Procédures modérées

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées de nitroglycérine, une tous les deux jours pendant neuf jours, pour reproduire une migraine chronique et une hypersensibilité douloureuse au toucher appelée allodynie, avant d'être anesthésiés et mis à mort pour prélever leurs tissus nerveux. Le porteur étudie l'implication des astrocytes et annonce un intérêt "fondamental" doublé d'une possible piste thérapeutique contre la migraine humaine. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace ce protocole car la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux.

Objectifs

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades. L’allodynie correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à une inflammation.En temps normal, les informations tactiles et douloureuses n’aboutissent pas au même niveau de la moelle épinière ou du tronc cérébral, les deux modalités sensorielles (tact et douleur) sont donc normalement séparées. En conditions pathologiques, par exemple lors d’une allodynie, l’information tactile devient capable d’activer des neurones nociceptifs, grâce à un circuit qui implique plusieurs cellules. Le tact va alors devenir douleur (allodynie mécanique). Ce processus va provoquer l'activation de plusieurs populations neuronales et implique également une population spécifique de cellules gliales, les astrocytes. Cependant, peu de choses sont connues sur ces cellules et leur implication dans le déclenchement de l’allodynie .L’objectif de ce projet va consister à étudier l’implication des astrocytes et plus précisément des canaux potassiques astrocytaires dans un modèle de migraine chronique .Ce projet combinera des études comportementales et d’expression protéique. Il présente donc un intérêt fondamental, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les douleurs pathologiques chez l’homme.

Bénéfices attendus

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques.

Procédures

Les injections intra péritonéales (fréquence: 1 injection tous les 2j pendant 9j/ durée: 30s) et les perfusions (fréquence: 1/ durée 30min) seront réalisées par du personnel formé et compétent, sous la responsabilité des membres de la Structure du Bien Etre Animal.

Impact sur les animaux

Les résultats obtenus des travaux des autres laboratoires avec ce modèle de migraine chronique ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux autre que la développement d'une allodynie. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.

Devenir

A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une quantification protéique ou une analyse immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de Nitroglycérine.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales et moléculaires est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux par groupe: habituation, injection,comportement, prélèvements et préparation des échantillons. C'est un modèle que le laboratoire veut mettre en place, donc, pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05. Les groupes non stimulés (NS) seront réalisés en priorité; si les résultats obtenus sont significatifs, nous ne réaliserons pas les groupes stimulés (St).

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats seront préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, en cas d’injection d’un produit inflammatoire au niveau de la lèvre supérieure droite ou de la patte, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. Lors des enregistrements électrophysiologiques, un contrôle de la température et cardiorespiratoire est réalisé sur l'animal. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie. Si au cours de l’expérimentation, l’animal a de grosses difficultés à se déplacer, se relever pour se nourrir, l’animal sera euthanasié par dose létale de pentobarbital.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 7-10 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire.

170 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur prélève un morceau de nageoire caudale sous anesthésie pour génotypage, puis on les isole jusqu'à trois jours, dans le but de créer des lignées génétiquement modifiées rendant fluorescentes des vésicules extracellulaires. Le porteur indique que les poissons sont réutilisés pour maintenir la lignée et gardés en vie jusqu'à leur an et demi, avant d'être mis à mort. Il conclut qu'aucune méthode de remplacement in vitro n'est possible parce que le projet repose sur la modification du génome d'un organisme vivant.

Objectifs

Les vésicules extracellulaires sont des petites particules qui sont sécrétées naturellement pas les cellules de l’organisme. Bien que ces vésicules semblent intervenir dans un grand nombre de mécanismes physiopathologiques, leur caractérisation dans des organismes vivants est encore très limitée, notamment du fait de leur petite taille, ce qui entrave leur utilisation en tant que marqueur ou véhicule thérapeutique. Pour permettre cette caractérisation, l’utilisation du poisson zèbre apparait comme un modèle prometteur du fait de son développement rapide et en dehors de leur mère, mais également de sa transparence au stade embryonnaire, qui rendent possible la visualisation de ces vésicules en temps réel chez l’animal vivant. Notre projet aura pour but de générer différentes lignées de poissons zèbres qui exprimeront un marqueur de ces vésicules qui sera fluorescent, jouant ainsi le rôle d'une étiquette, ce qui permettra de visualiser directement ces vésicules dans les différents tissus de notre choix (muscles, vaisseaux sanguins, neurones...) puis de les suivre dans tout l'organisme. Nous réaliserons la sélection des individus présentant l’étiquette fluorescente dans le tissu d’intérêt et par technique de génotypage, respectivement. Ces nouvelles lignées permettront ensuite de caractériser les propriétés biologiques et fonctionnelles de ces vésicules chez l’animal, pour chacun des tissus choisis.

Bénéfices attendus

La création de ces nouvelles lignées contribuera à une meilleure compréhension de la biologie des vésicules extracellulaires chez l’animal et fournira des données importantes sur leur potentiel thérapeutique.

Procédures

Prélèvement de morceau de nageoire caudale, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes. Isolement pour génotypage, en une fois, pendant 3 jours maximum.

Impact sur les animaux

Lors de ce projet, les nuisances attendues seront le stress de l’anesthésie, la douleur liée au prélèvement pour le génotypage.

Devenir

Les animaux seront réutilisés à la fin de la procédure pour maintenir la lignée et donc perpétuer les futures générations. Cependant, les animaux seront gardés en vie jusqu’à leur un an et demi, après cela, ils seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet repose sur la création de nouvelles lignées de poissons zèbres dont le génome sera modifié pour l’étude du comportement des vésicules extracellulaires en temps réel chez un organisme vivant. En ce sens, aucune méthode de remplacement in vitro n’est possible pour cette question.

Réduction

Selon des tests statistiques, nous avons réduit le nombre de poissons à 10 de manière à toujours avoir 90% de chance d’obtenir des différences significatives. Nous estimons que des groupes de 10 animaux seront suffisants pour la durée de ce projet, bien que la morbidité et viabilité de ces nouvelles lignées de poissons restent encore inconnues.

Raffinement

Afin d’améliorer la qualité de vie des animaux, un enrichissement de milieu sera mis en place, notamment par l’utilisation d’un fond imagé lors des accouplements, mais également par l’approvisionnement en plancton une fois par jour, en fonction de la production en plancton au sein de l’animalerie. De la même manière, afin de limiter la souffrance et/ou stress de l’animal lors du génotypage, un analgésique (lidocaïne) et un anesthésique (benzocaïne) seront utilisés. Un système d’hébergement spécifique au génotypage sera également mis en place et relié au système aquatique, de manière, à ce que les poissons soient séparés les uns des autres mais qu’ils puissent se voir au travers de parois transparentes. Enfin, le temps d’isolement sera le plus court possible, c’est-à-dire le temps de la réalisation des techniques de génotypage.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle animal où son développement rapide et en dehors de leur mère permet de réaliser facilement des manipulations génétiques pour l’obtention de lignées dont le génome a été modifié. Du fait de la transparence des embryons, l’observation des organes internes à l’échelle de l’organisme entier est facilitée. Cette caractéristique ainsi que la taille de ce modèle sont un grand avantage pour la visualisation des vésicules extracellulaires (notamment dans les fluides biologiques) et de leur interaction avec des tissus récepteurs. Les poissons seront utilisés jusqu’à leur un an et demi de manière à pouvoir vérifier le génotype de ces poissons, à partir de leur deuxième mois, lorsqu’ils auront une taille suffisamment grande ; mais également pour perpétuer les lignées dont le génome a été modifié, par reproduction sexuée.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intra-péritonéale d'un composé qui enflamme le péritoine et un prélèvement sanguin, avant d'être mises à mort pour prélever leurs organes et caractériser leur système immunitaire. Le projet répond à des prestations pour des laboratoires privés et publics qui veulent mesurer l'effet de modifications génétiques sur la réponse immunitaire. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune méthode substitutive ne placerait dans des conditions physiologiques similaires, le modèle devant selon lui être évalué à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact d’une inflammation sur le système immunitaire suite à la modification de gènes cibles. L’objectif de ce projet est d’évaluer la réponse immunitaire après l’induction d’une inflammation temporaire dans le péritoine de souris contrôles ou d’animaux génétiquement modifiés. Nous caractériserons les différentes populations du système immunitaire des organes de ces souris afin de déterminer l’impact de la modification génétique sur la réponse immunitaire suite à l’inflammation. Les cohortes de souris génétiquement modifiées que nous caractériserons seront produites indifféremment par notre animalerie ou des laboratoires partenaires extérieurs. Les animaux contrôles pourront quant à eux provenir également d’un fournisseur extérieur agréé. Le présent projet ne concerne que les étapes d’induction de l’inflammation et de caractérisation fonctionnelle des populations du système immunitaire après réception des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet est mis en oeuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative la capacité d’un modèle murin à répondre à une inflammation.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’injection unique d’un réactif provoquant l’inflammation du péritoine. Cette injection est rapide et dure moins d’une minute par animal. Le jour de la mise à mort des animaux pour l’étude du système immunitaire, un unique prélèvement sanguin est réalisé pour quantifier l’état inflammatoire des souris et pour la récolte du plasma sanguin. Le prélèvement sanguin sera réalisé dans le respect du bien-être animal et ne dure que 30 secondes. Les souris seront ensuite mises à mort pour le prélèvement des organes en vue de de la caractérisation des populations du système immunitaire.

Impact sur les animaux

L’induction de l’inflammation du péritoine par injection intra-péritonéale de composé inflammatoire engendre un phénotype modéré chez la souris pendant les premières 24H, se traduisant par un ralentissement de l’activité des animaux. Au-delà de ces premières 24H, un retour à la normale est observé avec une reprise d’activité des animaux. Pour les animaux génétiquement modifiés étudiés, la sévérité du phénotype est évaluée pendant toute la procédure et comparée à celle des animaux contrôles. La non reprise d’une activité normale à 24H entraînera une observation particulière, bi-journalière des animaux pour les 3 jours suivants selon une grille de score et des points limites préétablis. De plus, le prélèvement sanguin avant la mise à mort des animaux pourra engendrer un stress de courte durée. Tous les actes techniques seront réalisés par du personnel technique formé et expert dans le respect du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’experience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 5 animaux par génotype et par lot expérimental. Trois lots sont quantifiés et comparés, correspondants aux différents temps après induction de l’inflammation : soit 4 jours après inflammation, soit 1 jour après ou soit sans inflammation. Il faudra donc 30 souris au total par expérience (15 animaux par génotype) pour permettre une évaluation complète de l’ensemble du recrutement des populations myéloïdes suite à l’inflammation.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier, que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des injections et la surveillance journalière des animaux en expérimentation est assurée par du personnel de zootechnie formé et qualifié.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles. Nous avons en effet à notre disposition un grand nombre d'anticorps marqués par une grande variété de fluorochromes permettant un phénotype du système immunitaire à très haut contenu. Nous utiliserons des souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.

Chaque souris reçoit sous anesthésie une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, puis, une fois la tumeur développée, une injection intraveineuse de nanoparticules lipidiques porteuses d'un ARNm de luciférase, une injection de luciférine dans l'abdomen et une séance d'imagerie. Les 625 souris, dépourvues de thymus pour faciliter la prise des tumeurs, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont mises à mort après l'imagerie pour un prélèvement d'organes. L'équipe veut savoir si ses vecteurs concentrent les nanoparticules dans les tumeurs en limitant leur accumulation dans les autres tissus, et le porteur cite parmi les effets possibles des chocs anaphylactiques, des détresses cardio-respiratoires et la gêne due à la tumeur, mesurée deux fois par semaine. Il ne nomme pas les lignées tumorales et ne fixe aucun volume tumoral maximal.

Objectifs

Ce projet est centré sur l'adressage sélectif de nanoparticules lipidiques vectorisés (LNP-V) vers des tumeurs afin d’en améliorer leur diagnostic/traitement. L’imagerie par bioluminescence permet la détection et la quantification/accumulation in vivo de conjugués ou de cellules développées pour présenter une activité bioluminescente. L'objectif principal de ce projet est donc d’utiliser cette technique pour étudier les effets de l'utilisation de différents vecteurs sur la biodistribution et l'accumulation plus spécifique dans les tumeurs de LNP-V en limitant leur accumulation non spécifique dans les autres tissus. En effet un ARNm codant pour l'enzyme luciferase sera encapsulée dans les LNP-V et servira de read out de l'accumulation des différents LNP-V dans les tumeurs.

Bénéfices attendus

L'utilisation de nanoparticules lipidiques vectorisées (LNP-V) permets de protéger la molécule thérapeutique de la dégradation et de permettre une distribution plus spécifique. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Chaque souris sera implantée avec un modèle de cellules tumorales par une injection en sous cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié. Après croissance tumorale, les souris recevront une injection par i.v. de nanoparticules lipidiques (LNP) vectorisées (V) contenant un ARNm codant pour la luciférase (protéine émettant de la lumière en présence de son substrat la luciférine), en solution isotonique stérile, sous anesthésie gazeuse. Vingt-quatre heures après, pour induire la bioluminescence, une injection intrapéritonéale de luciférine sera réalisée sous anesthésie, juste avant l’imagerie. Les imageries bioluminescentes dureront environ 10-15min et les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant la totalité de l'acquisition.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous-cutanées (réalisé une seule fois) sous anesthésie, les injections en i.v. des molécules (réalisé une fois) et en i.p du susbtrat Luciferine (réalisé une fois) sous anesthesie, ainsi que le développement de la tumeur primaire chez l’animal en tant que pathologie. Ce developpement de la tumeur en sous cutanée peut entrainer une gène physique, avec de possibles grattages et demangeaisons. Les animaux seront soumis à la mesure bi-hebdomadaire des volumes tumoraux. La pousse de la tumeur peut eventuellement entrainer chez l'animal une gêne physique au déplacement ou à la toilette par exemple. Les LNP-V peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des troubles comportementaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure d'imagerie les animaux seront mis à mort et certains organes seront prelevés afin de valider ex vivo la biodistribtuion des LNP-V.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos LNP-V ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice. L'utilisation de rongeurs (ici, n= 125 souris/an) impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations et cahier des charges.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le nombre total de souris pour cette étude s'élève à 625 souris. Il tient compte du suivi des modèles expérimentaux développés dans le projet et de la variabilité de développement des tumeurs qu’il peut exister dans les différents modèles. L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux répartis sur des études necessitants 25 souris chacune sera de 625 souris décomposé en 5 études de 25 individus/an sur 5 ans. Ce nombre sera suffisant pour appréhender la détection et l'accumulation de nos molécules dans les tumeurs. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Ce nombre d'animaux pour ces procédures nécessaire à l'obtention d'une significativité statistique a été défini en déterminant le test statistique et l'effet biologique et la dispersion escomptés.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien, personne dument qualifiée, pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Dès leur arrivées les souris sont placées dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et alternance d'enrichissement, dômes, tubes, fibres pour faire des nids. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale) réalisera les injections des cellules tumorales qui se feront sous anesthésie gazeuse (Sévoflurane). Une observation bi-hebdomadaire des animaux par les expérimentateurs (poids, douleurs/souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs, en plus de leur observation quaotidienne par les animaliers. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie ou au cours du developpement tumoral constituera un point limite. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de deux fournisseurs extérieurs.

Choix des espèces

- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique (sans thymus) comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection du candidat imagerie) en fonction de la taille des tumeurs.

150 cochons et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins, des anesthésies générales et des chirurgies thoraciques avec pose d'implants et examens d'imagerie, avant leur mise à mort pour une nécropsie et un examen des tissus, afin d'évaluer des dispositifs pour les affections pulmonaires et thoraciques. Le porteur présente le recours à l'animal comme une obligation réglementaire et "incontournable". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou numérique n'est adapté et que l'expérimentation sur "organisme entier" est indispensable.

Objectifs

La chirurgie des structures thoraciques (cage thoracique, plèvre, médiastin et organes du thorax) et le traitement des affections pulmonaires et bronchiques (comme les tumeurs et les suites de cancers, les greffes, les sténoses,) se sont considérablement développés au XXe siècle avec le développement de technologies comme la vidéo endoscopie/thoracoscopie thérapeutique, de techniques chirurgicales peu invasives assistées ou non par la robotique, ou le développement de dispositifs médicaux implantables comme les stents. Il est dorénavant possible d’opérer avec une réduction importante du traumatisme tissulaire. Le développement et l’évaluation de nouveaux dispositifs, molécules, techniques pour le diagnostic et le traitement des affections du thorax, des organes thoraciques et des poumons par des méthodes/dispositifs/tissus et molécules, par des techniques de chirurgie mini-invasives, demandent une phase de recherche/développement préalable. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Les différentes itérations de prototypes doivent être confrontées au modèle animal en reproduisant fidèlement le contexte clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire visé pour les futures applications humaines. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés du projet sont : - Une amélioration de la sécurité et/ou de l'efficacité des implants, dispositifs et techniques évalués. - Une amélioration de la durabilité des implants (permettant par exemple d’éviter le rejet de ceux-ci et les réopérations parfois multiples des patients), la réduction de l'invasivité du geste chirurgical et des temps opératoires (permettant par exemple la réduction du traumatisme tissulaire et du risque infectieux secondaires, corollaires de ces interventions) sont d'autres bénéfices attendus du projet. - Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients, une amélioration des capacités diagnostiques de la pathologie visée peut également être obtenue.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites postopératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients represente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et leur durabilité. Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro ou numérique adapté pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être de tous les stades de développement : juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme. Les animaux utilisés pourront être des : juvéniles ou des adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme, de l'enfant à l'adulte de grande taille.

195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes d'un candidat médicament, puis sont soumises à des tests de mémoire dont un test d'évitement passif où un stimulus aversif est appliqué à leurs pattes, avant leur mise à mort pour analyser leur cerveau, afin de préciser l'action d'une molécule contre la maladie d'Alzheimer développée par une société. Le porteur situe les retombées avant un éventuel développement clinique. Il affirme que le modèle murin reste "indispensable" pour ces réponses comportementales.

Objectifs

Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer est aujourd’hui une priorité, notamment parce que les médicaments disponibles s'avèrent d'effet limité et présentent de nombreux effets secondaires invalidants. Suite à au faible niveau de service rendu au patient, les 4 médicaments commercialisés dans la maladie d'Alzheimer ont fait l'objet d'un déremboursement par la sécurité sociale en France. Une société Montpelliéraine développe donc une nouvelle molécule, qui s'avère, dans les modèles animaux précliniques de la maladie, très efficace, plus anti-inflammatoire, sans effet secondaire sur la mémoire et de plus longue durée d'action que les médicaments actuels. Pour préciser la nature de son activité pharmacologique, deux expériences de comportement sont aujourd'hui nécessaires : l'une pour analyser ses effets directs sur la mémorisation, l'autre pour confirmer son action pharmacologique particulière sur un système neuronal particulier.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de préciser les effets pharmacologiques in vivo d'un candidat médicament et apporter des informations importantes avant le développement clinique de cette molécule de nouvelle génération potentiellement efficace pour modifier de façon durable le décours de la maladie, car neuroprotectrice.

Procédures

Les animaux recevront une injection intrapéritonéale (moins d'une minute) des molécules à tester pendant 6 jours lors de l'expérience 1 et pendant de 1 à 12 jours pendant l'expérience 2. Suite au traitement les capacités de mémorisation des animaux seront testées, avec des tests comportementaux qui dure 15 secondes pour le test d'évitement et pour la préférence de place, deux fois 30 minutes pour le conditionnement et 10 minutes pour l'analyse.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ces deux expériences subiront deux types de stress modéré : une ou deux injections intrapéritonéales quotidiennes. Pour l'expérience 1 reposant sur un test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme, un stimulus aversif sera administré au niveau des pattes de la souris. Les animaux ont la possibilité de remonter sur la plate-forme pour échapper au stimulus. . Pour l'expérience 2, les animaux sont placés dans une boite à 2 compartiments pendant une session de 30 minutes par jour durant la phase de conditionnement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure et les cerveaux prélevés pour des analyses biochimiques ultérieures.

Remplacement

La molécule est ici testée sur des réponses comportementales spécifiques (phases de mémorisation, dépendance d'état chimique pour le test de préférence de place) au moyen de tests standardisés et très prédictifs. Par exemple, l'ensemble des phases de la mémorisation (acquisition, consolidation, rappel, extinction, reactivation) sera examiné en une seule procédure comportementale au moyen du test d'évitement passif. Les gammes de doses testées seront réduites à 3-4 doses autour des effets anti-amnésiants déjà déterminés dans les études précédentes. L’utilisation du modèle murin reste par ailleurs indispensable car il permet de préciser des réponses comportementales très proches de celles observées chez l'homme.

Réduction

Les molécules sont administrées dans une gamme de doses réduite (généralement 0.3 - 1 - 3 mg/Kg en fonction des résultats antérieurs). Les animaux sont testés sur des tests comportementaux adaptés au paramètre à mesurer (mémoire à long terme non-spatiale pour l'évitement passif et dépendance d'état chimique pour le conditionnement préférentiel de place). Les analyses statistiques sont optimisées aux données générées de façon à limiter le nombre d'animaux par groupe (15 souris/groupe). Ce nombre de 15 souris par groupe a été déterminé de façon empirique mais a été depuis confirmé en analysant nos données antérieures à l'aide de logiciel statistiques.

Raffinement

Les animaux seront reçu une semaine avant le début de l'expérimentation et gardés en groupe de 8-10 individus par grande cage. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Les traitements pharmacologiques envisagés ont déjà été utilisés et ne sont pas à l’origine de douleur visible ou de détresse. Un examen quotidien sera fait et un formulaire de suivi du bien-être sera complété. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur.

Choix des espèces

Le modèle souris est adapté aux protocoles comportementaux et utilisé dans les expériences antéreiures. Les doses et mode d'administration sont donc connus. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines. C'est à cet âge que les effets de la molécules ont été caractérisé dans les phase antérieures du projet.

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, des séances d'irradiation localisée et des injections répétées d'immunothérapie, avant leur mise à mort pour analyser les tumeurs, afin d'étudier l'association d'une radiothérapie à faible dose et d'une immunothérapie. Le porteur renvoie au conditionnel d'éventuels bénéfices pour les patients réfractaires à l'immunothérapie. Il présente cette association comme une "source d'espoirs" contre les cancers métastatiques.

Objectifs

Il y a trois objetifs. 1) Evaluer l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie délivrée à faible dose en combinaison avec une immunothérapie en utilisant un modèle préclinique de lignée tumorale murine greffée chez des souris immunocompétentes. 2) Etudier les mécanismes par lesquels la radiothérapie à faible-dose est capable d'induire une réponse immunitaire anti-tumorale potentialisée par l'immunothérapie et ainsi expliquer l'effet synergique du traitement associant radiothérapie à faible dose et immunothérapie. 3) Déterminer le rôle des macrophages dans l'efficacité de la combinaison thérapeutique associant radiothérapie faible dose et immunothérapie.

Bénéfices attendus

Malgré une amélioration sans précédent du pronostic de nombreux cancers grace à l'immunothérapie, de trop nombreux patients présentent une réponse insuffisante à ces nouvelles thérapies. L'optimisation et la compréhension des traitements combinés associant une radiothérapie à faible dose et une immunothérapie pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie et présentant un cancer à un stade avancé inaccessible à une radiothérapie standard qui serait trop toxique pour les organes et tissus sains adjacents. Dans ce cadre, la mise au point du meilleur schéma de radiothérapie faible dose à utiliser en combinaison à l'immunothérapie, ainsi que la compréhension des mécanismes à l'origine de l'efficacité d'une telle association doivent être recherchés sur modèle animal préclinique avant une transposition au patient.

Procédures

Irradiation sur la tumeur uniquement : 1 à 2 séances d'environ 1 minute chacune. Injections sous-cutanées de cellules tumorales: 1 seule injection, 1 minute. Injections intra-péritonéales d'immunothérapie ou d'IgG contrôle : 1 injection d'une minute tous les 3 jours pendant un total de 9 jours, soit 4 injections au total. Injections intra-tumorales : 1 minute, 1 injection unique/souris

Impact sur les animaux

Ils sont liées aux injections en intrapéritonéales ou sous-cutanées sous anesthésie locale, aux injection intra-tumorales après anesthésie gazeuse et aux séances d'irradiations localisées. Les séances d'irradiation seront effectuées sur la tumeur uniquement grâce à des caches adaptés, le risque de dommages aux tissus et organes sains adjacents est donc très limité. Aucun effet indésirable de ces irradiations localisées n'est donc à prévoir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses de laboratoire sur les tumeurs prélevées.

Remplacement

Le cancer est aujourd’hui la 1ère cause de décès chez l’homme et la 2ème chez la femme en France. Malgré la révolution thérapeutique que constitue l’immunothérapie, seul un nombre limité de patients présente une réponse tumorale significative aux inhibiteurs de checkpoints immunitaires utilisés seuls. Un nombre croissant de données suggère que de faibles doses de radiothérapie délivrées sur la tumeur pourraient augmenter la réponse anti-tumorale induite par l’immunothérapie, le tout avec un excellent profil de tolérance. La compréhension des mécanismes soutenant cette stratégie d’association est source d’espoirs pour de nombreux patients atteints de cancers métastatiques présentant une réponse insuffisante à l’immunothérapie et un pronostic réservé. Le recours à un modèle animal est nécessaire car les interactions entre radiothérapie, immunothérapie, tumeur et système immunitaire de l'hôte font appel à des processus cellulaires et moléculaires complexes impossibles à reproduire de façon fiable sur des modèles alternatifs. De plus, l’étude de l’efficacité de l’association entre radiothérapie à faible dose et immunothérapie sur une tumeur constituée ne peut se vérifier que sur un modèle in-vivo.

Réduction

Nous allons tester plusieurs schémas d’irradiation à faible dose délivrés en 1 ou 2 séances, associés ou non à une immunothérapie anti PD-L1. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaire, nous avons réalisé une analyse statistique à priori à l’aide du logiciel GPower, version 3.1. Afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, nous avons choisi le test ANOVA avec les paramètres suivants : effect size f = 0.25 ; puissance = 0.9 ; risque d’erreur α = 0.05. En considérant un total de 48 lots, nous avons besoin de 25 souris par lot, soit 1200 souris au total : 1) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 1 fraction associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée). 2) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 2 fractions associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle) 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul) 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée). 3) Influence des macrophages sur l'efficacité de la combinaison thérapeutique associant radiothérapie faible dose et anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec anti PD-L1 + injection intra-tumorale de PBS, 1 lot non-irradié avec anti PD-L1 et injection intra-tumorale de clodronate, 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) + injection intra-tumorale de PBS, 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) + injection intra-tumorale de clodronate. Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible, une analyse statistique a été effectuée a priori. Celle-ci a estimé le nombre de souris nécessaire à 1200.

Raffinement

Des stratégies d’expérimentation et d’observation visant à réduire au minimum la souffrance des animaux ont été instaurées. Dans ce cadre, les administrations d’immunothérapie s’effectueront sous anesthésie locale pour réduire le risque de stress et de douleur. L'administration intra-tumorale de clodronate sera effectuée après anesthésie gazeuse à l'isoflurane 3%. Par ailleurs, les souris seront hébergées en groupe, avec nourriture et eau ad libitum, ainsi qu’un environnement enrichi en coton et nids en carton pour respecter leur bien-être. Une surveillance du poids et du volume tumoral sera effectuée régulièrement. Le respect des points limites et d’un volume tumoral limite seront strictement observés.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, utilisée dans la quasi-totalité des études dans ce domaine. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues, ce qui facilite le transfert en clinique des résultats acquis lors des expérimentations précliniques dans cette espèce. Les animaux seront utilisés entre l’âge de 8 et 10 semaines bien après sevrage, âge à partir duquel les souris peuvent supporter les rayonnements ionisants.

350 miniporcs génétiquement modifiés vont être utilisés, une partie tuée pour des prélèvements terminaux et environ 125 réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats médicaments par voie intraveineuse ou sous-cutanée de façon répétée sur deux mois, avec des prélèvements de fluides et de tissus, pour évaluer la pharmacocinétique et la sécurité de ces molécules avant leur première administration humaine. Le porteur décrit un modèle au système immunitaire "plus proche de l'Homme". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

Un médicament n’est mis sur le marché et rendu disponible aux patients qu’après une longue phase de Recherche et de Développement. Le défi majeur pour la recherche biomédicale est de découvrir de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux tolérés. Actuellement, de nouveaux besoins et enjeux apparaissent concernant des candidats médicaments biothérapeutiques dans la recherche contre les maladies cancéreuses, les maladies rares et les maladies immuno-inflammatoires. Ce projet utilise le modèle miniporc génétiquement modifié présentant un système immunitaire fonctionnel plus proche de l’Homme en exprimant des anticorps humanisés. Ces animaux génétiquement modifiés sont plus tolérants aux médicaments biothérapeutiques. Les anticorps dirigés contre le candidat médicament dans les études précliniques peuvent réduire l’exposition des candidats médicaments, réduire leur efficacité et dans certains cas peuvent induire des effets secondaires. L’utilisation de ce modèle permet d’être plus prédictif quant à la formation dans l’organisme d’anticorps dirigés contre le candidat médicament et donc de générer des données précliniques davantage transposables à l’Homme.

Bénéfices attendus

Grâce à l’utilisation du modèle miniporc génétiquement modifié, ce projet permettra de générer des informations essentielles avant la première administration chez l’Homme et de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter plus précocement le développement de molécules ayant un profil non satisfaisant en termes de sécurité, d’efficacité et/ou de pharmacocinétique au regard de l’indication thérapeutique.

Procédures

Les molécules sont administrées aux animaux par différentes voies (principalement intraveineuse et sous-cutanée) de façon unique ou répétée (en général hebdomadaire ou toutes les 2 à 3 semaines) sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements de fluides et/ou tissus biologiques associés à une contrainte légère ou modérée de quelques minutes (en début et fin d’étude) sont nécessaires pour évaluer les effets des candidats médicaments et/ou de leurs métabolites. Leur fréquence et volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie quand ils sont invasifs (entre 15 et 60 minutes). Des mesures, comme par exemple la température corporelle (avec une puce électronique) et le poids (deux fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude.

Impact sur les animaux

Les effets attendus chez les animaux seront limités à une contrainte modérée. Ces contraintes correspondent à celles de l’administration des molécules pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une modification du comportement de l’animal, une baisse de la consommation alimentaire, une perte de poids ou une modification de la température corporelle. Par ailleurs, les prélèvements et examens nécessaires au cours des études peuvent entraîner des nuisances de courte durée (ex : contention, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).

Devenir

Ces études nécessitent souvent des prélèvements terminaux (analyse anatomo-pathologique ou quantification de l’exposition tissulaire des candidats médicaments). C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas ces analyses que certains animaux pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 30-40%.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, modélisation in silico, tests in vitro (cellulaires et organoïdes) ainsi que des données recueillies chez les patients, ce qui permet de limiter le recours à l’animal de laboratoire. Cependant, le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant la complexité des interactions (notamment via le système immunitaire) d’un organisme entier et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Enfin, ce projet permet indirectement de réduire le nombre de primates non humains utilisés dans d’autres projets de Sécurité Préclinique grâce à l’utilisation de ce modèle miniporc.

Raffinement

Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique. La contrainte des prélèvements et administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et training avec distribution systématique de récompenses alimentaires (par exemple, pour certains prélèvements sanguins, mis en hamac après training avec renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et de mettre en place des mesures spécifiques (changement de dose, arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support ou analgésie) par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire en application des points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

​​Le choix de cette espèce est défini par ses similitudes immunologiques à l'Homme qui font du miniporc génétiquement modifié l’espèce appropriée pour générer des données précliniques transposables à l’Homme.​ Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes afin d’évaluer de manière satisfaisante les profils PK, PD, et toxicologiques des candidats médicaments.

4 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit 25 prélèvements sanguins, cinq chirurgies d'implantation et de retrait et seize ponctions lombaires sous anesthésie, avant sa mise à mort pour des analyses de tissus, dans une étude de faisabilité d'une thérapie contre une leucodystrophie infantile. Le porteur présente ces étapes comme requises par les agences réglementaires avant un essai clinique. Il affirme que l'implantation chez le primate est "indispensable" pour préparer ce dossier.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique (MLD) est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (gaine qui isole la fibre nerveuse) isolation de la gaine nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une dégradation très rapide dans les 6 mois suivant les premiers symptômes et un décès des patients dans les deux ans au maximum. De nos jours la majorité des patients atteints de MLD sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités en présymptomatique mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques. Une composante particulière de la MLD est la neuro-inflammation que développent les patients et qui est présente aussi dans le modèle souris de la pathologie. Dans ce contexte, nous proposons de mener le projet de recherche qui a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la pathologie. L’efficacité́ de la thérapie a été évaluée préalablement dans le modèle murin de la pathologie et les résultats préliminaires démontrent des résultats très (approche confidentielle) encourageant. L’objectif ici est de démontrer la faisabilité et la tolérance de notre approche chez le primate non humain (PNH) afin d’évaluer la quantité d’enzyme sécrétée. Le bien-être animal sera surveillé tout au long du projet avec mise en place de critères précis d’interruption.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de leucodystrophie métachromatique (MLD) ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Ce projet a pour but d'identifier une nouvelle voie thérapeutique chez les patients déjà symptomatiques pour la MLD.

Procédures

- prelevement sanguin, durée d'environ 5min (25 au total) - une chirurgie d'implantation et de retrait répétée 5 fois par animal d'une durée maximale de 30 min et -16 ponctions lombaires d'une durée de 5min Tous ces actes sont faits sur animaux anesthésiés. Tous ces actes sont fait sous analgésie et l'animal sera euthanasié en fin de procédure pour réaliser les prélèvements

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont: - un risque anesthésique - un risque infectieux/inflammatoire (type rejet) lors de la mise en place des implants - un risque de fuite de LCR lors des prélèvements - la formation d'hématomes lors des prises de sang - un stress lors de la contention pour anesthésie

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux (n=4) sera euthanasié pour permettre les etudes histologiques et de biodistribution composant l'etude preclinique permettant de supporter une étude de Toxicologie et la soumission aux agences reglementaires (FDA et ANSM).

Remplacement

Toutes les études possibles sur des cellules ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des constructions et des implants et la preuve de concept établiet dans le modèle souris de la pathologie. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de scale-up (efficacité, biodistribution de la protéine d'interet, toxicité, etc) chez le gros animal (PNH). Ces étapes sont requises par l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé pour toute demande d’autorisation d’étude clinique

Réduction

4 animaux au total avec plusieurs implantations par animal afin de tester plusieurs conditions et de selectionner la meilleure avant l’euthanasie pour etude de l’efficacité en post mortem. L'etude statistique etant assez limitée en terme de toxicité. La majeure partie des analyses etant une étude histologique par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté. Enfin, le nombre d'anesthesies est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandation en terme de Bien être animal validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la meme anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie, l'utilisation d'analgésique pour les ponctions lombaires pour eviter tout inconfort. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si necessaire. Si un animal ne presentait pas d'amelioration dans le suivi, il sera euthanasié avec avis vétérinaire Enfin, en termes de raffinement nous avons travaillé sur la taille de notre puce à implanter qui est 10 à 15 fois plus petite que celle de notre étude précédente qui avait été utilisée chez la souris

Choix des espèces

La capacité des implants a secréter de manière efficace de la protéine d'interet qui soit mobilisable par les systèmes nerveux centraux et périphériques est dépendante de l’organisme dans lequel on réalise l’implantation. Ainsi à finalité clinique, l’implantation chez le NHPPNH est une étape indispensable en vue de la préparation d’un dossier d’essai clinique. PNH : macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau completement développé

750 esturgeons européens juvéniles vont être utilisés, maintenus vivants puis relâchés en milieu naturel, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issus de reproduction en bassin, ils sont capturés puis opérés sous anesthésie pour l'implantation chirurgicale d'un émetteur acoustique, afin de suivre par télémétrie leurs déplacements en vue d'une réintroduction de l'espèce. Le porteur situe les bénéfices sur le "long terme", pour la faisabilité de cette réintroduction. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au suivi télémétrique et qu'il est nécessaire de doter chaque individu d'un émetteur.

Objectifs

L'objectif principal de l'étude est de mieux comprendre les fonctionnalités des zones estuariennes et des deltas pour la réintroduction de l'esturgeon européen (Acipenser sturio). Selon les lignes de l'UICN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature) pour les translocations de conservation, une analyse de la qualité de l'habitat et de son utilisation par l’espèce est obligatoire avant que la réintroduction ne puisse commencer. Pour étudier les mouvements de juvéniles d'esturgeons européens marqués, un réseau de suivi des esturgeons comprenant 70 récepteurs a été mis en place. Des recherches télémétriques dans ces zones permettront d'observer la distribution, les voies de migration, et d'identifier les zones d'alimentation et de repos des esturgeons juvéniles.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de cette étude est de renforcer l'évaluation de la faisabilité d'une future réintroduction de l’esturgeon européen dans un bassin versant. Par ce lâcher expérimental et ce suivi individuel à grande échelle par télémétrie, nous visons à identifier les possibilités et les problèmes potentiels pour les juvéniles d'esturgeons européens.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. L'anesthésie ne durera que quelques minutes. Au préalable les animaux sont soumis à une capture dans des bassins d'élevage.

Impact sur les animaux

Les esturgeons juvéniles seront marqués avec de petits émetteurs acoustiques. Ces émetteurs respectent le ratio de 2% du poids du poisson, n'entrainant aucune perturbation dans le comportement. Au fur et à mesure que le poisson grandit, le poids de ce petit émetteur interne sera de moins en moins perceptible par le poisson. Le comportement des individus une fois remis à l'eau pourra être perturbé par le stress du transport de longue durée, et les changements d'eau. L'impact des captures dans les bassins est minime puisque la capture se fait avec l'aide d'un plongeur professionnel qui va chercher les poissons délicatement. La chirurgie est réalisée par du personnel formé, et est faite sous anesthésie en limitant au maximum le stress des poissons.

Devenir

Tous les animaux marqués seront conservés vivants, et relâchés dans le milieu naturel, tel que prévu dans le cadre du Plan National d'Actions pour la sauvegarde de l'esturgeon européen 2020-2029, et plus spécifiquement son volet en lien avec la coopération internationale.

Remplacement

L'esturgeon européen était autrefois naturellement présent sur le bassin concerné. L'espèce est révélatrice d'un système fluvial amélioré en ce qui concerne la qualité de l'habitat et la migration. En raison de la quasi-absence d'esturgeons européens dans le système étudié, les esturgeons issus de ces lâchers expérimentaux fourniront un aperçu du comportement migratoire local, annuel et saisonnier et des zones d'utilisation de l'habitat par l’espèce. A cette fin, une utilisation spécifique est faite du suivi télémétrique des individus dans ce milieu. Il n'y a pas d'alternative disponible pour cela. Il est nécessaire de doter ces individus d'un émetteur ; il s'agit donc d'une expérimentation animale pour laquelle l’espèce-cible ne peut être remplacée.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser ne peut pas être déterminé par des modèles ou des méthodes statistiques existants, car l'étude est menée dans un environnement non contrôlé. Le nombre d'animaux est choisi sur la base de l'expérience pratique et des résultats de la littérature, notamment en termes de mortalités attendues. Les expérimentations précédentes mettent en avant un nombre trés faible de mortalités après lâchers en milieu naturel. L'esturgeon européen est une espèce protégée, il est important de réduire au maximum le nombre d'individus utilisés. 750 individus permettront d'avoir des retours intéressants et permettant de conclure sur les capacités de migration. Le nombre a été établi en lien avec des études précédentes réalisées sur d'autres territoires, et en lien avec la multiplication des connections et des voix de migration. Les reproductions assistées sont complexes à mettre en oeuvre, et le nombre d'individus disponibles ne peut être supérieur en l'état actuel du succès des reproductions assistées.

Raffinement

Basé sur des recherches antérieures, la télémétrie est la méthode de suivi la plus appropriée pour mieux comprendre les routes de migration et les zones d'alimentation et de croissance des espèces en milieu naturel. En ce qui concerne l'animal, on veillera lors de l'implantation chirurgicale de l'émetteur à ce que les poissons aient des poids (ou tailles) minimales afin de respecter le ratio convenu des 2% pour limiter au mieux les problèmes de flottabilité, les biais de comportement et les risques de surmortalités. Le protocole a été établi sur la base des rapports de la littérature et de l'expérience pratique, et garantit que le risque d'altération du bien-être de l’animal dû à l'émetteur implanté est minime. Afin de limiter le stress chez les animaux et de favoriser leur récupération physiologique, les animaux seront marqués à la station d'élevage en France. Avant l'insertion de la marque, les animaux seront placés en phase d'anesthésie profonde (dose chirurgicale). Les animaux seront ensuite observés quotidiennement durant 4 semaines pendant leur récupération.

Choix des espèces

Il s'agit d'une étude d'évaluation de faisabilité pour la réintroduction de l'esturgeon européen dans le delta et estuaire des rivières concernées. C'est pourquoi cette étude est dédiée à cette espèce. Les animaux impliqués dans le projet seront des juvéniles âgés de 6 à 12 mois, issus de reproductions assistées en bassin. L'âge exact des individus sera défini en fonction de leur taux de croissance sur le site d'élevage. Il faudra qu'ils fassent a minima 100g pour pouvoir être marqués avec les marquées définies. A ce stade, les esturgeons européens se déplacent normalement en eau douce et en eau saumâtre ; pourtant, d'autres individus de cet âge sont déjà tolérants au sel et se déplaceront vers la mer. Les questions de recherche tiennent compte des déplacements de ces poissons dans la zone d’étude : a) La disponibilité de zones d'eau saumâtre dans le port, pour l'acclimatation des poissons. b) La disponibilité des aires d'alimentation dans la zone d'étude