Procédures modérées

Produire de la "matrice témoin", du sang, du plasma, de l'urine, des fèces, des biopsies de peau et de muscle exempts de tout produit testé, pour valider les méthodes de dosage d'autres études : 100 chiens et 105 chats vont être utilisés à cette fin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon le prélèvement, chaque chien ou chat subit une prise de sang sous contention manuelle, un séjour de 24 heures au plus seul en cage à métabolisme, ou un prélèvement de tissu sous anesthésie. Le porteur déclare que l'effectif de 205 animaux non-humains est le "minimal" pour cinq ans, tout en reconnaissant n'avoir fait aucune approche statistique. Les deux déclarations sur le devenir gardent les 205 chiens et chats en vie pour d'autres usages, y compris après un prélèvement de tissu sous anesthésie, alors que la description des procédures estime à une ou deux minutes la durée d'une mise à mort.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de fournir des échantillons témoins c'est à dire ne contenant pas le produit test qui sera analysé ( par exemple du sang, du serum, du plasma, des excretas, des biopsies cutanées et musculaires et des liquides céphalo-rachidien) afin de permettre le dosage des échantillons. Il est indispensable d'avoir à disposition de la matrice témoin ou exempte de molécule active pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages.

Bénéfices attendus

Il est indispensable d'avoir de la matrice témoin. Il s'agit d'échantillons témoins c'est à dire ne contenant pas le produit test qui sera analysé pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages. Cela est indispensable pour valider les résultats d'une étude.

Procédures

Les animaux seront soumis à un seul prélèvement de sang. La durée du prélèvement sera de l'ordre de la minute. Ce prélèvement sanguin servira à fournir de la matrice témoin en plasma ou en sang. Pour générer de la matrice d'urine ou de féces, les animaux seront placés en cage à métabolisme de façon individuelle pour une durée maximale de 24h. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Les échantillons d'urine ou de féces seront juste collectés sans aucune manipulation particulière de l'animal. Pour générer des matrices tissulaires , les animaux seront préalablement anesthésiés. Ces gestes seront réalisés par un personnel formé selon les bonnes pratiques vétérinaires et la règlementation en vigueur. La durée de l'anesthésie est de l'ordre de la minute et la durée de l'euthanasie est de l'ordre de quelques minutes (estimation entre 1 à 2 minutes)

Impact sur les animaux

Pour pouvoir générer de la matrice témoin il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble. L'animal subira une contention manuelle pour pouvoir réaliser un prélèvement sanguin. Le temps d'immobilisation même de courte durée pourra induire un stress chez l'animal. Dans le cas de recueil d'excrétas, l'animal devra la plupart du temps être hébergé en cage à métabolisme (pour une durée maximale de 24h) pour pouvoir collecter des échantillons d'urine ou de fèces témoins. Ce type d'hébergement entraînant un isolement de l'animal qui peut également engendrer un stress.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie: dans le cas de prélèvement sanguin classique (volume inférieur à 20 % du volume circulant de l'animal) et dans le cas de collecte d'excrétas (urine, féces) ou dans le cas de prélèvement tissulaire sous anesthésie générale.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de générer de la matrice témoin, il est indispensable de recourir à l’animal dans son ensemble . En effet la non utilisation de matrice témoin entraine un bias dans la méthode. Si l'échantillon qui permet la quantification est différent de celui à quantifier, la méthode n'est pas exacte.

Réduction

100 chiens et 105 chats sont prévus dans ce projet. C'est le nombre d'animaux minimal pour générer de la matrice témoin sur une durée de 5 ans. Aucune approche statistique faite pour ce projet. Les mesures prises pour réduire le nombre d'animaux sont l'utilisation d'une méthode avec un seuil de quantification faible , l'appareillage utilisé devra avoir un seuil de détection faible afin de réduire au maximum la quantité d'échantillon utilisé pour la quantification. Le nombre d'échantillon nécessaire pour la quantification sera réduit afin d'assurer l'exactitude de la méthode.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, à même le sol. De l'enrichissement sera présent autant que possible. Pour l'espèce chien , des balles, des cordes, des tablettes seront présentes. Pour l'espèce chat, des griffoirs, coussins, cordage seront présents autant que possible dans les hébergements. Les animaux seront manipulés par un personnel formé et tout geste sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. En ce qui concerne les prélèvements de sang pour les matrices témoins sang / plasma, 7.5% du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée d'une semaine pour l'animal. 10 % du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée deux semaines pour l'animal. 15 % du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée de quatre semaines pour l'animal.. Pour la collecte d'excretas ( matrice d'urine ou de fèces), l'animal sera placé en cage à métabolisme pour une durée maximale de 24h et sera réduite autant que possible. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Dans ce projet les points limites sont : - Problèmes hématologique ou biochimique, dans ce cas l'animal ne sera pas inclus dans ce projet - Douleur observée au niveau du site de prélèvement avant la réalisation du prélèvement lui même, l'animal pourra être prélevé au niveau d'un autre site ou il n'y aura pas de prélèvement du tout. - Animal ayant un comportement inhabituel (prostré, poils ébouriffé, signes d'agressivités). Dans ce cas, l'animal sera observé plusieurs fois par jour pour suivre les signes comportementaux et sera exclu du projet. Cette décision sera prise en accord avec le vétérinaire désigné. - Animal présentant une perte de poids supérieur à 20 % par rapport à son poids basal. L'animal sera exclu de ce projet - Animal présentant des fèces liquides, diarrhéiques. En fonction de la fréquence et de la durée cela pourra éventuellement conduire à une exclusion du projet en accord avec la décision du vétérinaire responsable

Choix des espèces

Dans les études précliniques, il est très souvent nécessaire d'avoir de la matrice témoin (sang, serum, plasma, tissus, excretas). Ceci est indispensable pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages. Les espèces chiens et chats sont largement utilisés dans ce type d'étude en tant qu'espèces non rongeurs Cela dépendra des matrices témoins. S'il s'agit de prélèvement sanguin un animal de stade jeune adulte conviendra le mieux. S'il s'agit d'un prélèvement de tissus, un animal adulte vieillissant pourra plutôt être sélectionné. Cela dépendra des objectifs de l'étude pour laquelle la ou les matrices témoins seront collectées.

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chimiquement, entraînant perte de poids et diarrhées pouvant contenir du sang, puis les souris reçoivent un traitement par voie orale pendant quatorze jours avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur cherche à identifier le rôle d'un gène dans l'action d'une molécule anti-inflammatoire déjà testée en essai clinique de phase 2. Il justifie le recours à la souris par l'échec des modèles cellulaires à "conclure" et par la "complexité d'un organisme vivant entier", et cite parmi les mesures de raffinement un fond musical dans les locaux.

Objectifs

La Rectocolite hémorragique est une maladie inflammatoire chronique de l'intestin affectant 1 personne sur 1000. Elle se manifeste généralement par poussées plus ou moins sévères caractérisées par des diarrhées, des douleurs abdominales et un amaigrissement pouvant amener à des complications comme une péritonite. Sur le long terme, les patients sont exposés à un risque plus élevé de cancer du côlon. Des traitements existent et permettent de réduire cette inflammation mais ne fonctionnent pas chez un grand nombre de patients. Notre molécule a montré une efficacité anti-inflammatoire dans le modèle murin de colite et chez le patient atteint de rectocolite hémorragique lors d'un essai clinique de phase 2. Dans l’objectif d’une autorisation de mise sur le marché de cette molécule en tant que médicament, il est important de connaître son mode d’action afin de cibler les patients pour lesquels ce nouveau traitement serait bénéfique. Lors des études in vitro sur cellules et chez le patient, nous avons ciblé un gène qui pourrait être responsable de l'effet anti-inflammatoire de notre molécule. Pour valider notre hypothèse, nous utiliserons des souris chez lesquelles ce gène est non fonctionnel pour tester si l'effet anti-inflammatoire de notre composé est maintenu.

Bénéfices attendus

La mise sur le marché de ce composé permettra d'améliorer la prise en charge des patients pour qui les traitements actuels ne fonctionnent pas, et par la suite, de pouvoir travailler sur d'autres maladies dans lequel ce gène serait impliqué.

Procédures

Nous administrerons par voie orale quotidiennement aux animaux un traitement sur une durée de 14 jours. Cette procédure est non douloureuse et réalisée avec une contrainte de très courte durée (10 secondes en moyenne). Deux prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse (d’une durée de 3 secondes en moyenne) au cours de l'étude afin d'analyser différents paramètres biologiques. Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus chez les animaux résultent de la prise du composé qui induit la colite. Ce composé induit une altération du colon qui provoque une perte de poids chez les souris malgré une alimentation et une hydratation normale et des diarrhées qui peuvent ou non contenir du sang. Les effets apparaissent, notamment pour la perte de poids, entre le 6ième et le 7ième jour et persistent entre 2 ou 3 jours soit jusqu’au 9ème jour correspondant à la fin de l’étude.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus et évaluer l’efficacité du traitement.

Remplacement

Pour répondre à l'étude du mode d'action d'une molécule inflammatoire destinée à une mise sur le marché, seule l'utilisation d'un modèle murin est adapaté. En effet, les différents modèles cellulaires testés n'ont pas permis de conclure et ne représentent jamais la complexité d'un organisme vivant entier, l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés permet d’étudier plus précisément le rôle des gènes d’interêt.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en se garantissant l’obtention de résultats statistiquement représentatifs. Le nombre de souris pour chaque groupe est fixé à partir des résultats de tests statistiques précédemment obtenus dans un modèle de colite murine. Un maximum d’échantillons biologiques seront prélevès lors de l’euthanasie et seront conservés si une hypothèse est formulée après l’étude, permettant ainsi de ne pas recommencer l’étude pour y répondre.

Raffinement

La surveillance des animaux se fera quotidiennement avec une évaluation du stress et de la douleur. Plusieurs signes pour lesquels il est établi qu'ils reflètent une douleur ressentie par l'animal seront considérés comme points limites et entraineront l’euthanasie des animaux concernés. L'administration par voie orale sera privilégiée pour éviter l'apparition d'une péritonite douloureuse et stressante pour l'animal et elle sera réalisée par du personnel entrainé à un geste précis et rapide. Ceci afin de limiter le stress de l'animal. Une anesthésie gazeuse sera utilisée pour permettre un prélèvement sanguin indolore. L'hébergement des souris sera enrichi par l'ajout dans les cages de cabane en carton et de cotons, favorisant par exemple la construction de nids. Un fond musical est également assuré dans les locaux afin de diminuer le stress des animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin de colite est très documenté et permet de reproduire les symptômes et les mécanismes immunitaires de la rectocolite hémorragique chez l'homme. C’est un modèle très utilisé car sa mise en place est rapide (9 jours) ce qui permet de ne pas garder les animaux trop longtemps en expérimentation tout en offrant une bonne reproductibilité des résultats, évitant ainsi la répétition des études et limitant l’utilisation d’animaux. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 9 semaines car c’est l’âge optimal pour une induction de la colite qui ne soit ni trop importante ni trop mineure pour observer des effets de la molécule.

218 souris juvéniles de quatre semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un ou deux gavages de streptocoque du groupe B, susceptible de provoquer une infection systémique, avant d'être tuées pour prélever leurs organes et dénombrer les bactéries. Le porteur reste bref sur les atteintes, mentionnant un léger stress au gavage et le risque d'infection, sans détailler l'état des souris atteintes. Il indique recourir à un modèle cellulaire de barrière intestinale quand c'est possible, tout en jugeant la souris "indispensable" pour les interactions immunitaires.

Objectifs

Le streptocoque du groupe B est une bactérie présente naturellement chez environ un quart de la population, sans pour autant entraîner d’infection. Il s’agit pourtant de la première cause d’infection grave chez les nouveau-nés. Le streptocoque du groupe B se trouve habituellement dans l’intestin qui possède normalement un rôle de barrière que les bactéries ne peuvent pas traverser. Parfois, chez les nouveau-nés, le streptocoque du groupe B commence par coloniser l’intestin avant de le traverser pour atteindre le sang puis le cerveau, avec des conséquences qui peuvent être mortelles. Dans ce projet, des souris seront colonisées par du streptocoque du groupe B au niveau intestinal pour comprendre comment l’interaction de la bactérie avec les cellules intestinales peut conduire à une infection sévère. Les objectifs de ce projet sont : 1. identifier si certaines cellules de l’immunité présentes dans l’intestin peuvent prendre en charge le streptocoque du groupe B pour l’amener dans le sang ; 2. comprendre comment le streptocoque du groupe B intervient dans la modification de la barrière intestinale pour la rendre plus permissive ; 3. déterminer si la colonisation par le streptocoque du groupe B facilite la traversée de la barrière intestinale.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous allons mieux définir l'impact de la colonisation par le streptocoque du groupe B sur la composition de la barrière intestinale ainsi que les facteurs et les cellules qui facilitent son franchissement. A plus long terme, cela permettra d'identifier de nouvelles thérapeutiques et de nouveaux moyens de prévention de l'infection chez les nouveau-nés.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à un ou deux gavages (à 5 jours d’intervalle) d’une durée de 20 secondes. Ils seront ensuite soumis à une injection d'analgésique par voie intrapéritonéale d'une durée de 3 secondes, suivie d'une mise à mort sous anesthésie.

Impact sur les animaux

L’inoculation par gavage est susceptible de provoquer un léger stress chez les souris. Le gavage oral par le SGB est susceptible de provoquer une infection systémique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Des prélèvements d'organes seront réalisés pour des études moléculaires, immunologiques, histologiques et pour dénombrement des bactéries.

Remplacement

L'étude des interactions du SGB avec des modèles cellulaires simples est utilisée à chaque fois que cela est possible en remplacement du modèle animal. Nous utilisons en particulier un modèle cellulaire permettant de reproduire la barrière épithéliale intestinale. Cependant, le modèle cellulaire est dépourvu en particulier de cellules immunitaires (cellules dendritiques, lymphocytes, etc.) qui sont d'une part essentielles à la maturation de la barrière intestinale et d'autre part qui concourrent à la dissémination du pathogène et au processus inflammatoire. Aussi, le modèle animal est indipensable à l'étude des interactions entre l'hôte et le SGB et au franchissement de la barrière intestinale par le SGB.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum en homogénéisant strictement les conditions expérimentales. Nous utilisons des animaux de même sexe, même âge et même poids, obtenus chez le même fournisseur afin de limiter au maximum la variabilité expérimentale dans un souci de réduction du nombre d’animaux. De même, la multiplication des prélèvements réalisés sur un même animal nous permet de répondre à plusieurs questions expérimentales tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux par lot a été estimé à l’aide de tests statistiques et les résulats des expériences seront analysés à l'aide de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec eau et nourriture à volonté, dans un environnement enrichi avec maisonnette en carton et coton compacté. Ils seront observés quotidiennement pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les animaux dont les scores cliniques atteindront le score critique (point limite) seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la colonisation intestinale, l'infection par franchissement de la barrière intestinale et la survenue de méningite observées au cours de l'infection néonatale par le SGB chez l'espèce humaine. Le modèle souris permet d'étudier les différents organes et types cellulaires impliqués dans la physiopathologie de l'infection humaine. Nous utiliserons des souris juvéniles de 4 semaines car il s'agit d'une étude pédiatrique.

645 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant vingt-huit jours des injections quotidiennes de corticostérone, l'hormone du stress, pour induire un état anxio-dépressif, puis passent une batterie de tests comportementaux (open field, labyrinthe en croix surélevé, splash test, novelty suppressed feeding, interaction sociale), avant d'être tuées pour analyser leur cerveau. Le porteur qualifie l'induction du phénotype dépressif de "nuisance légère" et affirme les nuisances "très faibles". Les bénéfices se limitent à des informations sur de nouvelles molécules contre les déficits sociaux, le porteur jugeant l'expérimentation animale "indispensable" faute de modèle in vitro.

Objectifs

L’objectif de ce protocole est de caractériser les effets de différents antidépresseurs sur different types de comportements, chez un modèle de dépression développé chez la souris. A coté des tests comportementaux utilisés pour la quantification de l'anxieté et du comportement de type depressif, le comportement de type social, qui est une caractéristique clé des rongeurs, sera evalué à l'aide de cages d'interaction sociale. Cette caractérisation phénotypique complète nécessite l’utilisation de plusieurs tests comportementaux mesurant l’état anxieux/dépressifs des animaux et l’état social, chez des souris modèles d'anxiété-dépression induit par un traitement chronique de corticostérone (hormone du stress chez les rongeurs).

Bénéfices attendus

Cette étude examinera les effets comportementaux à la fois de type anxiolytic-antidepressif, et de type social de differentes molécules chez des souris rendus anxio-dépressifs par un traitement chronique de corticostérone. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles informations surtout sur l'utilisation de certaines nouvelles molécules pour le traitement des deficits sociaux souvent présents dans les pathologies de type anxieux et dépressif.

Procédures

Administration quotidienne de médicaments par injection intrapéritonéale (réalisée en 10 secondes) pendant 28 jours. Tests comportementaux : toutes les souris seront soumises à une batterie de test comportementaux 4 tests en 5 jours : -le test de l'open field (mesure de l'activité motrice) qui dure 30 minutes, - labyrinthe en croix surélevé qui dure 5 minutes, - le splash test (observation du toilettage) qui dure 5 minutes - novelty supressed feeding qui dure 5 minutes, -test d'interaction sociale : les souris sont placées dans une cage où le comportement de chaque souris vis à vis de ses congénères est automatiquement évalué : cette évaluation a lieu 3 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Outre l'induction de phénotype dépressif qui est considéré comme une nuisance légère, les nuisances pour ces animaux sont très faibles : les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur . Les administrations de médicaments seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques.

Devenir

Suite à la dernière batterie de tests comportementaux, les souris seront euthanasiés pour analyse post mortem des cerveaux

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico des troubles de l’humeur n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc indispensable pour étudier ces pathologies et les alterations comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisations des mêmes animaux tout au long de l'expérience chaque animal est même son propre témoin (évaluation du comportement au cours des différentes phases du protocole).

Raffinement

Au cours des semaines de traitements une surveillance quotidienne sera entreprise pour veiller au bien être des animaux. Des points limites ont été définis et seront strictements appliqués.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. En effet, cette espèce a été choisie puisqu'elle permet de modéliser la pathologie dépressive ainsi que d'évaluer les différents effets des médicaments testés. Les animaux seront des adultes âgés de 6-8 semaines au moment de la réception, comme nous sommes intéressés aux effets comportementaux à l'âge adulte.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée sous anesthésie puis des injections de morphine à doses croissantes deux fois par jour pendant six jours, pour observer les effets du sevrage sur leurs interactions sociales par un suivi vidéo. Le porteur indique que le sevrage aux opiacés provoque une douleur modérée et une perte de poids. Les souris sont ensuite tuées sans aucune analyse post-mortem, faute de pouvoir les réutiliser après un traitement pharmacologique, une mise à mort que le porteur présente comme conforme aux "3R".

Objectifs

Les troubles de consommations aux opiacés sont en forte augmentations ces dernières années et ont des conséquences dévastatrices. Ce projet de recherche vise à comprendre le développement des troubles de l’humeur (en particulier dépression et les déficits d’interaction sociale) qui se développent lors de la mise en place d’une dépendance aux opiacés. Les opiacés agissent sur un système spécifique dans le cerveau. En conditions normales, ce système régule la douleur, les processus de récompense, les réponses émotionnelles et les réponses au stress. L’exposition aux opiacés altère le fonctionnement de ce système, ce qui conduit aux troubles du comportement et de l'humeur. L’objectif de ce projet consiste à comprendre le développement de ces pathologies, en particulier les déficits sociaux en utilisant de nouveaux tests comportementaux murins permettant de suivre les interactions entre animaux en temps réel.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre l’effet des troubles de consommations aux opiacés dans les interactions sociales entre les animaux. L’appareillage utilisé effectue en effet un suivi permanent de l’activité des animaux, qu’ils soient proches de congénères ou isolés. Ce type d’analyse complexe nous permettra de poursuivre notre recherche sur les adaptations à la suite de l’abstinence aux opiacés.

Procédures

-Implantation sous-cutanée d'une puce sur l’ensemble des souris soit 90 souris. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique durant une durée de 30 minutes maximum. -Injections à doses croissantes de la morphine ou solution saline, durée moins d’une minute par injection, 2x par jour, espacées de 12 heures, pendant 6 jours sur deux groupes de souris mâles composés de 15 traités à la morphine et 15 traités à une solution saline et deux groupes de souris femelles composés de 15 traitées à la morphine et 15 traitées à une solution saline

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une implantation d'une puce permettant l'identification par radiofréquence en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Ensuite, ils resteront en groupe sociaux dans leurs cages d'hébergement. Après deux semaines de repos, les souris des groupes traités à la morphine ou solution saline vont subir des injections à doses croissantes de la morphine ou solution saline, par la voie intrapéritonéale 2x par jour, pendant 6 jours. Lors des périodes d'analyse, les souris seront simplement transférées dans une arène de 50 cm de côté qu'ils pourront explorer. Les expériences réalisées précédemment avec la morphine montrent une faible perte de poids totalement réversible et d'une courte durée. Il y aura une douleur induite par le sevrage opiacé qui est considérée comme modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet sans analyse post-mortem. En effet, nous ne pouvons pas réutiliser ces animaux dans une autre étude sachant qu'ils ont reçu un traitement pharmacologique. En accord avec le principe des « Trois R », ils ne seront donc pas gardés en vie, car aucune autre utilisation ne peut leur être attribuée.

Remplacement

Les effets de l’exposition aux opiacés sur le comportement et leurs conséquences ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne peuvent pas récapituler la complexité du cerveau. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes mammifères vivants et entiers. La souris est l’organisme le plus adapté car, nous pouvons étudier des comportements liés aux addictions et aux réponses émotionnelles.

Réduction

Pour cette étude, nous emploierons le minimum d'animaux pour pouvoir conclure de manière robuste et statistiquement significative. Les animaux utilisés seront consanguins, ce qui permet de diminuer la variabilité entre individus et donc de réduire le nombre d'animaux tout en mettant en évidence un effet statistiquement significatif. De plus, les mesures d'interactions sociales seront répétées au cours du temps sur les mêmes animaux ce qui permet également de réduire le nombre d'animaux. Ces expériences produisent également de nombreuses données (vidéo 3D) qui seront sauvegardées et qui permettront de faire des analyses poussées sur un nombre d'animaux limité. Nous utiliserons des tests statistiques pour étudier les données et mettre en évidence des différences significatives entre les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les réponses comportementales à l’administration d’opiacés. De plus, au cours de l’étude, tout signe d'inconfort sera pris en charge en prenant les mesures appropriées en fonction du niveau observé, limitant ainsi la souffrance à l’animal. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Pour éviter tout stress de l'animal durant l'implantation, une anesthésie gazeuse sera effectuée.

Choix des espèces

La souris est un modèle de prédilection pour la recherche biomédicale. Avec 90% de son génome identique à l’homme, elle est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies. Etant donnée que les pathologies neuropsychiatriques se manifestant principalement à l’âge adulte chez l’humain, notre étude se fera chez des animaux ayant atteint le stade mature de leur développement, c’est-à-dire au minimum 2 mois pour les modèles souris.

180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 mâles tués à l'issue et 60 femelles réutilisées dans d'autres projets de l'équipe. Les souris subissent une gonadectomie sous anesthésie avec pose d'implants hormonaux, puis des tests de comportement de reproduction, les femelles utilisées pour déclencher le comportement des mâles, ceux-ci étant ensuite tués pour analyser leur cerveau. Le porteur décrit des atteintes possibles allant du dos courbé et de la perte de poids rapide à l'état de choc et à la détresse respiratoire, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Les bénéfices se limitent à mieux comprendre l'action des hormones sexuelles sur le comportement, et le porteur affirme que l'étude ne peut se faire que sur "l'organisme entier".

Objectifs

La survie des espèces dépend de la capacité des individus à se reproduire. Pour une reproduction réussie, il faut non seulement une production de gamète (oocytes et spermatozoides) mais également l’expression des comportements de reproduction mâle et femelle optimisant ainsi la rencontre des partenaires sexuels et la fécondation. Chez le mâle, le comportement de reproduction est contrôlé par le cerveau sous l’action des hormones sexuelles : androgènes (testostérone) et des oestrogènes (oestradiol). Différentes études sur des modèles de souris ne possédant pas les récépteurs de ces hormones sexuelles dans le cerveau ont permis de montrer le rôle de la testostérone et de l’oestradiol dans la régulation du comportement sexuel mâle. Néanmoins, la manière dont les hormones agissent spécifiquement sur le cerveau restent encore à identifier. Dans cette étude, nous souhaitons donc identifier les modes d’actions et les cibles cellulaires dans le cerveau des androgènes et des oestrogènes Plus particulièrement, nous étudirons les effets de la délétion génétique des récepteurs des hormones sexuelles au sein du cerveau sur les structures cérébrales régulant le comportement sexuel mâle.

Bénéfices attendus

Au cours de la vie, notre corps et nos fonctions biologiques sont soumis à des variations hormonales pouvant avoir un impact sur notre système reproducteur et sur notre cerveau. Cette étude participera à faire progresser la compréhension des effets des variations des hormones sexuelles testosterone et oestradiol sur la fonction de reproduction mâle spécifiquement. Les modèles animaux transgéniques utilisés nous permettront de comparer les effets d'une absence de signalisation des hormones sexuelles, oetsradiol et testosterone, sur le comportement de reproduction chez le mâle.

Procédures

Les souris utilisées au sein de ce projet subiront une chirurgie gonadectomie et pose d’implants sous-cutanée (180 animaux) sous anesthésie générale avec réveil et analgésique d’une durée maximale de 30 minutes. Ensuite, l’ensemble des souris de cette demande d’autorisation de projet entreront dans un protocole de tests de comportement de reproduction. Pour les femelles stimuli (60 animaux), des injections sous-cutanées seront pratiquées quelques heures avant les tests de comportement de reproduction.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous anesthésie générale à l’isoflurane pendant lesquelles les gonades seront retirés et un implant contenant des hormones sexuelles estradiol/testostérone sera posé en sous-cutané. Les éventuels symptômes à court et à long terme liés à cette procédure chirurgicale sont : Apparence et position anormale (poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie); Comportements anormaux (aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation)); Une perte de poids rapide; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité; Difficulté respiratoire. Certains animaux subiront également des injections sous-cutanées pouvant entrainer un stress lié à la contention et aux injections.

Devenir

L’ensemble des mâles adultes (120 animaux) de cette demande d’autorisation de projet seront euthanasié à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvement et analyses post-mortem nécessaires à l’étude des cibles moléculaires des signalisations androgénique et oestrogénique impliquées dans la plasticité cérébrale controlant l’expression du comportement de reproduction chez le mâle adulte. L’ensemble des femelles adultes (60 animaux) utilisés pour tester les comportements de reproduction mâle seront réutilisés dans d’autres projets au sein de l’équipe.

Remplacement

L’étude de la fonction et du comportement de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Dans cette étude, nous souhaitons identifier les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction de reproduction et l’expression du comportement sexuel mâle. Cela nécessite donc l’utilisation de modèles animaux afin de pouvoir étudier les structures et populations cellulaires contrôlant la reproduction. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques récentes pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau. Des animaux vivants sont donc nécessaires pour ce projet afin de réaliser des analyses comportementales et neuroendocrines sur des souris transgéniques dont les récepteurs aux différentes hormones stéroidiennes sont délétés dans le système nerveux. Ainsi des méthodes alternatives et/ou substitutives ne peuvent remplacer l’animal entier pour ce projet.

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, nous utiliserons un total de 180 animaux sur 2 procédures qui nous permettrons d’étudier les cibles moléculaires des récepteurs aux hormones sexuelles, androgènes et oestrogènes, impliquées dans le contrôle central du comportement de reproduction mâle. Pour chaque procédure, nous avons eu à cœur de calculer au plus juste le nombre d’animaux dans chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la puissance statistique de l’étude. Pour les études comportementales, 8 à 12 animaux par groupe sont nécessaires pour des résultats fiables et consistants. De plus, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses comportementales et moléculaires. Nous péléverons également d’autres organes et les garderont pour de futures études ou afin de les proposer aux collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie spécialisée sous la supervision des soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010-63-EU en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie sous anesthésie avec réveil, les animaux seront injectés en sous-cutanée avec un analgésique en pré-opératoire 30 minutes avant la chirurgie et avec un analgésique anti-inflammatoire en post-opératoire toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Par la suite, un suivi journalier sera réalisé afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être animal. Les critères absolus suivants seront observés : Apparence et position anormale : poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie ; Comportements anormaux : aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation) ; Une perte de poids rapide et supérieur à 20 pourcent du poids corporel de l’animal mesuré avant la chirurgie. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie stéréotaxique puis 1 fois par semaine ; Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité ; Difficulté respiratoire Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s’assurer que toute souris présentant une perte de poids excessive (-20 pourcent du poids corporel au début de l’étude) ou une détresse seront euthanasiées.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d’outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques, vecteurs viraux, …) et de données dans la littérature permettant de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires et ainsi d’implémenter les connaissances sur cette thématique. Les animaux seront utilisés à l’age adulte (à partir de 8 semaines). En effet, le but de ce projet est d’étudier les effets de l’invalidation des différents récepteurs des hormones stéroidiennes sur la neuroplasticité des structures cérébrales associés à la régulation des comportements de reproduction chez la souris mâle adulte.

1 200 poissons, 900 goujons et carassins et 300 truites, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et les individus de taille extrême relâchés. Ils sont capturés par pêche électrique, exposés deux à trois semaines à des cocktails de polluants en rivière ou en laboratoire, marqués et parfois injectés d'un antigène mimant une attaque parasitaire, puis euthanasiés par surdose d'anesthésique pour mesurer la contamination de leurs tissus. Le porteur indique choisir des doses faibles et des durées courtes pour observer des effets non létaux tout en limitant la mortalité. Les bénéfices se limitent à "mieux comprendre" les effets des pollutions humaines sur la faune sauvage, et le porteur juge le remplacement par culture cellulaire inapplicable à l'étude de stress multiples.

Objectifs

Les écosystèmes aquatiques sont lourdement impactés par les pollutions organiques (pesticides) et inorganiques (métaux) issues des activités agricoles et industrielles, mais leurs effets à long terme sur la santé et les capacités d’adaptation des organismes aquatiques et notamment des poissons sont encore peu évalués, notamment en conditions réalistes de stress multiples (parasites, température…). Le projet vise à évaluer les impacts potentiels des stress environnementaux multiples (notamment chimiques) en combinant des approches en laboratoire et sur le terrain, au plus près du réalisme environnemental.

Bénéfices attendus

A terme les résultats de ce projet permettront de caractériser les effets des pollutions environnementales sur la santé des poissons, et de mieux comprendre les réponses comportementales et physiologiques des animaux soumis aux stress chimiques. Ils permettront donc de mieux comprendre et anticiper les effets des pollutions d'origine humaine sur la santé de la faune sauvage.

Procédures

Pour tester leur réponse aux stress chimiques, des poissons seront exposés à des polluants en dose et cocktails réalistes au plus proche des concentrations trouvées en rivière, et ce pendant une durée maximale de 21 jours pour éviter tout effet mortel, mais observer des effets physiologiques et comportementaux. Dans un premier temps, des approches en laboratoire seront utilisées afin de tester les effets des polluants en conditions contrôlées sur carassins et goujons, notamment des cocktails de contaminants représentatifs du milieu naturel en se basant sur des bases de données existantes. Pour tester la variabilité de réponse entre populations sauvages hétérogènes, plusieurs populations sauvages de goujons ayant évolué dans des rivières plus ou moins polluées seront comparées. Dans un deuxième temps, des expérimentations d’encagement en rivière seront mises en place afin de tester les réponses des poissons en conditions réalistes de multistress sur le terrain. Des goujons issus de populations plus ou moins exposées aux pesticides, et des truites également issues de zones plus ou moins polluées par des métaux, seront transplantés en cage dans des rivières contaminées ou peu contaminées. Les cages seront de dimensions suffisante avec un grillage fin de 5 mm qui laisse passer les invertébrés pour la nourriture. Les poissons seront exposés pendant 14 à 21 jours à des rivières plus ou moins polluées que leur rivière d’origine. Après toutes les expositions en laboratoire ou rivière, les poissons seront anesthésiés, marqués avec des colorants non toxiques par injection sous-cutanée, mesurés (poids et longueur totale), une unique injection sous-cutanée d’antigène mimant une attaque parasitaire pourra être effectuée au niveau de la queue afin de tester l’immunité des poissons. Au total ces interventions sont réalisées en moins de 2 minutes. Enfin les poissons seront euthanasiés par surdose d’anesthésique, et les taux de contamination de leurs tissus seront mesurés, ainsi que leur état de santé à partir de diverses mesures dans les tissus (nageoires, foie, rein, muscles, sang).

Impact sur les animaux

Pour l’ensemble des démarches expérimentales, excepté celles impliquant le carassin domestique et les goujons d’élevage (animaux d’élevage), la capture des individus sauvages sera réalisée par pêche électrique. Cette procédure de pêche peut causer un stress mais elle sera effectuée par des personnels formés et après demande d’autorisation auprès des autorités compétentes via l’utilisation de matériel spécifique respectant la législation en vigueur. Le voltage utilisé sera adapté pour causer une sédation légère et rapide des poissons qui seront ensuite transportés dans des conteneurs isothermes oxygénés puis acclimatés en laboratoire ou dans les cages en rivière pendant 7 jours minimum pour limiter le stress de capture, de transport et de captivité. Les démarches expérimentales (en laboratoire et en rivière) impliquent des expositions à des polluants qui peuvent causer des dommages mais les cocktails et doses seront relativement faibles car représentatives du milieu naturel. De plus, les durées d’exposition seront relativement courtes (21 jours maximum) pour observer des réponses physiologiques mesurables tout en limitant les dommages pathologiques potentiels infligés aux organismes d’étude et la mortalité. En effet l’objectif étant de mimer des niveaux de stress réalistes et des effets non létaux. Le reste des procédures (mesures, prises de sang, injections) aura lieu sous anesthésie de quelques minutes et devrait causer un stress limité.

Devenir

Les animaux pêchés par pêche électrique seront euthanasiés pour être disséqués post-mortem. Les animaux pêchés mais jugés de taille extrême (trop petit ou trop grand) seront immédiatement remis à l'eau après vérification de leur état après passage dans un seau de réveil.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant de caractériser l’effet des stress multiples sur la variation des réponses physiologiques des poissons d’eau douce, l’utilisation de méthodes de remplacement (par exemple test sur cultures cellulaires) en vue de limiter le nombre d’animaux vivants utilisés dans le projet ne peut être appliquée. Néanmoins, afin de limiter le prélèvement d’individus dans le milieu naturel, des carassins seront utilisés ainsi que des goujons d’élevages pour remplacer une population sauvage (population de référence non polluée) afin d’affiner la caractérisation des processus physiologiques impliqués dans la réponse à une exposition à des stress multiples.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, un maximum d’information sera tiré de chaque individu en utilisant un maximum de mesures sur les organes pertinents. Nous avons préalablement réalisé une étude statistique pour déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser dans chaque procédure et dans chaque lot pour obtenir un résultat statistiquement probant. A posteriori, des traitements statistiques seront également effectués pour mettre en évidence des différences significatives entre les lots et les modalités d’exposition.

Raffinement

Afin de limiter le stress induit par la captivité des animaux (aquariums et cages), les individus seront maintenus en groupe de 5 à 10 individus maximum avec une densité d’environ 1 cm de poisson pour 1 L d’eau. En laboratoire, la photopériode sera fixée à 12h de jour/12h d’obscurité (lors des phases expérimentales) et la qualité de l’eau sera assurée quotidiennement via la mise en place d’un système de filtration propre à chaque aquarium et la mesure régulière des paramètres physico-chimiques. Dans le cas où certains de ces paramètres (en particulier les produits azotés) dépasseraient les optimums de chaque espèce, des renouvellements d’eau partiels seront effectués. Les aquariums d’exposition seront alimentés avec de l’eau du réseau, filtrée et stérilisée. Pour les phases de stabulation, les bacs seront alimentés par de l’eau du réseau. Des refuges seront introduits dans tous les bacs de stabulation et cages afin de limiter le stress et enrichir le milieu. Il n’est pas possible de placer des refuges dans les aquariums d’exposition en raison de l’adsorption des polluants sur les surfaces des refuges. Un suivi régulier des aquariums et des cages sera effectué quotidiennement pour surveiller l’état des animaux notamment pendant les phases d’exposition.

Choix des espèces

La pertinence de l’utilisation des poissons et plus particulièrement des 3 espèces sélectionnées se justifie par le fait que : - Le carassin domestique Carassius auratus est un animal utilisé depuis plusieurs décennies en recherche. Sa physiologie, son mode de vie et ses besoins sont connus et bien documentés. - Concernant les 2 espèces sauvages, le goujon Gobio occitaniae et la truite fario sauvage Salmo trutta trutta, ces dernières ont été sélectionnées car elles sont bien implantées dans notre zone d'étude. Comme pour le carassin, leur physiologie est connue et bien documentée. - Ces espèces ayant des exigences différentes (en termes d'habitat, de régime alimentaire, de déplacement…), elles sont exposées aux polluants de manière différente. Ainsi, les goujons seront soumis à des contaminations liées aux polluants utilisés en agriculture, alors que les truites seront soumises à des contaminations métalliques minières. Tous les poissons utilisés seront des adultes ou jeunes adultes d’une taille d’environ 10 cm (carassins et goujon adultes, truitelles jeunes adultes). Nous utilisons des adultes pour deux raisons essentielles : - la pêche d'adultes dans le milieu naturel permet de ne pas compromettre la régénération des populations sauvages - les adultes sont sexés et donc sexables. Par conséquent le sexe dans animaux étant connu, il est possible d'intégrer ce facteur de variation à notre étude statistique, pour mettre en évidence un éventuel impact du sexe dans le comportement et/ou la physiologie des animaux exposés aux contaminants.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de phalange, des injections intrapéritonéales, une chirurgie de dénervation chimique par injection d'une toxine dans le tissu adipeux, un régime hypercalorique et une exposition au froid à 6 °C, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur répète que ces gestes n'entraînent "aucune nuisance supplémentaire", la fonction étudiée étant présentée comme "bénéfique". Les retombées, une nouvelle cible thérapeutique contre l'obésité, restent renvoyées à l'avenir, et le porteur justifie le prélèvement de tissus non utilisés par une banque censée réduire le recours futur à d'autres animaux.

Objectifs

L’obésité, qualifiée d’épidémie depuis 1997 par l’OMS, touche plus de 1,9 milliards d’adulte dans le monde. De plus, l’OMS prévoit qu’un quart de la population mondiale sera obèse d’ici 2045. L’obésité se caractérise par une surcharge pondérale et favorise le développement de nombreuses complications et qui impliquent le dysfonctionnement de nombreux organes, tels que le foie et le tissu adipeux. Dans ce contexte, contrairement aux effets délétères associés à une augmentation de la production de glucose (sucre) par le foie, la production intestinale de glucose (PIG) est une fonction particulièrement intéressante, puisqu’elle améliore le métabolisme. En effet, le sucre produit par l’intestin active un signal nerveux qui se traduit, au niveau du cerveau, par une induction de la satiété (diminution de la prise alimentaire), une augmentation de la sensibilité à l’insuline et une diminution de la production de glucose par le foie. Le rôle important de la PIG dans la régulation du métabolisme a été démontré grâce à la caractérisation du phénotype de deux modèles murins : d’invalidation ou d’induction de la PIG. Ainsi, les résultats montrent que la PIG est capables de favoriser ou de protéger de l’apparition de nombreux troubles métaboliques tels que l’obésité, le diabète, la stéatose hépatique ou encore la dyslipidémie. Plus particulièrement, ces études ont permis de mettre en évidence le rôle de la PIG dans la régulation du métabolisme du tissu adipeux, et notamment sur sa fonction de production de chaleur (thermogenèse) qui est un poste de dépense d’énergie important dans la résistance au froid, mais également dans le maintien de la balance énergétique (et par conséquent du poids corporel). En effet, de nombreuses études visent à augmenter la dépense d’énergie en modulant la thermogenèse du tissu adipeux, dont on sait qu’elle est diminuée au cours de l’obésité. Puisque cette fonction est principalement sous le contrôle du système nerveux sympathique (SNS), cette étude vise à déterminer si les effets de la PIG sur le métabolisme du tissu adipeux passent une activation du SNS et préciser les mécanismes impliqués. Cette étude est réalisée dans différentes conditions nutritionnelles afin de nous d’étudier les effets métaboliques de la PIG dans un état physiologique (régime standard) et pathologique (régime hypercalorique riche en gras et en sucre).

Bénéfices attendus

La PIG est une fonction qui exerce des effets bénéfiques anti-obésité, anti-diabète et anti-stéatose hépatique lorsque les souris sont soumises à un régime hypercalorique pendant 5 mois. De plus, l’activation de la PIG améliore le métabolisme du tissu adipeux en diminuant l’adiposité et en augmentant la thermogenèse (production de chaleur) par le tissu adipeux brun (TAB) et le tissu adipeux blanc épididymaire (TAE), se traduisant par une amélioration de la tolérance au froid. Néanmoins, alors que les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques de la PIG sur la résistance au froid et la protection contre l’obésité restent encore mal compris, nous proposons ici que le système nerveux sympathique innervant les tissus adipeux jouerait un rôle essentiel. Ainsi, grâce à ce projet, une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu permettra à l’avenir de proposer la PIG comme une nouvelle cible thérapeutique contre l’obésité, dont la prévalence à l’échelle mondiale a considérablement augmenté ces dernières années.

Procédures

Les différents modèles de souris génétiquement modifiées nécessaires à ce projet seront obtenus par modification génétique. Ainsi, une biopsie de tissu (au niveau de la 1ère phalange, inférieure à 1 mm) réalisée à l’âge de 7 à 10 jours est nécessaire pour vérifier la modification de leurs gènes. Ce geste est réalisé en quelques secondes. L’activation génétique de la PIG ne nécessite aucune intervention supplémentaire. Néanmoins, l’invalidation de la PIG sera réalisée par un traitement injecté (dans le péritoine) à l’âge de 6-8 semaines (5 jours de suite). Les souris de type naturel (contrôle) recevront le même traitement. Ce geste est réalisé en quelques secondes. Afin de déterminer si les effets bénéfiques de l’induction de la PIG passent par le système nerveux sympathique du tissu adipeux brun interscapulaire (TAB) ou du tissu adipeux blanc épididymaire (TAE), nous réaliserons des chirurgies de dénervation chimique spécifique des fibres sympathiques grâce à l’injection d’une toxine directement dans l’un de ces tissus. Ces chirurgies seront réalisées chez des souris contrôles ou ayant une PIG activée, nourries avec une alimentation standard ou hypercalorique. Cette intervention est très rapide n’excédant pas 15-20min par animal. Les effets de la dénervation sur la résistance au froid seront évalués après une exposition des souris à une température froide. Les souris seront exposées à une température froide de 6°C pour 4h (7jours après la chirurgie), et la température rectale sera mesurée (avant/après). Alors que 24h d’exposition au froid n’entraine aucun dommage sur l’animal , 4h d’exposition au froid ne devrait pas présenter d’effets dommageables pour l’animal. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes, en particulier les tissus adipeux et l’intestin.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en PIG présentent un phénotype anxieux léger (comportement exploratoire diminué et plus forte résignation). Néanmoins, d’après notre expérience, l’hébergement en groupe et l’apport d’enrichissement est suffisant pour atténuer l’anxiété. Les souris chez lesquelles la PIG est activée seront nourries avec un régime standard ou riche en graisses et en sucres. Ce dernier favorise la prise de poids et le diabète, néanmoins, avec le temps de régime prévu dans ce projet, les souris seront étudiées à un stade précoce afin de limiter les complications liées à ces maladies. De plus, la PIG étant une fonction bénéfique, aucune nuisance supplémentaire n’est attendue. Nous réaliserons une dénervation chimique spécifique des fibres sympathiques grâce à l’injection d’une toxine dans les différents tissus adipeux (l’un ou l’autre) de souris contrôles ou chez lesquelles la PIG est activée (nourries avec un régime standard ou hypercalorique). Cette dénervation sympathique est une bonne alternative à la dénervation chirurgicale qui est plus invasive et moins spécifique. De plus, l’injection locale restreinte à un tissu n’entraine aucun effet délétère ou douloureux (ni aucun problème de cicatrisation). Les souris seront exposées à une température froide de 6°C pour 4h (7jours après la chirurgie), et la température rectale sera mesurée (avant/après). Alors que 24h d’exposition au froid n’entraine aucun dommage sur l’animal, 4h d’exposition au froid ne devrait pas présenter d’effets dommageables pour l’animal. Une dénervation du TAE sera réalisée chez des souris nourries avec une alimentation standard. Dès le lendemain de la chirurgie, les souris seront soumises à un régime hypercalorique pendant 1 mois (4 semaines). La dénervation du TAE ne devrait pas entrainer d’effets indésirables supplémentaires par rapport à celle du TAB. De plus, l’apport d’un régime hypercalorique pendant seulement 4 semaines permet de limiter les dommages sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et de différents tissus. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin de comprendre les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques de la production de sucres (glucose) par l’intestin. Des tissus non nécessaires à ce projet seront également prélevés afin de constituer une banque de tissus qui permettra à l’avenir de réduire le recours à des animaux supplémentaires.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la fonction étudiée, la production de glucose par l’intestin, a des impacts sur l’ensemble du métabolisme de l’organisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté au niveau des senseurs de glucose (détecteurs) dans les vaisseaux sanguins entre l’intestin et le foie, et qui vont transmettre un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie, régulant en particulier le métabolisme du tissu adipeux.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept. Afin de pouvoir faire une analyse statistique pertinente, des groupes de 10 souris seront analysés. Au total, 160 souris mâles transgéniques et de type naturel (contrôles). En fin de procédures, les animaux seront mis à mort afin de prélever différents tissus à analyser, mais également de nombreux autres tissus pour constituer une banque de tissus utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans animaux supplémentaires.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées par groupe 3-4 souris par cage en milieu enrichi pour favoriser la nidation (coton de nidation, bois à ronger) et contrôlé. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés régulièrement pour suivre leur prise de poids. Les procédures sont maitrisées par les personnes en charge de l’expérimentation animale. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole ou lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet selon les méthodes autorisées par la législation. Dans les conditions d’hébergement (groupe et enrichissement) aucun phénotype dommageable n’est observé chez les souris déficientes en production intestinale de glucose. Cependant, une attention particulière sera portée sur cette lignée ayant une susceptibilité à l’anxiété augmentée dans des conditions de challenge du stress. Une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée sera mise en place lors des chirurgies .

Choix des espèces

Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production endogène de glucose, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme. De plus, le phénotype des modèles murins utilisés dans ce projet a été largement caractérisé au laboratoire depuis de nombreuses années. Par ailleurs, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kits biochimiques…). Nous souhaitons utiliser dans nos expériences des souris C57BL/6J, lignée murine choisie pour pouvoir comparer les résultats avec nos lignées transgéniques utilisées sur le même fond génétique. Cette souche a également été choisie car c’est une bonne souche pour l’étude du diabète et des maladies métaboliques. Les animaux provenant d’un éleveur agréé (souris de type naturel: C57BL/6J) seront commandés à 4 semaines afin qu’ils soient hébergés dans les mêmes conditions que les animaux transgéniques (sevrés à 4 semaines). Cela permet de limiter les biais expérimentaux dus à des conditions d’hébergement différents. A l’âge de 6-8 semaines, les souris (qui vont devenir déficientes en PIG) recevront des injections pour induire la modification génétique. Ces injections se font à l’âge adulte pour limiter les effets de la molécule sur le métabolisme des jeunes souris. L’activation de la PIG ne nécessite aucune intervention, mais les souris seront étudiées aux mêmes âges pour pouvoir comparer les résultats. Ainsi, après réalisation de la modification génétique à l’âge adulte, les animaux seront étudiés à l’âge de 11-13 semaines (soit 5 semaines après les injections, temps nécessaire à la disparition des effets potentiels de la molécule sur le métabolisme). Ainsi, à l’issu des différentes procédures, les souris âgées de 13, 14, 17 ou 34 semaines, seront mises à mort pour prélever des tissus à analyser.

124 souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d'Alzheimer, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une photobiomodulation par la lumière trente minutes par jour pendant onze à douze mois, subissent des prélèvements sanguins et une batterie de tests comportementaux (labyrinthe radial, labyrinthe de Barnes, rotarod, open field), avant une ponction de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie létale et une perfusion intracardiaque. Le porteur cherche à déterminer l'heure de la journée la plus favorable à ce traitement. Les retombées annoncées, un passage chez le singe puis un traitement humain, restent renvoyées à la suite, tandis que le porteur affirme le modèle animal "indispensable" et "seul moyen" de répondre à la question.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) comporte plusieurs dysfonctionnements cellulaires tels que l’hyper-phosphorylation ou l’agrégation de petites protéines. Ces protéines sont normalement éliminées par la cellule mais en conditions pathologiques, elles sont présentes en excès et peuvent être très toxiques. Le but du projet est d’observer à quelle période de la journée, la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne a un effet curatif sur un modèle murin de la MA. Plusieurs études ont déjà pu observer que la photobiomodulation procure un bénéfice thérapeutique sur d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie de Parkinson mais aucun article ne montre in vivo à quel moment elle est la plus bénéfique. C’est pour cela que le présent projet permettra d’obtenir des réponses sur l’évolution comportemental et anatomique de la maladie dans un modèle de souris. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons constituent un modèle de choix pour la maladie d’Alzheimer. Elles développent la MA de type symptomatique à partir de 12 mois même si certaines protéines en excès sont présentes dès le 3ème mois. Cette étude permettra également d’entreprendre une voie thérapeutique non-invasive pour la médecine humaine. Pour respecter les 3Rs, ce projet comporte une procédure pilote afin de déterminer les paramètres techniques de la photobiomodulation et l’entraînement au bon geste de prélèvements du sang et du liquide céphalo rachidien sur un nombre réduit d’animaux, le raffinement avec l'utilisation d'analgésique et le suivi des animaux par l'expérimentateur. Chaque souris sera préalablement anesthésiée avant sa mise à mort pour éviter toute douleur. Pour être en accord avec la réglementation, l'expérimentateur mettra en œuvre des actions précoces et adaptées en cas d’atteinte d’un point limite et ceci afin de respecter le bien-être animal. Les différentes étapes du projet sur le modèle murin seront l’application de la photobiomodulation sur des souris âgées de 3 mois (phase 1), la réalisation de tests comportementaux (phase 2) permettant d’étudier les bénéfices symptomatiques et la mise à mort des animaux pour des analyses biochimiques et histologiques (phase 3).

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mieux comprendre l’effet de la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne dans un contexte pathologique et définir la meilleure période pour photobiostimuler le cerveau. En effet, la vérification des bienfaits sur les stigmates de la maladie d’Alzheimer dans un modèle murin permettrait d’entreprendre un projet pré-clinique sur singe de manière plus sereine. Il s’agirait également d’une stratégie non-invasive qui pourrait être rapidement adoptée pour un traitement chez l’être humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à : -la photobiomodulation durant 11/12 mois pendant 30 minutes chaque jours (à des périodes différentes de la journée selon les groupes) tout en restant dans leur cage d’hébergement (aucune manipulation) -3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles en sub-mandibulaire (à 3 mois, 7 mois, 12 mois, durée de 5 minutes maximum par souris) -des tests comportementaux à l’âge de 11/13 mois (tests mesurant les déficits cognitifs et étalés sur 1 à 2 mois par souris, 15 jours le 8-arm radial, 8 jours Barnes maze, 2 jours Rotarod, et 2 jours pour l’OF avec une moyenne de 15/20 minutes par jour, par souris et par test) -1 prélèvement sanguin et 1 prélèvement du liquide céphalo-rachidien sous anesthésie réalisée avec des doses létales, l’animal étant ensuite perfusé en intra-cardiaque afin d’effectuer des analyses immunohistochimiques et biochimiques. L’ensemble de cette procédure dure 1H30 maximum.

Impact sur les animaux

Pour la phase 1, un faible stress pourrait être attendu avec la présence de la photobiomodulation mais cela sera vite dissipé par l’habituation à la lumière des animaux au fil des semaines. Par ailleurs, les prélèvements sanguins pourront également induire un stress mais nous aurons recours à l’isoflurane pour anesthésier l’animal si le stress est trop important. La phase 2 pourrait également induire un stress chez les animaux car les tests comportementaux demandent un minimum de stress pour stimuler l’animal à effectuer le test comportemental. Des points limites seront déterminés afin de pouvoir exclure les animaux incapables d’effectuer les tests comportementaux. Enfin la phase 3 consiste à mettre à mort l’animal par perfusion intracardiaque donc chaque animal recevra une dose létale d’anesthésique afin que chaque souris ne ressente rien lors de cette procédure.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Pour obtenir des résultats les plus cohérents sur l’influence du rythme circadien pour l’application de la photobiomodulation (PBM), un modèle animal est indispensable et représente le seul moyen de répondre à cette question. A ce jour il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux par une autre alternative. En effet, un modèle intégré Alzheimer permettra d’obtenir toutes les informations sur la période de la journée la plus bénéfique pour la PBM et de déterminer l’ensemble des modifications subcellulaires générées par la PBM. L’avantage incontestable des souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d’Alzheimer (MA), que nous avons choisi, est la dynamique évolutive de la pathologie, ressemblant au développement de la MA chez l’humain. D’un point de vue comportemental, les souris présentent des déficits de mémoire, d’apathie et d'anxiété. Survenant en amont de l’apparition des plaques, des modifications du rythme circadien et une perte de protéines synaptiques ont été décelées. Par imagerie, on distingue aussi une altération de l’assimilation du glucose dans les aires cérébrales identiques à celles impactées chez l’être humain.

Réduction

En prenant connaissance des bases de données sur les tests comportementaux avec un fond génétique hybride 129/C57BL6, en prenant en compte des connaissances du modèle 3xTgAD par le concepteur du projet, en prenant en compte des conditions de photobiomodulation et en s'appuyant sur une approche statistique, nous avons déterminés que nous aurions besoin de 60 souris 3xTgAD soit 15 souris par groupe (femelles), de 18 souris contrôles femelles avec le même fond génétique et de 22 souris pour l’expérience pilote (22 souris WT). Le total de souris sera de 100 individus. Les modèles murins utilisés seront les 3xTg-AD et les WT femelles exclusivement car les stigmates anatomiques et cognitifs de la MA sont beaucoup prononcés. L’expérience pilote permettra d’affiner les paramètres de la photobiomodulation (PBM), de mettre au point parfaitement les techniques mis en œuvre pour répondre à l’hypothèse du projet et d’obtenir des résultats exploitables. Une modification du nombre de souris WT est actuellement demandé. Selon la première hypothèse et les connaissances sur le sujet, nous avions diminué le nombre de groupe de souris WT pour suivre la stratégie de réduction des 3Rs et car le cycle circadien et la photobiomodulation n’aurait pas dû avoir une influence sur ces souris. Nous avions également expliqué que le groupe WT-PBM sera illuminé série 1 le matin, série 2 l’après-midi et série 3 la nuit pour répondre aux futurs reviewers des journaux scientifiques. Cependant aux vues des premiers résultats, nous devons effectuer la photobiomodulation sur l’ensemble du cycle circadien. Passant de 2 à 4 le nombre de groupe de souris WT et pour obtenir des résultats statistiquement corrects (avec l’aide du logiciel G*Power), le nombre de souris supplémentaire est de 24, soit 124 souris au lieu de 100 auparavant. Ces groupes seront divisés en 4 séries avec pour les 3 premières séries un n=3 pour les WT/ WT-PBM-N et un n=5 pour les 3xTg-AD (au total n=18 pour les WTs et n=60 pour les ADs). Pour la 4ème série, il y aura seulement des souris WTs avec un n=3 pour les WT, n=9 WT-PBM-AM, n=9 WT-PBM-PM et n=3 WT-PBM-N (au total n=24 pour les WTs). Pour respecter les 3Rs, nous avons effectué un test statistique pour limiter le nombre d’animaux tout en ayant des résultats exploitables pour le projet.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure expérimentale, des points limites ont été déterminés pour agir en fonction de la douleur ou du mal être ressenti. La phase 1 n’a à priori aucune incidence sur le bien-être de l’animal mais une surveillance accrue sera faite les premières semaines afin d’évaluer les éventuels effets indésirables que pourrait être produit par la photobiomodulation. Par ailleurs, l’expérience pilote permettra de mieux anticiper les mesures à prendre pour diminuer au maximum les répercussions de cette procédure. En ce qui concerne la phase 2, les tests comportementaux procurent différents niveaux de stress. Avant de commencer la procédure, l’expérimentateur ira chaque jour pendant une semaine pour habituer l’animal à être manipulé. Pour finir, en ce qui concerne la phase 3, les souris recevront une dose létale d’anesthésique permettant de diminuer à zéro la douleur infligée lors de la perfusion intracardiaque et du prélèvement du liquide céphalo-rachidien.

Choix des espèces

Pour analyser l’efficacité de la photobiomodulation (PBM) extracrânienne aux différentes périodes de la journée, pour vérifier la pénétrance de la PBM à travers la boite crânienne et pour observer toutes les conséquences subcellulaires dans un contexte Alzheimer, la souris génétiquement modifiée modèle de la maladie d’Alzheimer correspond à l’espèce la plus pertinente pour tester cette hypothèse. Selon la dynamique évolutive de la maladie d’Alzheimer dans ce modèle, les marqueurs pathologiques (plaques amyloïdes et Tau) sont observables scientifiquement entre l’âge de 12 et 14 mois d’où la procédure sans réveil à cet âge et les déficits cognitifs sont, quant à eux, visibles à partir du 12ème mois. La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative sur des personnes âgées. Dans le cas des souris, cela correspond aux stades adultes/âgés entre 12 et 14 mois.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une greffe de cellules hépatiques humaines sous la capsule rénale, subit jusqu'à seize prélèvements sanguins pour suivre la formation d'un hépatome, puis est tué pour l'extraire, certains échantillons nécessitant un second passage dans le rein d'une autre souris. Le porteur décrit des risques d'hypothermie, de saignement, d'infection et de perte de poids liés à la chirurgie. Il présente ces lignées cellulaires comme un moyen de "réduire l'utilisation d'animaux" dans les tests d'hépatotoxicité, tout en fondant leur production sur l'usage de 900 souris.

Objectifs

Les lésions hépatiques sont une des raisons principales du retrait de médicaments du marché tandis que de nombreuses molécules en cours de développement échouent au cours des essais cliniques pour des raisons d’hépatotoxicité. Pour ces raisons, les études d’hépatotoxicité et de pharmacocinétique représentent des éléments essentiels pour réduire les échecs de développement de nouveaux médicaments. Le foie est un organe essentiel d’où les hépatocytes represente environ 70-80 % de sa totalité et ont des fonctions essentielles telles que : la régulation du métabolisme des glucides, des lipides et du cholestérol ; la production de composants du sérum (facteurs de coagulation, albumine, etc) ; la sécrétion et l’excrétion d’acides biliaires et la biotransformation et la détoxification des médicaments et toxines. Les hépatocytes humains primaires (PHH) constituent le modèle de référence pour prédire le métabolisme et l'hépatotoxicité des médicaments en développement. Cependant, leur accès est limité. Devant cet accès très limité aux prélèvements cadavériques d’échantillons de foie humain, rares, au coût très élevé et de qualité très variable notamment en fonction du donneur et du prélèvement, les laboratoires se tournent vers des modèles animaux ou de lignées cellulaires transgéniques très éloignées de la physiologie humaine. Ainsi notre projet a pour objectif de développer des hépatocytes humains hautement fonctionnels, illimités, reproductibles et prêts à l'emploi provenant de différents donneurs, totalement similaires à des PHH. Ceci en se basant sur notre technologie Natline® d’immortalisation et de maturation ciblée de cellules fonctionnelles qui a déjà fait ses preuves avec la création de cellules béta pancréatiques humaines entièrement fonctionnelles EndoC-bH1 à -bH5. Ainsi, nous pourrions répondre au besoin très fort des laboratoires de recherche et de développement pharmaceutique de modèles humains physiologiques et prédictifs de la physiologie des hépatocytes et de leur réponse aux toxines.

Bénéfices attendus

Le développement de lignées d’hépatocytes humains fonctionnels, ainsi disponibles en quantité illimitée, aurait des conséquences très bénéfiques pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments. En recherche, ces cellules remplaceraient les hépatocytes humains primaires, d’accès limité, et seraient un complément idéal aux lignées cellulaires humaines et modèles animaux. Elles permettraient d’accélérer la recherche sur la physiologie hépatocytaire humaine, les mécanismes des maladies du foie et de toxicité et permettraient la création de modèles pathologiques reproductibles. Concernant la pharmacologie et la toxicologie, l’impact de ces cellules serait immense. La possibilité d’avoir une source illimitée et reproductible de cellules similaires aux hépatocytes humains primaires et représentatives de la variabilité des réponses à l’hépatotoxicité rencontrée dans la population serait un bouleversement pour le processus de développement des médicaments. Une meilleure prédiction de l’hépatotoxicité permettrait de réduire le nombre de médicaments retirés du marché et augmenterait la sécurité des médicaments mis sur le marché, ce qui diminuerait le risque de toxicité hépatique chez les patients. Enfin, l’utilisation de tels hépatocytes humains prédictifs permettrait de réduire l’utilisation d’animaux dans les études de métabolisme et d’hépatotoxicité.

Procédures

Deux interventions: 1) Chirurgie pour greffe sous la capsule rénal de la souris (1 greffe par souris) et 2) prélèvement sanguin pour suivre le succès de la greffe (toutes les 2 semaines après la greffe ou tous les mois, en fonction des premiers résultats et du développement de l'hépatome, 16 prélèvements maximum par souris). La chirurgie, une procédure d’environ 30 min, sera effectuée sous anesthésie et analgésie et il y aura un analgésique administré en préventif pendant 3 jours. Pour la prise de sang, il s'agit d'une procédure sans anesthésie et analgésie car très peu douloureuse. La souris aura une gêne au moment de la piqure ce qui ne durera que très peu de temps. Les prélèvement s’effectueront par la queue de l’animal ou par voie submandibulaire.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les souris seront soumises à une chirurgie afin de greffer des cellules ou tissus humains dans la capsule rénale. Ainsi, la chirurgie et les jours qui suivent sont les moments pendant lesquels les animaux pourront subir des effets indésirables et des nuisances. Les effets indésirables et nuisances possibles sont de la douleur et du stress liés à la chirurgie et une gêne et/ou douleur occasionnée par la plaie. Dans le cas de complications liées à la procédure celles-ci pourraient se traduire par une hypothermie liée à l’anesthésie, un saignement dû à la chirurgie, une infection suite à la chirurgie et une perte de poids. L’amplification des hépatocytes humains sous la capsule rénale des animaux ne devrait pas générer de douleur ou d’inconfort supplémentaire étant donné que leur taille restera très modeste. Néanmoins, dans le cas où un hépatome se formerait vite, l’expérience serait arrêtée au plus tôt et l’animal serait euthanasié et le tissu prélevé afin de minimiser les effets indésirable sur l’animal. La formation de l’hépatome sera suivie via des prélèvements réguliers de sang (1 fois toute les 2 semaines à 1 mois, selon les premiers résultats), pour la mesure de l’albumine humaine. Concernant ces prélèvements sanguins, il s’agit d’une procédure légère qui pourrait occasionner une gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des prélèvements.

Devenir

Tous les animaux utilisé dans se projet seront soumis à une chirurgie pour la greffe de hépatocytes sous la capsule rénal. Ils resteront en vie le temps que l’hépatome progresse et ils seront mis a mort à la fin de l’expérience pour l’extraction de l’hépatome (les hepatocytes). Le cas écheant ils seront mis a mort après l'age de 20 semaines.

Remplacement

Afin d’assurer le succès de notre projet de développement d’hépatocytes humains hautement fonctionnels, stables et en quantités illimités similaires aux PHH, nous nous baserons sur la méthodologie qui a permis la génération des cellules bêta pancréatiques EndoC-bH1 à -bH5, la plateforme NatLine. Une des étapes de cette plateforme est la transplantation de cellules primaires récemment transduites avec un gène immortalisant dans la capsule rénale de la souris SCID afin de permettre l’amplification sélective de cellules différenciées et leur maturation. Pour le développement des cellules EndoC-bH, cette étape a été indispensable, aucune autre stratégie n’ayant permis d’obtenir l’amplification de cellules béta pancréatiques humaines fonctionnelles sécrétrices d’insuline et répondant aux incrétines. Plusieurs travaux décrivant l’immortalisation in vitro d’hépatocytes humains primaires à différents stades de développement ont été publiés par d’autres équipes, mais aucune de ces lignées cellulaires n’a aboutit à des cellules avec des caractéristiques fonctionnelles proches des hépatocytes primaires, principalement en ce qui concerne leur capacité à détoxifier les toxines, ce qui empèche leur utilisation dans les études de pharmaco-toxicologie. Pour cette raison, la greffe initiale des hépatocytes primaires dans la capsule rénale de souris apparait indispensable pour pouvoir assurer l’obtention de lignés d’hépatocytes similaires aux hépatocytes primaires humains. Par ailleurs, dans le cas des cellules béta pancréatiques, après récupération du premier insulinome pour chaque échantillon primaire donné, cet insulinome a du être transplanté à nouveau sous la capsule rénale d’un seconde animal. Sans quoi ces lignées primaires ne survivaient pas in vitro. Seulement après un second passage dans l’animal, les lignées d’insulinome créées étaient suffisamment stabilisées pour pouvoir être adaptées à la culture in vitro. Dans le cas des hépatocytes nous procéderons de la même manière en séparant les hépatomes primaires en deux afin de tenter leur culture in vitro tout en sauvegardant une partie d’hépatome in vivo. Après les premiers essais, si les premiers hépatomes survivent in vitro, nous éliminerons cette étape de passage secondaire dans la capsule rénale de souris et la remplacerons par leur culture in vitro. Cela aura pour conséquence de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention des lignées d’hépatocytes.

Réduction

Nous avons estimé que le projet nécessiterait l’utilisation d’un nombre maximal de 900 animaux. Ce calcul est basé sur l’utilisation de 3 animaux pour la greffe primaire puis d’un maximum de 6 animaux pour les greffes secondaires soit jusqu’à 9 animaux par échantillon primaire de foie. D’autre part, basé sur l’expérience de la génération des cellules béta EndoC-bH, nous avons estimé qu’il nous faudrait un total de maximum 100 échantillons primaires, étalés sur une période maximale de 5 ans, pour générer environ 30 à 40 lignées cellulaires stables à partir desquelles seraient caractérisées les 5 à 10 lignées d’hépatocytes humains les plus fonctionnelles et représentatrices de la diversité de métabolisme hépatique. L’expérience des cellules béta nous a montré qu’il pourrait être indispensable de procéder à une ré-implantation des hépatomes primaires incapables de survivre in vitro. Si cela n’est pas le cas pour les hépatomes et que lors des premières expériences pilotes nous observons qu’ils peuvent être amplifiées in vitro tout en acquérant un caractère de cellules fonctionnelles, nous n’effectuerons plus de passage secondaire dans la souris pour les échantillons primaires suivants. Ceci aurait pour conséquence de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet de jusqu’à 400 animaux (30 échantillons primaires x 9 souris puis 70 échantillons primaires x 3 souris = 480 animaux) si nous considérons qu’il nous faudra traiter un tiers des échantillons primaires via un passage secondaire dans l’animal avant d’avoir un recul suffisant sur notre capacité à amplifier in vitro des lignées fonctionnelles à partir des hépatomes primaires.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les nuisances et douleurs induites par la procédure (chirurgie) et subies par les animaux, différentes actions seront menées. Afin de réduire le stress, les animaux seront reçus dans les locaux de la zootechnie et seront acclimatés pendant au moins 5 jours avant la procédure. Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets prévus pour enrichir leur environnement. Avant la procédure (30 mins), les animaux seront soumis à une injection sub-cutanée d’analgésique en préemptif. Ils seront ensuite soumis à une anesthésie injectable à la kétamine et à la xylazine Ces deux derniers composants entraînent une anesthésie, d’une durée de 20 à 30 minutes et celle-ci sera re-administrée dans l’éventualité où la procédure prendra plus de temps, à une dose équivalente au tiers. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera placé sous l’animal et celui- ci sera couvert tout au long de la procédure. Dans la phase de réveil, l’animal sera placé dans une cage en isolation dans un environnement chauffé et monitoré pour sa température corporelle, hydratation, absence de douleur et confort pendant les heures qui suivent la chirurgie, et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, une analgésie sera administrée en préventif pendant 3 jours, le jour de la chirurgie inclus, soit 6 à 8 heures après la chirurgie puis 2 fois par jour espacé d’environ 12h. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées (7-10 jours après la chirurgie). Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les condition d’hébergement classique A2 de nos installations et surveillé tous les jours. De plus l’apparition des points limites sera surveillé afin d’éviter la souffrance de l’animal ou résoudre d’éventuelles complications opératoires ou post-opératoires. Ainsi, l’animal sera surveillé pour des signes : d’hypothermie, de douleur ou stress, de perte d’activité, de déshydratation ou d’absence de prise de nourriture, de perte de poids, pour l’apparition d’ une infection ou d’une ulcération de la plaie. Dans le cas où un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’évité la degradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il ne sera pas possible de reverser ou soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée.

Choix des espèces

Nous avons mis au point chez la souris, un modèle expérimental qui permet de récapituler la différenciation du pancréas humain. Ainsi, en greffant sous la capsule rénale de souris SCID immuno incompétentes des fragments de pancréas embryonnaires humains immatures, nous sommes capables de reproduire le développement du pancréas tel qu’il a lieu in vivo. Cette méthode, associée à la transduction lentivirale d’un oncogène, nous a permis de générer les seules lignées cellulaires béta pancréatiques humaines entièrement fonctionnelles (EndoC-bH). Ces lignées cellulaires ont depuis été adoptées par plusieurs centaines de laboratoires dans le monde. Cette stratégie sera appliquée ici à l’amplification et à la maturation d’hépatocytes humains pour lesquels il n’existe pas de modèle cellulaire humain définitif. Ce modèle expérimental n’a été testé que sur la souris et pas sur d’autres espèces, rendant nécessaire le choix de la souris pour mener le projet hépatocytes. Les souris qui seront utilisées auront entre 6-20 semaines au moment de l’implantation des cellules ou tissus humains transduits. Ceci car avant l’animal est trop petit et donc la chirurgie est plus compliqué du fait de leur petite taille. En autre, l’amplification in vivo du tissu pourra prendre ensuite jusqu’à 8 mois ( notre expérience avec le développement des cellules béta), ce qui fait que l'animal ne doit pas être trop âgé.