Procédures modérées

164 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une chirurgie crânienne de quatre à six heures avec ouverture d'un volet crânien et implantation d'électrodes, puis des enregistrements répétés pendant le sommeil, certaines étant soumises à un conditionnement associant un lieu à des stimulations électriques de la paupière avant d'être tuées pour localiser les électrodes. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie, d'infection du tissu cérébral et de prostration liée au conditionnement aversif, tout en indiquant que les animaux disposent de zones de repli. Il décrit ces travaux sur la mémoire comme "incontournables" et juge la souris "centrale" faute de modèle in vitro ou invertébré équivalent.

Objectifs

La mémoire est une faculté essentielle qui permet d’acquérir et de stocker des informations pour ensuite adapter un comportement en fonction de l’expérience. De nombreuses études ont montré que les oscillations cérébrales jouent un rôle crucial dans la consolidation de la mémoire pendant le sommeil. Étudier ces mécanismes permet de mieux comprendre le rôle des différents états de vigilance afin de préserver nos capacités cognitives dans un contexte général de réduction du temps de sommeil, mais aussi pour envisager des pistes thérapeutiques aux pathologies telles que l’insomnie chronique. Les techniques standards d’enregistrement de l’activité cérébrale pour l’étude du sommeil sont l’IRM fonctionnelle chez l’homme et les primates non-humains d’une part, et les enregistrements électrophysiologiques dans les modèles rongeurs, d’autre part. Ces deux techniques présentent des inconvénients de taille : l’IRM fonctionnelle est coûteuse et bruyante, tandis que l’électrophysiologie souffre d’une faible résolution. Une nouvelle modalité, l’imagerie ultrasonore fonctionnelle, permet de mesurer les variations de flux sanguin cérébral dans plusieurs régions du cerveau simultanément, avec une bonne résolution spatiotemporelle. Elle est facile à mettre en place, portable et abordable. A ce jour, l’imagerie ultrasonore couplée à l’électrophysiologie est tres prometteuse pour observer finement l’ensemble des régions cérébrales activées lors des processus de consolidation. Les études précédentes en imagerie ultrasonore fonctionnelle ont été réalisées sur des rats vigiles ou pendant le sommeil paradoxal : nous manquons donc de données précises sur le sommeil lent. Or, c’est précisément pendant le sommeil lent que les mécanismes de consolidation mnésique (appelés réactivations) ont été mis en évidence. Les corrélats à grande échelle de ces réactivations n’ont été examinés que chez le singe, d’où la pertinence de ce projet. Le but de ce projet est donc double : 1- imager les réseaux associés aux réactivations à l’échelle du cerveau entier et 2- examiner les dynamiques spatiotemporelles de l’apprentissage aversif/appétitif, qui module fortement ces réactivations. Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes de consolidation de la mémoire sur le plan fondamental, ainsi que le développement de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de pathologies comme le syndrome de stress post-traumatique ou la maladie d’Alzheimer

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes électrophysiologiques impliqués dans la consolidation de la mémoire notamment dans le cas de la mémoire émotionnelle. Ces travaux apparaissent comme incontournables afin de pouvoir améliorer notre compréhension de la dynamique spatiale et temporelle de la consolidation de la mémoire, mais aussi des régions cérébrales associées spécifiquement la mémoire aversive et la mémoire appétitive. Les données acquises dans le cadre de ce projet permettront à court terme de mettre en lumière de nouvelles régions d’intérêt pour l’étude de circuits par des techniques comme l’optogénétique ou l’électrophysiologie et dans le long terme pour l’évaluation de troubles mentaux permettant d'anticiper leur apparition et d'améliorer la prise en charge des patients. Par l'utilisation du modèle rongeur, nous serons donc en mesure de mettre nos résultats en lien avec une littérature fournie et de constituer une nouvelle base de données pour d’autres laboratoires. De plus, l’anatomie du modèle souris étant bien décrite, nous serons en mesure de transposer les résultats de nos travaux non seulement aux patients atteints de troubles mentaux, mais aussi à d'autres espèces animales comme les animaux de production ou domestiques. En effet, les résultats de ces travaux pourront également permettre une meilleure évaluation de l'état émotionnel de l'animal, thématique d'importance croissante dans l'amélioration du bien-être animal.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet subiront une chirurgie sous anesthésie générale comprenant une implantation d’électrodes ainsi qu’un volet crânien, pour une durée moyenne de 4h à 6h. Une période stricte de récupération de 7 jours sera observée au cours de laquelle un suivi et une prise en charge de la douleur post-opératoire sera effectué. A l’issue de cette période, un premier groupe d’animaux ne subira aucun enregistrement réel, mais des enregistrements simulés avec une ‘fausse’ sonde afin d’évaluer les effets du port répété de celle-ci. Un suivi longitudinal permettant d’évaluer visuellement la qualité du volet crânien, la stabilité de l’implant et le comportement de l’animal sera effectué, ainsi qu’un suivi de la douleur. Pour un autre groupe, à l’issue de cette période d’habituation de 2 à 5 jours, les animaux suivront un protocole d’enregistrement de 2h30, pendant leur sommeil directement dans leur cage et du comportement dans un labyrinthe enrichi, ce qui permettra d’établir des cartes d’activations associées au sommeil. La durée maximale de ces enregistrements sera de 8 semaines au total (10 semaines après la chirurgie). Un dernier groupe d’animaux subira à la place un protocole d'association d'un endroit de l’environnement à des stimulations agréables, désagréables ou mixtes. Les stimulations agréables seront des récompenses directes comme de l’eau chocolatée (selon les préférences individuelles). Les stimulations désagréables seront des stimulations électriques calibrées (stimulation électrique bénigne de la paupière) n’occasionnant qu’un inconfort bref et générant un comportement de fuite caractéristique puis de ‘freezing’. Les animaux bénéficieront toujours d’une large zone neutre vers laquelle se réfugier pour ne plus subir de stimulation désagréable. Ils seront ensuite replacés dans leur cage afin d’étudier les réactivations associées à cette expérience. La durée maximale de ces enregistrements sera de 8 semaines au total (10 semaines après la chirurgie). Tous les animaux seront enfin euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes.

Impact sur les animaux

Pour réaliser les travaux de ce projet, il est nécessaire de réaliser des procédures invasives sur les animaux impliquant notamment une procédure chirurgicale. Les autres effets indésirables sont liés au protocole d’enregistrement et à l’isolement des animaux. Cela implique donc un suivi longitudinal soutenu et une évaluation quotidienne de la douleur de l’animal. Les effets indésirables liés à la chirurgie sont, à court terme, liés aux risques per-opératoires (hémorragie, hypovolémie, etc.) et à moyen terme, aux risques de complications post-opératoires et d’infection locale du tissu cérébral. Dans une moindre mesure, le tissu cérébral (bien que protégé) est plus vulnérable aux chocs mécaniques, en l’absence de barrière osseuse au-dessus de la zone d’imagerie. A long terme, les effets indésirables majeurs sont liés au poids et à la taille de l’implant, ainsi qu’au stress mécanique pouvant résulter des chocs répétés contre les parois de la cage. Les effets indésirables liés au protocole d’enregistrement lui-même sont limitées en termes de douleur : le matériel d’enregistrement étant miniaturisé, le poids sur la tête de l’animal est réduit. Cependant, l’utilisation d’un câble, même souple, restreint la liberté de mouvement de l’animal et peut occasionner son enroulement, ce qui augmente l’inconfort de l’animal. La répétition de sessions d’enregistrement quotidiennes peut aussi détériorer la stabilité de l’implant, ce qui peut, à terme, diminuer la qualité des enregistrements et favoriser les risques cités plus-haut. Enfin, le protocole de conditionnement aversif implique d'utiliser des stimulations désagréables (ou très légèrement douloureuses) pour l'animal (nécessaire afin d’étudier la mémoire aversive) ce qui peut modifier le comportement de l’animal sur le long terme et occasionner des comportements telle que la prostration. Ces animaux bénéficieront cependant toujours de larges zones de « repli » dans lesquelles ils ne subiront pas de stimulations.

Devenir

A l'issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes ainsi que les caractéristiques (niveau d'activation, nombre, localisation) des neurones qui ont été réactivés.

Remplacement

Notre objectif est d’étudier les réactivations neuronales à l’échelle du cerveau entier suivant un apprentissage spatial neutre, ou aversif. Ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro, ex vivo ou in silico. Ces études ne peuvent pas non plus être réalisées chez les invertébrés, qui ont une structure cérébrale et un comportement trop simple. De plus nous souhaitons étudier à la fois les réponses électrophysiologiques et vasculaires mais aussi les paramètres physiologiques comme la respiration ou le rythme cardiaque pour pouvoir faire un parallèle avec l’Homme (notamment pendant l’apprentissage). Enfin, les tests comportementaux, mécanismes de la consolidation mnésique et disponibilité des modèles génétiquement modifiés rende le modèle souris central a l’étude de la mémoire. C’est donc le seul modèle réunissant tous ces critères.

Réduction

Afin de minimiser l’utilisation d’animaux dans chacun des groupes, nous améliorerons l’efficacité de la procédure chirurgicale et le suivi longitudinal des animaux. Le nombre d'animaux requis pour ces expériences sera réduit au minimum nécessaire, pour pouvoir réaliser des tests statistiques, à partir de nos résultats. Les comparaisons entre groupes expérimentaux seront réalisées avec des tests paramétriques (student ou Anova). Si les données ne suivent pas une loi normale, nous utiliserons des tests équivalents non-paramétriques (Mann- Whitney, Friedmann). Dans la littérature ainsi que selon nos précédentes publications, le nombre d’animaux requis pour obtenir des résultats significatifs au niveau histologique est de 5 animaux/groupe pour les groupes contrôle et de 15 animaux/groupe pour les groupes test. Étant donné que nos résultats dépendent de l’efficacité des implantations d’électrodes et de la qualité des images obtenues, de l’efficacité de l’apprentissage spatial et de la volonté des souris à explorer l’environnement, nous nous attendons à 50% de succès, pour l’approche histologique, soit un nombre total d’animaux de 10/groupe pour les groupes contrôles et de 30/groupe pour les groupes où une quantification histologique sera effectuée. Pour les études comportementales couplées à l’électrophysiologie, il est cependant préférable de disposer d’au moins 12 animaux/groupe. Pour améliorer l’utilisation des animaux, nous utiliserons des analyses basées sur des réseaux de neurones artificiels qui nécessitent 3 sous-groupes : pour entrainer le réseau de neurones, adapter les hyper- paramètres et pour obtenir les résultats. Il est donc nécessaire de disposer d’un nombre suffisant d’animaux pour chaque sous-groupe (le nombre minimum est de 4), mais la puissance des analyses en sera très fortement augmentée. De plus plusieurs hypothèses sur les modifications des réseaux de neurones pourront être testées sans avoir besoin de refaire des expériences sur de nouvelles souris. En plus des 50% de succès décrits précédemment d’autres facteurs limitant interviennent. L’implantation optimale des électrodes, le maintien de l’intégrité du connecteur et de la fenêtre crânienne diminuent le taux de succès des expériences comportementales de 30% supplémentaires. Les lots d'animaux expérimentaux à prévoir pour la tâche 2 comprendront donc 36 animaux/groupe.

Raffinement

Nos procédures seront optimisées afin de minimiser la douleur et la souffrance des animaux. Les chirurgies se feront en conformité avec la règlementation (anesthésie et analgésie appropriées). Le contact entre l’animal et l’expérimentateur sera facilité par une période d’habitation et de manipulation simple (2 expositions quotidiennes pendant 5 jours) permettant de réduire le stress de l’animal au contact de l’expérimentateur et donc la variabilité des résultats expérimentaux. Les animaux recevront un soin optimal après les chirurgies. Tout au long de leur hébergement, les animaux ont accès dans leur cage à des objets d’enrichissement (dôme, tubes). Le suivi par le personnel de l'animalerie est quotidien dans un contexte général et le suivi post-chirurgie est assuré par l'expérimentateur quotidiennement pendant une semaine avec relevé de signes potentiels de douleur et prise en charge analgésique si nécessaire.

Choix des espèces

Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour l’étude du comportement et de ses bases physiologiques, car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionnelle transposables aux humains. Le modèle souris est en particulier adapté aux études comportementales pour sa rapidité d’adaptation. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle nous avons le plus de données électrophysiologiques préexistantes et pour laquelle l’outil pharmacogénétique et les modèles génétiques sont les plus développés ce qui permettra de faire le lien avec les études existantes et réduire in fine le nombre d’animaux. Nous utiliserons des souris sauvages C57Bl/6. La procédure de fenêtre crânienne et de stéréotaxie nécessite d’utiliser des animaux dont la croissance de l’os du crâne est stabilisée. C’est pourquoi, en accord avec la littérature, nous choisirons un âge compris entre 8 et 10 semaines pour réaliser les implantations d’électrodes. Les enregistrements seront réalisés jusqu’à 4 mois après l’implantation.

112 souris, dont des invalidées pour le gène du récepteur au froid, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant quatre mois un régime riche en sucres et en gras destiné à provoquer prise de poids et dysfonction cardiaque, puis subissent tests d'effort sur tapis, échocardiographie sous anesthésie, tests de tolérance au glucose et à l'insuline et prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour analyser le cœur et des marqueurs inflammatoires. Le porteur indique n'avoir constaté aucun effet indésirable sur seize semaines, tout en attendant une prise de poids importante et un mauvais fonctionnement du cœur. Sur le remplacement, il affirme devoir prouver l'effet protecteur du récepteur dans une étude sur "organisme vivant", les travaux in vitro ayant seulement établi son potentiel.

Objectifs

Le diabète est en pleine expansion dans notre société. Or, le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette dysfonction représente un challenge important pour les chercheurs et les cliniciens afin d’améliorer la qualité de vie des patients. Ce projet vise à comprendre le rôle du récepteur au froid dans l’apparition des complications cardiaques au cours d’un syndrome métabolique. En effet, nos derniers résultats ont montré un lien entre le métabolisme des graisses et le récepteur au froid. Nous avons pu montrer que lorsqu’on diminuait la quantité de récepteur au froid, cela induisait une augmentation des graisses insaturées. Nous pensons que le récepteur au froid pourrait jouer un rôle clé dans la modulation des complications cardiaques de la cardiomyopathie diabétique. Plus précisément nous nous attendons à une meilleure résistance des animaux invalidés au récepteur au froid dans l’apparition des complications cardiaques au cours du syndrome métabolique. La cardiopathie diabétique est la conséquence des altérations de structure et de fonction du tissu cardiaque survenant chez les diabétiques indépendamment des facteurs de risque. Nous allons utiliser un régime riche en sucres et en gras pour mimer cette pathologie, comparé à un régime contrôle. Les symptômes attendus sont une prise de poids importante, une fatigue accrue et un essoufflement plus important à l’effort. Des souris invalidées ou non pour le récepteur au froid seront soumises à un régime riche en sucres et en gras pendant 4 mois. Cette procédure permettra d’évaluer l’effet de l’absence du récepteur au froid sur la fonction contractile sous régime riche en sucres et en gras, par un test d’effort sur tapis de course, une échocardiographie sous anesthésie gazeuse, ainsi que sur le profil diabétique des souris par des tests de tolérance à l’insuline et au glucose et un test de signalisation à l’insuline. L'inflammation dans le sang et dans les tissus sera évaluée après mise à mort des animaux, en mesurant les taux sanguins de marqueurs inflammatoires et l’infiltration des cellules immunitaires (monocytes, neutrophiles et lymphocytes) dans le tissu cardiaque.

Bénéfices attendus

A moyen terme, ce projet nous permettra de comprendre le lien entre le métabolisme des graisses et le récepteur au froid dans la cardiomyopathie diabétique. A plus long terme, ce travail pourrait ainsi proposer l’utilisation des modulateurs pharmacologiques du métabolisme des graisses, ainsi que des substituts pharmacologiques du récepteur au froid, permettant de rétablir une contraction normale cardiaque chez les patients diabétiques.

Procédures

Le protocole dure au total 16 semaines. Toutes les 2 semaines un suivi du poids et de la glycémie sera effectuer sur les souris (prise de la glycémie ~1min). Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline seront effectués à 8 et 16 semaines (durée d’un test : 1h). Deux tests d’endurance seront également effectués à 16 semaines sur tapis de course, avec 5 jours d’intervalle (de repos) entre les deux tests (durée de chaque test : 1h maximum). Une échographie sera effectuée à 16 semaines sous anesthésie (durée anesthésie générale :30min) et un prélèvement de sang de 50uL sera réalisé à la fin de la 24ème semaine de régime (durée : 2mn).

Impact sur les animaux

Comme précisé dans le déroulé du projet, nous nous attendons, en réponse au régime riche en sucres et en gras, à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un dysfonctionnement cardiaque, raison de l’étude. Nous n’avons pas constaté d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (16 semaines). Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) réalisés sous anesthésie générale.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire et cellulaire) des différents organes

Remplacement

Le récepteur au froid dont il est question dans ce projet a été étudié in-vitro depuis de nombreuses années. Ces études ont permis d’établir le potentiel de ce récepteur au froid comme cible thérapeutique. Nous devons désormais prouver que l’implication de ce canal dans la modulation du métabolisme lipidique a un effet protecteur au cours de la cardiomyopathie diabétique, dans une étude physiologique sur organisme vivant.

Réduction

Les effectifs ont été calculés au plus juste pour permettre l’obtention de résultats statistiquement exploitables. En outre, l’expérience et le recul de l’équipe concernant les régimes alimentaires utilisés et les examens prévus, permettent de prévoir un très faible taux de mortalité et d’échec. Par ailleurs, nous utiliserons les souris mâles et femelles pour optimiser les animaux issus de l’élevage. Ceci constitue en outre un effort de réduction à long terme, car les conclusions de ce projet permettront à l’avenir aux utilisateurs de cette lignée de clarifier l’effet du sexe sur la régulation du récepteur au froid au cours de la cardiopathie diabétique

Raffinement

Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisés sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis.

Choix des espèces

Les modèles pathologiques développés chez la souris de cardiopathie diabétique miment très bien les pathologies humaines et permettent l’étude des mécanismes d’intérêt par les modèles génétiquement modifiés (animaux invalidés pour le gène du récepteur au froid). De plus, au sein de notre laboratoire et dans la communauté scientifique, le fond génétique dont il est question dans ce projet est le plus utilisé pour les maladies cardiovasculaires, ce qui supporte notre choix (les animaux transgéniques utilisés dans ce projet ont d’ailleurs été développés sur ce fond génétique). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines lors de la mise en place de la diète pour 4 mois, menant à un âge de 22-24 semaines à l'issue de la procédure. Le fait de réaliser des échographies sur des sujets jeunes va permettre de limiter l’intensité des cônes d’ombres dus aux côtes pendant les examens d’échocardiographie.

242 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles inhalent du styrène ou des isomères du xylène six heures par jour, cinq jours par semaine, pendant une à quatre semaines, et une partie subit une chirurgie du crâne pour implanter un système de contention à vis destiné à mesurer les mouvements oculaires, avant la mise à mort et le prélèvement des oreilles. Le porteur indique que les fortes concentrations peuvent déprimer le système nerveux et provoquer des effets narcotiques et des troubles de l'équilibre. Il présente l'étude comme la validation in vivo d'une toxicité déjà suggérée in vitro, en vue d'un éventuel test de criblage des polluants industriels.

Objectifs

Ce projet vise à étudier la potentielle toxicité de quatre solvants aromatiques présents dans l’industrie, le styrène et les trois isomères du xylène, sur l’organe périphérique de l’équilibre, le vestibule, situé dans l’oreille interne. Il s’agit également de comparer cette potentielle toxicité à celle décrite avec ces solvants sur la cochlée, organe périphérique de l’audition, également situé dans l’oreille interne.

Bénéfices attendus

La toxicité vestibulaire de certains solvants aromatiques a été suggérée précédemment par une étude in vitro. La présente étude permettra de valider (ou d’infirmer) ces informations grâce à une approche in vivo. Si les résultats in vivo confirment les résultats obtenus in vitro, alors ce test pourra potentiellement être proposé comme test de criblage afin d’identifier les polluants industriels susceptibles de perturber l’équilibre des salariés.

Procédures

Les animaux seront exposés par inhalation à différentes doses de styrène ou d’un des 3 isomères du xylène. Cette exposition durera entre une et quatre semaines, à raison de 6 heures / jour, 5 jours par semaine. Afin de déterminer les effets de ces différentes substances sur l’oreille interne, l’audition et l’équilibre des animaux seront testées avant exposition, à la fin de l’exposition puis 4 semaines après. L’audition sera estimée par la mesure des produits de distorsion, une méthode non invasive utilisée pour le dépistage des surdités chez les nouveaux nés. Chez le rat, elle nécessite une anesthésie médicamenteuse légère. L’équilibre sera estimé par des tests comportementaux et par la mesure de la persistance des saccades oculaires après rotation (nystagmus post-rotatoire). Cette dernière mesure demande une contention de la tête, qui nécessite l’implantation à demeure d’un système de contention (pas de vis). Cette chirurgie crânienne est réalisée, une seule fois, 4 semaines avant le début de l’exposition. Chez la moitié des animaux, un prélèvement sanguin à la queue sera réalisé sous anesthésie gazeuse en sortie d’exposition. Au terme des expérimentations, les animaux seront mis à mort et les oreilles prélevées pour observer les dommages causés par les expositions aux solvants.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront opérés afin de recevoir un dispositif de contention pour mesurer les mouvements oculaires. Afin d’éviter les douleurs post-chirurgicales, un antalgique morphinique sera délivré avant de réaliser l’anesthésie. Par ailleurs, il n’est pas exclu, que les animaux recevant une anesthésie par voie générale ou gazeuse, dans le but de réaliser des tests auditifs ou des prélèvements sanguins, ressentent du stress. Néanmoins, celui-ci devrait être mineur car les animaux sont habitués à être manipulés et les gestes sont opérés par du personnel qualifié. Les tests comportementaux, mais également la mise en rotation des animaux lors de la mesure des saccades oculaires, pourraient générer chez les animaux, pendant un court instant, un désagrément se traduisant par des troubles de l’équilibre. Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant 6 heures/jour, 5 jours par semaine durant 4 semaines. Ces concentrations élevées pourront avoir un effet dépresseur sur le système nerveux central et des troubles sensori-moteurs comme des effets narcotiques pourront alors être observés. Néanmoins, ces troubles ne devraient pas persister dans l’heure qui suit la sortie des chambres d’inhalation.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques.

Remplacement

La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études sur l’animal et par des approches épidémiologiques en entreprise. En revanche, les effets de ces substances sur le vestibule (récepteur de l’équilibre), qui se trouve également dans l’oreille interne, n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle de culture de l’organe récepteur, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données in vitro doivent être confirmées par une étude in vivo avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces subtances sur cet organe. La présente étude se propose d’exposer des rates au styrène et aux différents isomères du xylène par inhalation. L’évaluation de la toxicité se fera par des mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui permettront de comparer de manière objective les effets toxiques sur la cochlée et sur le vestibule. Des analyses histologiques seront également réalisées post mortem. Cette étude évalue donc la fonction de deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être appliquées que sur des organismes vivants. D’autre part, pour modéliser la toxicité de ces agents chimiques chez l’Homme, il est nécessaire qu’ils soient métabolisés par des organismes vivants

Réduction

La démarche consiste à tester dans une première phase expérimentale (phase 1) les effets vestibulaires d’une forte concentration de styrène pendant une exposition courte (5 jours). Si celle-ci ne génère pas d’effet vestibulaire, une nouvelle exposition à la même concentration sera réalisée pendant 4 semaines (phase 2). Si aucune vestibulotoxicité n’est observée, la recherche de seuil d’effet (phase 3) ne sera bien évidemment pas réalisée, et les expérimentations seront stoppées. Dans le cas contraire, la phase expérimentale 3 sera menée en exposant les animaux à des concentrations de styrène plus faibles (la durée dépendra des résultats des phases 1 et 2). Enfin, la phase 4 s’attachera à évaluer la vestibulotoxicité de chacun des isomères du xylène (la durée de l’exposition dépendra une nouvelle fois des résultats des phases 1 et 2). Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures des saccades oculaires après rotation ne permettant pas les mesures des produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront prévus. Ainsi pour chaque solvant et concentration, 2 groupes expérimentaux seront prévus, l’un pour la mesure des saccades oculaires après rotation et l’autre pour les mesures de comportement suivies des mesures des produits de distorsion acoustique (idem pour les contrôles). Lors de chaque campagne, un maximum de conditions expérimentales seront testées simultanément afin de limiter le nombre de groupes contrôles associés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance (logiciel G-Power). Le résultat de ce calcul est de 10 animaux par groupe. 22 animaux surnuméraires (soit 10% de l’effectif prévu) seront nécessaires en cas de mortalités (anesthésie, perte de casques...). L’étude nécessitera au maximum 242 rates (dont les 22 surnuméraires). Ce nombre pourrait être réduit si les résultats des phases 1 et 2 sont négatifs.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les rates seront placées dans les conditions standard d’hébergement pour cette espèce (température, hygrométrie). Aucune expérimentation ne sera réalisée lors de la première semaine afin de laisser le temps aux rates de s’habituer à leur nouvel environnement. Par ailleurs, les rates, animaux nocturnes, seront placées en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h afin de réaliser les expérimentations pendant leur phase d’activité. Elles seront stabulées à 2 ou 3 par cage pour permettre les liens sociaux de s’établir. Les animaux seront habitués à être manipulés en amont des expérimentations. Les animaux soumis à une intervention chirurgicale recevront une médication adaptée à savoir une analgésie pré-opératoire avant de réaliser l’anesthésie et des anti-inflammatoires seront administrés en post-opératoire. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance ou une perte de poids trop importante nécessitant une prise de décision immédiate. Ils seront hébergés en cage individuelle pendant deux semaines afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose et leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton ou du « sizzle nest » pour constituer des nids. Pendant les phases d’exposition par inhalation aux solvants, les rates seront également surveillées toutes les deux heures afin de déceler d’éventuels signes cliniques traduisant un mal-être de l’animal qui nécessiterait d’isoler immédiatement l’animal. Des fiches de suivi seront renseignées à cet effet.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle recommandé pour les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Des femelles ont été choisies pour réaliser les expérimentations car celles-ci grossissent moins avec l’âge que les rats mâles et le dispositif pour enregistrer le mouvement oculaire après mise en rotation de l’animal ne permet pas de faire ces mesures sur des animaux de plus de 300 g. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les enzymes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.

7 020 animaux non-humains, 5 460 souris et 1 560 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les modèles, ils subissent une ligature chirurgicale du canal biliaire, des injections répétées de tétrachlorure de carbone ou d'autres composés, puis des traitements par de multiples voies pouvant aller jusqu'à deux administrations par jour, pour reproduire des maladies chroniques du foie. Le porteur affirme que ces maladies ne sont pas associées à une douleur chez l'humain et n'en attend donc pas chez l'animal, malgré l'induction d'inflammation et de fibrose hépatiques. Il conclut au caractère de "stricte nécessité" du modèle animal, jugé irremplaçable pour examiner l'"animal entier".

Objectifs

Les maladies hépatiques cholestatiques chroniques regroupent 2 formes majeurs chez l’adulte : la cholangite biliaire primitive (PBC) et la cholangite sclérosante primitive (PSC). Ce sont toutes les 2 des maladies rares qui endommagent les canaux biliaires entrainant une accumulation de bile au niveau du foie. Cette accumulation entraine de l’inflammation, de la fibrose et peut éventuellement mener à la cirrhose du foie et à une insuffisance hépatique. Concernant la PBC, seuls les canaux intra-hépatiques sont touchés alors que ce sont les canaux intra- et extra-hépatiques qui sont impactés par la PSC. Ces maladies sont asymptomatiques au stade précoce puis les personnes atteintes peuvent présenter un état de fatigue, du prurit, la jaunisse et un inconfort abdominal. L’estimation de la survie moyenne à partir du diagnostic de la maladie est de 15 à 20 ans. A ce jour, il n’existe qu’un seul traitement capable de traiter la PBC et approuvé par les autorités américaines: l’acide ursodesoxycholique (UCDA). Malheureusement, plus de 40% des patients traités n’y répondent pas et nécessitent l’ajout d’un traitement de 2eme intention (comme l’acide obéticholique) engendrant beaucoup de toxicité et d’effets secondaires. De plus, même après une transplantation hépatique de dernier recours, il y a une forte probabilité de récurrence de la maladie. En ce qui concerne la PSC, aucun traitement n’a encore été approuvé et il devient donc urgent de développer de nouveaux médicaments permettant de traiter et d’améliorer la qualité de vie des patients touchés par ces pathologies. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques visant à découvrir ou repositionner des molécules et comprendre les mécanismes qui jouent un rôle dans la survenue et l’évolution de la maladie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie, de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de maladies hépatique cholestatiques chroniques avec la mise en place de modèle animaux reproduisant ces pathologies chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la progression de la maladie et améliorer la qualité de vie des patients atteints par ces pathologies.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans les cholestases chroniques hépatiques. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui ralentiraient la progression de la maladie évaluée par des analyses sanguines (marqueurs enzymatiques, anticorps) ou par analyse histologique (inflammation et fibrose du foie).

Procédures

Tous les animaux des groupes 2 à 7 subiront soit des injections systémiques toutes les 2 semaines de 2OA-BSA et 3 injections d’αGalCer (procédure 1), soit des injections systémiques 2 fois par semaine de tétrachlorure de carbone (procédure 3), soit une ligation du conduit biliaire par méthode chirurgicale (procédure 4) pour induire la pathologie. Les procédure 1 et 3 se feront sur animaux vigiles et de manières répétées tandis que pour la procédure 4, l’induction se fera chirurgicalement de manière unique sur animaux anesthésiés. Les animaux du groupe 1 quant à eux recevront de l’adjuvant de Freund et du sérum physiologique ou de l’huile de maïs ou opéré à blanc selon la procédure correspondante. Les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 1 mois après l'induction du modèle). Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra- péritonéale, sous-cutané, par voie orale, par voie topique sur animal vigile ou par système de mini-pompe osmotique (procédure 5). Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques.

Impact sur les animaux

Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer une maladie hépatique cholestatique chronique associée à une élévation des enzymes hépatiques et des complications aux long terme telle qu’une hypertension portale et des dommages ou de la fibrose du foie. Cette condition n’est habituellement pas associée à une douleur chez l’homme et n’est donc pas non plus attendue chez l’animal. Aucune complication sévère au long terme, ni autres effets indésirables, ne sont attendus aux doses administrées. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

Euthanasie pour récupérer différents organes, dont le foie, pour analyses histologiques ou autre.

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation et la fibrogenèse implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie des cholestases chroniques hépatiques. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation et les dommages hépatiques pouvant mener à la fibrose, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en modèle cellulaire.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude donc une analyse statistique appropriée sera réalisée avec le test des rangs de Kruskal et Wallis (nonparametric Kruskal-Wallis one-way analysis of variance (Dunn’s post test)). Si deux groupes sont comparés, un test t pour séries non appariés (Mann-Whitney) sera réalisé. Une valeur significative sera considérée si p < 0.05.

Raffinement

Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, prélèvement de sang) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque). Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Pour les modèles d’induction par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique qui sera administré en phase pré- et post-opératoire ainsi qu’un analgésique local appliqué lors de la procédure chirurgicale. En dehors de la phase de chirurgie, l’utilisation d’analgésiques n’est pas nécessaire pour les modèles inductibles chimiquement étant donné que ce sont des modèles chroniques à long terme et qu’ils ne sont pas supposé induire de douleur notable chez les animaux. Toutefois, en cas de douleur ou de souffrance importante, un analgésique pourra être employé. Nos études étant basées sur des modèles inflammatoires, les anti-inflammatoires ne sont pas applicables. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 10-15 premiers jours qui suivent l’induction puis de façon bi-hebdomadaire ensuite pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, de par leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de cholestases chroniques en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat SD est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Chez la souris, les souches C57Bl/6, Balb/c et SWISS représentent les souches de choix. Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier du modèle utilisé, des objectifs et des besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés d’au moins 8 semaines au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie abdominale reproduisant une ischémie-reperfusion rénale, plusieurs anesthésies générales, des injections et des prélèvements sanguins, avant la mise à mort pour prélever organes et tissus. Le projet étudie une molécule censée limiter les lésions rénales lors d'une transplantation. Le porteur annonce des atteintes transitoires de la fonction rénale et une perte de poids, et affirme que seul un protocole in vivo reproduit la complexité de ces mécanismes.

Objectifs

La transplantation rénale est le traitement de choix de l’insuffisance rénale terminale. Lors d’une transplantation, les phénomènes liés à l’ischémie-reperfusion (séquence indissociable de la transplantation d’organes solides) sont à l’origine de lésions qui peuvent contribuer au dysfonctionnement et au rejet du greffon. L’ischémie correspond à la phase où l’organe est privé de la circulation sanguine et donc des apports en oxygène et en métabolites (tels que le glucose et le lactate). La reperfusion de l'organe se traduit par la reprise de la circulation sanguine et donc des apports en métabolites et oxygène. Il est nécessaire de développer des thérapies afin de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion, tels que les troubles métaboliques (notamment la dérégulation des voies du métabolisme énergétique dépendantes du glucose et du lactate), et donc d’améliorer la qualité du greffon. Des travaux récents ont montré qu’un traitement avec une molécule thérapeutique, ayant une action sur la régulation du métabolisme du lactate, a permis de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion et ainsi améliorer la qualité du greffon rénal. L’objectif de notre projet est de décrypter le mécanisme d’action, en lien avec le lactate et ses transporteurs, induit par le traitement thérapeutique. Nous proposons de réaliser cette étude dans un modèle d’ischémie reperfusion rénale chez la souris.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes cellulaires et tissulaires mis en jeu par un traitement avec une molécule protectrice des lésions l’ischémie-reperfusion. A plus long terme, ce projet nous permettra d’identifier de nouvelles voies et cibles thérapeutiques permettant de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion et donc d’améliorer notamment les taux de réussite en transplantation rénale. Ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le foie, le cœur, le cerveau. Ces cibles thérapeutiques pourront ensuite être évaluées dans d’autres contextes pathologiques impliquant une ischémie/hypoxie, tels que l’infarctus, l’accident vasculaire ischémique ou la chirurgie vasculaire chez l’homme.

Procédures

Chez les animaux vigiles : 2 à 13 pesées par animal, acte d’une durée de 1 minute. 1 à 5 injections sous-cutanées d’antalgique par animal, acte d’une durée de 1 minute. 2 à 5 anesthésies générales par voie gazeuse par animal, avec : Sur animal sous anesthésie générale par voie gazeuse + anesthésie locale : 1 à 2 injections intraveineuses d’un traceur fluorescent et 1 à 2 poses et retraits d’un capteur cutané de fluorescence par animal, pour analyse de la fonction rénale, acte d’une durée de 2 fois 10 min. 2 prélèvements sanguins par voie intraveineuse par animal, acte d’une durée de moins de 1 minute et 1 injection sous-cutanée de sérum physiologique par animal, acte d’une durée de moins de 1 minute. 1 injection intraveineuse d’une molécule thérapeutique par animal, acte d’une durée de 1 minute. Et sur animal sous anesthésie générale par voie gazeuse + antalgie locale : 1 chirurgie abdominale par animal (au cours de laquelle sera réalisée l'ischémie-reperfusion) avec 2 injections d’anesthésique local par voie dermique, acte d’une durée de 1 heure.

Impact sur les animaux

L’acte de pesée et l’injection sous cutanée d’analgésique sur animal vigile pourront induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un inconfort transitoire au réveil. Suite à la chirurgie et à l’ischémie/reperfusion rénale, les effets indésirables attendus sur les animaux sont : une atteinte partielle de la fonction rénale, une mobilité très légèrement réduite, ainsi qu’une légère perte de poids, ces effets indésirables seront transitoires et ne dureront pas plus de 72h après chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Des prélèvements d’organe et tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

L'étude de l'ischémie-reperfusion in vitro est limitée par l'absence de vascularisation des cellules en culture et l'impossibilité d'étudier les multiples conséquences qui impliquent des interactions entre les différents types cellulaires. A ce jour, il existe des modèles in silico ou in vitro permettant de recréer un rein, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire parfaitement la physiologie rénale notamment associée à une modulation du métabolisme d’un rein vascularisé. Seul un protocole in vivo peut reproduire la complexité des mécanismes physiologiques impliqués lors d’une séquence d’ischémie-reperfusion. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux, défini pour répondre aux objectifs du projet, est réduit au minimum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il s’agit d’un nombre maximum d’animaux qui pourra être réduit; en effet certaines procédures ne seront pas réalisées selon les premiers résultats obtenus. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d'organes/tissus murins afin de mutualiser les échantillons au sein du laboratoire.

Raffinement

Durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse. Pour ce faire, les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Les animaux feront l’objet d’un suivi de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement, cicatrisation) et des « actions » seront mises en place en cas de « problème(s) » observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Les prélèvements sanguins, les injections intraveineuses et les chirurgies seront réalisées en asepsie stricte sous anesthésie générale + anesthésie locale et/ou antalgie sur tapis chauffant, une prise en charge antalgique sera mise en place en post-chirurgie. Durant toute la procédure, les animaux seront manipulés par la même personne afin de diminuer leur stress (personnel compétent et expérimenté à l’expérimentation animale).

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion rénale chez la souris, est un modèle validé et adapté pour répondre aux objectifs du projet. 2) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. La procédure débutera chez des souris mâles âgées d'environ 11 semaines, puis la chirurgie sera réalisée chez des souris âgées d'environ 12 semaines, ce qui correspond à un âge adulte approprié pour l’expérimentation.

180 animaux non-humains, 90 cochons et 90 moutons, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins réguliers, des anesthésies générales et des interventions chirurgicales pouvant durer plusieurs heures pour l'implantation de dispositifs médicaux, avant une autopsie et une analyse des tissus. Le projet évalue des dispositifs et techniques chirurgicales pour la santé gynécologique et obstétricale des femmes. Le porteur qualifie le recours à l'animal vivant d'"indispensable" et d'"incontournable", en le présentant comme une obligation réglementaire pour valider les dispositifs implantables.

Objectifs

La santé de la Femme regroupe l’ensemble des spécialités et domaines de la médecine s’intéressant à diagnostiquer, soigner et guérir les troubles, désordres, pathologies ainsi que leurs suites, comme les affections gynécologiques et de la sphère génitale (organes génitaux internes et externes et appareil suspenseur), les troubles obstétricaux, les dysendocrinies, l’infertilité, les pathologies de la glande mammaire comme le cancer du sein et ses conséquences, ou à assurer le suivi des cycles hormonaux ou de certains états physiologiques comme la grossesse par exemple. Le développement des techniques et méthodes d’imagerie et de chirurgie interventionnelles, l’essor de la thérapie génique et cellulaire ou la découverte et l’amélioration des connaissances vis-à-vis de nouvelles entités pathologiques comme par exemple l’endométriose dont la lutte est une stratégie nationale depuis 2021, permettent d’envisager le développement de nouvelles techniques chirurgicales et dispositifs médicaux implantables pour améliorer la santé des patientes, et parfois aussi celle du fœtus ou du nourrisson. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. L'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs, méthodes et techniques chirugicales en faveur de la santé de la Femme, pour le diagnostic et le traitement des pathologies gynécologiques et obstétricales par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase pré-clinique de recherche et de développement. La réponse tissulaire et les modifications anatomophysiologiques au cours des cycles ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Durant ce projet le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans sa phase initiale, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patientes, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patientes, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patientes, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections par le recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites post-opératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. La réponse tissulaire, les cycles hormonaux et les modifications anatomo-physiologiques correspondantes en particulier durant la grossesse ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patientes représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s'assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de la femme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles. L'atteinte de l’objectif scientifique passe par l'utilisation d'animaux ayant une anatomie et/ou un contexte clinique (création de défect, modèle lésionnel) comparables à ceux observés chez la Femme.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une première chirurgie abdominale avec réveil, puis 24 heures plus tard une seconde chirurgie sans réveil pour prélever un caillot et du sang, avec une exposition de six heures à une hypoxie reproduisant les conditions d'un vol long-courrier. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des douleurs post-opératoires dans les heures suivant le réveil. Il justifie l'animal par l'impossibilité de reproduire in vitro la complexité d'un vaisseau sanguin entier.

Objectifs

Evaluation en préclinique des effets de l’hypoxie sur la thrombose veineuse profonde. L'’intérêt est d'’identifier les acteurs cellulaires et protéiques impliqués dans la formation du thrombus après une exposition à un environnement hypoxique hypobare similaire à un vol d’avion long-courrier (minimum de 4 heures)

Bénéfices attendus

Ce projet d’expérimentation permet de reproduire in vivo la formation d’un thrombus sous l’effet d’une hypoxie hypobare et donc de simuler au mieux les conditions environnementales auxquelles sont exposées les passagers d’un vol long-courrier. Cette approche permettrait d’identifier les acteurs cellulaires par lesquels l'hypoxie joue son rôle pro-thrombotique et donc de révéler à terme de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant être spécifiques pour les personnels de bord et les « grands voyageurs ».

Procédures

Les animaux sont dans un premier temps soumis à une chirurgie abdominale avec réveil. 24 heures après ces mêmes animaux sont soumis à une deuxième chirurgie qui cette fois est sans réveil permettant le prélèvement du thrombus et du sang. Les deux chirurgies ainsi que les prélèvements ne sont réalisés qu'une seule fois par animal. Un groupe d’animaux sera également soumis à du gavage sur 3 jours à raison d’une fois par jour.

Impact sur les animaux

Cette procédure est une procédure avec réveil et nécessite une chirurgie abdominale qui peut engendrer des douleurs post-opératoires les heures suivants le réveil des animaux. Les chirurgies ont une durée de 40 minutes et l'exposition à l'hypoxie hypobare ou normoxie normobare dure 6 heures. Le gavage ainsi que le phénotype bloquant l’activation plaquettaire rendent les chirurgies plus longues d’environ 10 minutes car les animaux ont un risque de saignement plus élevé que la normale.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure après prélèvement sanguin et prélèvement de caillot sanguin.

Remplacement

A ce jour l’étude in vitro des neutrophiles, des plaquettes et des cellules endothéliales ne permet pas à elle seule de reproduire l’intégralité du vaisseau sanguin. De plus, l'induction de l'hypoxie à l'échelle cellulaire ne reproduit pas la complexité des pathologies thrombotiques veineuses auxquelles sont exposés les passagers d’un avion.

Réduction

Dans le cas où une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant l’utilisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d’expérimentations supplémentaires. L’analyse du thrombus et des composés sanguins sera réalisée dans les mêmes animaux afin de respecter la règle des 3R (Reduction).

Raffinement

Les animaux seront utilisés 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie pour leur laisser le temps de s'acclimater. Afin de limiter le stress, les animaux seront transférés 24h avant la chirurgie dans la cage qui les hébergera tout le long de la procédure. Ceci aura pour but de les habituer à leur nouvel habitat et de les acclimater à la prise d'eau gélifiée. Au cours de la chirurgie, les animaux suivants attendront dans une pièce d’hébergement afin de ne pas être perturbé par la chirurgie en cours. Les animaux seront opérés sur un tapis chauffant (37°C) afin de maintenir leur température pendant la chirurgie. Pour améliorer les conditions de réveil, les animaux seront placés sur une bouillotte dans la cage pour les maintenir au chaud. Une surveillance accrue sera réalisée après la chirurgie toute la journée ainsi que pendant l'exposition à l'hypoxie hypobare pour le groupe concerné pour évaluer le bien-être des animaux et détecter rapidement tout signe de souffrance. Une première dose d'anti-douleur sera administrée aux animaux 30 minutes avant la chirurgie et une deuxième dès la fin de la chirurgie. Une troisième dose est injectée à la fin de la journée afin de limiter les douleurs durant la nuit. Le lendemain matin, soit 12 heures après, une dernière injection d'anti-douleur est réalisée avant de placer les souris en normoxie normobare ou en hypoxie hypobare. En cas de signes de souffrances chez un animal une nouvelle injection d'anti-douleurs lui sera administré.

Choix des espèces

Le modèle murin est un excellent modèle de thrombose à la fois artérielle et veineux et reproduit au mieux les mécanismes de thrombose présents chez l'humain. Les animaux seront utilisés entre 5 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire et vasculaire fonctionnel.

775 animaux non-humains, 525 souris et 250 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent de support à des travaux pratiques où des stagiaires s'exercent à la contention, aux injections par plusieurs voies, au gavage et au prélèvement sanguin, non pour produire des connaissances mais pour former de futurs expérimentateurs. Le porteur indique que les animaux sont tués en fin de séance car ils ne peuvent réintégrer l'animalerie, leur statut sanitaire étant jugé dégradé. Il présente cette formation aux "bons gestes" comme une contribution au bien-être des animaux non-humains.

Objectifs

Les formations spécifiques pour les personnes appliquant/concevant des procédures expérimentales sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Ce projet décrit cette partie pratique qui a pour objectif de montrer et d'apprendre les gestes de préhension/contention et les différents modes d'administration et de prélèvement utilisés usuellement chez la souris et le rat.

Bénéfices attendus

Cette formation a pour objectif de former les futurs expérimentateurs. Dans cette formation leur sont enseigné les gestes précis, permettant de réduire au maximum le stress de l’animal. Par la formation aux bons gestes, cette formation participe au bien-être animal et permet la diffusion de gestes techniques précis et maitrisés.

Procédures

Les 2 espèces (souris et rat) auront au maximum 1 préhension / contention et 1 injection maximum par voie choisie (intrapéritonéale, gavage, sous-cutanée, intramusculaire et intraveineuse). Les souris auront un seul prélèvement de sang submandibulaire. Chaque technique dure 5 minutes maximum. Après chaque intervention, les animaux sont remis dans leur cage pour une durée minimale de 10 minutes. NB: Tous les apprenants feront obligatoirement la préhension/contention mais en fonction de l'aisance de chaque groupe, toutes les techniques seront effectuées par les formateurs mais pas obligatoirement par chaque stagiaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur ses animaux peuvent être un stress généré par l’inexpérience des apprenants. Cette hésitation peut être source de stress pour l’animal. Le stress généré n’est cependant que transitoire et de courte durée. Le gavage per-os peut également entrainer un inconfort pour l’animal, il n'y a pas de risque de fausse route les sondes utilisées ont un embout "rond" ou "olive. Le prélèvement submandibulaire peut dans de rare cas entrainer un risque d’hémorragie s’il n’est pas réalisé correctement, dans ce cas le formateur expert évalue la souffrance de l'animal et si necessaire l'animal est mis à mort. Les injections sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire sans administration provoquent une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les animaux ne peuvent être réutilisés pour une prochaine session de travaux pratiques car 2 mois séparent généralement 2 formations, les animaux seront trop gros et difficilement manipulables par les apprenants novices. De plus, on considère que leur statut sanitaire est dégradé du fait de leur sortie de l'animalerie en salle de travaux pratiques ils ne peuvent donc réintégrer l'animalerie. Les animaux sont donc tous mis à mort à la fin de la séance.

Remplacement

L’objectif de cette séance est d’une part de montrer aux stagiaires les bonnes pratiques en terme de contention, d'administrations et de prélèvements, puis de vérifier qu’ils mettent correctement en œuvre ces pratiques. Il est important pour cela, qu’ils soient confrontés à des animaux vivants, tout comme dans les futures procédures expérimentales qu’ils appliqueront. Cela leur permettra aussi d’anticiper les réactions des animaux face aux contentions mais aussi aux injections et prélèvements.

Réduction

525 souris seront utilisées pour ce projet. Par session: 1 souris x 18 apprenant + 3 formateurs = 21 souris La souris étant le modèle rongeur le plus utilisé, il est essentiel que chaque stagiaire puisse manipuler et effectuer toutes les techniques enseignées. 250 rats seront utilisés pour ce projet. Par session: 1 rat x (18 apprenants/2) + 3 formateurs = 10 rats. 1 rat pour 2 stagiaires sera utilisé, les stagiaires expérimenteront la moitié des techniques enseignées. Il y a 5 sessions/ an donc sur 5 ans: 21 souris x 25 = 525 souris et 10 rats x 25 = 250 rats Le nombre d’animaux est choisi pour être réduit au minimum tout en gardant la possibilité à chaque apprenant de pouvoir effectuer les différents gestes techniques. Diminuer ce nombre ne ferait qu’augmenter les nuisances pour chaque animal, ainsi que le stress rendant les contentions plus difficiles et les apprentissages plus complexes.

Raffinement

Les animaux seront commandés pour arriver 1 semaine avant le TP, le temps qu’ils s’acclimatent et se remettent du stress du voyage. Ils seront hébergés en groupe avec nourriture et eau à volonté. Leur cage sera enrichie avec des cachettes et de quoi faire un nid. Une surveillance quotidienne sera assurée par les zootechniciens de l'animalerie. Les mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales seront de limiter le temps d’utilisation de l’animal pour chaque geste technique à 5 minutes maximum qui sera obligatoirement suivi par un replacement dans leur cage de 10 minutes minimum. Durant cette période de « répit », le comportement et l’apparence physique seront évalués (grille de scoring). Tout animal dont le scoring identifiera une douleur importante sera immédiatement mis à mort. Les manipulations se feront sous le contrôle du/des responsables de groupe qui veillera à l’exécution du bon geste pour le bien-être animal ce qui permettra de stopper très rapidement les mauvaises manipulations entrainant une douleur. La préhension des souris, en limitant au maximum la prise par la queue, sera enseignée (utilisation de tunnels et main en coupe).

Choix des espèces

La souris reste le modèle le plus utilisé en recherche (60% des utilisations d’animaux), le rat, bien que moins utilisé (environ 10%) reste néanmoins très utilisé notamment dans le cadre des neurosciences, discipline très représentée au sein des chercheurs du CNRS. Les souris seront utilisées à 7 semaines de manière à n’être pas trop grosses afin de pouvoir entrer facilement dans la boite de contention pour l’IV. Les rats d’un poids de 250g ce qui correspond à 6 semaines et les souris de 7 semaines sont aussi utilisés à cet âge de manière à ne pas rendre trop compliquée la préhension et la contention pour les apprenants.

1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sur un ou deux flancs, puis des traitements par différentes voies, avant un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour tester un anticorps contre un modèle de neuroblastome, un cancer de l'enfant. Le porteur décrit une nécrose tumorale qui peut atteindre la surface et former une plaie s'agrandissant par frottement ou "cannibalisme", tout en la présentant comme un signe d'efficacité. Il justifie l'usage de l'animal par une exigence "réglementaire" de tester le médicament sur deux modèles avant l'humain.

Objectifs

La neurotensine (NTS) est une hormone du tractus gastro-intestinal. Son action est transmise à la cellule par des récepteurs, le plus important étant le récepteur de haute affinité, le NTSR1. Nous avons pu démontrer la contribution de ce couple dans l’agressivité tumorale, par ses actions sur la croissance tumorale avec des effets sur la prolifération cellulaire et l’apoptose, mais aussi sur les processus métastatiques en modifiant la migration, l’invasion et l’adhérence cellulaire. Le récepteur est surexprimé dans les cancers solides. Nous avons montré que l’expression élevée de NTSR1 est un marqueur de mauvais pronostic pour les cancers du poumon, et pour de nombreux autres cancers. La présence du récepteur NTSR1 associé à son ligand la NTS sont également associés à la résistance aux traitements anticancéreux. Nous avons donc cherché à développer des stratégies thérapeutiques pour antagoniser ce couple, afin de faire baisser l’agressivité des tumeurs et sensibiliser les cellules tumorales aux traitements thérapeutiques. Dans le but d’inhiber les effets de la neurotensine, nous avons développé un anticorps neutralisant dirigé contre la forme longue de la NTS, la LF-NTS. Notre stratégie est de diminuer l’activité du NTRS1. La preuve de concept expérimentale a été réalisée dans des modèles de cancer du poumon et du sein. Il nous ait demandé de prouver l’efficacité de notre anticorps sur un autre modèle de cancer avant de mettre en place un essai clinique. Nous avons donc décidé de nous orienter vers une maladie orpheline de l’enfant, le neuroblastome. A l’heure actuelle, les données montrent que 50 % des enfants atteints de ce type de cancer récidivent, et 10 % en survivent. Les points forts qui ont orienté ce choix sont d’une part que le récepteur de la neurotensine et les signalisations oncogéniques associées sont activés de manière permanente lors l’exposition chronique à l’agoniste de la neurotensine. D’autre part, l’étude des données publiques montre clairement un lien significatif entre l’expression de la neurotensine, la gravité de la maladie, la résistance aux traitements et la survie.

Bénéfices attendus

Nous avons établi la preuve de concept de l’efficacité d’un anticorps murin et humain dirigé contre les formes longues de la neurotensine sur la croissance tumorale, invasion métastatique et la réponse aux chimiothérapies. Ces résultats ont été publiés. L’étape suivante est de mettre en place un essai clinique, mais il nous est demandé de prouver l’efficacité de notre anticorps sur un cancer plus rare et au pronostic sombre qui validerait ce que nous avons montré sur d’autres modèles cancéreux (cancer du sein triple négatif, et du poumon non à petites cellules). La règlementation exige que les médicaments destinés à la thérapie humaine soient testés sur des modèles animaux et sur différents cancers. Les tests de l’efficacité thérapeutique de ces anticorps dans un modèle murin sont une étape préalable, nécessaire et obligatoire avant de poursuivre vers les études règlementaires de toxicologie et un essai clinique.

Procédures

Les animaux commerciaux seront acclimatés durant une semaine puis ils seront soumis à une injection sous-cutanée de cellules tumorales sur animal vigile (15 secondes/animal) sur un flanc ou sur les 2 flancs. Après la validation de l’apparition d’une tumeur solide les animaux seront traités avec les molécules thérapeutiques par injection intraveineuse au sinus retro-orbitaire, par injection per os sur animaux vigils 5 jours de suite, et par une injection de notre anticorps thérapeutique à J1, J8 et J15. Enfin, les animaux subiront un prélèvement sanguin terminal unique sous anesthésie profonde (5 minutes) puis seront immédiatement mise à mort sans réveil de l’animal. Le developpement des métastases est possible.

Impact sur les animaux

L’implantation des cellules tumorales sur le flan de l’animal provoque le développement d’une tumeur solide. Les tumeurs ne sont à priori pas innervées et elles n’entrainent donc pas de douleur en tant que telle. En revanche la taille de la tumeur peut provoquer des difficultés de déplacement des souris surtout si après l’implantation en sous-cutanée la tumeur se développe dans le creux de la patte postérieure. Ce phénomène arrive parfois, il n’est pas contrôlable. L’efficacité de la thérapie que nous développons se traduit par une réduction de la taille tumorale, ralentissement de la pousse, mais aussi par une possible nécrose plus ou moins importante qui démarre au centre de la tumeur. Ce phénomène de nécrose peut atteindre la surface de la tumeur et provoquer une plaie. Cette plaie peut s’agrandir soit par frottement soit par cannibalisme. Dès l’apparition d’un point de nécrose, nous appliquons des soins adaptés. Cependant, plus le traitement est efficace plus la nécrose va se développer à l’intérieure de la tumeur. C'est un phénomène inévitable que nous prenons en compte pour évaluer l’efficacité de la thérapie.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.

Remplacement

Nous avons établi la preuve de concept de l’efficacité d’un anticorps murin et humain dirigé contre les formes longues de la neurotensine sur la croissance tumorale, invasion métastatique et la réponse aux chimiothérapies. Ces résultats ont été publiés. L’étape suivante est de mettre en place un essai clinique, mais il nous est demandé de prouver l’efficacité de notre anticorps sur un cancer plus rare et au pronostic sombre qui validerait ce que nous avons montré sur d’autres modèles cancéreux (cancer du sein triple négatif, et du poumon non à petites cellules). La règlementation exige que les médicaments destinés à la thérapie humaine soient testés sur des modèles animaux et sur différents cancers. Les tests de l’efficacité thérapeutique de ces anticorps dans un modèle murin sont une étape préalable, nécessaire et obligatoire avant de poursuivre vers les études règlementaires de toxicologie et un essai clinique.

Réduction

Nous limitons au minimum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 10 souris pour chaque groupe expérimental est prévu afin de pouvoir réaliser des études statistiques. Un total de 796 souris, qui a été défini par une approche statistique, sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. Les 3 phases de ce projet se dérouleront séquentiellement à partir du moment où la phase précédente est validée. Phase 2 sera mise en place si la phase 1 est validée. Phase 3 sera mise en place après la sélection des lignées cellulaires en phase 2. La phase 4 sera réalisée qu’après la validation de la phase 3.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bienêtre animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bienêtre des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites adaptés) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Dans ce projet, l’administration des traitements devrait apporter un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression tumorale. De plus, l’ensemble des gestes techniques qui sont réalisés sur animal vigile sont pratiqués par des personnes formées et expérimentées avec du matériel adapté permettant de réduire significativement les nuisances liées aux actes techniques.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le choix de l’espèce est justifié à travers différents aspect : - La physiologie de la souris qui est un mammifère comme l’Homme ; - La possibilité de recréer un modèle de neuroblastome - Une espèce couramment utilisée et reconnue en oncologie - Un modèle ayant permis de déterminer l’importance du protocole d’administration, l’influence du volume tumoral et la toxicité des traitements - La réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant administration chez l’humain. Description du ou des modèle(s) : La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche NMRI Nude-Foxnu afin de faciliter la greffe et le développement de cellules d’origine humaine. Selon la fiche research models de la souche NMRI-Foxn1nu/nu proposée par le fournisseur, le poids des animaux se stabilise entre 28 et 35 jours d’âge. Ce stade de développement est couramment utilisé et validé par la communauté scientifique. Description de l’identification : L’identification par bague est privilégiée, car la plus pratique pour identifier les souris. Elle sera réalisée au cours de la semaine d’adaptation. En cas de perte les animaux seront bagués de nouveau ou à défaut des marquages au feutre de couleur des queues pourront également être réalisées pour sécuriser l’identification.

30 agames des colons, une espèce de lézard, vont être capturés dans la nature et tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste un gel d'euthanasie à base de tricaïne appliqué dans la bouche, avec deux prélèvements sanguins et une observation des signes de souffrance pendant la mise à mort. Le porteur qualifie ces lézards d'espèce exotique envahissante menaçant la biodiversité locale et présente la méthode comme visant une mort rapide et "sans souffrance". Il indique que la capture induit un stress conséquent et que les reptiles sont des êtres sentients capables de ressentir douleur et détresse.

Objectifs

L’Agame des colons a été introduit vers 1995, par voie maritime. Son expansion à travers le territoire concerné a fait l’objet de plusieurs suivis qui ont montré sa forte capacité de colonisation, à la fois de façon naturelle et anthropique via le transport de matériaux. Ce lézard imposant et au régime alimentaire très opportuniste représente une menace forte pour les geckos verts endémique . Il fait l’objet d’un plan de lutte. Ce projet vise à mobiliser les différents acteurs pour mettre en œuvre la lutte contre cette espèce afin de limiter son invasion et de freiner les fronts de colonisation vers des zones d’intérêt écologique majeur. Des essais sur 3 différentes méthodes de lutte contre l’Agame des colons ont été testées : tir a carabine, sarbacane et pièges à colle. Le tir à la carabine est très efficace, mais son utilisation est très limitée. La sarbacane n'est pas aussi efficace que le tir, mais elle est plus largement applicable. Les pièges à colle se sont révélés être un outil très efficace s'ils sont utilisés de manière active.Le piégeage vivant nécessite l'euthanasie des agames capturés. La mise à mort des individus capturés se fait manuellement de manière rapide par percussion de la boîte crânienne, ou avec l’application orale d’une crème à base de lidocaine. Cette dernière méthode a été largement utilisée pour l'euthanasie de petits lézards auparavant, et s'est avérée efficace sur l'Agame des colons. Un désavantage majeur est la nécessité d'une prescription médicale, empêchant une large application de cette crème par les professionnels travaillant contre les nuisibles.Dans l'euthanasie des reptiles, l’utilisation de la tricaïne est couramment utilisé et injecté dans la cavité abdominale. Les injections sous-cutanées sont cependant sujettes à des erreurs si elles sont pratiquées par des personnes non formées. Il est donc nécessaire de développer un produit qui soit aussi facile à appliquer que la crème et qui ne nécessite pas de compétences médicales avancées. La crème est appliquée dans la bouche et ingérée par l'Agame, ce qui entraîne une perte de conscience rapide et la mort.L'objectif de ce projet est de développer un gel contenant de la tricaïne comme substance active.

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice à court terme attendu sera pour les animaux, et plus spécifiquement les Agames des colons de l’île de la Réunion. En développant une méthode d’euthanasie non invasive, nous pourrions induire une mort rapide, sans souffrance, sans douleur et avec le minimum de stress possible. Dans le cadre de lutte contre les espèces invasives, cette méthode pourrait être déployer à d’autres espèces de reptiles. Le deuxième bénéfice, à moyen terme, sera pour la biodiversité locale, extrêmement menacée par la présence d’espèces exotiques envahissantes (EEE) dont l’Agame des colons. Il est aujourd’hui établi que la présence des EEE est la deuxième cause d’appauvrissement de la biodiversité dans les milieux insulaires. Le troisième bénéfice, à plus long terme, serait pour les reptiles type lézards de façon générale, avec une technique d’euthanasie validée et reconnu qui pourrait être utilisé dans la sphère de soins vétérinaires : cliniques vétérinaires, centres de soins, parc zoologiques.

Procédures

Les animaux subiront un prélèvement sanguin au moment de la capture. Un deuxième prélèvement est prévu, mais sur l'animal anesthésié juste avant l'euthanasie. Chaque prélèvement durera moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront tout effet indésirable lié à la capture ou à la procédure d’euthanasie. Notre étude porte sur des animaux capturés dans la nature. Les reptiles sont des êtres sentients, capables de ressentir la douleur, la souffrance et la détresse. De ce fait, toute procédure de capture induira un stress conséquent sur les animaux. Celui-ci ne devrait pas être long puisque la procédure de capture sera chronométrée pour ne pas dépasser un temps maximum de 24h. Au moment de l’administration du produit (procédure d’euthanasie), les animaux pourraient présenter une agitation anormale pouvant générer des blessures potentielles. De la même façon cet effet ne devrait pas durer car les animaux seront surveillés de près durant toute la durée de la procédure et ne pourra pas excéder 10 minutes.

Devenir

Notre objectif est d'évaluer une méthode innovante d'euthanasie, tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Les méthodes non animales ne peuvent pas être utilisées pour répondre à notre objectif scientifique. Nous avons besoin d’un animal vivant, et particulièrement d’un Agame des colons, pour répondre à notre objectif et évaluer notre méthode d’euthanasie.

Réduction

Pour notre étude nous avons choisi d’utiliser des lots de 15 individus pour chaque condition (crème commerciale à base de lidocaïne et gel artisanal à base de tricaïne). Il s’agit d’un nombre minimum pour s’assurer de l’efficacité de la technique en prenant en compte la variabilité inter-individuelle. Les individus seront tous capturés dans la nature, de ce fait cette variabilité est importante et nécessite d’avoir des groupes conséquents. L’agame des colons est une espèce exotique envahissante qui présente un plan de lutte au niveau territoriale.

Raffinement

Tous les individus seront capturés dans la nature et seront de ce fait exposés à un stress conséquent. Pour y pallier, chaque animal sera placé dans un sac individuel en coton à l’abri de la lumière et de la chaleur. Cet isolement n’excèdera pas 24h, pour limiter toute détresse. Avant la prise orale, le pH du gel sera testé pour s’assurer qu’il n’y ait aucun risque de douleur lors de l’ingestion du produit. Le pH devra alors se situer dans une fenêtre de 3 à 6. Chaque étape de la procédure de capture/euthanasie sera suivie sur des paramètres de bien être animal : rythme cardiaque, rythme respiratoire, cortisolémie, évaluation du reflexe nociceptif, observation de spasmes tétaniques. Ainsi, chaque individu sera observé minutieusement pendant toute la durée de la procédure. En cas d’atteinte d’un point limite, une méthode secondaire d’euthanasie sera utilisée.

Choix des espèces

L’espèce choisie est l’Agame des colons, Agama agama. L’étude porte sur l’utilisation d’une méthode sur cette espèce, dans le cadre d’un programme de lutte, c’est pour cela qu’elle a été choisie. Les individus inclus dans ce projet seront des juvéniles et des adultes principalement. Nous ne souhaitons pas sélectionner car la méthode d’euthanasie développée concernera tous les Agames des colons, quelque soit leurs stades de développement. Les animaux seront des mâles et des femelles. Nous ne souhaitons pas sélectionner car la méthode d’euthanasie développée concernera tous les Agames des colons, quelque soit leurs sexes.

20 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, on perce l'os du crâne avec une aiguille pour injecter de l'insuline dans les ventricules cérébraux, puis les cerveaux sont prélevés 24 heures plus tard, afin d'étudier la neurogenèse chez l'adulte. Le porteur décrit une procédure invasive mais rapide et affirme n'avoir jamais observé de troubles après ce type d'injection. Il conclut que les modèles in vitro n'ont pas la complexité suffisante et justifie ainsi le recours à l'animal.

Objectifs

Le projet consiste à évaluer l'impact de l'injection intracérébroventriculaire d'insuline sur la neurogenèse chez le poisson-zèbre adulte. Bien que la neurogenèse soit un phénomène se produisant principalement au cours du développement du système nerveux, de nombreuses études ont démontré que ce processus pouvait se produire au niveau de certaines régions particulières du cerveau adulte. Les données de la littérature ont montré que la neurogenèse chez l'adulte pouvait être impactée tout au long de la vie par différents facteurs tels que le stress et les dommages cérébraux (accidents vasculaires cérébraux, traumatismes crâniens et maladies neurodégénératives). Dans le cadre de ce projet, nous nous intéressons à la prolifération des cellules souches neurales à la suite d'une injection intracérébroventriculaire d'insuline, en évaluant l'activité proliférative au niveau des niches neurogéniques des poissons zèbres adultes. Notre objectif est de comprendre si la stimulation des voies de l'insuline pourrait permettre d'augmenter la neurogenèse afin de contrecarrer l'effet de certaines maladies impactant négativement la neurogenèse (maladies neurodégératives, diabète, obésité).

Bénéfices attendus

Ce projet participera à une meilleure compréhension du rôle de l'insuline ainsi que des mécanismes au niveau moléculaire qui se mettent en place dans le processus de neurogenèse chez l'adulte. Il pourra permettre d'envisager à termes certaines solutions thérapeutiques visant à maintenir un certain niveau de neurogenèse indispensable à la mémorisation et à l'homéostasie cérébrale.

Procédures

Tous les animaux (n=20) seront soumis à une seule injection (véhicule ou insuline) au niveau des ventricules cérébraux. Il s'agit d'une procédure invasive mais rapide et réalisée sous anesthésie générale. Pour cela, le poisson est anesthésié sous tricaïne (0.02 %), un orifice au niveau de l'os du crâne à la jonction télencéphale/rhombencéphale est réalisé avec une aiguille 30G ½ et une injection intracérébroventriculaire d'insuline (1 à 2 μL) est effectuée au niveau de cet orifice via un micro injecteur. L’ensemble de la procédure dure environ 2 min.

Impact sur les animaux

L'injection, si mal réalisée, peut entrainer des troubles locomoteurs du poisson. Cependant, cette procédure sera réalisée par une personne qualifiée et expérimentée. Lorsque les poissons sont replacés dans de l’eau propre, la récupération est rapide (moins de 30 secondes). Un stress post-anesthésique peut être observé pendant cette période (

Devenir

A la fin de l'expérimentation (24h post-injection), les animaux sont mis à mort et les cerveaux sont prélevés afin de permettre l'étude de la prolifération des cellules souches neurales au niveau des niches neurogéniques.

Remplacement

Les modèles in vitro ne présentent pas une complexité suffisante capable de prendre en considération l'ensemble des signaux intrinsèques et extrinsèques qui se mettent en place. Le modèle animal permet de considérer l'ensemble des processus tels que l'activation de différentes voies de signalisation ainsi que l'activation de différents types cellulaires qui se mettent en place à la suite d'une injection d'insuline au niveau du ventricule.

Réduction

L'expérimentation a été conçue afin d'utiliser le moins d'animaux possible. Les expérimentations seront réalisées sur un nombre total de 20 poissons (10 animaux/groupe). Les données de précédentes études chez le poisson-zèbre au sein du laboratoire ont montré qu’un nombre minimal d’environ 10 poissons/groupe était suffisant afin de s’affranchir de la variabilité inter-individuelle et d’obtenir des résultats statistiquement exploitables.

Raffinement

A la suite de l'injection intracérébroventriculaire, les animaux sont regroupés dans un aquarium avec un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal. La procédure invasive sera réalisée sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu'un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront appliqués et tout signe de souffrance sera étudié afin de prendre les mesures adéquates.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle solidement reconnu pour l’étude de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. Il existe une forte conservation de ces processus au cours de l’évolution. C'est un modèle d’étude de l’immunité, d’oncologie, de réparation cellulaire, de neurogenèse et depuis quelques années, des maladies métaboliques. Il est en effet très utilisé dans l’étude de la plasticité cérébrale puisque les gènes intervenant dans ces processus physiopathologiques sont très conservés chez le poisson-zèbre.