Procédures modérées

76 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée, des injections, l'insertion d'électrodes à aiguille sous la peau avec stimulation électrique, et sont contenues dans un cylindre fermé pendant qu'on leur diffuse des sons jusqu'à 110 décibels. Le porteur décrit plusieurs tests comportementaux, dont un test des capacités de filtrage sensoriel et un test cognitif avec eau acidifiée sur quatre semaines, pour modéliser un syndrome humain rare. Il indique que le comportement des patients ne peut pas être reproduit in vitro.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux (NDD) sont des maladies complexes et hétérogènes présentant des symptômes associés à un développement anormal du cerveau pouvant entraîner plusieurs déficits comportementaux, tels des troubles de l'attention/hyperactivité, les troubles du spectre autistique, une déficience intellectuelle, l'épilepsie ou encore les troubles d'apprentissage. Les NDD englobent plusieurs dysfonctionnements cérébraux développementaux, qui se manifesteront par des troubles neuropsychiatriques ou une altération de la fonction motrice, de l'apprentissage, du langage ou de la communication non verbale avec une grande variabilité et différents degrés de gravité. Des études récentes ont révélé un rôle essentiel du développement cortical embryonnaire dans la physiopathologie des NDD, mais la génétique et les mécanismes sous-jacents sont encore méconnus. En particulier, un gène joue un rôle crucial dans le développement du cerveau. Des mutations sur ce gène entraine l’apparition du syndrome Bosch-Boonstra-Schaaf optic atrophy (BBSOA), qui est une maladie génétique rare, décrite pour la première fois en 2014. Les patients présentent une multitude de symptômes neuronaux et comportementaux, y compris, un retard développemental, une déficience intellectuelle, un trouble du spectre autistique, un trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité, des convulsions, une déficience visuelle et auditive. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les mutations de ce gène peuvent causer le syndrome BBSOA. Certains des symptômes observés chez les patients BBSOA fournissent déjà des indices importants sur le rôle de ce gène dans le développement du cerveau. En outre, des corrélations entre la génétique et le comportement commencent à être caractérisées chez les patients atteints de BBSOA. Néanmoins il est nécessaire d’étudier de façon approfondie des modèles animaux qui permettront de reproduire les mutations génétiques décrites chez l’Homme. Au cours de ce projet nous caractériserons le comportement de 3 lignées de souris présentant des différentes mutations sur ce gène. Cela nous permettra de mieux comprendre comment les mutations contribuent aux différentes anomalies du développement neurologique chez les patients atteints du syndrome BBSOA.

Bénéfices attendus

Les troubles neurologiques du développement sont des maladies neuro-développementales qui impliquent un dysfonctionnement de l’apprentissage, la mémoire, la perception, le langage, la résolution de problèmes et/ou l’interaction sociale. Ces troubles sont principalement d’origine génétique et se manifestent au cours de la petite enfance. Ce projet de recherche expérimentale se focalise sur un gène dont le rôle clé pendant le développement cortical est bien connu et dont plusieurs mutations conduisent au syndrome appelé BBSOA. Les enfants atteints de cette maladie présentent des déficits cognitifs et comportementaux, des crises d’épilepsie au jeune âge et montrent des retards dans l’apprentissage et dans le langage. La majorité des patients (>80%) diagnostiquée présente des troubles du spectre autistique (TSA). Les études récentes à ce sujet ont permis de mettre en évidence des anomalies cérébrales, notamment dans les régions du cerveau impliquées dans le langage et l’abstraction. Pour approfondir la compréhension de l’impact fonctionnel des mutations de ce gène, le projet global vise à mieux caractériser les mécanismes dans le cerveau qui sous-tendent les déficits cognitifs des enfants malades. En particulier, cette étude comportementale qui sera comparée avec celle clinique permettra d’étudier l’impact fonctionnel des mutations du gène dans le contexte des TSA avec le but à long terme de déboucher sur des pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes) - Injection intra-péritonéale d'anesthésique (durée = moins d'une minute) (deux fois). -Etude de la structure de l'oeil par histologie in vivo (durée = 10 minutes). - Mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes), insertion d'électrodes à aiguille + stimulation électrique (0,1 ms, 8mA). Les aiguilles sont insérées à travers la peau de l'animal à une profondeur de 1 à 2 mm. - Injection sous-cutanée d'antidote de l'anesthésique (durée = moins d'une minute). -Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. - Contention des animaux dans un cylindre fermé lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information. Dans ce test des sons de 110 dB pour une durée de 40 msec et d'autres plus faibles (65-70-75-85-90 dB ; durant 10 msec) sont présentés à l'animal. Chaque type de stimulus est présenté 10 fois aléatoirement durant le test. Un intervalle de 20 sec sépare 2 stimuli. Avec 11 types de stimuli présentés 10 fois, une session dure environ 45 min.

Impact sur les animaux

Ce projet comprend une implantationd'une puce d'identification par radiofréquence en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'implantation. Pour le test d'altérations des capacités de filtrage de l’information, l’animal est placé dans un cylindre fermé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude comportementale sera complémentaire d'études in vitro sur des cellules de patients BBSOA porteurs des différentes mutations. Ceci permettra de décrypter les anomalies cellulaires et moléculaires à la base du trouble du développement BBSOA. Néanmoins, la présence d’anomalies comportementales des patients ne pourra pas être reproduite in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux pour mieux comprendre l’impact/ le lien des mutations sur le phénotype neurodéveloppementale.

Réduction

Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, et les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux seulement 2 groupes contrôles seront utilisés pour 3 groupes expérimentaux présentant des mutations.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test, afin de réduire le stress auquel seront exposés les animaux. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. De la même manière lors de l'Electromyographie et de la Tomographie par Cohérence Optique une anesthésie sera faite pour éviter tout stress. Les animaux seront injectés en sous-cutané avec un antagoniste de l'anesthésique après les tests et placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu’à leur réveil. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage d’hébergement et surveillés quotidiennement.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations génétiques chez la souris et modéliser donc une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 6 à 9 semaines. Cet âge a été choisi car le développement du cortex est terminé, mais ce dernier est encore plastique. De plus les systèmes visuels et auditifs sont aussi matures.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent sous anesthésie une chirurgie d'ischémie du membre inférieur par ligature de l'artère fémorale, suivie de la pose d'un stent, pour évaluer un stent recouvert de vésicules biologiques. Le porteur reconnaît une douleur prise en charge par la buprénorphine et un stress lié aux manipulations. Il annonce un dépôt de brevet et renvoie l'essai chez des patients au long terme, jugeant qu'aucune alternative in vitro ne teste le bénéfice global d'un stent.

Objectifs

L'angioplastie et la pose de stents sont les principales approches thérapeutiques pour permettre la revascularisation des artères bouchées qui sont responsables d’AVC ou d’infarctus du myocarde. Les stents disponibles actuellement peuvent entraîner des complications graves chez certains patients et nécessitent souvent une thérapie médicamenteuse anti-agrégante associée afin de limiter les éventuelles complications. Nous proposons de tester des nouveaux stents bioactifs et recouverts de vésicules biologiques ayant déjà montré des propriétés anti-inflammatoires et cardioprotectrices dans des modèles animaux après injection intraveineuse. L’intérêt sera d’amener directement ces vésicules sur le site/artère bouchée via le stent. L’objectif est donc de tester les bénéfices thérapeutiques de ce type de stent dans un modèle expérimental de maladies cardiovasculaires, sur 40 rats, nombre nécessaire afin de conclure de manière statistique sur le bénéfice.

Bénéfices attendus

Ce projet fera l’objet d’un dépôt de brevet auprès de la SATT avant publication des résultats. Au final, ce projet vise à développer des stents actifs « coatés » avec des CD146-EV afin de diminuer les thromboses de stent et les resténoses intra-stent dues à la composante inflammatoire résiduelle de la paroi vasculaire. A plus long terme, nous envisageons de tester les bénéfices de ces nouveaux stents biologiques actifs dans des cohortes de patients recrutés dans les services de cardiologie interventionnelle.

Procédures

Une procédure chirurgicale par animal d'une durée de 40 minutes sous anesthésie générale gazeuse.

Impact sur les animaux

Les animaux devront subir sous anesthésie générale gazeuse, des injections d’analgésie, une chirurgie d'ischémie du membre inférieur par ligature de l'artère fémorale puis seront implantées dans la foulée avec le stent déposé au niveau de l'artère obstruée, avant réveil. Les expérimentations prévues entraînent une douleur qui sera prise en charge par l’administration de buprenorphine. Les animaux pourront également subir une angoisse générée par les manipulations (pesée, mise en cage d’induction anesthésique).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse des bénéfices du stent biologiquement actif après ischémie.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucune autre alternative à l'utilisation d'un modèle animal pour tester le bénéfice global d'un stent biologiquement actif sur artère obstruée après ischémie, l'évaluation des effets indésirables hors-cibles ne pouvant pas se faire in vitro.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux sera utilisé pour atteindre le seuil statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés au moins par 2 dans des cages contenant de l’enrichissement, type carrés de coton et dômes, et auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Aussi, si les animaux présentant des symptômes type infection visible cliniquement donc essentiellement cutanée (dermatite), ils seront écartés des protocoles. Nous serons attentif à toute souffrance animal lors de l'élevage. En effet, si l'animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait l’analgésie peut être envisagée par administration de carprofène par voie sous-cutanée à 5 mg/kg, 1 injection par jour et si les signes de douleur persistent, l’avis du vétérinaire référent sera demandé.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation d'un modèle animal de pathologie athéroscléreuse tel que ApoE KO qui est très bien décrit et exploré avec le modèle murin ou le rat. Ici, la pose de stent nécessite des vaisseaux les plus larges possibles, donc le choix s'est porté sur le rat ApoE KO. Les animaux seront utilisés au stade adulte à un âge avancé d’environ 20 semaines. En effet, les AVC et les infarctus du myocarde touchent le sujet humain adulte. Il faut donc utiliser le modèle adulte pour ces protocoles. Par ailleurs, il est beaucoup plus aisé de réaliser les protocoles sur des rats de taille adulte et ainsi d’effectuer les bons gestes, ce qui justifie d'utiliser les rats au stade adulte.

128 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'implantation intratissulaire d'un dispositif de mesure sous anesthésie puis deux heures d'acquisitions IRM, et 76 d'entre eux subissent en plus l'induction d'un gliome, pour développer des micro-antennes d'imagerie. Le porteur reconnaît des risques de saignement, d'hémorragie et de troubles neurologiques liés à la tumeur intracérébrale. Il indique valider en amont in vitro et in silico, et présente le rat comme le modèle courant des plateformes d'imagerie précliniques.

Objectifs

Les objectifs du projet de recherche portent sur le développement et la validation de nouveaux dispositifs pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et à la spectroscopie par résonance magnétique (SRM). Ces dispositifs permettront de détecter et d’analyser de façon plus précoce, plus précise et plus sensible l’apparition et le développement de tumeurs. Ils permettront également de mieux évaluer la réponse des tumeurs aux traitements anti-tumoraux appliqués.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la réalisation de ce projet sont la validation de nouveaux dispositifs d’analyse IRM et SRM utilisables pour améliorer la compréhension in vivo de processus physiologiques et pathologiques (dans le cas présent, un modèle de gliome) mais également pour évaluer plus finement et précocement l’effet de thérapies ciblants ces pathologies.

Procédures

Les animaux (128), seront soumis à l’implantation intratissulaire d’un dispositif de mesures pour l’IRM. La procédure d’implantation, d’une durée d’environ 30 minutes, sera réalisée sous anesthésie générale. A la suite de de cette implantation, des acquisitions IRM seront réalisées sur les animaux sous anesthésie générale pendant deux heures. Une partie de ces animaux (76) sera soumise également à l’induction de tumeurs (modèle de gliome) réalisée sous anesthésie générale pour une durée d’environ 30 minutes. Le développement de la tumeur se fera sur une période d’environ 10 jours avant l’implantation intratissulaire d’un dispositif de mesures IRM et l’acquisition IRM comme décrit plus haut.

Impact sur les animaux

Pour les animaux utilisés pour la procédure 1, les effets indésirables et nuisances attendus et possibles sont les suivants. La pose de la canule présente un risque de saignement avec des effets indésirables de douleur post-opératoire et de stress lié à la présence de la canule sur le crâne de l’animal. L’introduction de la micro-antenne présente un risque d’hémorragie. Pour les animaux de la procédure 2, sur lesquels l’induction de la tumeur est réalisée, les nuisances et effets indésirables attendus et possibles sont les suivants. L’implantation des cellules tumorales présente un risque d’effet indésirable liés à la douleur post-opératoire. La croissance tumorale intracérébrale peut être cause de troubles neurologiques pour l’animal. La pose de la canule présente un risque de saignement avec des effets indésirables de douleur post-opératoire et de stress lié à la présence de la canule sur le crâne de l’animal. L’introduction de la micro-antenne présente un risque d’hémorragie. Durant la réalisation des gestes, pour l’ensemble des animaux, existent également des risques de déshydratation et de sécheresse oculaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure. La procédure subie par les animaux ne permettant pas de les maintenir en vie.

Remplacement

En ce qui concerne l’exigence de remplacement, la validation amont des protocoles de recherche sera réalisée dans la mesure du possible in vitro sur des solutions contenant des métabolites à des concentrations similaires à celles rencontrées in vivo ainsi que dans des fruits (raisins, kiwi, ...) et des gels d’agarose. Les antennes miniaturisées RF ont également été caractérisées in silico à l’aide de logiciel de simulation RF. L’ensemble de ces validations en amont permet de réduire le nombre d’animaux qui seront utilisés dans le projet et de s’assurer autant que possible de la pertinence de l’approche avant sa validation in vivo.

Réduction

En ce qui concerne l’exigence de réduction, la spectroscopie et l’imagerie par résonance magnétique (SRM et IRM) sont des techniques qui permettent de suivre longitudinalement l’évolution d’une pathologie ou les bénéfices d’une thérapie. De plus chaque animal peut être son propre témoin. Ceci permet de réduire fortement le nombre d’animaux nécessaire pour distinguer de façon statistiquement significative deux populations.

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement comprend l’installation dans les cages de cachettes, coton, frisures pour nidification en lanières de peuplier ou papier craft afin d’introduire de la nouveauté et briquette à ronger. L’hébergement se fait en groupe (3 rats par cage) durant la période d’acclimatation. Procédure 1 : L’état des animaux et leur niveau de souffrance seront évalués au niveau comportemental (posture anormale, isolement, réduction ou augmentation d’activité). L’administration d’analgésique (injection sous-cutanée Buprédine à 0,05 mg/kg) sera répétée dans le cas où l’animal montrerait des signes de souffrance (prostration, comportement, poils hérissés) aboutissant à un score inférieur à la moyenne calculée dans la fiche de suivi de l’animal. Les points limites pouvant entrainer l’arrêt de la procédure et la mise à mort de l’animal sont l’apparition de saignements trop importants au cours de la pose de la canule ou de l’introduction de l’antenne implantable, la perte de la résine et de la canule après le réveil de l’animal.Procédure 2 L’état des animaux et leur niveau de souffrance seront évalués quotidiennement au niveau comportemental (posture anormale, isolement, réduction ou augmentation d’activité). L’administration d’analgésique (injection sous-cutanée Buprédine à 0,05 mg/kg) sera répétée dans le cas où l’animal montrerait des signes de souffrance (prostration, comportement, poils hérissés) aboutissant à un score inférieur à la moyenne obtenue dans la fiche de suivi de l’animal. Les animaux seront pesés 2 ou 3 fois/ semaine jusqu’à la fin de l’étude. L’euthanasie de l’animal sera réalisée en cas de dépassement des points contrôles limites (perte de poids supérieur à 15 % et score obtenu dans la fiche de suivi de l’animal se maintenant à zéro). La taille des tumeurs sera mesurée à intervalle régulier (quelques jours) de façon non invasive par IRM. Une taille de tumeur supérieure à 5 mm sera considérée comme un point limite entrainant l’euthanasie de l’animal. Les autres points limites pouvant entrainer l’arrêt de la procédure et la mise à mort de l’animal sont l’apparition de saignements trop importants au cours de la pose de la canule ou de l’introduction de l’antenne implantable, la perte de la résine et de la canule après le réveil de l’animal.

Choix des espèces

Les rats sont les modèles animaux largement utilisés sur les plateformes d’imagerie IRM dites pré-cliniques. L’instrumentation et les protocoles sont spécifiques à cette espèce animale. Le rat type Wistar sera utilisé dans ce projet. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (entre 3 et 6 mois) afin de faciliter les procédures de chirurgie (pose de canule, implantation des antennes RF et croissance des tumeurs).

1 499 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à trois craniotomies sous anesthésie, avec injection de vecteurs viraux ou implantation, une restriction alimentaire et des tests comportementaux, pour visualiser et moduler les circuits de la mémoire. Le porteur qualifie la chirurgie de douloureuse et limite la perte de poids à 10 %. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne modélise la mémoire et renvoie les thérapies contre Alzheimer ou le stress post-traumatique au long terme.

Objectifs

L'étude de la mémoire et de ses bases neuronales est essentielle pour comprendre ses mécanismes et pouvoir, à partir de ces analyses, traiter les troubles qui y sont liés, comme la maladie d'Alzheimer, le syndrome de stress post- traumatique et d'autres types d'amnésie. Dans ce projet, nous proposons d'utiliser un modèle animal pour étudier comment la mémoire est stockée et rappelée à court et long terme. Cela nous permettra de comprendre les modalités d’activation des régions impliquées, et, en visualisant et en modifiant leur activité, de comprendre dans quelle mesure ces régions influencent le maintien de souvenirs spécifiques. En particulier, nous utiliserons une tâche de conditionnement classique pour former et étudier des souvenirs émotionnels, positifs et négatifs. Par ce projet, nous souhaitons répondre à quatre questions principales : quels sont les changements d'activité observés au niveau des cellules individuelles (1) ou du cerveau entier (2) lorsqu'un animal apprend et se souvient d'un événement passé ? La manipulation artificielle de ces régions identifiées peut-elle influencer le comportement de l'animal (3) et l'activité des régions cérébrales qui leur sont liées (4) ?

Bénéfices attendus

Le modèle souris est un excellent modèle translationnel, qui nous permet d’étudier la complexité des fonctions cognitives telles que la mémoire. Il nous permet, grâce à des techniques invasives, de tester par la manipulation et la visualisation in vivo les dynamiques neuronales qui sous-tendent la formation et le rappel de la mémoire, et ce à différentes échelles. A court terme, le projet permettra d’élucider le fonctionnement de la formation et du rappel des souvenirs à court et long termes, chez la souris mais également de façon translationnelle chez l’Humain. A plus long terme, ces connaissances pourront conduire à la découverte et au développement de thérapies plus ciblées et efficaces pour lutter contre divers troubles de la mémoire, et donc avoir un impact clinique concret. Nous utilisons le modèle souris en particulier car la reproduction est rapide et mène à un grand nombre d’animaux dans chaque portée, ce qui facilite l’obtention rapide de résultats statistiquement significatifs. Par ailleurs, l’ensemble de l’équipe est formé sur ce modèle, ce qui permet la réduction maximale du nombre d’animaux utilisés, et la littérature sur la mémoire est très riche pour cette espèce (par comparaison, par exemple, au modèle rat).

Procédures

Au cours de chaque phase de ce projet, les animaux peuvent passer par : - Un régime alimentaire de maximum 5 jours (et de maximum 2 fois par animal, à plusieurs semaines d'intervalle) pendant lequel l'animal reçoit une quantité restreinte de nourriture. Chaque jour, les animaux sont surveillés et si leur poids diminue trop, les quantités de nourriture mises à disposition sont modifiées en conséquence ; - Des tests comportementaux pour étudier leur mémoire et leur niveau de stress. Ces tests sont très courts et durent entre 5 et 10 minutes. - Des opérations chirurgicales sous anesthésie générale qui durent entre 30 et 50 minutes. Si un animal subit plusieurs interventions chirurgicales (dans tous les cas, 3 au maximum par animal), celles-ci sont espacées d'au moins 1 semaine. - Dans certains cas spécifiques, les animaux seront maintenus en isolement depuis l'intervention chirurgicale jusqu'à la fin des expériences comportementales, qui dureront au maximum deux mois à compter de la date de l'opération.

Impact sur les animaux

Pour ces études, la technologie de pointe utilisée nécessite des procédures d'implantation invasives à l'intérieur du cerveau de l'animal. Les animaux subiront donc une ou deux craniotomies, suivies d’une injection d’un vecteur viral ou d’une implantation. Cette procédure, douloureuse, sera donc effectuée sous anesthésie générale et durera un peu moins d’une heure. Les implants n'affectent toutefois pas le comportement normal et le bien-être de l'animal une fois implantés. Certains animaux devront subir une privation de nourriture partielle, procédure indispensable à leur motivation pour certaines tâches comportementales. La quantité de nourriture qu'ils ingèrent chaque jour sera limitée, mais de manière à ne pas dépasser une perte supérieure à 10% de leur poids normal afin d’éviter tout stress superflu ou malnutrition, ce qui serait non seulement préjudiciable à l'animal mais aussi contre-productif pour nos expériences, qui exigent que l'animal soit en parfaite santé et non stressé ou même malade, car cela fausserait les résultats de nos recherches. Pour les expériences employant l’électrophysiologie, la fragilité des implants ne permet pas de replacer les souris dans la même cage que leurs congénères, et ceci cause un stress émotionnel modéré à fort. Néanmoins, cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisé, en réduisant au maximum les risques que l’implant ne tienne pas dans la durée. Par ailleurs, cet isolement n’est pas le cas pour tous les autres implants utilisés. Par ailleurs, ce projet étudiant les souvenirs émotionnels, certains animaux devront subir un conditionnement aversif, induisant une douleur moyenne brève, ainsi qu’un stress passager d’intensité modérée.

Devenir

Tous les animaux subiront l’euthanasie. Celle-ci interviendra alors que l’animal sera profondément anesthésié. Ceci est absolument nécessaire pour les études histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

Du fait des approches intégratives de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants reste incontournable. En effet, à l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données sur ces processus cognitifs, bien trop complexes pour envisager toute simulation informatique. Par ailleurs, de par la nature de nos expérimentations (chirurgie, conditionnement aversif, analyse par immunohistochimie), il nous est impossible d’employer directement des sujets humains. Le modèle souris se révèle alors être idéal du fait de la proximité fonctionnelle entre son système nerveux central et celui de l’humain quant à ses capacités à créer des souvenirs émotionnels simples (auxquels nous nous intéressons, type conditionnement pavlovien) et de sa petite taille. Ceci explique également l’impossibilité d’utiliser des modèles animaux invertébrés, trop éloignés de l’humain pour raisonnablement étudier une réponse émotionnelle à un souvenir ainsi que trop éloignés dans la configuration du système nerveux central, critique à notre étude inter-régions.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au nombre minimal permettant de faire des études statistiquement significatives, nombre choisi sur la base d'expériences présentées dans des articles montrant des analyses similaires. Nous utilisons également les tissus après les expériences, maximisant ainsi l’utilisation de chaque animal.

Raffinement

Afin d’améliorer les conditions de vie des animaux, réduire la douleur, le stress et l’anxiété causés lors des différentes procédures, un certain nombre de mesures sont mises en place : - Les cages seront enrichies d’un tube en carton qui permettra de manipuler les souris sans les soulever par la queue. - Les animaux seront habitués plusieurs jours avant les expériences aux branchements et débranchements de leurs implants afin de réduire leur stress. - Nous avons amélioré la technique d’implantation des optrodes et des plaques de base du miniscope afin de ne plus avoir à isoler les animaux après implantation. - En plus de l’utilisation d'anesthésiques adaptés et d’anti-inflammatoire, nous appliquons également un anesthésique local ainsi qu’un analgésique lors de la chirurgie et après la chirurgie en cas de signes de douleurs.

Choix des espèces

Les comportements que nous souhaitons étudier sont trop complexes pour justifier de l’utilisation d’espèces non-mammifères (drosophile, poisson-zèbre, etc.). De même, les méthodes in silico et in vitro ne sont pas assez développées pour modéliser ni la mémoire, ni le fonctionnement du cerveau à si grande échelle. Par ailleurs, eu égard au nombre d’animaux requis, les rongeurs (et plus particulièrement les souris) s’imposent de par la facilité et la stabilité de leur élevage. La souris a également été préférée au rat pour deux principales raisons: - La littérature relative à la mémoire, incluant tous nos précédents travaux, est bien plus riche chez la souris que chez le rat. - Notre équipe est déjà formée sur la souris, notamment pour la réalisation des chirurgies. Ne pas changer de modèle nous permettra de conserver ce savoir-faire, et ainsi de ne pas sacrifier d’animaux supplémentaires pour adapter les chirurgies à un nouveau modèle animal. Les souris étudiées seront adultes (plus de 7 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

3 chats vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés dans un autre projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent, sous anesthésie générale de deux heures trente, l'implantation d'électrodes cérébrales, un transport vers un établissement partenaire et des administrations orales d'une molécule, pour tester un antagoniste du récepteur H2 de l'histamine sur le sommeil. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire d'environ trois jours et le stress du transport. Il présente le chat comme un modèle de référence du sommeil transposable à l'être humain et affirme que seul l'animal "entier" reproduit l'alternance veille-sommeil.

Objectifs

L'être humain est soumis à l'alternance du cycle veille-sommeil. L'éveil est un état permettant la réalisation d'activités vitales et cognitives. Durant l’éveil le cerveau reçoit des informations internes et externes et les analyse pour y répondre de manière adaptée. Inversement le sommeil lent est un état comportemental de repos, permettant à l'organisme d'assurer la récupération physique et fonctionnelle dans des conditions de dépense énergétique minimale. Notre équipe s’intéresse depuis de nombreuses années à l’histamine qui est l’un des neurotransmetteurs majeurs de l’éveil. Les neurones à histamine sont localisés dans une région située sous l’hypothalamus postérieur et émettent des prolongements dans l’ensemble du cerveau. Il existe plusieurs récepteurs à l’histamine, dénommés H1, H2 et H3. Suivant le type de récepteur et sa localisation, l’histamine libérée au cours de l’éveil va avoir des effets activateurs sur ses récepteurs cibles ou inhibiteurs sur ses récepteurs d’autorégulation. Afin de mieux comprendre les mécanismes de déclenchement et de maintien de l’éveil il est important d’identifier précisément l’action de l’histamine sur ces différents récepteurs. Ceci est rendu possible par l’utilisation d‘antagonistes c’est-à-dire des molécules qui vont bloquer sélectivement l’un de ces récepteurs. A l’inverse des récepteurs H1 et H3 dont le rôle sur le sommeil est bien démontré, celui des récepteurs H2 reste peu connu. Dans le cadre d’une autorisation précédente, nous avons obtenu une amélioration du sommeil lent à l’aide d’une nouvelle molécule ciblant spécifiquement ce type de récepteurs, l’effet restant néanmoins à être confirmé statistiquement en raison d’un petit échantillon (n=3). L'objectif de cette étude consiste à finaliser la caractérisation de l’effet de ce nouvel antagoniste H2 sur les états de vigilance et sur l’électroencéphalogramme (EEG) en réalisant des expériences complémentaires sur un nombre réduit d'animaux afin de compléter et confirmer nos premiers résultats.

Bénéfices attendus

Les retombées potentielles de cette étude sont non seulement d’ordre scientifique sur l’animal-modèle (connaissances des mécanismes neuronaux de l’éveil et du sommeil, du rôle des récepteurs centraux H2 de l’histamine) mais aussi transposables à l’Homme et notamment en situation clinique. Les résultats de l’étude pharmacologique vont nous permettre de finaliser la caractérisation du nouvel antagoniste H2 et de ses effets sur les états d’éveil et de sommeil, sur le plan comportemental et de la qualité du sommeil. Ces résultats permettront également de conforter le potentiel translationnel de l’étude. En effet, ce nouvel antagoniste du récepteur H2 a récemment obtenu un statut « cliniquement approprié » après une série de tests réglementaires montrant son innocuité aigue et chronique chez l'animal. Cette étude de preuve de concept chez le chat constitue donc une étape cruciale pour la conception d’une nouvelle thérapie capable d’améliorer le sommeil affecté par les différents types de stress rencontrés dans la vie au cours de l’éveil.

Procédures

L’étude comporte une analyse quantitative et qualitative du sommeil grâce à des enregistrements par électrodes (électroencéphalogramme (EEG), électromyogramme (EMG)) ainsi que des administrations par voie orale de la molécule d’intérêt testée à trois doses contre placebo. La procédure implique pour les animaux les étapes suivantes - une acclimatation d’une durée minimale de deux semaines dans notre établissement - un transport (aller et retour) dans un établissement partenaire d’une durée de 35 minutes - une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée maximale de deux heures trente visant à implanter les électrodes. - une période post-opératoire de 24h à 48h dans l’établissement partenaire suivie d’une convalescence de deux semaines avec évaluation de la douleur et soins appropriés incluant des injections répétées (2 à 3) d’antalgique sous la peau (1 minute). - des sessions d’enregistrement du sommeil au nombre de 24 (8 enregistrements de référence et 16 enregistrements avec administration orale de la molécule d’intérêt ou du placebo). Les sessions durent chacune 6h et sont séparées d’au moins trois jours pour permettre l’élimination de la molécule. Lors des sessions, l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale de 4m^2 équipée comme la salle d’hébergement, avec enrichissement. Il est privé de ses congénères dont la présence et les interactions pourraient affecter la qualité de son sommeil, puis les retrouvent à la fin des sessions. Chaque session débute avec une courte immobilisation de l’animal (30 secondes) pour placer l’émetteur sans fil et introduire la gélule contenant le composé testé par voie orale. Pour un animal donné, l’expérience dure au total onze semaines.

Impact sur les animaux

Lors du transport aller-retour dans l’établissement partenaire, l’animal est susceptible d’éprouver un stress, de l’angoisse passagère et un mal des transports Les animaux subissent une intervention chirurgicale au cours de laquelle un dispositif est implanté pour capter les signaux cérébraux. Cette intervention va être à l’origine d’une douleur post-opératoire susceptible de se prolonger plusieurs jours et de se traduire par une modification de l’état général et du comportement ainsi qu’une réaction au toucher de la zone opérée. Ces douleurs pourront durer plus ou moins longtemps selon l’animal, mais leur durée moyenne est estimée à trois jours environ et font l’objet d’une prise en charge par des injections de médicaments antidouleurs ; ces injections entraineront une douleur transitoire au niveau de la peau du site d’injection et pourront être répétées plusieurs fois. Malgré leur taille réduite, les électrodes d’enregistrement peuvent générer des microlésions cérébrales, un œdème (gonflement) ou un hématome (saignement). Il existe également un léger risque d’infection au niveau de l’implant. Lors des sessions l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale, il est momentanément privé de ses congénères et est susceptible d’éprouver un stress lié à l’isolement ou à la nouveauté de la situation. Les sessions débutent avec la pose d’un petit émetteur sans fil sur l’implant et l’administration orale de la gélule contenant le placebo ou la dose du composé testé. Ceci nécessite une contention de l’animal créant un inconfort momentané qui peut se traduire par une réaction de fuite ou de défense s’il n’est pas habitué. Il n’est pas attendu d’effet indésirable avec la molécule testée.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie. Les animaux implantés seront réutilisés dans un autre projet car l'implantation est pérenne dans le temps et les enregistrements sont possibles pendant plusieurs mois. Les animaux non implantés qui n’auront pas été inclus dans l’étude seront proposés à l’adoption par le biais d'une association. La décision est prise en concertation par le responsable du projet et le vétérinaire désigné.

Remplacement

Cette étude fait suite à des travaux préalables in vitro qui ont montré l’implication du récepteur H2 de l’histamine dans l’excitabilité et l’activité neuronale. Elle a pour objet la caractérisation des effets d’un nouvel antagoniste des récepteurs H2 sur les états de vigilance et l’électroencéphalogramme (EEG) ce qui intègre une réponse physiologique et comportementale complexe qui ne peut être obtenue que chez l’animal entier. Il n’existe pas à ce jour de modèle de sommeil in silico ou ex-vivo capable de reproduire les mécanismes neuronaux complexes qui sous-tendent l’alternance des états d’éveil et de sommeil. Les mammifères sont les seuls animaux possédant un cycle veille/sommeil comparable à celui de l’homme.

Réduction

Notre plan d’expérience est conçu pour collecter le maximum de données sur un nombre réduit d’animaux, grâce à des mesures répétées sur un même animal (3 répétitions) et au recueil simultané de données à la fois quantitatives et qualitatives sur le sommeil. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au minimum sur la base d’expériences préliminaires et du nombre d’essais complémentaires à réaliser pour obtenir des résultats exploitables et valides d’un point de vue statistique. En outre, l’étude sera menée de façon séquentielle avec un premier animal dont nous analyserons les données avant d’envisager l’ajout d’un second animal ou d’un troisième, uniquement si cela s’avère nécessaire. Les résultats obtenus feront l’objet de tests statistiques pour mesures répétées qui figurent parmi les plus fiables et les plus robustes. L’étude donnera lieu à une publication scientifique ; les enregistrements de sommeil pourront faire l’objet d’un partage avec la communauté scientifique grâce aux plateformes de données ouvertes. La réutilisation par d’autres scientifiques de ces données rares permettra de limiter le recours à de nouveaux animaux.

Raffinement

Les conditions d'hébergement, de soins et les méthodes mises en œuvre dans ce projet ont été définies en collaboration avec des vétérinaires spécialistes et la structure chargée du bien-être animal de façon à réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables : Une période d’acclimatation minimale de deux semaines est prévue, ainsi que des délais de récupération après le transport et l’intervention chirurgicale. L’implantation chirurgicale d’électrodes est réalisée sous anesthésie générale profonde avec analgésie peropératoire dans un établissement vétérinaire offrant des conditions optimales de réalisation ; la prise en charge postopératoire repose sur un protocole de soins post-opératoires qui inclut une évaluation de la douleur, des injections de puissants antalgiques et prévoit des points limites adaptés. Des visites quotidiennes assurent une familiarisation de chaque animal avec l’expérimentateur et les zootechniciens ainsi que le suivi individuel du bien-être au moyen de grilles de score. Notre expérience montre que des visites et manipulations régulières avec chaque individu atténue l’expression de comportement de fuite ou d’agression et les signes de stress. De façon importante, les animaux implantés cohabitent en parfaite harmonie avec des individus non implantés. Les administrations du composé ou du placebo se font par voie orale en gélule et non au moyen d’injections. L’animal est brièvement tenu à la main par l’expérimentateur pour introduire la gélule, il ne subit dont pas l’inconfort et la douleur d’une piqûre. Les enregistrements d’éveil et de sommeil sont limités à 6 heures et sont réalisés à l’aide d’un système sans fil ce qui permet à l’animal d’être complétement libre de ses mouvements. Les sessions se déroulent après une habituation dans une volière séparée et enrichie comme la volière d’hébergement. Un temps de repos est ménagé entre chacune des sessions pendant lequel l’animal est replacé en hébergement commun avec ses congénères.

Choix des espèces

Le chat est un modèle animal de référence pour le sommeil et les théories contemporaines sur l’alternance veille-sommeil. Par rapport aux petits mammifères comme les rongeurs, il a un cerveau de plus grande taille et un électroencéphalogramme dont les caractéristiques sont très proches de celui de l’Homme ; il a de plus une plus grande propension à dormir (environ 70% du temps contre 50% pour les rongeurs) et son sommeil comprend des stades similaires à ceux de l’homme, avec des de sommeil lent et l’activité pontogéniculooccipitale (absente chez le rongeur). Le chat est aussi l’espèce qui nous a permis d’identifier le modafinil et plus récemment, une thérapie histaminergique basée sur le récepteur H3 et utilisée depuis 2016 en Europe et 2019 aux USA pour améliorer l’éveil des patients narcoleptiques et hypersomniaques. Dans la continuité de nos recherches, cette espèce modèle devrait nous permettre d’explorer une nouvelle piste thérapeutique utilisant un ligand H2 en vue d’améliorer le sommeil notamment dans le cadre des troubles du sommeil lié au stress. Chats adultes d'un poids compris entre 3,0 et 5,0kg. Les paramètres étudiés dans cette étude nécessitent des animaux ayant atteint une maturité cérébrale, ainsi qu’une stabilité de l’architecture globale du cycle veille-sommeil, par opposition à des animaux jeunes ou sénescents. Le stade adulte garantit l’implantation reproductible des électrodes aux coordonnées stéréotaxiques prédéfinies.

24 chats vont être utilisés, gardés vivants et susceptibles d'être réutilisés dans un autre projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent deux administrations orales d'un comprimé puis douze prélèvements de sang, et sont hébergés seuls pendant 24 heures, pour comparer la pharmacocinétique de deux produits. Le porteur reconnaît des douleurs aux sites de prélèvement, à la veine jugulaire, et le stress de l'isolement. Il indique que l'objet est de mettre sur le marché un anti-inflammatoire vétérinaire équivalent à un produit existant et juge l'animal "entier" "indispensable".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de deux produits tests différents. Il s'agit de comparer les paramètres pharmacocinétiques du produit référent avec ceux du produit testé pour voir s'ils sont bioéquivalents. Les produits testés seront sous forme de comprimés et administrés par voie orale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer que les paramètres pharmacocinétiques de l'élément test sont équivalents à ceux de l'élément référent. L'intêret de ce projet est de pouvoir générer un anti inflammatoire non stéroïdien en administration orale équivalent à celui qui existe déja sur le marché chez le chat.

Procédures

Les animaux auront deux administrations orales, sous forme d'un comprimé, par animal . Temps estimé par administration de l'ordre de la minute. Des prélèvements de sang seront réalisés. Nombre total de prélèvement n=12. Temps estimé par prélèvement: inférieur à la minute. Les animaux seront hébergés de façon individuelle durant 24h maximum. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont des douleurs aux sites de prélèvements ( au niveau des veines jugulaires principalement). Les animaux seront hébergés de façon individuelle durant 24h aprés administration. Cela peut engendrer un stress pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure. Les animaux auront une période de repos suffisante et pourront être ré inclus dans un autre projet si besoin.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.

Réduction

24 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront répartis en 2 groupes de 12 animaux. Chaque groupe recevra chacun des éléments testés sur 2 périodes différentes. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 2 ou 3 (2 ou 3 males ou 2 ou 3 femelles par box d'hébergement , 8 males et 4 femelles par groupe) mais seront en condition individuelle pendant les 24 premières heures suivant l'administration pour chacune des périodes. Durant cette période les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible. Lors des prélèvements sanguins, l'analgésie par le froid pourra être faite si necessaire en appliquant un peu de glace dans une compresse au point de prélèvement.

Choix des espèces

Espèce cible pour ce produit vétérinaire Adulte, age supérieur à 1 an. Animaux compris entre 2.5 et 6 Kg. Nécessaire pour avoir des doses comprises entre 1 et 2.4 mg/kg

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Borrelia, subissent des prélèvements de sang hebdomadaires puis un prélèvement de liquide céphalorachidien avant leur mise à mort, jusqu'à 45 jours après l'infection, pour développer des tests diagnostiques de la maladie de Lyme. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une arthrite avec gonflement, douleur et perte de poids. Il affirme que le recours aux animaux est "nécessaire" faute d'échantillons humains suffisants et renvoie les bénéfices pour les patients au long terme.

Objectifs

La Borréliose de Lyme, aussi appelée maladie de Lyme, est due à la transmission d’une bactérie, la Borrelia, lors d’une morsure de tique infectée. Les signes cliniques sont variés et évoluent. En phase précoce, nous observons des lésions cutanées associées à des symptômes non spécifiques. En cas d’absence de diagnostic et de traitement antibiotique, la bactérie peut se disséminer dans le corps entrainant une évolution de la maladie. On parle de phase de dissémination puis de la phase chronique ou persistante, avec l’apparition plusieurs mois voire années après le début de l’infection d’arthrites, de troubles neurologiques, cardiaques ou de manifestations cutanées. Le diagnostic repose majoritairement sur l’observation d’un signe clinique typique, l’érythème migrant (70 à 80% des cas). En son absence le diagnostic est complexe, les signes cliniques sont non spécifiques et les performances des tests biologiques sont insuffisantes. Ces tests sont indirects et souffrent d’un manque de sensibilité, de spécificité et d’une absence de standardisation. Ils reposent exclusivement sur la recherche d’anticorps dirigés contre la bactérie. De plus, au stade précoce de la maladie, les anticorps sont peu ou pas présents et chez certaines personnes infectées on ne retrouve pas d’anticorps dirigés contre Borrelia même à un stade avancé de la maladie. Le diagnostic direct par détection de la bactérie est possible mais difficile car le nombre de bactéries dans le sang ou au lieu de l’infection est très faible et/ou difficilement accessible. Comme souvent en bactériologie, la culture est la technique de référence, mais dans le cas de Borrelia cette approche est longue (2 à 8 semaines) et peu sensible. Il est primordial de diagnostiquer rapidement et avec certitude la maladie pour limiter le risque de développement des symptômes plus invalidants mais également pour éviter l’errance médicale des patients. Il y a une véritable demande pour ces tests comme en témoigne le plan national de lutte contre la maladie de Lyme, lancé en septembre 2016 par la ministre de la santé. Notre objectif est de développer différents tests de diagnostics directs basés sur la détection de protéines de la bactérie. Nous souhaitons récolter des échantillons de fluides biologiques provenant de souris infectées par Borrelia aux différents stades de la maladie afin d’évaluer la capacité des anticorps développés au laboratoire à détecter les antigènes de Borrelia.

Bénéfices attendus

Le développement de nouvelles méthodes de diagnostic directes, plus sensibles, plus rapides et plus fiables de la maladie de Lyme est nécessaire afin de limiter le risque de développer une forme dite chronique ou persistante de la maladie mais également pour éviter les errances médicales de ces patients. A long terme, le développement de ce type de test permettrait une meilleure qualité de vie aux patients et une réduction des coûts de diagnostic, de soins et de prise en charge psychologique.

Procédures

Une injection sous cutanée de bactérie sera réalisée sous anesthésie gazeuse. En tenant compte du délais d’anesthésie, cette intervention dure entre 3 et 5 minutes et aura lieu qu’une seule fois. Une fois par semaine, elles seront soumises à une technique de contention sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements de sang (durée d’une minute maximum) à 4 temps différents maximum après infection. Après anesthésie profonde, un prélèvement de LCR (durée de trois minutes environ) sera réalisé une seule fois puis les animaux seront euthanasiés afin de récupérer plusieurs tissus.

Impact sur les animaux

- Stress lors des manipulations diminué grâce à une semaine d’habituation. - 7 jours après l’infection, une arthrite avec gonflement et rougeur des membres peut apparaitre et entrainer une douleur et une diminution de la mobilité. Une perte de poids et déshydratation légères peuvent également être observé. La repousse des poils est plus lente au point d’injection. Durée totale des symptômes entre 5 et 10 jours correspondant à la phase de dissémination de la maladie. Selon la littérature, après un rétablissement, des épisodes d’arthrites peuvent apparaitre au-delà de 28 jours après infection. Les souris seront euthanasiées au maximum 45 jours après infection.

Devenir

Lors des phases tardive et chronique, la peau, le système nerveux central et les articulations sont les tissus préférentiellement ciblés par la bactérie. Tous les animaux utilisés seront euthanasiés afin de prélever et analyser ces différents tissus.

Remplacement

Il existe peu de cohortes d’échantillons humains ou vétérinaires bien caractérisés. Les performances des outils de diagnostic sont très variables entre les laboratoires et la souche infectante et la phase de la maladie ne sont pas toujours identifiés. Lorsqu’ils existent, ces échantillons sont peu nombreux et très précieux, leur accès est difficile. La production des protéines bactériennes n’est pas toujours effective in-vitro et ne reflète pas celle induites lors d’une infection chez un hôte. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux de laboratoire est nécessaire. Une étude pilote a déjà été réalisée et a permis de valider le modèle animal et la capacité des 3 souches de Borrelia utilisées dans ce projet à induire une infection persistante.

Réduction

Le but de cette expérimentation est de concevoir une cohorte d’échantillons biologiques pour rechercher la présence des protéines bactériennes et de tester l’efficacité de détection de nos outils immunologiques. Nous avons déterminé que le nombre minimum d’animaux par temps et par souches de Borrelia était de 10 afin d’obtenir un volume suffisant de fluides corporels pour détecter les protéines bactériennes, développer et évaluer les tests diagnostiques. Les performances de ces tests seront évaluées en utilisant un test statistique adéquat pour un faible nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans un milieu enrichi. Une période d’adaptation à leur environnement et d’habituation à la manipulation d’une semaine est respectée. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées est effectuée. Afin de diminuer le stress et la douleur dus aux expérimentations et prélèvements, les animaux sont anesthésiés et les expérimentations réalisées dans une pièce au calme sans passage. Une grille d’évaluation de la douleur et de l’état de santé de la souris est mise en place et décrit clairement les signes qui, s’ils apparaissaient, conduiraient à une euthanasie de l’animal (points limites). Lors des pics de symptômes, un complément alimentaire (mélange d’aliments et d’eau gélifiés) est disposé dans la cage et un antidouleur peut être administré en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Nous utiliserons des jeunes souris adultes de 4 à 8 semaines, lesquelles sont plus sensibles que les adultes à l’infection par les Borrelia. De nombreuses études dans la littérature sur ce sujet ont déjà utilisé ce modèle murin pour étudier la maladie de Lyme. Les souris infectées avec Borrelia présentent certaines caractéristiques similaires à la maladie de Lyme chez l’homme tout en étant capable de développer une réponse immunitaire complète.

3 chats vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés dans un autre projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent, sous anesthésie générale de deux heures trente, l'implantation d'électrodes cérébrales, un transport vers un établissement partenaire et des administrations orales d'une molécule, pour tester un antagoniste du récepteur H2 de l'histamine sur le sommeil. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire d'environ trois jours et le stress lié au transport. Il affirme que seul l'animal "entier" reproduit l'alternance veille-sommeil et présente le chat comme un modèle de référence transposable à l'être humain.

Objectifs

L'être humain est soumis à l'alternance du cycle veille-sommeil. L'éveil est un état permettant la réalisation d'activités vitales et cognitives. Durant l’éveil le cerveau reçoit des informations internes et externes et les analyse pour y répondre de manière adaptée. Inversement le sommeil lent est un état comportemental de repos, permettant à l'organisme d'assurer la récupération physique et fonctionnelle dans des conditions de dépense énergétique minimale. Notre équipe s’intéresse depuis de nombreuses années à l’histamine qui est l’un des neurotransmetteurs majeurs de l’éveil. Les neurones à histamine sont localisés dans une région située sous l’hypothalamus postérieur et émettent des prolongements dans l’ensemble du cerveau. Il existe plusieurs récepteurs à l’histamine, dénommés H1, H2 et H3. Suivant le type de récepteur et sa localisation, l’histamine libérée au cours de l’éveil va avoir des effets activateurs sur ses récepteurs cibles ou inhibiteurs sur ses récepteurs d’autorégulation. Afin de mieux comprendre les mécanismes de déclenchement et de maintien de l’éveil il est important d’identifier précisément l’action de l’histamine sur ces différents récepteurs. Ceci est rendu possible par l’utilisation d‘antagonistes c’est-à-dire des molécules qui vont bloquer sélectivement l’un de ces récepteurs. A l’inverse des récepteurs H1 et H3 dont le rôle sur le sommeil est bien démontré, celui des récepteurs H2 reste peu connu. Dans le cadre d’une autorisation précédente, nous avons obtenu une amélioration du sommeil lent à l’aide d’une nouvelle molécule ciblant spécifiquement ce type de récepteurs, l’effet restant néanmoins à être confirmé statistiquement en raison d’un petit échantillon (n=3). L'objectif de cette étude consiste à finaliser la caractérisation de l’effet de ce nouvel antagoniste H2 sur les états de vigilance et sur l’électroencéphalogramme (EEG) en réalisant des expériences complémentaires sur un nombre réduit d'animaux afin de compléter et confirmer nos premiers résultats.

Bénéfices attendus

Les retombées potentielles de cette étude sont non seulement d’ordre scientifique sur l’animal-modèle (connaissances des mécanismes neuronaux de l’éveil et du sommeil, du rôle des récepteurs centraux H2 de l’histamine) mais aussi transposables à l’Homme et notamment en situation clinique. Les résultats de l’étude pharmacologique vont nous permettre de finaliser la caractérisation du nouvel antagoniste H2 et de ses effets sur les états d’éveil et de sommeil, sur le plan comportemental et de la qualité du sommeil. Ces résultats permettront également de conforter le potentiel translationnel de l’étude. En effet, ce nouvel antagoniste du récepteur H2 a récemment obtenu un statut « cliniquement approprié » après une série de tests réglementaires montrant son innocuité aigue et chronique chez l'animal. Cette étude de preuve de concept chez le chat constitue donc une étape cruciale pour la conception d’une nouvelle thérapie capable d’améliorer le sommeil affecté par les différents types de stress rencontrés dans la vie au cours de l’éveil.

Procédures

L’étude comporte une analyse quantitative et qualitative du sommeil grâce à des enregistrements par électrodes (électroencéphalogramme (EEG), électromyogramme (EMG)) ainsi que des administrations par voie orale de la molécule d’intérêt testée à trois doses contre placebo. La procédure implique pour les animaux les étapes suivantes - une acclimatation d’une durée minimale de deux semaines dans notre établissement - un transport (aller et retour) dans un établissement partenaire d’une durée de 35 minutes - une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée maximale de deux heures trente visant à implanter les électrodes. - une période post-opératoire de 24h à 48h dans l’établissement partenaire suivie d’une convalescence de deux semaines avec évaluation de la douleur et soins appropriés incluant des injections répétées (2 à 3) d’antalgique sous la peau (1 minute). - des sessions d’enregistrement du sommeil au nombre de 24 (8 enregistrements de référence et 16 enregistrements avec administration orale de la molécule d’intérêt ou du placebo). Les sessions durent chacune 6h et sont séparées d’au moins trois jours pour permettre l’élimination de la molécule. Lors des sessions, l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale de 4m^2 équipée comme la salle d’hébergement, avec enrichissement. Il est privé de ses congénères dont la présence et les interactions pourraient affecter la qualité de son sommeil, puis les retrouvent à la fin des sessions. Chaque session débute avec une courte immobilisation de l’animal (30 secondes) pour placer l’émetteur sans fil et introduire la gélule contenant le composé testé par voie orale. Pour un animal donné, l’expérience dure au total onze semaines.

Impact sur les animaux

Lors du transport aller-retour dans l’établissement partenaire, l’animal est susceptible d’éprouver un stress, de l’angoisse passagère et un mal des transports Les animaux subissent une intervention chirurgicale au cours de laquelle un dispositif est implanté pour capter les signaux cérébraux. Cette intervention va être à l’origine d’une douleur post-opératoire susceptible de se prolonger plusieurs jours et de se traduire par une modification de l’état général et du comportement ainsi qu’une réaction au toucher de la zone opérée. Ces douleurs pourront durer plus ou moins longtemps selon l’animal, mais leur durée moyenne est estimée à trois jours environ et font l’objet d’une prise en charge par des injections de médicaments antidouleurs ; ces injections entraineront une douleur transitoire au niveau de la peau du site d’injection et pourront être répétées plusieurs fois. Malgré leur taille réduite, les électrodes d’enregistrement peuvent générer des microlésions cérébrales, un œdème (gonflement) ou un hématome (saignement). Il existe également un léger risque d’infection au niveau de l’implant. Lors des sessions l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale, il est momentanément privé de ses congénères et est susceptible d’éprouver un stress lié à l’isolement ou à la nouveauté de la situation. Les sessions débutent avec la pose d’un petit émetteur sans fil sur l’implant et l’administration orale de la gélule contenant le placebo ou la dose du composé testé. Ceci nécessite une contention de l’animal créant un inconfort momentané qui peut se traduire par une réaction de fuite ou de défense s’il n’est pas habitué. Il n’est pas attendu d’effet indésirable avec la molécule testée.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie. Les animaux implantés seront réutilisés dans un autre projet car l'implantation est pérenne dans le temps et les enregistrements sont possibles pendant plusieurs mois. Les animaux non implantés qui n’auront pas été inclus dans l’étude seront proposés à l’adoption par le biais d'une association. La décision est prise en concertation par le responsable du projet et le vétérinaire désigné.

Remplacement

Cette étude fait suite à des travaux préalables in vitro qui ont montré l’implication du récepteur H2 de l’histamine dans l’excitabilité et l’activité neuronale. Elle a pour objet la caractérisation des effets d’un nouvel antagoniste des récepteurs H2 sur les états de vigilance et l’électroencéphalogramme (EEG) ce qui intègre une réponse physiologique et comportementale complexe qui ne peut être obtenue que chez l’animal entier. Il n’existe pas à ce jour de modèle de sommeil in silico ou ex-vivo capable de reproduire les mécanismes neuronaux complexes qui sous-tendent l’alternance des états d’éveil et de sommeil. Les mammifères sont les seuls animaux possédant un cycle veille/sommeil comparable à celui de l’homme.

Réduction

Notre plan d’expérience est conçu pour collecter le maximum de données sur un nombre réduit d’animaux, grâce à des mesures répétées sur un même animal (3 répétitions) et au recueil simultané de données à la fois quantitatives et qualitatives sur le sommeil. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au minimum sur la base d’expériences préliminaires et du nombre d’essais complémentaires à réaliser pour obtenir des résultats exploitables et valides d’un point de vue statistique. En outre, l’étude sera menée de façon séquentielle avec un premier animal dont nous analyserons les données avant d’envisager l’ajout d’un second animal ou d’un troisième, uniquement si cela s’avère nécessaire. Les résultats obtenus feront l’objet de tests statistiques pour mesures répétées qui figurent parmi les plus fiables et les plus robustes. L’étude donnera lieu à une publication scientifique ; les enregistrements de sommeil pourront faire l’objet d’un partage avec la communauté scientifique grâce aux plateformes de données ouvertes. La réutilisation par d’autres scientifiques de ces données rares permettra de limiter le recours à de nouveaux animaux.

Raffinement

Les conditions d'hébergement, de soins et les méthodes mises en œuvre dans ce projet ont été définies en collaboration avec des vétérinaires spécialistes et la structure chargée du bien-être animal de façon à réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables : Une période d’acclimatation minimale de deux semaines est prévue, ainsi que des délais de récupération après le transport et l’intervention chirurgicale. L’implantation chirurgicale d’électrodes est réalisée sous anesthésie générale profonde avec analgésie peropératoire dans un établissement vétérinaire offrant des conditions optimales de réalisation ; la prise en charge postopératoire repose sur un protocole de soins post-opératoires qui inclut une évaluation de la douleur, des injections de puissants antalgiques et prévoit des points limites adaptés. Des visites quotidiennes assurent une familiarisation de chaque animal avec l’expérimentateur et les zootechniciens ainsi que le suivi individuel du bien-être au moyen de grilles de score. Notre expérience montre que des visites et manipulations régulières avec chaque individu atténue l’expression de comportement de fuite ou d’agression et les signes de stress. De façon importante, les animaux implantés cohabitent en parfaite harmonie avec des individus non implantés. Les administrations du composé ou du placebo se font par voie orale en gélule et non au moyen d’injections. L’animal est brièvement tenu à la main par l’expérimentateur pour introduire la gélule, il ne subit dont pas l’inconfort et la douleur d’une piqûre. Les enregistrements d’éveil et de sommeil sont limités à 6 heures et sont réalisés à l’aide d’un système sans fil ce qui permet à l’animal d’être complétement libre de ses mouvements. Les sessions se déroulent après une habituation dans une volière séparée et enrichie comme la volière d’hébergement. Un temps de repos est ménagé entre chacune des sessions pendant lequel l’animal est replacé en hébergement commun avec ses congénères.

Choix des espèces

Le chat est un modèle animal de référence pour le sommeil et les théories contemporaines sur l’alternance veille-sommeil. Par rapport aux petits mammifères comme les rongeurs, il a un cerveau de plus grande taille et un électroencéphalogramme dont les caractéristiques sont très proches de celui de l’Homme ; il a de plus une plus grande propension à dormir (environ 70% du temps contre 50% pour les rongeurs) et son sommeil comprend des stades similaires à ceux de l’homme, avec des de sommeil lent et l’activité pontogéniculooccipitale (absente chez le rongeur). Le chat est aussi l’espèce qui nous a permis d’identifier le modafinil et plus récemment, une thérapie histaminergique basée sur le récepteur H3 et utilisée depuis 2016 en Europe et 2019 aux USA pour améliorer l’éveil des patients narcoleptiques et hypersomniaques. Dans la continuité de nos recherches, cette espèce modèle devrait nous permettre d’explorer une nouvelle piste thérapeutique utilisant un ligand H2 en vue d’améliorer le sommeil notamment dans le cadre des troubles du sommeil lié au stress. Chats adultes d'un poids compris entre 3,0 et 5,0kg. Les paramètres étudiés dans cette étude nécessitent des animaux ayant atteint une maturité cérébrale, ainsi qu’une stabilité de l’architecture globale du cycle veille-sommeil, par opposition à des animaux jeunes ou sénescents. Le stade adulte garantit l’implantation reproductible des électrodes aux coordonnées stéréotaxiques prédéfinies.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Atteintes de mucoviscidose, elles reçoivent des injections de cellules tumorales ou des injections répétées d'uréthane pour induire des cancers, afin d'étudier le sur-risque tumoral lié à la maladie. Le porteur affirme que ses modèles de culture in vitro suffisent pour la majorité des expériences mais qu'une approche sur "organisme entier" reste "nécessaire" pour la tumorigenèse. Il renvoie les développements thérapeutiques à de possibles pistes futures.

Objectifs

Ces dernières décennies, les nouvelles thérapies de transplantation pulmonaire et celles visant à corriger l’expression du gène responsable de la mucoviscidose, ont permis à ces patients de dépasser les 40 ans. L’augmentation de l’espérance de vie des patients a également accentué l’apparition de nouvelles comorbidités associées à cette maladie, dont un risque accru de développer plusieurs types de cancers (cancers digestifs, pulmonaires, cutanés, etc.). Dans ces comorbidités, la composante vasculaire y est affectée mais encore peu étudiée. Néanmoins, nos travaux ont démontré que le gène responsable de la mucoviscidose avait un rôle insoupçonné dans les cellules endothéliales, en promouvant une dysfonction/inflammation endothéliale qui est également impliquée dans les pathologies menant à l’apparition de cancers (ex : obésité, diabète, inflammation chronique de l’intestin). De plus l’expression du gène responsable de la mucoviscidose est souvent réprimée dans de nombreux cancers et un haut taux de ce gène est corrélé à une mauvaise survie des patients. Notre projet vise donc à démontrer l’augmentation de l’incidence de cancer dans un modèle de souris déficiente pour le gène responsable de la mucoviscidose, puis d’expliquer comment une dysfonction des cellules endothéliales serait associée à ce développement tumoral. Nos différents travaux publiés et en cours démontrent l’implication des cellules endothéliales dans ce phénomène, mais dans une optique de transfert vers la clinique requiert le passage dans des modèles animaux vivants qui reproduisent de façon pertinente la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires systémiques associées.

Bénéfices attendus

Les dernières avancées thérapeutiques ont permis aux patients atteints de mucoviscidose de voir leur qualité et espérance de vie augmentées de façon significative. En revanche de nombreuses comorbidités préjudiciables à leur santé sont également apparues. Parmi celles-ci un risque élevé de cancers gastro-intestinaux, qui est maintenant pris en charge par un dépistage précoce chez ces patients. En revanche la cause principale du risque élevé de développer certains cancers n’est pas bien comprise. Grâce à ce projet, l’utilisation de différents modèles tumoraux, et à différents stades de la tumorigénèse, permettra d’ouvrir de nouvelles pistes pour expliquer l’élévation de l’incidence des cancers chez les patients atteints de mucoviscidose, et mettre en lumière de potentiels développements thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales (1 seule injection), ou à des injections intra-péritonéales répétées de traitements (1 injection hebdomadaire pendant 4 semaines). Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 4 injections par animal.

Impact sur les animaux

Les données de la littérature sur le modèle d’induction tumorale par injection intra-péritonéale d’uréthane (4 fois par semaine) ne font état d’aucun effet indésirable notoire pour les animaux lorsque ceux-ci sont euthanasiés au cours du 4ème mois suivant la première injection d’uréthane. Néanmoins, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.

Devenir

Des prélèvements de tissus seront nécessaires pour les études histologiques de nos procédures. De fait, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure. De même, les animaux ne pourront être réutilisés car les procédures précédentes pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable sur les prochaines expérimentations.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) et de cellules primaires dérivées de patients qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. Grâce à ces modèles nous avons d’ailleurs validé de nombreux aspects qui soutiennent notre hypothèse. L'approche sur organisme entier nous est en revanche nécessaire pour analyser des processus plus complexe et sur le long terme comme la tumorigénèse.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons. Notre projet nécessitera 168 animaux au total.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en fin de procédure ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces. - Respiration anormalement rapide et synonyme d’une masse tumorale intrathoracique trop importante (dans le cas des tumeurs thoraciques). •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques : - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.

Choix des espèces

L’objectif principal de notre projet est de déterminer l’impact d’un défaut du gène responsable de la mucoviscidose sur le développement tumoral. Nos précédents travaux publiés ont utilisé le modèle de souris envisagé dans ce projet, et mis en lumière des défaut vasculaires qui pourraient expliquer l’apparition de cancers. De fait, l’utilisation de ce modèle de souris particulier au travers de différents modèles tumoraux nous apparaît pertinente et essentielle pour apporter une preuve solide étayant notre hypothèse. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature

1 584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur, des prélèvements de sang hebdomadaires et l'injection d'une molécule d'ADN, pour étudier le lien entre microbiote intestinal et efficacité des immunothérapies anticancéreuses. Le porteur décrit une gêne modérée liée aux tumeurs sous la peau et affirme qu'un animal vivant et "entier" est "indispensable" faute de reproduire l'immunité antitumorale in vitro. Il présente un effet possible sur la survie des patients résistants comme une retombée majeure attendue.

Objectifs

Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements au cours d’une dysbiose intestinale suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin. L’altération de l’expression de cette protéine conduit donc à une accumulation de ces cellules immunosuppressives dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. Afin de montrer le lien de causalité entre la présence des cellules impliquées et la perte d’efficacité des traitement d'immunothérapie, nous souhaitons dans un contexte traitement antibiotiqueou par la colonisation intestinale par certaines bactéries être en mesure d’induire une forte expression de la protéine d'intérêt à distance de la tumeur afin de capter certaines cellules d'importance. Nous envisageons donc d’administrer une molécule induisant l’expression la protéine d'intérêt dans le foie. Le rationnel de ce projet est de confirmer l’effet délétère de ces cellules importantes recirculantes au cours d’une modification du microbiote intestinal en forçant leur rétention dans le foie plutôt que dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons montrer qu’en l’absence de ces cellules d'intérêt d'origine intestinales dans la tumeur, nous sommes en mesure de restaurer l’efficacité des traitements par immunothérapie, malgré le contexte de changement de microbiote intestinal. Cela aurait donc un impact très important sur la survie des patients résistants aux traitements par immunothérapies.

Procédures

Greffes de tumeur: une injection sous anesthésie locale, durée 1 minute. Prélèvements de sang sous anesthésie générale (1 fois/semaine, durée 3 minutes) - Injection du produit (molécule d'ADN d'intérêt) sous anesthésie générale (1 fois, durée 3 minutes), prostration de courte durée suite à l'injection.

Impact sur les animaux

Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs, d’administration orale de bactéries et l’injection du plasmide, ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons définis un nombre maximal théorique de 18 animaux par groupe. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes entre eux. Le nombre d'animaux par groupe pourra être diminué à 12 (analyses en cours de procédure) si nous obtenons une résultat statistique. Ce résultat statistique sera basé sur la réduction du nombre de cellules a4b7 dans la tumeur ou leur augmentation dans le foie en présence du plasmide. Enfin, les dernières procédures envisagées se seront réalisées que si les premières procédures donnent les résultats attendus.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être, avec enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement (prostration, auto-agressions, etc). Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Les points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. - Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines.

Une perte de poids de plus de 15 %, ou de plus de 10 % pendant plus de trois jours, constitue un point limite pour les 25 500 rongeurs de ce projet : 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les composés testés, froids ou radiomarqués, leur sont administrés par la bouche, le nez, la trachée, le muscle, la peau, l'abdomen, la veine porte, le cerveau ou la vessie, cette dernière voie après jusqu'à quatre heures de privation d'eau, ou par minipompe implantée par chirurgie. La phase in vivo peut durer jusqu'à 12 mois, avec des jeûnes jusqu'à 16 heures et un hébergement individuel sans enrichissement pour recueillir urines et fèces, afin de mesurer la distribution et l'élimination de composés que le résumé ne nomme pas. Le porteur déclare 10 220 rongeurs réutilisés, et réserve ce maintien en vie à ceux qui n'ont reçu qu'une administration unique de composé non radioactif et sont restés moins d'une semaine en procédure, les autres étant mis à mort pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. Ce projet permettra d’une part de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. Une seconde partie du projet aura recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, ou des paramètres métaboliques (insulinémie, glycémie) et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Dans le cas de l’insulinémie et de la glycémie ou d’autres paramètres métaboliques, une injection de glucose en IP ou SC ou une administration PO pourront être réalisées au préalable des prélèvements sanguins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie: intranasale, intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire, intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte d’1min environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ 1h); injection intraportale ou minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ 1h). Les implants pourront être retirés au plus tôt une semaine plus tard (chirurgie d’environ 15min, anesthésie d’environ 1h). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’1h) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h,Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vis sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité (diarrhée, perte de poids, douleur, signes neurologiques), ce qui sera surveillée. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit. Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.

Devenir

Les animaux seront la plupart du temps mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé non radioactif et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront réalisées sur les paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales, intravésicales, intraportales, les prélèvements de liquide cérébrospinal et les poses et retraits de mini-pompes osmotiques ou d’un implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (buprénorphine au moins 30 minutes avant). Pour les pompes et implants, les animaux seront hébergés individuellement et suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie suturée (en général 3-4 jours) et des soins locaux seront apportés si nécessaire. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique (buprénorphine).

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.