ. L’objectif de ce projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser, sur des saumons sauvages de retour en rivière après leur phase de croissance marine, des capteurs de fréquence cardiaque implantés dans la cavité péritonéale à proximité du cœur. Nous souhaitons notamment mesurer la relation qu’il existe entre la fréquence cardiaque – utilisé comme proxy de l’activité métabolique – et la température afin d’évaluer les limites physiologiques des saumons et l'effet des températures estivales élevées sur le comportement et la survie.

Bénéfices attendus

A court terme : Ce projet est en fait une étude de faisabilité qui vise notamment à évaluer notre capacité à récupérer les émetteurs et les données récoltées et le taux de perte ainsi que la qualité des données produites par le capteur afin de valider ou ajuster le paramétrage. Elle permettra en outre de produire des premières données sur la physologie des saumons lors de la phase de migration retour et d'évaluer la réponse physiologique aux températures estivales qui sont suspectées affecter la survie ou à la reproduction des saumons. A long terme : Il s'agit de mieux comprendre comment cette espèce emblématique des cours d’eau français répond aux contraintes thermiques et pourra faire face (ou non) aux conditions futures, dans le contexte du changement climatique. Il s'agit aussi de fournir des pistes pour améliorer la gestion des populations et des habitats, par exemple en préservant ou restaurant des habitats refuges.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule opération chirurgicale visant à l'introduction dans la cavité générale de matériel scientifiques (capteurs de fréquence cardiaque et radioémetteur). Cette opération durera moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Insertion par chirurgie du capteur et de l'émetteur (réalisée sous anesthésie ) : les nuisances potentielles (douleurs, saignements, infection) sont limitées par l'utilisation de mesures prophylactiques et des traitements adaptés et définis avec la collaboration d'un vétérinaire spécialisé. Cette intervention est considérée comme "modérée". Les individus choisis pèseront un poids qui leur permettra de supporter l'insertion du matériel scientifique. Ce dernier ne dépassera pas 2% du poids de l'animal comme recommandé dans la littérature.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, c'est à dire à l'issue de la reproduction des individus, tous les animaux sont mis à mort part surdose d'anesthésiant afin de récupérer le matériel scientifique et les données enregistrées. NB: 90% des saumons de la population étudiée meurent après la reproduction, épuisé par un effort et un investissement intense. Leur mise à mort est considérée comme n'ayant qu'un effet marginal sur la population locale.

Remplacement

L'objet de l'étude est de produire des connaissance sur les déplacements et la physiologie du saumon Atlantique dans le milieu naturel. Le modèle biologique ne peut être substitué par des alternatives non animales.

Réduction

L'effectif d'animaux utilisés (65) a été déterminé en fonction de critères scientifiques (effectifs suffisant pour apporter des réponses aux questions posées) et le bien être animal (les interventions sur les individus se déroulent-elle comme prévu et quelles sont les effets notamment en terme de comportement et de survie après remise dans le milieu naturel). D'un point de vue scientfique, 65 est un nombre suffisant pour valider les réglages des paramètres d'enregistrement des biologgers dans un premier temps et produire des données représentatives de la variabilité phénotypique au sein de la population.

Raffinement

Les principales mesures de raffinement concernent la limitation des nuisances (angoisse et douleur) lors de la manipulation des animaux avant, pendant et après la chirurgie et la limitation des risques d'infection post-opératoire. La combinaison d'utilisation de produits anesthésiques de concentration adaptée (1- concentration pour l'anesthésie pré-opératoire et 2- pour le maintien de l'anesthésie pendant l'opération) et d'antalgiques limitent directement l'angoisse et la douleur pendant et après l'opération et l'administration d'antibiotiques limite les risques d'infections liés à l'opération. Les mesures prophylactiques classiques (désinfection du matériel) limitent également les sources d'infection pouvant induire des nuisances post-opératoires. Les opérations de chirurgie seront effectuées par du personnel habilité et spécifiquement formé par un vétérinaire. Le protocole opératoire est co-construit avec un vétérinaire. Les conditions environnementales d'importance première pour les poissons (température et oxygénation de l'eau) seront contrôlées avant, pendant et après la capture et l'opération. Les individus seront gardés en observation dans un vivier placé dans la rivière afin de contôler la façon dont ils récupèrent de l'anesthésie et seront relâchés lorsqu'ils auront retrouvé un comportement actif normal (équilibre dans la colonne d'eau, nage).

Choix des espèces

L'espèce ciblée, le saumon atlantique, est étudié dans son milieu naturel. Les populations de saumon sont actuellement menacées par divers facteurs dont certains sous contrôle anthropique (ex. changement climatique). L'objectif de l'étude est in fine d'améliorer la compréhension de la réponse des saumons à ces facteurs afin de produire des connaisances permettant d'améliorer leur gestion. Les individus seront des adultes de retour en rivière après la phase de croissance en mer. Les connaissances sur ce stade de vie sensible sont encore très éparses, mais on sait que les individus sont exposés à de multiples stress et que la mortalité ou les affections subléthales sont élevées.

8 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Achetés déjà cathétérisés, ils reçoivent l'Enniatine B, une mycotoxine des céréales, par voies orale et intraveineuse, avec des prélèvements sanguins répétés et un séjour en cage à métabolisme, pour valider un modèle mathématique censé remplacer ensuite l'expérimentation. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour reproduire la cinétique plasmatique, qu'il juge "indispensable" à la validation du modèle. La mise à mort est justifiée par le fait que leur cathétérisation les rend inutilisables ensuite.

Objectifs

Les Enniatines sont des mycotoxines produites par des souches de champignons Fusarium et appartiennent à la classe la plus courante de contaminants des céréales. L’Enniatine B est la molécule la plus prévalent parmi les 28 homologues identifiés dans cette famille de molécules et par conséquent nos concitoyens peuvent être exposés à de faible doses de manière chronique dans leur alimentation quotidienne. Malgré le nombre considérable de propriétés pharmacologiques et toxicologiques et la prévalence de cette mycotoxine dans les aliments à base de céréales il est éthiquement impossible d’étudier in vivo sa toxicologie et donc sa toxicocinétique (et notamment son devenir plasmatique) chez l’humain. Ainsi ce projet de recherche se propose d’utiliser des méthodes alternatives permettant de pallier ce manque de données toxicocinétiques chez l’humain. Ces alternatives reposent sur 3 étapes: a) la génération in vitro (à partir d’essais de laboratoires sur cellules) de données essentiellement de métabolisme qui constituent l’élément principal des différences inter-espèces dans la pharmacocinétique de la molécule étudiée puis b) par l’extrapolation vitro/vivo permettant de prendre en compte le changement d’échelle de la cellule à l’organe et enfin c) par une autre modélisation mathématique dite « pharmacocinétique basée sur la physiologie » permettant d’intégrer ces données cellulaires et tissulaires au fonctionnement de l’organisme (animal ou humain) entier. Les essais in vitro ont déjà été réalisés en incubant l’Enniatine B avec des cultures primaires d’hépatocytes humains et de rats. Il s’agit désormais de valider les extrapolations des cellules a l'organisme faites pour le rat en générant des données in vivo du devenir plasmatique et en les intégrant au modèle mathématique. Le rat a donc été choisi car la comparaison avec l’humain aura été préalablement réalisée à partir d’expérimentations in vitro réalisées sur des hépatocytes primaires de ces deux espèces.

Bénéfices attendus

D’une manière globale, ce projet vise à déterminer les paramètres métaboliques quantitatifs de l’enniatine B: clairances in vivo et in vitro. Ces nouvelles données permettront de développer un modèle mathématique humain de l’enniatine B basé sur l’extrapolation de l’in vitro vers l’in vivo et permettront d’estimer les concentrations plasmatiques en enniatine B en fonction des scénarios d’exposition. Parallèlement, nous déterminerons les réponses moléculaires induites par l’enniatine B après exposition aigüe et répétée sur des hépatocytes primaires de rat et d’humain. Ces réponses permettront de définir les concentrations effectrices de toxicité. Ces concentrations effectrices pourront être comparés aux concentrations plasmatiques déduites du modèle mathématique et ainsi déterminer un risque de toxicité de l’enniatine B pour l’Homme.

Procédures

Le design de prélèvements se fera en deux séquences. Lors de la première séquence 4 rats seront choisis aléatoirement et recevront l’administration par voie iv (en moins de 10 secondes) et seront placés en cage à métabolisme afin de recueillir l’ensemble de leurs urines (recueil continu de l'ensemble des urines grâce à la cage à métabolisme). Deux rats se verront prélevés 0,1ml de sang 0min, 10min, 20min, 45min, 2h et 6h après l’administration tandis que les deux autres rats se verront prélevés 0,1ml de sang 5, 15min, 30min, 1h, 4h et 8h après l’administration. Lors de cette même séquence les quatre autres rats recevront l’administration par voie orale (en moins de 10 secondes). Deux rats se verront prélevés 0,1mL de sang 0h, 1h, 4h, 7h, 9h et 11h après l’administration tandis que les deux autres rats se verront prélevés 0,1ml de sang 1/4h, 2h, 6h, 8h, 10h et 12h après l’administration. L’ensemble des prélèvements de sang pour chaque rat sur cette première séquence est de 0,6 mL soit si l’on approxime le volume total individuel de sang à 30 mL, un prélèvement de 2% de ce total. Entre chaque administration, un temps suffisant pour permettre l’élimination de la molécule et la reconstitution d’une partie du sang des rats, sera respecté. Ce temps de récupération sera de 1 jour. Lors de la seconde séquence, le principe des séquences veut que les 4 premiers rats recevront cette fois-ci l’administration par voie orale et à l’inverse les 4 derniers rats recevront cette fois-ci l’administration par voie iv. Les prélèvements de sang réalisés sur chaque individu ont été limités à 6 prélèvements de chacun 100 μl par rat et par séquence. Ce qui fait pour chaque rat un prélèvement total de 4% du volume de sang individuel.

Impact sur les animaux

Pour réaliser la cinétique plasmatique, les rats seront achetés cathétérisés au fournisseur. A l’aide du cathéter, les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme (1 gavage par animal) mais la contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus d’une à deux minutes. De plus l’inconfort due au maintien en cage à métabolisme nécessaire au recueil de l’ensemble des urines, sera réduit à son strict minimum vis-à-vis de toute la durée d’hébergement (qui lui se fera en cage individuel), c’est-à-dire la phase de prélèvement de 8 heures après l’administration par voie intraveineuse (sur 4 rats lors de la première séquence et sur les 4 autres rats lors de la seconde séquence).

Devenir

Chaque rat sera mis à mort à l’issue de la seconde séquence de prélèvement de la procédure dans des conditions éthiques, étant donné qu'ils ne seront ni réutilisés, ni replacés ni adoptés du fait de leur cathétérisation.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternative non-animale pertinente actuellement permettant de reproduire la cinétique plasmatique et urinaire (avec la variabilité interindividuelle existante) des molécules chez des animaux vivants, indispensable à la validation des modèles mathématiques (qui une fois validés permettent de remplacer des expérimentations animales par simulation d’autres scénarii d’exposition).

Réduction

Dans un effort de réduction, le nombre d’animaux est calculé de manière à obtenir la quantité de prélèvements sanguins suffisante. Nous utiliserons 8 rats au total. La subdivision des groupes de 4 rats en deux sous-groupes permet de couvrir l’ensemble des échéances de cinétique et leur exploitation par une approche de population garantie ainsi une estimation de la variabilité interindividuelle des paramètres pharmacocinétiques de la population et de chaque individu. En outre, le design en séquences permet d’utiliser les mêmes animaux entre 2 administrations, en garantissant la fiabilité des données grâce à l’instauration d’un temps de récupération.

Raffinement

Concernant le raffinement, des points limites ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux. La douleur, le stress ou les contraintes seront atténués par des méthodes ou médications appropriées. Une analgésie sera mise en place si nécessaire. La contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Les prises de sang répétées seront effectuées par le cathéter permettant ainsi une récolte de sang non-douloureuse et limitant le stress. Les cathéters seront nettoyés à chaque utilisation avant fermeture avec un désinfectant à base de Chlorhexidine et une surveillance sera effectuée afin de détecter d’éventuels signes d’infection au niveau de cette ouverture sensible sur le système veineux. La procédure expérimentale est conçue pour limiter autant que possible la souffrance animale, en minimisant les interventions sur les animaux au strict nécessaire. Les animaux seront hébergés sur litières dans des boites en polypropylène, en respectant les normes (dimensions notamment) du bien-être animal et avec, à disposition, des enrichissements appropriés (hamac, igloo, jouets tels que des balles...). Les rats seront seuls par cage afin de limiter les risques d'arrachement du cathéter. L’hébergement en cage à métabolisme plus stressant pour l’animal mais nécessaire à un recueil rigoureux de l’ensemble des urines, sera limité à une période de 8 h par animal.

Choix des espèces

Sur la base de connaissances acquises sur l’Enniatine-B lors d’étude in vitro à partir de matériel biologique relevant des rats Sprague-Dawley, il convient de générer des données in vivo chez cette espèce afin de pouvoir les comparer aux données in vitro pour valider cette extrapolation et pouvoir la poursuivre avec le modèle mathématique. Les rats utilisés seront des rats Sprague-Dawley males d’environ 200-250 g (6-8 semaines). Ce stade a été choisi pour limiter la quantité d’Enniatine-B nécessaire tout en maximisant la possibilité d’obtenir des échantillons sériés de plasma. L’étendue indiquée ici dans leur stade de développement est due aux éventuelles contraintes du fournisseur en charge de la pose chirurgicale de cathéter.

Une partie des 288 souris porte des mutations parmi les plus fréquentes du cancer de la prostate humain, et à 5 mois, après un traitement au tamoxifène à 8 semaines de vie, les souris présentent selon le porteur des lésions précancéreuses et des adénocarcinomes. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : cinq injections intrapéritonéales quotidiennes, une chirurgie de 45 minutes pour implanter une mini-pompe qui diffuse pendant six semaines le composé GC7 ou une solution saline, puis une seconde chirurgie pour la retirer. Le porteur écrit avoir choisi la mini-pompe afin d'"améliorer le bien-être animal en évitant les injections quotidiennes", un choix qui impose deux opérations. Toutes sont tuées par lots, de trois semaines après le début du traitement jusqu'à un mois après sa fin, pour le prélèvement d'échantillons.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier les effets d'inhiber une forme de modification post-traduction de protéine qu'on appelle "hypusination" sur le développement du cancer de la prostate dans un modèle de souris. Nos résultats préliminaires démontrent qu'inhiber cette voie par un composé disponible commercialement bloque la multiplication des cellules cancéreuses de prostate. Afin de valider ces résultats chez la souris, nous traiterons les souris avec ce composé en diffusion continue grâce à l’utilisation de mini-pompes couramment utilisées en expérimentation animale. La diffusion est gérée par la mini-pompe qui envoie durant une période de 6 semaines une concentration régulière du traitement afin de traiter l’animal en continue en maitrisant la dose délivrée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si la voie de l’hypusination est impliquée dans la tumorigenèse du cancer de la prostate. Si c’est le cas, cette étude ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate qui dans ses formes résistantes à la castration possède actuellement un pronostic très sombre pour les patients avec une médiane de survie n'excédant pas 15 mois.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale par jour pendant 5 jours, soit 5 x 1 minutes, puis à une procédure chirurgicale sous inhalation d'isoflurane durant 45 minutes, temps d'implantation de la mini-pompe puis d'une seconde intervention chirurgicale à son retrait. L'administration du composé a lieu en continu pendant 6 semaines. A la fin du traitement, les pompes seront retirées sous anesthésie générale par inhalation d'isoflurane (30 minutes). Aucun prélèvement ne sera fait sur l'animal vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir une éventuelle douleur post-opératoire ou une infection post-opératoire. Cependant, toutes les mesures seront prises pour éviter ces nuisances, avec une prise en charge sous aseptie et une administration systématique d'antalgiques, ainsi que surveillance et réévaluation rapprochée dans les suites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 1 mois après la fin de la procédure. La mise à mort est nécessaire pour le prélèvement des échantillons et leur analyse. Par ailleurs, un temps d'observation de 1 mois est nécessaire pour laisser le temps au composé d'agir et d'avoir un effet sur la croissance des tumeurs, ce qui justifie d'attendre un mois.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

En raison de l'hétérogénéité des tumeurs, et pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, il est nécessaire d'inclure 18 souris par groupe par génotypage et par temps (5 souris pour les analyses histologiques, 8 souris pour les analyses immunophénotypiques et 5 souris pour l'analyse des transcrits soit 2 génotypes x 18 souris x 2 conditions x 4 temps, donc 288 souris. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques. Nous aurons les génotypes des souris contrôle et des souris mutantes, et les 2 conditions eau saline et GC7. Pour évaluer l'effet du composé, nous sacrifirons un lot d'animaux 3 semaines après le début de l'administration, à 6 semaines après le début de l'administration, ce qui correspondra à la fin du traitement, puis 2 semaines plus tard et enfin à 1 mois après la fin du traitement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec protection du cycle veille/éveil par des systèmes de lampes programmées. Une nourriture adaptée aux rongeurs ainsi que des biberons d'eau seront disponible à volonté. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’implantation de la pompe avec surveillance des points de suture et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, de la buprénorphine sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Enfin, il a été fait le choix de l'implantation des mini-pompes afin d'améliorer le bien-être animal en évitant les injections quotidiennes en intra-péritonéales du composé qui peuvent causer des nuisances. La surveillance générale sera visuelle, avec un suivi de l'aspect global de l'animal, sa posture et son comportement. Si l'animal presente un dos voute, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave (blessure importante par exemple), l'animal sera mis à mort immédiatement. De la naissance à la mort et afin de favoriser le bien-être animal, les groupes sociaux des animaux seront respectés et aucun animal ne sera laissé seul. Nous mettrons aussi dans chaque case de la cellulose afin que les souris puissent se constituer un nid. Une nourriture enrichie sous forme de nourriture gelifiée sera mise dans les cages durant toute la durée du traitement par mini-pompe afin de favoriser une bonne alimentation des animaux.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le cancer prostatique humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de cancer de la prostate afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux seront injectés au Tamoxifène à 8 semaines de vie, puis les mini-pompes seront implantées 3 mois plus tard, soit à 5 mois de vie. A ce stade, les souris présentent des lésions prénéoplasiques et des adénocarcinomes. Pour évaluer l'effet du composé, nous sacrifirons un lot d'animaux 3 semaines après le début de l'administration, puis un lot à 6 semaines après le début de l'administration, ce qui correspondra à la fin du traitement, puis 2 semaines plus tard et enfin à 1 mois après la fin du traitement.

168 760 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des imageries répétées, des régimes riches en graisses, des injections, des chocs thermiques, des clips de nageoire pour génotypage et le criblage de nombreuses molécules, pour caractériser la calcification cardiovasculaire, une partie étant issue de lignées à "phénotype nocif". Le porteur indique n'attendre aucune souffrance modérée ou grave mais avoir déclaré ce niveau par précaution, et précise qu'aucune analgésie ne peut être mise en place. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro et ex vivo restent biaisés et que l'animal demeure "crucial".

Objectifs

La calcification cardiovasculaire (CCV) est une anomalie pouvant toucher différents tissus tels que les valves cardiaques, le myocarde ou les vaisseaux sanguins. La calcification vasculaire, qui inclut les pathologies de calcification de l’artère coronaire, touche 90% des hommes et 67% des femmes de plus de 70 ans. Malgré l’incidence mondiale de ces maladies, les traitements sont très limités, ce qui conduit à des taux de morbidité et mortalité élevés pour ces pathologies. De plus, les mécanismes exacts conduisant à la CCV restent mal définis, limitant la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons le modèle poisson zèbre pour clarifier les mécanismes de la CCV et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques en nous appuyant (i) sur la facilité d’imagerie in vivo (ii) les possibilités de criblage haut débit (test de centaines de molécules sur les poissons présentant une CCV) et (iii) la conservation entre mammifères et poissons zèbres de la plupart des voies impliquées dans les systèmes cardiovasculaires et osseux (facilitant ainsi la translation des données générées chez les poissons zèbres vers les patients). Pour cela, nous caractériserons la dynamique cellulaire et les interactions au niveau moléculaire à travers différentes voies et signalisations, ainsi que l'impact fonctionnel de la calcification in vivo chez des mutants de poisson zèbre présentant des phénotypes de calcification cardiovasculaire. Cette caractérisation permettra l'établissement de nouveaux modèles génétiques de calcification cardiovasculaire, qui pourraient être utilisés dans la recherche de nouvelles thérapies pour bloquer ou inverser la calcification cardiovasculaire, ayant un impact considérable sur la population européenne, gravement touchée par ces maladies.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectifs d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la calcification cardiovasculaire puis de tester différentes thérapeutiques pour réduire les taux de morbidité et mortalité associés à cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1. Microscopie d'imagerie en direct avec coloration in vivo pour les tissus calcifiés : -45 minutes de coloration et de lavage de l'excès de teinture - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 30 jours (maximum) - Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l'animal à cette procédure au maximum 7 fois (5, 8, 12, 15, 20, 25 et 30 dpf) dans les 30 jours. 2. Échocardiographie : - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 60 jours (maximum) - Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l'animal à cette procédure au maximum 4 fois (60, 90 et >90 dpf) à partir de 60 dpf. 3. Alimentation avec des régimes riches en graisses et occidentaux - 5 minutes par tétée (2 à 3 tétées par jour) - Expérience de 90 jours - les animaux seront nourris ces jours-ci pendant une partie ou la totalité de cette période 3. Traitements médicamenteux, y compris pour l'ablation de populations cellulaires spécifiques Les médicaments seront administrés par l'eau ou par injection intrapéritonéale. - Injection intrapéritonéale avec un temps d'anesthésie inférieur à 5 minutes. - Les poissons seront maintenus en traitement médicamenteux pendant une durée maximale de 15 jours et seront analysés à différentes étapes. L'administration du médicament se fera en doses uniques ou répétées en fonction de la durée de vie du médicament et des périodes d'absorption. 4. Choc thermique local - Moins de 1 minute pour le choc thermique - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 90 jours (maximum) - Dans la mesure du possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. 5. Clip d'aileron pour le génotypage - Moins de 1 minute par clip d'aileron - Les poissons seront maintenus isolés pendant 3 jours (7 jours max., en cas de problème avec le génotypage/PCR) 6. Maintien de colonies d'animaux génétiquement modifiés établis avec un phénotype nocif Les animaux seront maintenus jusqu'à l'âge adulte et croisés pour une nouvelle progéniture jusqu'à 2 ans après la fécondation.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant impacter le bien être animale sont les risques de malformation squelettique et les dysfonctionnements du système cardiovasculaire. Certaines des lignées génétiques peuvent également présenter une croissance réduite (par rapport aux lignées de type sauvage) sans aucun effet sur les comportements de nage ou d'alimentation. À ce stade, nous ne prévoyons aucune souffrance modérée ou grave. Cependant, nous ne pouvous exclure des effets inattendus sur quelques animaux, c'est pourquoi nous avons déclaré les procédures en modéré et que nous maintiendrons cependant une surveillance constante, en particulier chez les animaux subissant des expériences d'ablation cellulaire et des traitements médicamenteux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe et analyse (histologique, moléculaire)

Remplacement

Notre projet se déroule dans la continuité de tests in vitro. Cependant, ces modèles ne permettent pas de prendre en considération les caractéristiques multifactorielles du scénario in vivo. Des travaux récents ont proposé comme alternative l’utilisation ex vivo d’aorte de souris ou de rat. Là encore, les résultats peuvent être biaisés par les conditions de culture, la rigidité de la matrice extracellulaire, régulant artificiellement les capacités des cellules cardiovasculaires à se différencier en lignée ostéoblastique. L'utilisation de modèles animaux reste donc cruciale.

Réduction

La variabilité interindividuelle, particulièrement importante chez les jeunes poissons zèbres (stades larvaires), justifie l'exigence d'un plus grand nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique minimale pour valider les résultats. De plus, la calcification cardiovasculaire est un phénotype progressif et très variable, nécessitant donc un plus grand nombre d'animaux pour un résultat robuste. Néanmoins, comme chaque fond génétique peut être plus ou moins variable, nous réaliserons nos expériences en plusieurs tours pour augmenter notre n de manière progressive et éviter d'utiliser des animaux en excès si la puissance statistique est atteinte avec un n inférieur. Par conséquent, le nombre d'animaux demandé est le plus grand nombre d'animaux que nous pouvons utiliser. La calcification cardiovasculaire étant un processus très dynamique et hétérogène, nous proposons d'utiliser et de générer un grand nombre de lignées génétiques pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires contribuant à établir et aggraver le phénotype de calcification. En utilisant des approches d'imagerie en direct, nous pourrons suivre les mêmes animaux et voir la progression individuelle de la calcification, réduisant ainsi le nombre d'animaux généralement utilisés pour caractériser et quantifier les échantillons post-mortem et les coupes histologiques de tissus.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des aquariums de différentes tailles avec les densités d’hébergement suivantes : - Pour les bacs de 3,5l : 1 à 20 animaux - Pour les bacs de 8l : 20 à 40 animaux Le système contrôle la température (27-29°C), la conductivité (500-600 uS)et le pH (7-8)de l’eau. Le cycle lumineux est de 14h jour pour 10h nuit. L’enrichissement est assuré par les courants d’eau dans les aquariums ainsi que par l’ajout de nourriture vivante (artémias). Les aquariums sont bleus et permettant ainsi de maintenir un éclairage adapté. Les accouplements sont réalisés dans des aquariums dédiés mimant les conditions naturelles d’accouplement. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel hautement qualifié dans la détection d’anomalie du poisson zèbre. Des points limites seront fixés de manière à détecter précocement tout signe de souffrance et à prendre toutes les mesures nécessaires à la réduire. Lorsqu’une immobilisation des poissons sera nécessaire, une anesthésie générale sera réalisée. Au vu des procédures et des phénotypes attendus, aucune analgésie ne peut être mise en place.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un organisme modèle avec des caractéristiques de développement dès son stade embryonnaire (la transparence des embryons et des larves jusqu'à plusieurs semaines après la fécondation) qui permettent des techniques d'imagerie qui ne sont pas possibles avec d'autres modèles de vertébrés. Sa petite taille qui facilite son hébergement et sa manipulation, et son nombre élevé de descendants, idéal pour les études à haut débit, sont d'autres atouts de ce modèle. De plus, les techniques et outils de transgenèse et de mutation dans cet organisme modèle sont très développés, donnant la possibilité de différentes méthodes pour des études spécifiques des gènes et voies de signalisations. De plus, la forte homologie constatée entre le poisson zèbre et les mammifères est également un point fort de cet organisme. L’extraordinaire capacité de régénération tissulaire que possède le poisson zèbre tout au long de sa vie en fait un organisme ayant un grand intérêt d’un point de vue translationnel. Pour notre projet, la possibilité d'acquérir des images en temps réel à différents stades de développement, ainsi que celle de cibler des cellules spécifiques avec des techniques d'ablation génétique, font du poisson zèbre l'organisme idéal pour l'expérimentation nécessaire au bon déroulé de ce projet. Nous étudierons l'établissement de la calcification cardiovasculaire au cours du développement et à l'âge adulte pour comparer l'apparition précoce et tardive de la maladie. Pour cela, nous nous intéresserons aux stades larvaire et juvénile (5, 8, 12, 15, 20, 25, 30 et 60 dpf) montrant les différents stades clés du développement cardiovasculaire ainsi qu'aux stades adultes (90 et >90 dpf ) où l'on peut observer un tissu adulte sain et malade chez les jeunes adultes (90 dpf) et chez les animaux âgés (>90 dpf).