Procédures modérées

198 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur cerveau est irradié sous anesthésie sur une à cinq séances, avec trois prélèvements sanguins et une batterie de tests comportementaux répétés pendant six mois (open field, rotarod, reconnaissance d'objet, labyrinthe aquatique), pour comparer des schémas de radiothérapie FLASH. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer détresse, perte de poids et des dépilations, croûtes ou ulcérations au point d'irradiation. Les bénéfices affichés, des essais cliniques en oncologie pédiatrique et contre les gliomes, restent renvoyés à la suite du projet, tandis que le porteur juge "indispensable" le modèle animal pour étudier un "organisme vivant intégré".

Objectifs

La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale chez des rongeurs. Nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique (ratio entre l’efficacité du traitement et les effets indésirables) en essayant de réduire la toxicité de ces techniques innovatrices en explorant différents schémas temporels de délivrance de la dose. Par ailleurs, nous évaluerons l’impact sur les tissus sains des différents schémas temporels, son impact n’étant pas connu dans cette nouvelle technique de radiothérapie pour le moment.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus sains. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques d’évaluation de la toxicité qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier à l'oncologie pédiatrique et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes, comme les gliomes. La preuve de concept de ces techniques innovantes existe déjà, le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.

Procédures

Dans la procédure visant à étudier l’influence du schéma de fractionnement temporel de la dose sur la préservation des tissus sains et des fonctions cognitives, émotionnelles et motrices, les animaux anesthésiés seront irradiés au niveau du cerveau (environ 20 minutes d’anesthésie). Ces irradiations seront réalisées 1 fois par jour pendant soit 1 ; 2 ; 3 ou 5 séances consécutives (espacées de 48 h). Trois prélèvements sanguins sur les animaux anesthésiés seront réalisés 24h avant la première irradiation, 24h après la dernière irradiation et 7 jours après la dernière irradiation. Tous les animaux seront ensuite évalués par les tests comportementaux suivants : Open Field : évaluation du niveau d’anxiété, de l’activité locomotrice et exploratrice des animaux. Les rats l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois), il se déroule en 1 session de 5 min, à partir d’une semaine avant la première irradiation. Rotarod : évaluation de la coordination motrice, quantification de l’équilibre, l’endurance et la force d’agrippement. Les rats l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois), à partir d’un mois après la première irradiation, il se déroule en 2 sessions de 5 min par jour pendant 4 jours. Reconnaissance d’objet : évaluation des capacités mnésiques des animaux. Les rats l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois), à partir d’une semaine avant la première irradiation, il se déroule en 3 phases : Phase d’habituation (Jour 1 : 2 fois 3 min d’exploration) ; Phase d’acquisition (Jour 2 : 5 min d’exploration) ; Phase de test (Jour 2 : 5 min d’exploration). Labyrinthe aquatique : évaluation d’une potentielle altération des capacités mnésiques par l’irradiation. Les rats l’effectueront 2 fois : à court terme (1 mois après la première irradiation) et à long terme (6 mois après la première irradiation). Ils réaliseront 4 essais par jour pendant 8 à 13 jours. Cage d’activité : cages de vie adaptées, équipées d’une roue de grand diamètre pour mesurer l’activité spontanée des rongeurs sur de longues périodes de stabulation, maximum 7 jours consécutifs. Ils l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois).

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent également présenter des dépilations, croûtes et même ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours. Les nuisances liées aux prélèvements sanguins sont comparable à celles occasionnées par une coupure superficielle. Pendant les tests de comportement, une légère baisse de poids transitoire peut être observée due à l'augmentation de l’activité physique. Les animaux retrouvent leur poids quelques jours après l'arrêt des tests. L'exposition à un nouvel environnement peut générer un léger stress initial chez le rat, ils sont donc habitués progressivement aux salles de comportement et les tests sont répétés plusieurs fois.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures pour analyses histologiques post-mortem.

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains (en particulier l’impact cognitif). De même, les mécanismes inflammatoires, d’infiltration immunitaire et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. C'est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d’animaux par groupe à l’aide d'outils statistiques. Les animaux seront suivis 6 mois maximum. Ce délai est considéré long-terme pour évaluer la possible apparition des effets secondaires sur le tissu sain chez les animaux survivants à long-terme et ainsi pouvoir évaluer l’augmentation de la fenêtre thérapeutique.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons régulièrement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être, puis nous utiliserons un enrichissement adapté avec des objets placés dans les cages d'accueil (des tunnels en carton). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale adaptée aux interventions mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours) pour y remédier, des aliments appétants sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème apaisante cicatrisante pendant au minimum une semaine. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Les animaux utilisés seront des adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de cancer colique et des gavages répétés, puis sont tuées pour prélever tumeur, côlon, foie, rate, sang et fèces, afin d'étudier le rôle d'un acide aminé, la sérine, dans l'effet pro-cancérigène d'une bactérie E. coli. Le porteur indique que le développement tumoral devrait provoquer une perte de poids, un amaigrissement et de possibles lésions cutanées ou nécroses. Les retombées pour les patients, une alimentation appauvrie en sérine après chirurgie, restent renvoyées au long terme, et le porteur affirme l'expérimentation animale "indispensable" faute d'alternative in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour but de poursuivre nos études en précisant les mécanismes d’action impliqués dans la capacité à participer au développement du cancer colorectal (CCR) suite à une infection bacterienne. Nos travaux préalablement publiés démontraient que l’infection avec des souches d’Escherichia coli producteurs de colibactine (CoPEC) isolées de CCR humains accéléraient le développement tumoral sur des modèles murins de carcinogenèse colique et via des mécanismes induits au niveau des cellules épithéliales intestinales. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire semblent démontrer le rôle essentiel d’un acide amine, la serine, dans les effets pro-carcinogènes des CoPEC, au niveau des cellules épithéliales intestinales et dans un modèle murin de prédisposition à développer un CCR. Ce dernier est un modèle long (4 mois), et la taille des tumeurs ne suffit pas à réaliser une étude mécanistique complète de la carcinogenèse. Ainsi, nous proposons d’évaluer l’effet d’une alimentation déplétée en serine sur le rôle pro-carcinogene des CoPEC dans un autre modèle murin. Pour cela, nous évaluerons le développement tumoral de cellules d’adénocarcinome colique murines greffées en sous-cutané chez la souris. Nous avons choisi de travailler chez la souris C57BL/6 avec un modèle murin syngènique afin de nous affranchir des limites de la xénogreffe, en injectant des cellules d’adenocarcinome colique murines MC38 isolées de souris C57BL/6. Il s’agit donc d’un modele tumoral se developpant assez rapidement (20 jours) et qui nous permettra d’obtenir suffisamment de materiel biologique pour les différentes études.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus pourraient nous permettre de conclure sur l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène à distance des CoPEC. Plus précisément, à long terme les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant la colonisation bactérienne chez les patients. Suite à une chirurgie et afin de limiter la recolonisation du tratus digestif par les E. coli producteurs de colibactine, il pourra être envisagé d'administrer aux patients une nourriture artificiel déplétée en sérine.

Procédures

Aucun prélèvement ne sera effectué pendant la durée de l’expérience, en dehors du prélèvement de fèces (1 fois par semaine après gavage soit 5 fois) . En revanche, des prélèvements seront réalisés sur animaux après la mise à mort (feces, sang, tumeur, côlon, foie, rate).

Impact sur les animaux

L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal ainsi que l'aspect et la localisation de la tumeur. Une baisse d'activité́, de locomotion ainsi qu'une perte de poil et un amaigrissement sont attendus au cours de l'expérimentation. D'éventuelles lésions cutanées/nécroses lié au développement tumoral pourront aussi être observées.

Devenir

Des prélèvements de tissus (tumeur, côlon, foie, rate), de sang et de fèces seront réalisés sur chaque animal. Des études histologiques et moléculaires seront ensuite mises en œuvre afin d’évaluer l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène à distance des CoPEC et de mieux comprendre les mécanismes d’interaction bactéries/hôtes/nutrition sur la carcinogenèse colique.

Remplacement

L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n’est pas possible d’étudier le rôle de la sérine sur les effet pro-carcinogènes des bactéries suite à une infection chronique en méthode in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité de la colonisation et de prise de la greffe entre les différents animaux. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage et aux injections sous cutanées, le nombre d'animaux par lot a été réduit au minimum Ainsi, nous avons montré que l’effectif optimal était de 10souris/groupe. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d'abord, un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau et de nourriture, observera le comportement général de l’animal (activité́, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, perte de poids) ainsi que l’aspect et la localisation de la tumeur. Cela permettra de repérer d’éventuelles lésions cutanées/nécroses, ainsi que des développements tumoraux trop importants qui pourraient gêner la souris. Ce suivi sera réalisé par une personne formée en interne au suivi des animaux et désignée compétente à détecter les signes de comportement anormal. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de scooring. Une mise à mort anticipée de l’animale sera réalisée si besoin.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l'homme. Ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur des questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal.

Pour provoquer une chute des plaquettes, des souris reçoivent des chimiothérapies anticancéreuses, 5-FU, carboplatine, gemcitabine ou bortezomib, injectées sous anesthésie gazeuse et suivies de prises de sang à la queue. 269 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements et des analyses post-mortem. L'équipe étudie comment les mégacaryocytes de la moelle osseuse libèrent les plaquettes dans le sang, et retient pour l'imagerie des souris de quatre à huit semaines, dont l'os du crâne est assez fin pour laisser passer la lumière. Une opération chirurgicale sous anesthésie attend en plus 95 d'entre elles, sans que le résumé dise laquelle.

Objectifs

La thrombopénie correspond à une baisse du nombre de plaquettes sanguines exposant les patients à des risques hémorragiques. Il s'agit d'un problème clinique courant chez les patients traités par chimiothérapie. Les plaquettes sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse. Une étape clé et mal comprise dans leur formation est la libération des plaquettes dans la circulation sanguine (intravasation). L’exploration de l’intravasation in vivo constitue encore aujourd’hui un véritable défi car ces événements sont rares dans la moelle. Nous avons montré précédemment que cette étape dépend d’une structure cellulaire particulière : la PodoPZ (extensions permettant de palper son environnement). La PodoPZ permet aux MKs de libérer les plaquettes dans la circulation sanguine. Notre hypothèse est que la PodoPZ contribue à restaurer une numération plaquettaire normale après thrombopénie induite par les agents chimio-thérapeutiques anti-tumoraux (CIT). Ainsi, le but de ce projet est d’étudier l’importance de la PodoPZ dans les thrombopénies liées aux chimiothérapies.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre le fonctionnement de la PodoPZ (zone périphérique des cellules riche en actine et myosine) dans une étape clé et indispensable de la formation des plaquettes sanguines, l’intravasation des MKs. Sur le plan clinique, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de la PodoPZ pour améliorer la prise en charge des CIT, offrant ainsi une méthode alternative de traitement de la thrombopénie.

Procédures

L'ensembles des 269 animaux seront soumis au début des expériences à des injections et prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse pendant 10 minutes. De plus 95 animaux seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les traitements de CIT, les souffrances infligées aux animaux sont légères puisqu’il s’agit principalement d’injections et de prélèvements de sang à la queue sur animal anesthésié. Les protocoles liés au 5-FU et au Romiplostim ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids. Pour les trois autres substances (Carboplatine, Gemcitabine, Bortezomib), le choix des doses et des voies d’injections sont basés sur des études publiées de la littérature qui n’indiquent pas d’effets néfastes ou de saignements. En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux et classons nos procédures en modérées. Pour cela, nous allons surveiller le réveil de l’animal et son état général, des critères qui seront notés dans nos fiches de suivi. Par ailleurs, les souris feront l’objet d’un suivi quotidien basé sur l’apparence, l’abreuvement, l’alimentation, l’examen clinique et le comportement de l’animal, en utilisant les grilles de scores cliniques.

Devenir

A l’issu des procédures les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, l’intravasation met en œuvre simultanément des interactions entre MKs, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal. Nous avons effectué les études préliminaires possibles en culture cellulaire avant de passer sur le modèle animal qui s’avère être la seule solution pour étudier ces phénomènes complexes dans leur intégralité.

Réduction

Nos expériences sont optimisées pour utiliser le moins d'animaux possible ainsi le maximum de prélèvements seront effectués : sang, tissus, organes pour avoir accès aux différentes expériences nécessaires au projet. Le nombre de souris nécessaires pour obtenir des résultats significatifs est calculé en amont suivant un calcul statistique bien défini et détaillé dans la demande de projet. On estime par ce calcul que le nombre d’animaux par lot doit être de n=9 (3 souris par groupe sur 3 séries différentes), l'effet attendu de nos traitements est augmenté de 5x par rapport aux témoins (thrombopénie et rebond selon la littérature).

Raffinement

Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs (ex : anticorps, souris génétiquement modifiées GFP-myosine permettant de visualiser en temps réel la PodoPZ). La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. L’approche d’imagerie requière des animaux à un stade de développement jeune (de 4 à 8 semaines) car ils ont l’os du crâne suffisamment fin pour laisser passer la lumière. Pour les autres expériences les souris seront utilisées entre 8-18 semaines.

Une partie des souris est invalidée pour le gène Slc20a2 et ne produit pas la protéine PiT2, que l'équipe pense impliquée dans la production de chaleur par les tissus adipeux. 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour la pesée et l'analyse de leurs organes. Une partie reçoit jusqu'à 14 semaines un régime riche en graisse, certaines à thermoneutralité, et les souris subissent à jeun une prise de sang à la veine mandibulaire, puis des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avec cinq microprélèvements en deux heures par incision de la queue, sans anesthésie. Le porteur fixe le point limite à une prise de poids de 50 à 60 %, et prévoit une "légère réduction de la mobilité non dommageable".

Objectifs

Nous avions montré que l’absence de la protéine X chez la souris modifie le volume du tissu adipeux de la moelle au cours de la maturation squelettique et dans un modèle d’ostéoporose induite. Ces résultats nous ont conduit à étudier le rôle de cette protéine dans la régulation des tissus adipeux périphériques. Ces tissus adipeux jouent un rôle important dans la régulation du métabolisme énergétique grâce à leur fonction de sécrétion d'hormones, leur fonction de stockage des lipides dans les adipocytes blancs et leur capacité à dissiper l’énergie sous forme de chaleur. La régulation de la température par l'organisme est une fonction vitale qui permet de stabiliser la température corporelle et de lutter contre l’accumulation de masse grasse. Nos travaux récents indiquent que les masses de tissus adipeux sont inférieures en absence de la protéine X. Nos résultats préliminaires obtenus chez les mâles soumis à un régime riche en gras indiquent que les mâles dépourvus de cete protéine résistent à la prise de poids. Pour aller plus loin dans la compréhension des mécanismes d’action de cette protéine dans la régulation du métabolisme énergétique, nous allons poursuivre l’analyse du rôle métabolique de cette protéine chez les souris mâles et femelles, en répondant aux questions suivantes : - les femelles n'exprimant pas cette protéine sont-elles résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras ? - la faible quantité de tissus adipeux et la résistance à la prise de poids sous régime riche en gras des souris dépourvues de la protéine X sont-elles dues à une augmentation de l’activité de régulation de la température par les cellules des tissus adipeux ?

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les mécanismes d’action de PiT2 comme nouveau régulateur de l’activité thermogénique des tissus adipeux. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de certaines maladies métaboliques, telle que l’obésité

Procédures

Les souris seront pesées une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure (Les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue, limitant le stress des animaux). Un prélèvement de 50µl de sang sera réalisé sur souris à jeun par ponction de la veine mandibulaire. Une semaine puis deux semaine avant la fin de la procédure, 5 micro-prélèvements seront réalisés sur une durée de 2h à l'aide d'une légère incision, maîtrisée par les expérimentateurs de ce projet et sous contrôle du personnel de la SBEA.

Impact sur les animaux

Ce protocole conduira à une prise de poids (maximum 50-60%) et à l’apparition d’une glycémie un peu plus élevée qu’en condition standard mais sans atteindre l’état de diabète (170-200mg/dl versus 140mg/dl). Pour les mesures de tolérance au glucose et à l’insuline, les prélèvements de sang sont faits à l'extrêmité de la queue, à l'aide d'une légère incision sur animaux vigiles : douleur légère et de courte durée. Une prise de 50μl de sang sera réalisée au niveau de la veine mandibulaire pour les dosages hormonaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélèvements d'organes (mesure du poids des organes, analyses histomorphométriques et analyses moléculaires)

Remplacement

Le projet concerne l'analyse des effets de l’absence d'une protéine sur la régulation du métabolisme énergétique dans des conditions standard ou dans un modèle d’obésité induite. Le métabolisme énergétique est sous le contrôle de plusieurs organes (tissus adipeux, muscle squelettique, foie, cerveau), nous avons donc besoin de l’organisme entier pour répondre à la question posée.

Réduction

D’après nos travaux antérieurs et nos analyses statistiques, n=12 animaux par groupe est le nombre suffisant pour observer une différence significative. Deux situations peuvent se présenter : 1/ les femelles mutantes sont résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras. Elles seront alors soumises à ce même régime à thermoneutralité pour vérifier si ce phénotype de résistance dépend du processus qui contrôle la température corporelle; 2/ les femelles mutantes se comportent comme les souris contrôles (gain de poids sous régime riche en gras). Le protocole s'arrêtera à cette étape (le nombre de souris total pour cette procédure sera alors réduit de 48 animaux).

Raffinement

Pour la mesure de poids hebdomadaire, les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue. Ce geste limite le stress des animaux. L'hébergement à thermoneutralité aura deux effets possibles : 1/ la résistance à la prise de poids est la même que celle observée à température ambiante dès les 8 premières semaines sous régime riche en gras ou 2/ les souris mutantes perdent leur capacité à résister au régime riche en gras. Dans le cas n°1, nous arrêterons le protocole après 8 semaines de régime puisque nous pourrons conclure sur les effets de la mise à thermoneutralité. La procédure sera donc réduite à 8 semaines au total. Dans le cas numéro 2, nous poursuivrons le protocole pour vérifier si la résistance apparait plus tardivement (maximum 14 semaines de régime riche en gras). Nous avons pris en compte le bien-être animal, un examen régulier permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant les analgésiques adaptés à notre procédure. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate). Nous identifions deux types de points limites. Les points limites généraux applicables à toutes nos expériences utilisant des souris et les points limites spécifiques à la procédure (prises de poids maximales attendues sous régime riche en gras de 50% à 60%). Cette prise de poids peut amener à une légère réduction de la mobilité non dommageable. Pour les tests de tolérance à l’insuline, nous utilisons une dose faible, mais si une souris présente une réponse trop marquée, celle-ci sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques comme l’obésité. Le modèle murin est utilisé de longue date pour comprendre les mécanismes physiopathologiques des maladies métaboliques. Ce projet est la poursuite de la caractérisation phénotypique de souris invalidées pour le gène Slc20a2 qui nous a permis de mettre en évidence, pour la première fois, un rôle potentiel de PiT2 dans la régulation du métabolisme énergétique (résultats non publiés). Sans ce modèle, cette nouvelle fonction n’aurait pas pu être découverte. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines, âge auquel le métabolisme énergétique est stable.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux trous sont percés dans la voûte crânienne de chaque animal sous anesthésie, puis la reconstruction est suivie par imagerie pendant douze semaines, pour tester des implants en titane destinés à la réparation du crâne. Le porteur annonce des douleurs post-opératoires, des infections locales et une ulcération de la plaie possibles, les rats étant tués pour analyser l'os reconstruit. Il retient le rat comme "l'espèce animale la moins évoluée" de taille suffisante pour la chirurgie et juge ces essais nécessaires avant tout passage chez l'humain.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier le potentiel de nouveaux implants en titane pour aider à la reconstruction osseuse du crâne.

Bénéfices attendus

Les implants en titane permettent une reconstruction osseuse complète du defect, sans complications. Ils limiteront également les complications de reconstruction liées aux infections post-opératoires.

Procédures

Les animaux subiront une création de défauts osseux au niveau de la voûte crânienne (sous anesthésie chimique). La durée de l'intervention est estimée à 20-25 minutes. Il y aura deux defauts osseux par rat. La reconstruction osseuse sera suivie, par imagerie tomodensitométrique, pour tous ces animaux à 2, 4, 6, 8, 10 et 12 semaines après l'opération (sous anesthésie volatile). La durée de l'imagerie est estimée à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sont : douleurs post-opératoires, infections locales de la zone opérée, ulcération de la plaie. L'intégrité de la dure-mère sera particlulièrement surveillée lors de l'intervention. A la moindre atteinte, l'animal sera écarté de l'étude. Si des effets non attendus surviennent, ils seront évalués et pris en charge par l'expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vue d'effectuer des analyses histologiques de l'os reconstruit et de la zone environnante.

Remplacement

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de structuration à tester et d'évaluer le risque potentiel d'inflammation post-implantation. Les informations de biocompatibilité et d'efficacité de reformation osseuse sont obtenues uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

L'expérimentation se déroulera en 2 séries d'animaux successives. La première série comprendra 8 animaux de chaque configuration. Le nombre d’animaux total pourra être réduit si l’effet attendu est suffisamment important, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables, après la première série. Les groupes expérimentaux sont constitués de n = 12 individus afin de disposer d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des différentes structurations. Si la normalité est respectée (test de Shapiro), le test statistique utilisé sera soit un Test T soit une ANOVA. Si l’ANOVA est significative (p < 0,05), elle sera suivie d’un post hoc de Tukey. Si la normalité n’est pas respectée, un test de Mann-Whitney ou un test de Kruskal Wallis sera effectué.

Raffinement

Le rat est une espèce animale très proche de la physiopathologie humaine et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. Les différentes étapes de chirurgie seront réalisées sous anesthésie chimique profonde. La douleur post-opératoire sera gérée par l’administration de substances antalgiques de façon systématique pendant les 48h suivant la chirurgie, puis de façon optionnelle en cas de signes de douleurs observés. Les animaux seront anesthésiés par anesthésie volatile pendant les sessions d'imagerie tomodensitométrique. Les points limites seront particulièrement surveillés dans les 48 à 72h qui suivront les expérimentations. Parmi ceux-ci le poids et le comportement seront les premiers contrôlés. Ceci permettra d’intervenir immédiatement en cas de souffrance (administration de substances antalgiques), et/ou d’appliquer les critères d’arrêt prédéfinis de l’étude le cas échéant. Tous les résultats obtenus lors de ces études seront exploités.

Choix des espèces

Le rat est l’espece animale la moins evoluee et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. En effet, la physiologie de la reconstruction osseuse et des réactions inflammatoires chez le rat sont proches de celles de l’humain. Ce modele permet ainsi la realisation d’etudes precliniques de chirurgie reconstructrice avec evaluation radiologique et histologique. Rats matures, âgés de plus de 22 semaines pour exclure un effet potentiel de croissance.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections provoquant une blessure des cellules filtrantes du rein, une partie étant gardée jusqu'à 32 jours au risque de développer une insuffisance rénale, pour étudier l'influence du rythme circadien sur la réparation rénale. Le porteur annonce une hématurie et une perte de poids possibles, les souris étant tuées par perfusion intracardiaque ou asphyxie pour analyser leurs reins. Il affirme que seul l'animal permet d'étudier le fonctionnement d'un organe entier, les pistes thérapeutiques restant à ouvrir.

Objectifs

Le rein assure des fonctions cruciales qui permettent de filtrer le sang afin d'éliminer les déchets de l'organisme dans les urines. La filtration rénale dépend de cellules spécialisées nommées podocytes. Ces cellules sont blessées chez 90% des patients souffrant de maladies chroniques rénales. Des résultats récents suggèrent que le rythme circadien joue un rôle important pour permettre aux podocytes de se réparer suite à une blessure. Dans ce projet, nous allons déterminer comment le rythme circadien influence la capacité des podocytes à répondre à une blessure. Les résultats obtenus grâce à ce projet fourniront des connaissances cruciales pour le développement de stratégies thérapeutiques permettant de traiter les patients atteints de maladies rénales.

Bénéfices attendus

Les résultats générés par ce projet permettront d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour favoriser la protection et la réparation des podocytes face aux blessures accumulées au cours de la vie adulte. Ce travail permettra à terme de tester des approches thérapeutiques innovantes visant à stimuler la capacité des podocytes à répondre à une blessure.

Procédures

Pour les analyses moléculaires (séquençage), les animaux recevront 3 injection intrapéritonéales (1 injection par jour pendant 3 jours consécutifs). Ils vont ensuite recevoir une injection intraveineuse. Ils seront euthanasiés 5 jours après l'injection intraveineuse par perfusion intra-cardiaque après avoir reçu 2 injections intrapéritonéales (analgésie et anesthésie). Pour les analyses histologiques, les animaux vont recevoir une injection intraveineuse. Ils seront euthanasiés 18 ou 32 jours après cette injection un automate par asphyxie au CO2. Durée des injections intrapéritonéales: environ 3 secondes. Durée des injections intraveineuses: environ 5 secondes. Durée des perfusions intracardiaques: environ 5 minutes. Les collectes d’urines se feront par une méthode non-invasive, à savoir par miction spontanée lors de la préhension des souris. Si les souris n’urinent pas lors de la préhension, elles seront placées individuellement, pendant 2 à 3h, dans des boîtes en plastique dans lesquels nous avons percé de petits trous pour permettre une bonne respiration. Ces boîtes sont dépourvues de litière, boisson et aliment, et le fond a été recouvert avec des plaques en plastiques type « 96 puits ». A l’issue de cette période, les animaux seront replacés dans leurs cages d’origine avec leurs congénères et l’urine excrétée par miction spontanée de l’animal sera alors collectée dans les puits.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable. L'injection intraveineuse va entrainer une blessure des podocytes. Cette blessure peut avoir des conséquences sur l'état de santé général des souris.Toutefois, les animaux seront euthanasiés 5 jours après l’injection pour les analyses moléculaires, un temps beaucoup trop court pour développer des symptômes suite à une insuffisance rénale. Pour les analyses histologiques, les animaux seront maintenus vivant jusqu’à 32 jours suite à la blessure, et seront donc susceptibles de développer une insuffisance rénale caractérisée par une hématurie. Une perte de poids transitoire est fréquemment observée dans les 10 jours qui suivent l'injection intraveineuse.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre d'analyser par séquençage et histologiquement les résultats obtenus.

Remplacement

Bien que les techniques de culture cellulaire aient fortement évoluées, les études in vitro ne permettent pas d’étudier des processus biologiques complexes. Seuls les modèles animaux permettent d’aborder des questions relatives au fonctionnement d’un organe dans son ensemble et à l’influence de l’environnement. Aussi, par définition, notre objectif scientifique nécessite le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

En tenant compte des exigences de réduction imposées par la législation, nous avons choisi d’utiliser un nombre minimum de souris par groupe expérimental qui nous permet d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Aussi, pour les analyses moléculaires, les animaux seront soumis à l'expérimentation de manière séquentielle, ce qui nous permettra de stopper cette expérimentation dès que nous aurons collecté des échantillons de qualité́ suffisante pour réaliser un séquençage et ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons un maximum de 104 animaux.

Raffinement

Pour les analyses moléculaires (séquençage), les animaux sont euthanasiés par exsanguination. Ces animaux sont tout d’abord anesthésiés profondément par administration d’un mélange d’anesthésique et de sédatif. Avant toute intervention, la profondeur de l’anesthésie est vérifiée par l’absence de réflexe de retrait suite au mincement des orteils. Cette approche garantit que l’animal ne souffrira pas pendant la perfusion. De plus, les animaux seront analgésiés afin de réduire au maximum la douleur potentiellement subie par les animaux. Pour les analyses histologiques, l’évolution de la dysfonction de la filtration rénale sera surveillée étroitement dès le début de l'expérimentation. Aussi, nous avons mis en place un suivi strict et régulier de la douleur et du stress potentiellement engendrés par l'expérimentation grâce à l’utilisation d’une grille de score. Si un problème est détecté́ sur un animal lors de ces observations, la complétion de la grille permettra de déterminer de façon objective le devenir de l’animal (suivi rapproché, euthanasie).

Choix des espèces

La réalisation de ce projet permettra de comprendre comment le rythme circadien influence la réponse des podocytes au stress. La souris apparait comme un excellent modèle pour répondre à cette question car elle présente de grandes similitudes avec l’Homme. En effet, le rein des souris est histologiquement et physiologiquement similaire à celui des humains. Dans ce projet, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, les animaux de cette tranche d’âge ont un fonctionnement rénal optimal qui n’est pas encore altéré par le vieillissement.

1 716 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses pour provoquer des métastases, dans un modèle génétiquement modifié de cancer du sein triple négatif. Le porteur annonce des tumeurs pouvant s'ulcérer et saigner, une gêne respiratoire et des fractures spontanées liées aux métastases osseuses, les souris étant tuées pour prélever les organes colonisés. Il reconnaît écarter les souris au mauvais génotype issues de l'élevage et juge une étape in vivo "nécessaire", les débouchés thérapeutiques restant hypothétiques.

Objectifs

Les principaux obstacles de l'étude des métastases sont qu'elles se produisent dans un délai inconnu, qu'elles sont visuellement et expérimentalement inaccessibles, qu'elles sont généralement complexes, et qu'il est difficile de maintenir cette complexité dans un système in vitro. Par conséquent, la plupart des études sur les maladies métastatiques se sont concentrées sur le stade ultérieur du développement métastatique, une fois que les métastases sont déjà formées. Bien que ces études aient amélioré nos connaissances sur la capacité des cellules cancéreuses à métastaser, elles ne nous ont pas informés sur la façon dont les cellules cancéreuses s’adaptent à leur nouvel environnement pour former des tumeurs. Décrypter les mécanismes cellulaire et moléculaire de la colonisation métastatique est essentiel pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour limiter la récidive métastatique. L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de la colonisation métastatique des cancers du sein triple négatifs. Pour cela, nous proposons d’utiliser le modèle murin génétiquement modifié C3(1)-Tag qui développe des tumeurs et des métastases similaires aux patients. L’étude de la colonisation métastatique de ce modèle nous permettra de caractériser des acteurs moléculaires pertinents pouvant être cibler par une thérapie innovante. Le projet global consiste à étudier la formation de métastases de carcinomes mammaires, de l’arrivée des cellules cancéreuses dans un nouvel organe à la formation de tumeurs secondaires afin de définir : 1. Les différents phénotypes cellulaires présents au cours de la formation métastatique par séquençage à ARN des cellules cancéreuses à différents temps. 2. Le rôle des marqueurs mésenchymateux dans les cellules cancéreuses au niveau du site métastatique. 3. Les différences de colonisation métastatique entre les organes distants (poumons, foie, os). 4. L’impact du système immunitaire sur la colonisation métastatique.

Bénéfices attendus

Les patientes atteintes du cancer du sein triple négatif (TNBC) connaissent souvent une récidive métastatique et ont donc un pronostic plus sombre. Ces cancers agressifs constituent un groupe de cancers caractérisés par l'absence de récepteurs hormonaux (progestérone et œstrogènes) et de la protéine HER2 à la surface de leurs cellules. Ils ne sont donc pas éligibles aux traitements ciblant ces trois types de marqueurs. Pour atteindre l'objectif ultime de guérir les TNBC, il est important de développer des stratégies qui préviennent ou guérissent la maladie métastatique. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la formation et au développement des métastases de TNBC est une première étape cruciale vers le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour cibler la maladie métastatique. Le projet de recherche proposé a un potentiel important pour faire progresser notre compréhension des métastases de TNBC et donc de réduire la mortalité des patientes. La réussite de ce projet fournira de nouvelles informations sur la manière dont les cellules cancéreuses se disséminent au niveau des sites distants et si différentes stratégies thérapeutiques doivent être développées en fonction du site métastatique. De plus, les résultats obtenus ouvriront de nouvelles voies de recherche pour identifier des thérapies ciblées contre la maladie métastatique des TNBC.

Procédures

Les animaux pourront recevoir l’une des procédures suivantes : - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans les veines caudales latérales (durée : 5 minutes) - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans l’artère caudale (durée : 5 minute) - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans la veine porte sous anesthésie générale (durée : 30 minutes)

Impact sur les animaux

Le modèle C3(1)-Tag est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide mais rarement métastatique (moins de 15% des animaux développent des métastases spontanées). La croissance de la ou des tumeurs primaires peut provoquer des effets indésirables sur les animaux. Particulièrement, l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose centrale par hypoxie, associée à des remaniements cutanés ulcératifs et hémorragiques entraînant une douleur pour l’animal. L’induction de métastases par injection chez la souris peut entrainer des difficultés fonctionnelles au niveau des organes colonisés. Notamment, au niveau du poumon une dyspnée peut être observée due à la présence mécanique des métastases. Des fractures spontanées peuvent être observées due à la présence mécanique de la masse dans le fût osseux. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit. Des observations et examens cliniques seront réalisés tous les deux à trois jours afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront alors surveillés tous les jours afin de leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites majeurs.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après chaque procédure. Pour la procédure 1 (élevage des souris C3(1)-Tag), les souris n’ayant pas le bon génotype seront euthanasiées (car elles ne peuvent être utilisées dans d'autres procédures).Lles souris femelles développant des tumeurs mammaires seront euthanasiées pour le prélèvement des tumeurs, les souris mâles trop âgées pour le croisement ou présentant des tumeurs seront euthanasiées. Pour les procédures 2 et 3 les souris seront euthanasiées aux différents temps nécessaires à notre étude sur la formation de métastases (de la colonisation d’un nouvel organe à la formation d’une tumeur secondaire) afin de collecter les organes contenant des métastases pour analyse.

Remplacement

Le projet s’intéresse à la caractérisation des mécanismes de colonisation métastatique. Il est très compliqué de mimer in vitro une implantation métastatique ectopique complexe dans un terrain pulmonaire ou autre, riche en divers éléments micro-environnementaux. Une étape in vivo est donc nécessaire pour se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales au niveau la niche métastatique. De plus, il est compliqué de maintenir in vitro l’hétérogénéité phénotypique des cellules cancéreuses in vivo. Toutefois, avant implantation in vivo dans la souris, le phénotype des cellules cancéreuses sera étudié ex vivo sur des cultures en 3 dimensions d’organoïdes fraichement isolés et en culture de tranches de poumons. Par exemple, l’effet de l’amplification ou délétion de gènes d’intérêts sera évalué ex vivo afin d’éliminer les cibles n’ayant pas d’effet sur le phénotype des cellules cancéreuses.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale (planification, randomisation et analyse) par l’utilisation de traitements statistiques des données (ANOVA, Bartlett,…). Les protocoles d’injection issus de la bibliographie sont validés et robustes permettant une prise tumorale optimale sur l’ensemble des individus de la cohorte, limitant l’utilisation d’animaux dont les prélèvements se révèlent non analysables. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en se basant sur notre expérience de ce modèle et pourra être réduit en fonction des résultats préliminaires qui seront obtenus ex vivo. L’ensemble du protocole expérimental sera précisément défini en amont afin de limiter les biais de non-homogénéité entre lots de souris. De plus, nous allons utiliser le modèle de culture de tranches de poumons. Brièvement, après injection des cellules cancéreuses par voie intraveineuse au niveau de la queue de souris, l’animal est euthanasié et les poumons sont rapidement récupérés et coupés en tranches fines puis mis en culture. Pour chaque poumon isolé, nous pouvons générer environ 20 tranches ce qui permet de tester in vitro jusqu’à 10 conditions différentes en utilisant un seul animal. En effet, selon notre expérience, au moins la moitié des tranches de poumons présentent des cellules cancéreuses. Cet essai est particulièrement utile pour étudier l’effet de molécules sur les cellules cancéreuses et le tissu pulmonaire en amont de test in vivo.

Raffinement

Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’élevage possible, notamment via un maintien des groupes sociaux (4- 5 animaux par cage) et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier ajoutés aux cages). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une contention la plus rapide et la moins fréquente possible. Nous avons une grande expérience des injections intraveineuse caudales qui nous permet de les réaliser rapidement en limitant le stress chez l’animal. La douleur des animaux utilisés sera fréquemment monitorée par un examen clinique des animaux tous les 2-3 jours afin de déterminer la présence de signes cliniques puis quotidiennement si l’état générale des animaux se dégrade afin d’adapter le plus précocement possible les points critiques chez un animal et d’adapter le protocole d’anesthésie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - Le modèle C3(1)-Tag de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie. - Concordance du modèle C3(1)-Tag murin avec les observations cliniques chez les femmes atteintes de cancer du sein triple négatif. - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - L'organisme évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine - Certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (absence du système immunitaire pour mettre en lumière le rôle de ce dernier dans la colonisation métastatique). - Modèle C3(1)-Tag : les souris C3(1)-Tag développent des tumeurs spontanées à partir de 16 semaines avec des tumeurs d’environ 17 mm de diamètre (1500 mm3, point limite) aux alentours de 22 semaines. Afin de récupérer un maximum de tissu cancéreux, les souris seront utilisées lorsqu’elles présenteront au moins une tumeur de 17 mm de diamètre (environ 1500 mm3), sauf si un point limite est atteint avant. - Modèle NSG : les souris seront utilisées entre 10 et 12 semaines, âge adulte permettant aux souris de supporter le développement de métastases. - Modèle REAR : similaire au modèle NSG, les souris seront injectées avec des cellules cancéreuse C3(1)-Tag entre 10 et 12 semaines pour permettre le développement de métastases.

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un sepsis leur est provoqué par chirurgie, puis elles reçoivent des séances d'électrostimulation musculaire sous anesthésie, pour évaluer un protocole d'exercice contre la fonte musculaire des patients en réanimation. Le porteur annonce une faiblesse et une fonte musculaires, un cumul d'anesthésies, un isolement de 72 heures et une restriction alimentaire imposée aux témoins, les souris étant tuées pour analyser leurs muscles. Il juge le modèle animal "indispensable" car le sepsis touche plusieurs organes, les retombées pour les patients restant annoncées.

Objectifs

Le sepsis, une infection généralisée pouvant conduire les patients en réanimation et sous ventilation mécanique, a des conséquences désastreuses sur le muscle squelettique conduisant à une faiblesse et à une fonte du tissu musculaire. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour lutter contre ces dysfonctions musculaires sévères. Nos travaux montrent que l’augmentation de l’activité musculaire à l’aide de stimulations électriques répétées, contrôlées et non-traumatiques a des effets bénéfiques sur le muscle normal. Ce projet a pour but d’évaluer les effets d’un protocole d’exercice induit par des stimulations électriques musculaires chez des souris atteintes de sepsis. Des analyses de force musculaire, de taille des fibres musculaires couplées à des investigations cellulaires sont réalisées pour objectiver l’efficacité du protocole d’exercice.

Bénéfices attendus

Les patients atteints de sepsis et admis en réanimation présentent une fonte du tissu musculaire et une réduction de la force, responsables d’atteintes fonctionnelles pouvant perdurer jusqu’à 5 ans après la sortie de réanimation. Ce projet permettra de développer un traitement permettant d’améliorer la fonction musculaire de patients atteints de sepsis

Procédures

Les animaux sont soit soumis à un sepsis soit à une procédure contrôle. La durée de l’anesthésie pour la procédure chirurgicale est d’environ 30 minutes. Les animaux reçoivent des injections sous cutanées 4 injections par jour pendant 3 jours. La durée de la contention et des injections est inférieure à 1 minute. Une première procédure permettra de raffiner le protocole de sepsis grâce à un traitement antibiotique et d’évaluer les conséquences des anesthésies indispensables au protocole d’exercice par stimulations électriques musculaires sur la proportion des animaux atteignant les points limites éthiques. Si le traitement antibiotique permet de limiter la proportion des animaux atteignant les points limites éthiques, une seconde procédure sera réalisée et visera à évaluer les effets d’un protocole d’exercice par stimulations électriques sur le système musculaire. Le protocole d’exercice sera réalisé sous anesthésie générale soit dans la phase aiguë (soit au 1er jour post-chirurgie) soit dans la phase tardive (au 4ème post-chirurgie) de l’induction du sepsis. Un protocole contrôle (sans stimulations électriques musculaires) sera également inclus. Dans les deux cas, la durée d’anesthésie générale est de 20 minutes. Six séances d’exercice (ou contrôle) sont réalisées sur une période de 7 jours.

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (chirurgie, injections sous cutanée, stimulations électriques musculaires, anesthésies). La procédure de sepsis a pour conséquence d’induire une faiblesse et d’une fonte musculaires. La procédure contrôle induit également un stress pour les animaux. Pour les deux groupes, le stress des animaux inclut également : 1) la contention lors des injections sous cutanée de buprénorphine, d’antibiotiques, de sérum salé et de solution glucosée (durée inférieure à 1 minute) et de la prise de température, 2) l'anesthésie lors de la procédure chirurgicale (sepsis et contrôle, durée inférieure à 30 minutes) 3) l'anesthésie lors des séances d’exercice par stimulations électriques musculaires ou la procédure contrôle (durée 20 minutes), 4) l’anesthésie avant la mise à mort (durée inférieure à 2 minutes), 5) la réduction de la prise alimentaire pour le groupe sham afin de mimer l’anorexie du groupe sepsis. L’isolement en cage individuelle pendant 72 heures pour faciliter la cicatrisation post-chirurgie

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car le sepsis impacte plusieurs organes, dont les conséquences sur le système musculaire sont impossibles à modéliser in vitro. Aussi, la procédure implique un exercice par stimulations électriques musculaires qui est impossible à reproduire in vitro. Enfin, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous proposons un traitement antibiotique qui permet de minimiser les conséquences fonctionnelles du sepsis. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement peu-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice par stimulations électriques musculaires et de mesurer la force musculaire de manière simultanée sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Si le traitement antibiotique n’est pas efficace pour raffiner le protocole de sepsis, la seconde procédure ne sera pas effectuée. Aussi, en l’absence d’effets du protocole d’exercice sur la force musculaire ou sur la taille des fibres musculaires, les analyses biologiques proposées ne seront pas effectuées.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique aux antalgiques, à l’injection de sérum physiologiques et de solution glucosée ainsi qu’à l'anesthésie générale adaptée lors de l’exercice de stimulations électriques musculaires. Aussi, le sepsis est traité par un traitement antibiotique. Des fibres de peuplier, du coton et un igloo seront placés dans les cages d’hébergement pour favoriser la nidification des souris et leur bien-être. De la nourriture et un hydrogel seront déposés à même la litière afin de prendre en compte la réduction de la mobilité de l’animal et le risque de ne plus pouvoir accéder facilement à la nourriture dans les 72 heures post-chirurgie. Une grille de score et une prise de température sont utilisées pour déterminer les points limites. L’expérience de l’équipe montre que cette stratégie est suffisamment prédictive pour que 93% des animaux soient inclus dans l’étude.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer des déficits de mémoire, elles reçoivent deux molécules par gavage ou injection pendant 21 jours, puis subissent des tests comportementaux dont des épreuves de nage dans une eau à 22 degrés. Le porteur n'annonce qu'un inconfort lié à la contention et attend des molécules qu'elles restaurent la mémoire, les souris étant tuées pour analyser leur cerveau. Il affirme qu'aucune alternative cellulaire ne peut remplacer l'animal entier, un passage en clinique restant conditionné aux résultats.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’identifier l’effet bénéfique de molécules pharmacologiques à potentiel thérapeutique dans des maladies du cerveau (démence fronto-temporale, maladie d’Alzheimer, tauopathie). Deux molécules seront testées et elles seront injectée par deux voies d’administration différentes dans deux lignées de souris modèlisant ces maladies du cerveau (et de leurs contrôles). Nous mènerons ensuite une série de tests comportementaux visant à évaluer si ces différents traitements (molécules actives, molécules contrôle) favorisent la formation de la mémoire chez ces animaux. Des analyses du tissus cérébral (obtenu post-mortem) permettront d’avancer sur la compréhension des effets de ces traitements au niveau cellulaire. Pour comprendre leurs mécanismes d’action, des études moléculaires seront menées en parallèle sur ces tissus obtenus post-mortem à partir d’autres groupes d’animaux traités. Ces études permettront de démontrer si l’administration de ces molécules par voie orale apporte un bénéfice sur le cerveau et s’il l’un de ces traitements (ou les deux) peuvent être ultérieurement appliqués à l’Homme pour des études cliniques.

Bénéfices attendus

En utilisant des modèles animaux de pathologies humaines, cette étude permettra de mettre en évidence si l’administration par voie orale (per os) de nouveaux médicaments est efficace contre les maladies du cerveau. En effet, la validation du mode d’administration oral pour le traitement pharmacologique avec l’une ou l’autre de ces molécules (ou les 2), permettra leur exploitation vers les phases cliniques chez l’Homme. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles apporteront des pistes et des preuves d’efficacité pour aller vers les études cliniques chez l’Homme. De plus, en apportant des bases mécanistiques à leur mode d’action, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet bénéfique de ces molécules sur le cerveau.

Procédures

Le gavage oral sera réalisé sur 360 animaux vigiles, à raison de 1X/jour pendant 3X5 jours suivi de 2 jours de repos, sur une période de 21 jours. Les injections intra-péritonéales seront réalisés sur 240 animaux vigiles, à raison de 1X/jour pendant 3X5 jours suivi de 2 jours de repos, sur une période de 21 jours. Le gavage oral nécessite une habituation à la contention de 30 secondes 1X/jour pendant 3 jours, suivie des contentions répétées 1X/jour pendant 15 jours (sur les 21 au total). Chaque contention est faite sur animal vigile et dure entre 10 et 15 secondes. Comportement réalisé sur 360 animaux vigiles hébergés en cage individuelle avec nid sur une période de 41 jours/animal: Test1 : 48h dans une cage avec peu de litière et sans nid, Test2 : 15min de test/jour dans une boite d’open field sur 5 jours, Test3 : 3X 1min/jour dans de l’eau à 22° C sur 6 jours + 1 min dans l’eau (22°C) 24h après l’entrainement + 1 min dans l’eau (22°C) 21 jours après l’entrainement. Chaque test est séparé du suivant par 3 jours. Les souris transgéniques développent des déficits mnésiques (souris THY-Tau22 à l’âge de 9 mois et souris Thy1-hSNCA à l’âge de 12 mois).

Impact sur les animaux

Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger liées au stress de la contention des souris au moment de l’administration de molécule. Cependant celui-ci sera minimisé par la mise en place d’une habituation à la contention, réalisée 1X/jour pendant 3 jours avant les différents types d’administration. La voie d'administration par gavage oral a été retenue car il s'agit de celle qui serait utilisée chez l’Homme dans les phases cliniques. La voie d'administration intrapéritonéale est la voie qui a déjà été utilisée chez l’animal dans des études pilotes et servira de contrôle à l’administration par gavage oral. L’inconfort ne durera que très peu de temps, juste pendant et après l’injection. Ces deux modes d’administration sont opérés par une personne qualifiée et spécialement formée sur ces gestes techniques, minimisant ainsi le stress auquel les animaux sont soumis. Enfin, aucun effet secondaire (indésirable) n'est attendu avec les deux molécules testées, car des études antérieures ont déjà montré qu’elles n’avaient pas d’effet toxiques, même lors d’injections répétées/chroniques. Cependant, les animaux seront observés et pesés quotidiennement par du personnel spécialement formé lors des administrations des molécules et lors des tests comportementaux. Les souris transgéniques développent des déficits mnésiques entre 9 mois et 12 mois. Notons que l’administration des molécules devraient, selon notre hypothèse de travail, minimiser ces nuisances (par exemple, restaurer la mémoire).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un traitement pharmacologique, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 18 souris/groupe (9 mâles et 9 femelles) pour le comportement et 12 souris/groupe (soit 6 mâles et 6 femelles) pour les approches moléculaires. L’efficacité de chaque traitement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes (voir chronogramme décrivant les groupes d’animaux). Enfin, nous avons créé les lots d’animaux de cette étude en tenant compte des études antérieures qui avaient déjà montré l’impact de ces molécules sur les groupes contrôles et cela nous permet de réduire le nombre total d’animaux de 720 à 600.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ceux-ci bénéficieront de soins appropriés pour optimiser le bien-être des souris, tels que des éléments d’enrichissement (matériel de construction du nid, barre à ronger) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux, sauf pour la durée des tests de comportement où ils seront isolés (1/cage). Dans ce cas, plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Les souris seront manipulées à l’aide de tubes spécifiques pour réduire le stress lors des changes (permet de nettoyer les cages sans toucher la souris). Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir après l’administration d’une molécule : la surveillance des souris est journalière (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et elles sont pesées avant chaque administration de molécule, permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors de l’administration des molécules. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront utilisés à l'âge adulte, soit 9 et 12 mois selon les modèles, cela correspond environ à la moitié de la vie d’une souris de laboratoire. Nos études antérieures ont montré que cela correspond également au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ces modèles. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.