Procédures modérées

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent de la cuprizone dans leur nourriture pour détruire leur myéline pendant quatre à douze semaines, puis une injection létale afin de prélever leur cerveau, pour étudier le rôle du récepteur RXRg dans la remyélinisation. Le porteur affirme que la cuprizone n'entraîne ni douleur ni inconfort et laisse un comportement normal, tout en déclarant le projet en gravité modérée. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la remyélinisation, processus dynamique qui ne pourrait selon lui être observé que chez l'animal vivant.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune affectant le système nerveux central (SNC). Causée par une dysfonction du système immunitaire, elle engendre des lésions de la myéline qui provoquent des perturbations motrices, sensitives, cognitives, visuelles et autres. Les traitements actuels sont insuffisants pour empêcher la progression du handicap à moyen terme. La myéline est une gaine qui entoure les fibres nerveuses. Cette gaine est nécessaire pour une bonne conduction de l’influx nerveux. Lorsque la myéline est dégradée, elle doit être reformée par des cellules spécialisées. Toutefois, dans la SEP, la myéline est la cible du système immunitaire qui engendre une réaction inflammatoire excessive. A long terme, cette inflammation empêche la myéline de se reformer conduisant aux symptômes cités précédemment. Il est important de comprendre pourquoi la myéline n’est pas reformée. En effet, une stratégie thérapeutique serait de stimuler la régénération de la myéline. Grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées, nous étudierons comment la myéline se forme et comment différents facteurs peuvent stimuler sa régénération dans la SEP.

Bénéfices attendus

La myéline est une gaine biologique qui entoure les fibres nerveuses dans le système nerveux central. Cette gaine est nécessaire pour la transmission des informations entre les neurones. La dégradation de la myéline et son remplacement sont un processus physiologique naturel, toutefois chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP) la myéline est la cible du système immunitaire ce qui entraine différents troubles neurologiques tels que des troubles moteurs, et une réaction inflammatoire importante. Une des conséquences de cette réaction inflammatoire est d’empêcher la régénération de la myéline et donc de contribuer à la maintenance des troubles cités. Différents acteurs ont été identifiés comme facteurs stimulant la formation de myéline dans la SEP. En utilisant des souris modifiées génétiquement, nous déterminerons l’implication de ces facteurs dans la formation de myéline en conditions pathologiques. Ceci pourrait mettre en lumière un mécanisme de remyélinisation précis qui pourrait également ouvrir une nouvelle voie de recherche dans la SEP et vers de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Ici, n=300 animaux recevront un régime alimentaire comprenant de la Cuprizone pour générer une perte de myéline pendant différents temps (4, 5, 6, 12 semaines et un groupe deux fois 4 semaines). A l’issue de ces différents temps de consommation, les animaux ayant consommé la Cuprizone ainsi que les contrôles (n=30) non nourris à la Cuprizone pendant 5 semaines recevront une injection létale d’anésthésique et seront mis à mort. Le cerveau de ces animaux sera prélevé pour réaliser des analyses immunohistochimiques.

Impact sur les animaux

La cuprizone est un traitement introduit dans la nourriture qui induit une démyélinisation des neurones et une activation du système immunitaire. Ce traitement n’entraîne pas de douleur ou d’inconfort chez l’animal, et les symptômes moteurs liés à ce traitement, telle que la coordination motrice, sont faibles. De plus, le traitement à la Cuprizone n'engedrera aucune modification du comportement animal, les animaux auront un comportement tout à fait normal. Toutefois, au début de la consommation, une légère perte de poids peut être observée chez la souris bien qu'il y ait une absence de faim/soif chez l'animal. L’effet de la Cuprizone est également réversible, c’est-à-dire que l’arrêt de sa consommation entraîne la restauration de la myéline. Un dernier effet attendu est le léger stress généré chez l’animal par les injections intrapéritonéales d’anesthésique/analgésique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les organes pour réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les modèles murins par un modèle in vitro dans cette étude pour trois raisons principales : (i) la myélinisation développementale ou remyélinisation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités de types cellulaires différents et ne peut être reproduit que chez un animal vivant dans son intégrité; (ii); une analyse de remyélinisation est espèce-dépendant, cependant la souris reste un très bon modèle de la myélinisation chez l’Homme; (iii) la souris est notre modèle de référence dans la recherche sur les récepteurs de vitamine A car c’est dans ce modèle que nous avons déjà identifié des programmes moléculaires contrôlés par ces récepteurs ainsi que des traitements pharmacologiques pour les futurs développements de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus, ce projet émane des nombreuses analyses menées préalablement in vitro sur des cultures primaires des oligodendrocytes, microglie ou des neurones qui nous ont amenées à proposer ce projet et tester in vivo nos hypothèses de travail.

Réduction

Dans ce projet, nous prévoyons d’utiliser 10 animaux par lot de chaque sexe. Ces effectifs tiennent compte de la variabilité inter-individus ainsi que de potentielles différencies liées au sexe. Les analyses seront réalisées avec des tests statistiques adaptés. Si des différences liées au sexe sont mises en évidence, des études plus poussées seront réalisées dans un second temps. Dans l’éventualité où des complications apparaissent durant l’expérience, 10 % d’animaux supplémentaires par lignée seront prévus (soit n=10 par lignée) afin de conserver un nombre suffisant de réplicat pour réaliser des analyses statistiques. Ceci représente un ajout de n=10 animaux/lignées, soit 30 animaux en plus. A des fins de réduction, les animaux générés en plus pourront servir aux différents temps de consommation de Cuprizone si besoin est. Il est possible que peu voire aucun animal ne meurt durant l’expérience. Dans ce cas, les 10% d'animaux supplémentaires prévus par lignée ne seront pas utilisés.

Raffinement

En vue de raffiner les procédures, les animaux sont hébergés en groupe dans des conditions optimales (dans des portoirs ventilés et avec un nid) et ils font l’objet d’un suivi adapté et régulier et de soins vétérinaires au besoin. Ici, nous ne nous attendons pas à engendrer une douleur/souffrance aux animaux. En effet, la Cuprizone est faiblement concentrée, les dégradations de myéline seront mineures et principalement localisées dans le corps calleux, ce qui ne devrait pas générer de phénotype durant le suivi expérimental. Quelques troubles de coordination motrices peuvent cependant être observés en début de traitement. De plus, une légère perte de poids peut être observée au début de la consommation de Cuprizone. Le poids corporel des animaux sera alors contrôlé avant, pendant, et après consommation de Cuprizone. Si une perte de poids comprise entre 5 % et 10 % est observée, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition de la souris pour faciliter sa prise alimentaire. Si une perte de poids supérieure à 10 % est observée, l’animal sera exclu de la procédure. A l’issue de la consommation de Cuprizone, la procédure expérimentale sera réalisée sous anesthésie générale par injection d'un mélange d'anesthésique : analgésique afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. Les injections sont peu douloureuses également, et génèrent principalement un stress à l'animal. A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort par un manipulateur expérimenté en minimisant le stress animal.

Choix des espèces

La myéline est une gaine biologique qui entoure les neurones assurant ainsi leur protection d’une part, et la transmission des messages nerveux d’autre part. La dégradation de la myéline et son remplacement sont un processus physiologique naturel. Cependant, chez des patients atteints de sclérose en plaques (SEP), la myéline est dégradée par le système immunitaire ce qui engendre différents troubles moteurs et cognitifs, et une réaction inflammatoire importante. Cette dernière va empêcher la régénération de myéline et donc maintenir les troubles cités précédemment. Une stratégie thérapeutique serait de stimuler la régénération de myéline. Pour comprendre comment la remyélinisation se met en place, nous utiliserons le modèle murin puisque ce modèle récapitule très bien la myélinisation chez l’Homme. De plus, les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet nous permettent d’étudier des programmes moléculaires importants dans la régénération de myéline, et différents traitements pharmacologiques ciblant ce programme ont déjà été validés chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes (âgées de 8 semaines) pour évaluer la régénération de la myéline dans des conditions pathologiques mimant la sclérose en plaques.

1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues à 90 % de leur poids pendant environ huit semaines, subissent une chirurgie stéréotaxique de quatre-vingt-dix minutes, un régime hypercalorique de treize semaines puis une injection de lipopolysaccharide, pour étudier le lien entre inflammation, dopamine et "fatigue". Le porteur indique que le lipopolysaccharide provoque un comportement de maladie avec fièvre et perte d'appétit pendant une douzaine d'heures. Il affirme que ces dimensions comportementales ne sont pas modélisables in vitro ou in silico.

Objectifs

De nombreuses études cliniques montrent que l'inflammation peut conduire au développement de symptômes dépressifs, en particulier la "fatigue". Ce projet vise à déterminer si et comment la manipulation d'enzymes de la voie de synthèse de la dopamine sélectivement au sein de la voie mésocorticolimbique est suffisant pour restaurer les troubles motivationnels induits par un état inflammatoire.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment l'inflammation perturbe la transmission dopaminergique, et si manipuler la voie de synthèse de la dopamine mésocorticolimbique pourrait permettre de réverser les troubles motivationnels induits par l'inflammation.

Procédures

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) durant environ 8 semaines - 1 chirurgie stéréotaxique d'environ 90 minutes- Exposition chronique à des régimes hypercaloriques pendant environ 13 semaines- Administration aigue de lipopolysaccharide (quelques secondes).

Impact sur les animaux

Une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) a des effets très limités pour l'animal. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. L'exposition chronique à des régimes hypercaloriques conduit au développement d'une obésité. L'administration aigue de lipopolysaccharide induit un comportement dit "de maladie" (fièvre, perte d'apétit, etc..) pendant une douzaine d'heure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes.

Raffinement

Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage: - Perte de poids anormale (15% score 1, 15-20% score 2) - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...) score 3 - Signes neurologiques score 2 Si un score entre 9 et 12 persiste pendant plus de 48h les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale suivie de décapitation. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations de la synthèse de dopamine sur le cerveau mature.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les unes reçoivent de la streptozotocine par injection cinq jours de suite pour induire un diabète, les autres un régime gras pour devenir obèses, puis toutes sont gavées douze jours avec trois composés bloquant les récepteurs CB1. Le porteur indique un risque important de déshydratation chez les animaux diabétiques et une possible dermatite chez les animaux obèses. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur l'organisme entier et qu'aucun modèle cellulaire ne peut se substituer totalement au modèle animal.

Objectifs

L’obésité et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandues et souffrent d’un manque de traitements pharmacologiques fiables. Les pathologies liées à l’obésité sont nombreuses et incluent le diabète lui-même facteur de risque de néphropathie. La néphropathie diabétique (ND) consiste en une perte de fonction rénale pouvant déboucher sur insuffisance rénale chronique touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Récemment, 3 composés visant à bloquer une nouvelle cible (A , B et C) ont été sélectionnés pour être testés in vivo après avoir démontré une absence de toxicité à travers plusieurs approches de modélisation informatique et de tests in vitro. Ainsi, notre objectif est de tester l’efficacité in vivo de ces 3 composés chez 2 modèles animaux différents. Procédure 1 : chez un modèle de souris diabétique de type 1 Procédure 2 : chez un modèle de souris rendue obèse suite à une alimentation riche en graisse.

Bénéfices attendus

Le diabète et l’obésité représentent un véritable enjeu de santé publique ; ces pathologies étant classées parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’évolution de ces pathologies et de leurs complications. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. Les bloqueurs des récepteurs aux cannabinoïdes 1 présentent un intérêt certain, l’un d’eux est d’ailleurs actuellement en cours d’évaluation au sein d’une étude clinique de phase II avec comme indication, la ND.

Procédures

Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et n’aura lieu que 2 fois par animal pour la procédure 1 et 7 fois pour la procédure 2. Les injections intrapéritonéale de streptozotocine auront lieu quotidiennement pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. Pour chaque injection, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes. Pendant les 12 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage. Pour chaque gavage, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses et des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que ces pathologies ne soient pas des points limites, les conséquences qu’elles génèrent peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont très importants chez les animaux diabétiques et nécessite une attention particulière. Pour le modèle d’obésité, une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peux également entraîné le développement passager de dermatite.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

L’obésité et le diabète sont des pathologies multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

Pour le modèle STZ, la sévérité de la pathologie est estimée par la mesure du degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 8-10. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte. Pour le modèle d’obésité, la même approche sera employée en analysant la perte de poids et la diminution de quantité de graisse contenue dans le foie.

Raffinement

Depuis leur arrivée en provenance du fournisseur, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Tout au long de ce projet, plusieurs mesures de raffinement sont prévues.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Son métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction du diabète et de l’obésité sera réalisée chez des souris de 6 semaines. Pour le modèle STZ (streptozotocine), les souris seront âgées de 20 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 22 semaines lors de la mise à mort. Pour le modèle d’obésité, les souris seront âgées de 22 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 24 semaines lors de la mise à mort. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.

60 volailles vont être utilisées, maintenues en cages individuelles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis remises en élevage si le responsable du bien-être animal le valide. Les mâles subissent des prélèvements de semence par massage dorso-lombaire trois fois par semaine et les femelles sont inséminées artificiellement, pour comparer deux cryoprotecteurs de la semence. Le porteur décrit ces gestes comme des "pratiques d'élevage courantes" et justifie l'isolement en cage par les comportements agressifs des mâles. Il affirme qu'aucun test in vitro ne peut remplacer l'évaluation in vivo de la fertilité.

Objectifs

L’objectif de cette expérimentation est de définir quel serait le meilleur cryoprotecteur non toxique pour les spermatozoïdes de coqs entre le diméthylacétamide (DMA) et le diméthylformamide(DMF).Nous allons cryoconserver de la semence aviaire avec les deux cryoprotecteurs et réaliser des analyses in vitro de qualité de la semence avant et après congélation afin de déterminer quel cryoprotecteur est le moins délétère pour la semence.

Bénéfices attendus

Suite à ce projet nous serons capables d’affirmer quel cryoprotecteur parmi le DMF et le DMA est le meilleur cryoprotecteur à utiliser pour cryopréserver de la semence de Gallus gallus. Suite à ce projet, nous pourrons optimiser le protocole de manière à obtenir un taux de fertilité maximal après cryopréservation de la semence avec l’un de ces cryoprotecteur. L’avantage de cette technique est qu’il ne sera pas nécessaire de rétirer le cryoprotecteur à la décongélation avant de réaliser les inséminations à l’inverse du protocole actuel qui utilise le glycérol comme cryoprotecteur. Le glycérol étant un spermicide il est nécessaire de le rétirer à la décongélation ce qui complique l’utilisation de la semence cryopréservée aviaire.

Procédures

Mise en cages individuelles Les prélèvements de semence auront lieu 3 fois par semaines espacés de 48h par du personnel qualifié. La méthode de collecte se fera par la technique de massage dorso lombaire décrite par Burrow et Quin, ce prélèvement dure entre 20 et 40 secondes. 3 inséminations artificielles seront réalisées espacées de 48h, ce geste d'élevage duren environ 5 secondes.

Impact sur les animaux

Des pratiques d’élevage courantes seront mises en œuvre, collecte de semence, inséminations artificielles. Les animaux devront être placés en cage individuelle pour éviter les comportements agressifs des mâles et pour suivre la ponte et la fertilité des femelles.

Devenir

Les animaux seront remis en élevage, si le responsable du bien-être animal valide cette possibilitée.

Remplacement

Etant donné que nous souhaitons étudier l’effet de la cryopreservation sur le potentiel de fertilité de la semence aviaire aucun test in vitro ne pourra remplacer les étapes in vivo (test de fertilité).

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum informatif et est basé sur les publications récentes sur le sujet. Etant donné le taux de ponte des femelles utilisées pour cette expérimentation, le nombre de 30 femelles est le minimum pour pouvoir tirer des conclusions sur l’effet des cryoprotecteurs sur le potentiel de la semence congelée-décongelée. Le nombre de mâles est défini à 30 pour avoir suffisament de matériel biologique (semence, 1 ml par éjaculat pour tester les différentes conditions de cryiopréservation et réaliser les tests de fertilité dans le temps imparti (8 semaines). Nous allons calculer des pourcentages de fertilités et comparer les 2 conditions. Nous allons comparer les pourcentages de fertilités entre les différentes conditions. Les variables suivies seront la fertilité des poules. Les données de fertilité seront analysées afin d'évaluer l'influence des conditions suivantes : DMF vs DMA. Nous comparerons les résultats obtenus avec ceux de la littérature pour savoir si les moyennes de fertilités de notre expérimentation sont proches des résultats préalablement obtenus.

Raffinement

Les poules et les coqs hébergés en cages individuelles de 0.75 m² pendant 8 semaines au maximum bénéficient d'un milieu enrichi par un jouet à picorer ainsi qu'un perchoir, et de la proximité avec leurs congénères permettant des échanges visuels, olfactifs et auditifs.

Choix des espèces

Travaillant avec les sélectionneurs avicoles, mon modèle d’étude est la poule. Cette étude est mise en place suite aux sollicitations des sélectionneurs pour mettre au point une méthode d’utilisation de la semence cryopréservée simplifiée. Le stade de développement correspond à l’âge des animaux utilisés pour renouveler les cheptels des lignées parentales des sélectionneurs avicoles.

6 900 animaux non-humains, 4 200 souris, 1 800 rats et 900 cobayes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont sensibilisés à l'ovalbumine et au pollen d'ambroisie, puis reçoivent des gouttes oculaires et des injections répétées, pour tester des substances contre la conjonctivite allergique. Le porteur indique que le nouveau contact avec l'allergène provoque un gonflement de la conjonctive, une hyperémie et un larmoiement, et que des nodules peuvent apparaître au site d'immunisation. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit l'œil dans sa globalité et conclut à la nécessité de recourir à ces animaux.

Objectifs

Comme l’allergie respiratoire, l’allergie oculaire est associée à une hypersensibilité allergique de type immédiat. Elle concerne essentiellement les conjonctivites allergiques bégnines c’est-à-dire la conjonctivite allergique saisonnière et la conjonctivite allergique péri-annuelle. Cette hypersensibilité concerne aussi pour partie les conjonctivites sévères compliquées de kératite comme la kératite conjonctivale vernale et la kératite conjonctivale atopique. Les allergènes responsables sont des pneumallergènes, aussi responsables de symptômes respiratoires, tels que les acariens ou les pollens ainsi que des trophallergènes comme l’arachide ou le blanc d’œuf. Ce projet a pour but de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux en permettant d’identifier et de tester l’efficacité de substances thérapeutiques visant à diminuer l’effet des allergènes dans la conjonctivite allergique. Dans ce cadre, nous proposons de mettre en place un protocole de sensibilisation à deux antigènes (l’ovalbumine et le pollen d’ambroisie) chez la souris, le rat ou le cobaye. Dans un second temps, nous testerons différents types de traitements.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Les procédures expérimentales nécessitent l'administration de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale (anesthésies). Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements de sang se feront par ponction et dureront moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Après un nouveau contact entre l'allergène et l'organisme « sensibilisé » par une précédente exposition, les nuisances attendues se manifesteront au niveau local par un gonflement de la conjonctive accompagné d'une hyperémie et d'un larmoiement. Au niveau du site d'immunisation, une réaction inflammatoire avec potentiellement la présence de nodules sous-cutanés peut être observée. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosages...).

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger. Si la procédure expérimentale le permet un abri sera ajouté. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie légère. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des cobayes ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude, les cobayes 8 semaines. Ce qui correspond à de jeunes adultes ayant atteint leur maturité de développement oculaire comme il convient au modèle.

321 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation cérébrale sous anesthésie et une administration intranasale, puis passent des tests de mémoire et de locomotion et des échodopplers répétés sur six mois, avant euthanasie pour prélever leurs structures cérébrales. L'objet est de tester des vésicules issues de cellules souches contre les troubles cognitifs qui suivent une radiothérapie du cerveau. Le porteur indique que les transports entre établissements peuvent stresser et amaigrir les animaux, et juge le modèle in vivo incontournable.

Objectifs

La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules constituant les vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, 50% à 90% des patients traités par radiothérapie pour des tumeurs du cerveau présentent dans les 6 mois après leur traitement des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. De nouveaux traitements permettraient d’améliorer la qualité de vie des patients. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses (CSM) pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les CSM sont un type de cellules souches très utilisé en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue (prélèvement et administration chez la même personne) des CSM. Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture des CMS. On note surtout une efficacité diminuée en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des CSM serait majoritairement lié à des vésicules extracellulaires (VE) qu’elles sécrètent. Elles sont produites en grand nombre par les CSM suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de VE in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des CSM via le patient. Les VE sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les VE permettent de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et pourraient donc limiter le développement des troubles cognitifs. Dans le cadre de ce projet, la mesure du flux sanguin cérébral sera réalisée de façon non invasive dans un autre établissement possédant expertise et équipement adaptés .

Bénéfices attendus

Les bénéfices que ce projet pourrait apporter sont multiples tels que : -une nouvelle thérapie non-invasive -une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) -une amélioration de la qualité de vie des patients vis-à-vis des troubles cognitifs

Procédures

Aucune chirurgie. Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes. Perfusion intracardiaque sous anesthésique, durée 15 minutes. Irradiation cérébrale sous anesthésie: 10 min.Administration intra-nasale sous anesthésie : environ 5 min par administration, 1 seule administration. Les animaux subiront plusieurs fois les interventions qui suivent à différents temps. Tests comportementaux 3 à 10 min (mémoire, locomotion) réalisés 4 fois sur une période de 6 mois): Analyse echodoppler 1 fois par mois sous anesthésie : 10 min.

Impact sur les animaux

Pour les irradiations, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Après irradiation, un animal peut développer des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri Après injection nasale, les effets indésirables peuvent être un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, difficultés à se déplacer, amaigrissement Le transport des animaux peut également conduire à du stress et de l’angoisse conduisant à un amaigrissement

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.

Remplacement

Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles précliniques (modèles animaux). En effet, lors des demandes d’Autorisation de mise sur le marché (AMM) ou des médicaments de thérapie innovante auprès de l’ANSM les études précliniques (modèle rongeurs, porcins ou primates) sont demandés. De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent pas d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.

Réduction

Les modèles d’expérimentation animale présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticiens déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les personnes compétentes impliquées dans ce projet, afin d’appliquer les points limites pour réduire la souffrance des animaux. De plus, lors de leur transport, les animaux seront placés dans des boites avec sciure, coton et gel qui remplace l’eau et les croquettes (4 animaux par boites de transport, nous ne mélangeons pas les groupes d’animaux). Si un animal présente des signes de souffrance, son euthanasie anticipée sera réalisée.

Choix des espèces

Nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Pour cette étude nous utliserons un modèle pré-clinique murin à l’age de 8 semaines. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés. Enfin, nous maîtrisons, chez la souris, les techniques et les équipements afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires (anticorps) et cognitifs indispensable pour démontrer l’efficacité de notre traitement. L’utilisation d’un modèle in vivo est aujourd’hui incontournable pour développer et proposer des thérapies innovantes. En effet, lors des demandes d’Autorisation de mise sur le marché (AMM) ou des médicaments de thérapie innovante auprès de l’ANSM les études précliniques (modèle rongeurs, porcins ou primates) sont demandés.

1 576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales issues de patients, puis des traitements par gavage, dans l'eau de boisson ou par voie intrapéritonéale, avec une imagerie hebdomadaire, avant sacrifice pour analyser l'infiltration tumorale. Le porteur indique que l'injection de cellules tumorales peut provoquer une perte de poids rapide et une hépatite, et vise à tester des traitements contre un lymphome intestinal compliquant la maladie cœliaque. Il affirme que la réponse des cellules malignes ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

La maladie coeliaque est une maladie intestinale inflammatoire fréquente induite par l’ingestion de gluten un protéine présente dans les farine (blé, orge, seigle). Une complication rare mais sévère est l’émergence de lymphomes intestinaux chez des patients ne répondant pas au régime sans gluten. L'accumulation de lymphocytes intestinaux peut donner naissance, chez certains patients coeliaques à un lymphome intestinal aussi appelé maladie coeliaque réfractaire de type II. Les cellules formant le lymphome contiennent des mutations hautement récurrentes augmentant l'activité d'une enzyme et/ou d'un facteur de transcription ainsi qu’un spectre de complémentaire d’autres mutations. Notre hypothèse est que ces mutations confèrent un avantage dans l’environnement intestinal inflammatoire des patients coeliaques. Le clone de cellules mutées pourrait ainsi s’expandre aux dépends des cellules normales et aboutir à un lymphome intestinal. Ce lymphome évolue initialement à bas bruit mais peut dans 40-50% des cas évoluer vers un lymphome invasif de très mauvais pronostic. Un objectif important est la mise au point de traitements capables d’éliminer les cellules mutées précocement avant l'aggravation de la maladie. Il semble en particulier important de tester les inhibiteurs spécifiques de l'enzyme et du facteur de transcription muté. Néanmoins la présence d’un nombre important de mutations additionnelles expose au risque de résistance des cellules au traitement. Notre but est de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques dans un modèle de souris obtenu par injection de lignées cellulaires malignes issues des biopsies intestinales de patients atteints de maladie coeliaque réfractaire de type II. Nous chercherons à évaluer leur efficacité sur le développement tumoral mais aussi le risque de sélection de cellules tumorales résistantes aux traitements, ceci afin d’évaluer les bénéfices et risques des traitements pour les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de tester l’efficacité des différentes molécules ciblant les voies de signalisations impliquées sur le développement des cellules tumorales et de tester un possible échappement. Seules des drogues déjà autorisées en clinique humaine seront utilisées, suggérant qu’il n’y aura pas de toxicité excessive. A terme, ce projet pourrait permettre de développer des traitements permettant de prévenir ou stopper le développement de lymphomes chez les patients coeliaques.

Procédures

Injection de cellules tumorales de patient (réalisée sur 1576 souris) : Les lignées cellulaires humaines transduites ou non seront injectées par voie intraveineuse rétro-orbitaire avec des seringues menues d’aiguilles à insuline(durée de l’injection : 5 secondes). Administration de traitements (réalisé sur 1176 souris) : - un traitement délivré en per os dans l’eau de boisson tous les deux jours (réalisé sur 294 souris) (durée de l’injection : 5 secondes) - deux traitements administrés par gavage oral tous les jours à l’aide d’une aiguille de gavage d (réalisé sur 588 souris) (durée de l’injection : 5 secondes). - un traitement administré par voie intra-péritonéale deux fois par semaine (réalisé sur 294 souris) (durée de l’injection : 5 secondes). Imagerie intra-vitale (réalisée sur 616 souris) : Les souris seront imagées à l’aide de l’IVIS spectrum 1 fois par semaine depuis l’injection des cellules tumorales jusqu’au sacrifice. Le temps d’imagerie dépend de la puissance du signal mais ne dépasse pas 30 min par animal.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Les souris génétiquement modifiées que nous souhaitons utiliser ne présentent pas de phénotype dommageable dans nos conditions d'utilisation. L'injection de cellules tumorales humaines est succeptible d'entrainer une perte de poids rapide ainsi qu'une hépatite.

Devenir

Les animaux seront tous sacrifiés à la fin de chaque procédure afin d'analyser l'infiltrat de cellules tumorales dans les différents organes (rate, foie, sang, rein et intestin).

Remplacement

La réponse de cellules malignes à un traitement est un mécanisme complexe qui ne peut être récapitulée in vitro. Nous avons dans un premier temps utilisé des cultures primaires in vitro pour cerner les drogues d’intérêt, nous permettant de réduire fortement l’utilisation d’animaux. Les cellules de patients étant fragiles et difficiles à cultiver in vitro, l’utilisation de modèle murin nous permettra de les amplifier dans un contexte riche en IL-15 afin de tester plusieurs stratégies thérapeutiques et de déterminer les effets de ces molécules sur les cellules transformées et d’évaluer le risque d’échappement tumoral favorisant leur progression vers des lymphomes invasifs.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible en tenant compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse, incluant pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles et de la nécessité de reproduire les résultats. Le nombre de 5 souris/lot est choisi pour permettre les analyses statistiques. Afin de limiter le nombre de souris, la viabilité cellulaire sera quantifiée avant toute injection pour optimiser la prise de greffe.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, mâles et femelles séparés, et le nombre d’individus par cage limité entre 2 et 5 individus pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes d'agréssion ou de stress engendrés par une population trop importante. Nous serons aussi très attentifs au bien-être des animaux. Nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement par la mise à dispositionde boules de coton, de maisonnettes en carton, de bâtonnets à ronger et d’un tunnel. La surveillance du bien-être des animaux sera assurée au quotidien par le personnel de l’animalerie et hebdomadaire par les expérimentateurs. Les expériences et en particulier l’injection de cellules seront réalisées par des personnes expérimentées et qualifiées afin d'éviter toutes fausses manipulations ou un éventuel stress pour les animaux. Les procédures d’injection sont peu douloureuses mais l’utilisation d’anti-inflammatoires ou analgésiques pourrait compliquer l’interprétation des résultats sur la progression tumorale. Les animaux seront alors particulièrement surveillés lors de ces procédures. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux souris, les prélèvements de sang se dérouleront sous anesthésie locale avec de la tétracaïne et les injections de cellules malignes humaines sous anesthésie générale . Le réveil se déroulera dans un environnement calme et silencieux. Des points-limite ont été établis, consuisant à la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera surveillé de façon quotidienne et selon la progression des symptômes observés via une grille d’évaluation, la prise de greffe et les variations de poids corporel.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes constituent un modèle d’étude reconnu pour la réalisation de greffes humaines. L’expression d'un facteur de croissance humain que nous savons indispensable à l’expansion des cellules malignes in vitro et qui assurera l'expansion des cellules de patients après injection chez la souris immunodéficiente. Les souris utilisées seront des souris adultes d’environ 8 semaines.