Procédures modérées

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans le cerveau, par chirurgie stéréotaxique, une injection d'extraits issus de cerveaux de patients Alzheimer, puis subit des tests comportementaux, pour étudier la propagation de la protéine Tau par des vésicules. Le porteur annonce une douleur post-chirurgicale et une réduction des capacités cognitives, les souris étant tuées pour analyser les lésions cérébrales. Il affirme qu'aucun modèle ne reproduit cette dynamique in vitro et présente une preuve de concept pour de futures thérapies, restée hypothétique.

Objectifs

L’envahissement progressif du cerveau par des dépôts protéiques anormaux est l’une des causes principales de la maladie d’Alzheimer, maladie neurodégénérative affectant plus d’un million de personnes en France. En particulier, des formes toxiques de la protéine Tau sont véhiculées de cellule en cellule. Ce faisant, elles « contaminent » les cellules réceptrices en provoquant la transformation des protéines Tau normales en formes toxiques. L’accumulation de ces protéines toxiques est liée au développement des signes cliniques de la maladie d’Alzheimer. La propagation dans le cerveau des formes toxiques de Tau repose sur différents modes de transport. Notre projet se focalise sur les modalités du transfert de Tau par des vésicules extracellulaires, des petites capsules microscopiques produites par les cellules. Notre projet vise à comprendre comment des sucres, des héparanes sulfate produits spécifiquement dans les neurones et présents à la surface des vésicules extracellulaires et des cellules, affectent la diffusion des protéines Tau via les vésicules extracellulaires. Nos objectifs sont, dans un premier temps, d’obtenir par purification des vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de tissus cérébraux obtenus post-mortem à partir de patients Alzheimer ou de sujets sains. Ces vésicules seront caractérisées par des méthodes biochimiques et de microscopie, en particulier pour identifier leur contenu en protéine Tau et en héparanes sulfate. Deuxièmement, à l’aide de modèles cellulaires permettant de modifier les niveaux d’expression de la protéine Tau et des héparanes sulfate, nous allons évaluer le rôle de modifications de ces sucres sur le comportement de vésicules extracellulaires et l’agrégation de la forme toxique de Tau. Enfin, à l’aide d’un modèle de souris dans lequel est supprimée l’enzyme HS3ST2, impliquée dans la production d’héparanes sulfate neuronaux, nous allons évaluer in vivo le rôle des héparanes sulfate neuronaux dans le développement d’une pathologie liée à Tau qui sera induite par injection intracérébrale de vésicules extracellulaires isolées d’échantillons post-mortem de cerveaux atteints de la maladie d’Alzheimer. Notre projet apportera une preuve de concept qui nous permettra de proposer des approches thérapeutiques innovantes ciblant de façon précoce la progression de la pathologie tau via l’étude des vésicules extracellulaires et des héparanes sulfates.

Bénéfices attendus

Nous attendons deux résultats majeurs de ce projet pour lequel nous avons déjà développé la plupart des réactifs et méthodes nécessaires. Dans un premier temps, nous caractériserons les mécanismes impliqués dans la propagation de cellule en cellule médiée par les vésicules extracellulaires (EV) des formes toxiques de Tau. Nous évaluerons l’association des EV contenant Tau avec les héparanes sulfates (HS) neuronaux afin d’identifier une nouvelle façon d'empêcher la propagation de Tau. Nous étudierons spécifiquement le rôle joué par HS3ST2, une enzyme neuronale principalement exprimée dans les régions cérébrales vulnérables au développement de la pathologie Tau. Deuxièmement, nos résultats constitueront une preuve de concept pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l'arrêt ou le ralentissement de la transmission entre cellules des formes toxiques de Tau associées aux EV en ciblant les HS neuronaux ou HS3ST2. En particulier, l'utilisation de souris dans lesquelles le gène codant pour HS3ST2 a été supprimé constituera un guide expérimental quant à la stratégie à suivre pour des thérapies futures. En résumé, ce projet constitue une approche originale permettant de mieux comprendre des mécanismes encore mal caractérisés de propagation pathologique des formes toxiques de Tau dans la maladie d’Alzheimer pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées. De plus, les résultats générés par ce projet seront étendus et applicables à d'autres pathologie liées aux protéines tau telles que la maladie de Pick, la paralysie supranucléaire progressive ou la dégénérescence cortico-basale.

Procédures

Les souris reçoivent une inoculation intracérébrale (durée de la stéréotaxie : 20 min). Tests comportementaux (3 sessions de 9 min chacune à 24h d’intervalle par animal) non invasifs permettant de déceler des altérations cognitives associées aux lésions Alzheimer. Euthanasie des souris et prélèvement du cerveaux pour analyses biochimiques et histologiques.

Impact sur les animaux

Douleur post-chirurgie. Réduction des capacités cognitives (légère et en général uniquement détectable dans des tâches comportementales très élaborées).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin du projet pour étudier par des techniques histologiques et biochimiques les différentes lésions cérébrales typiques de la maladie d'Alzheimer induites par notre schéma expérimental. Ces analyses ne peuvent étudiées qu'en post-mortem après prélèvement du cerveau des animaux.

Remplacement

L'apparition des lésions de la maladie d'Alzheimer et leur diffusion dans le cerveau dépend de l'interaction entre les lésions, le système immunitaire et le cerveau de l'hôte. Il n'y a actuellement aucun modèle disponible pour effectuer une analyse complète de la dynamique d'apparition des lésions sans utiliser des animaux. Les tests in vitro ne permettent que d'étudier des aspects non-intégratifs des pathologies amyloïdes ou tau dans la maladie d’Alzheimer. La procédure fait intervenir toute la complexité des systèmes biologiques intégrés (apparition et diffusion des lésions de la maladie d'Alzheimer, interactions avec le système immunitaire) et ne peut pas être réalisé in vitro ou avec des modèles non-mammifères.

Réduction

Le critère principal sur lequel nous basons notre étude statistique est l'induction d'une pathologie tau qui est quantifiée par immunohistologie. Pour l'ensemble de notre étude nous allons étudier 64 animaux. Pour ce projet nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental grâce à des études préliminaires. Les analyses vont être menées de façon progressive (lots de 8 animaux) et des calculs de puissance statistique basé sur des résultats intermédiaires permettra de réduire le nombre d'animaux si un effet fort est détecté ou d'annuler l'expérience si aucune lésion de la maladie d'Alzheimer n'est induite.

Raffinement

Pendant toute l'étude, les animaux sont hébergés dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h optimisés pour l’hébergement des souris. Eau et nourriture sont fournies ad libitum. L'environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire. Les animaux seront hébergés par groupes. Les animaux seront examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision d'un vétérinaire. Toute intervention chirurgicale sera effectuée sous anesthésie générale suivie d’un traitement au paracétamol (antalgique et antipyrétique) dans l’eau de boisson pendant 48h. Des points limites ont été définis afin de limiter la douleur éventuelle des animaux. Ces mesures garantissent que les conditions de douleur et de souffrance inutile des animaux sont contrôlées.

Choix des espèces

Les souris représentent le principal modèle animal pour l’étude de la maladie d’Alzheimer, que ce soit dans des animaux sauvages ou transgéniques. L'induction d’une pathologie Tau de type Alzheimer suite à l'inoculation d'extraits de cerveaux ou de vésicules extracellulaires Alzheimer a déjà été décrite chez des souris sauvages ce qui garantit le succès de notre approche expérimentale. La lignée murine mutée éteinte n’entraine pas le développement de caractères qui altèreraient gravement l’animal. Nous nous intéressons à des événements précoces de la maladie d’Alzheimer. Les souris seront donc inoculées à un stade jeune adulte (à l’âge de 3 mois), conformément aux données de la littérature. L'utilisation de souris plus jeunes ou plus âgées peut introduire des variables susceptibles d'affecter la robustesse de notre modèle.

581 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité tuées à l'issue et 110 replacées comme reproductrices. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie humaine, elles subissent des tests de glucose avec prélèvements par section de la queue, des épreuves de course et des mesures de force musculaire sous anesthésie, certaines recevant des injections six jours sur sept pendant plusieurs mois. Le porteur annonce un stress léger à modéré et utilise des animaux de réforme pour former les manipulateurs, les souris étant tuées pour prélever leurs muscles. Il teste un peptide qu'il juge prometteur après un essai sur levures, une piste d'essai clinique restant renvoyée au terme du projet.

Objectifs

Notre groupe étudie des souris modèles d’une myopathie congénitale de l’être humain. Nous avons mis en évidence que cette maladie s’accompagne d’une anomalie cellulaire qui amène à un défaut de production d’énergie par les muscles, ce qui explique leur capacité d’endurance réduite et les amène à consommer plus d’énergie pour assurer le fonctionnement de leurs muscles. Le gène muté dans cette affection participe à la synthèse de certains lipides et dans une étude précédente, nous avons pu montrer l’intérêt thérapeutique chez les souris mutante d’un peptide stabilisant un lipide dont le contenu est diminué dans les muscles atteints. Nous avons ainsi pu observer une amélioration des performances musculaires et de la respiration musculaire chez les souris traitées par ce peptide. Suite à ces résultats prometteurs, ce projet vise à consolider la caractérisation des effets thérapeutiques de ce peptide chez les souris mutantes et à poursuivre l’évaluation métabolique et musculaire de ces souris hors traitement. Nous évaluerons également l’impact de cette mutation sur les capacités de lactation des femelles en analysant la composition lipidique de leur lait et en suivant la croissance de leurs petits. Enfin, pour la bonne réalisation de ces expériences, nous souhaitons pouvoir former les utilisateurs aux gestes nécessaires grâce à des animaux de réforme.

Bénéfices attendus

Notre équipe a pour mission de caractériser des myopathies affectant l’être humain et de développer des thérapies susceptibles d’améliorer leur condition grâce à des modèles animaux. Une première étude nous a permis de démontrer un rôle prometteur d’un peptide sur le fonctionnement énergétique des muscles de souris modèles d’une myopathie congénitale rare chez l’être humain, à ce jour orpheline de tout traitement. Le projet que nous proposons vise à poursuivre la caractérisation de cet effet thérapeutique afin d’offrir à la communauté scientifique une description la plus précise possible de l’intérêt de cette molécule pour cette affection. Plus largement, ce projet améliorera notre connaissance de cette myopathie, sur le plan musculaire, métabolique et reproducteur. L’objectif est à terme de pouvoir fournir aux médecins en charge des patients atteints de cette myopathie des informations les plus précises possibles sur un modèle animal pertinent de cette maladie, concernant ses mécanismes, son évolution et ses conséquences. Enfin, l’objectif est de pouvoir leur proposer une piste pour un essai clinique à partir d’éléments fiables et précis sur la sécurité et l’efficacité d’une molécule, telle que potentiellement ce peptide.

Procédures

Selon les procédures, les animaux subiront l’une de ces séries d’interventions : 1. a. Test de tolérance au glucose ou de sensibilité à l’insuline : mise à jeun respectivement 12h ou 4h, 7 prélèvements de sang, de 20 secondes, sur 2h, après section d’1/2 mm de queue, 1 fois dans la vie. b. Epreuves de course comprenant habituation sur 4 jours, mesure de la vitesse maximale aérobie (VMA), endurance et mesure du taux de lactates dans le sang, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la VMA environ 30 min, l’endurance environ 1h30 et la mesure du taux de lactates dans le sang après une épreuve d’endurance à nouveau environ 1h30 maximum. Pour la mesure du taux de lactates dans le sang, les animaux subiront 2 prélèvements de sang de 30 s, l’un avant et l’autre après la course, après section d’1/2 mm de queue. c. Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale avec analgésie forte : chaque intervention durera au maximum 1h, soit 2h30 de manipulation au total en comptant depuis la première injection d’analgésique et jusqu’au réveil complet. Réalisée au maximum 3 fois dans leur vie. Tous les tests fonctionnels (test de tolérance au glucose, de sensibilité à l’insuline, mesure de la vitesse maximale aérobie, endurance, mesure du taux de lactates dans le sang, mesure de la force musculaire) seront séparés a minima de 4 jours. 2. Mêmes interventions qu’en 1, avec en plus une injection sous-cutanée 6 jours sur 7 de l’âge de 4 semaines jusqu’à 4 mois. Chaque injection dure environ 30 s. 3. Trois injections sous-cutanées ou intrapéritonéales ou prélèvements d’une micro-goutte de sang, ou toute combinaison de 3 de ces gestes, séparés a minima de 24h (30 s pour chaque geste) ou une série d’épreuves de course (habituation, VMA, endurance, mesure de la lactatémie) ou 3 mesures de force musculaire, séparées a minima de 4 jours, tels que décrits en 1. 4. Mesure de la glycémie par un prélèvement de sang de 20 s après section d’1/2 mm de queue, 1 fois dans la vie.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger lié à la contention, aux injections ou aux prélèvements, ou modéré lors des épreuves de course. Les femelles en lactation et leurs petits pourront subir un stress énergétique modéré. Les injections et prélèvements pourront causer une douleur légère et brève aux animaux.

Devenir

La majorité des animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires. Une partie des animaux sera replacée comme reproducteurs.

Remplacement

Nous étudions des souris mutantes qui constituent un modèle de myopathie humaine. Une molécule semblait prometteuse d’après son mécanisme d’action et nous l’avons donc testée chez des levures mutantes pour le gène équivalent à celui qui est muté chez les souris que nous étudions. Ces levures présentent en effet des défaut cellulaires et métaboliques très proches de ceux observés dans les cellules musculaires des souris mutantes. Dans ce contexte de remplacement, cette molécule a restauré la croissance des levures mutantes. Forts de cette preuve de concept, nous avons ensuite testé cette molécule chez les souris mutantes. A ce stade, nous avons besoin de nouvelles analyses sur ces souris mutantes pour poursuivre l’évaluation de cette molécule à potentiel thérapeutique sur la fonction musculaire et métabolique de ces souris. Nous avons également besoin d’utiliser des animaux pour évaluer les conséquences de la mutation de ce gène sur la fonction musculaire et la reproduction.

Réduction

Grâce aux connaissances accumulées ces dernières années sur ces souris mutantes et les tests réalisés, nous pourrons optimiser le nombre de lots et le nombre d’animaux par lot pour les réduire autant que possibe, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique. Nous utiliserons pour cela des analyses statistiques adaptées. Par ailleurs, nous utiliserons des animaux de réforme pour la formation aux gestes techniques et tests fonctionnels.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Le comportement des mâles est particulièrement surveillé et en cas de bagarre grave amenant à des plaies, le mâle agresseur est séparé de ses congénères et ses congénères sont pris en charge de manière adaptée (mise à mort compassionnelle si blessures trop graves, soins dans les autres cas). En dehors de ce cas, seuls les mâles reproducteurs seront maintenus isolés. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft ou du coton, un bâton de bois à ronger et une maison en carton. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Tous les gestes seront réalisés avec une attention très forte au respect physique et émotionnel des animaux. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice, au besoin pharmacologique, et en cas d'absence de bénéfice, nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Grâce à la génération de mutations d’intérêt par manipulation du génome, la souris est un mammifère particulièrement pertinent pour l’étude des affections humaines et notamment des myopathies congénitales, que ce soit pour l’étude des mécanismes en jeu ou la réalisation d’essais thérapeutiques. Elle présente par ailleurs des atouts zootechniques (temps de reproduction court, petite taille, effectifs importants) et techniques (familiarité et facilité de manipulation). Nous utiliserons de animaux à partir du sevrage, et jusqu’à un an maximum, ainsi que des jeunes, suivis de leur naissance jusqu’au sevrage (étude de la lactation). Pour la procédure de formation, nous utiliserons des animaux de réforme, âgés d’un mois à un an. Ces âges seront pertinents pour les études réalisées et minimiseront le risque d’effet dommageable de la mutation étudiée.

648 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie une incision du caecum ou de l'estomac refermée par un polymère adhésif, pour valider des produits destinés à remplacer les sutures en chirurgie digestive. Le porteur annonce un risque d'infection bactérienne, des douleurs abdominales, une perte de poids et une léthargie après l'opération, les rats étant tués pour analyser la cicatrisation. Il présente ces travaux comme une étape de développement de ses propres polymères et affirme qu'il lui est "impossible" de les remplacer par des méthodes sans animaux.

Objectifs

Ce projet permettra de caractériser et de valider in vivo l'intérêt de nos polymères adhésifs biocompatibles pour la réparation tissulaire dans le cadre de chirurgies du système gastro-intestinal. L'objectif est d'évaluer les propriétés adhésives et mécaniques de nos polymères notamment leur conformité aux tissus après application locale au site de chirurgie. Les indications dans lesquelles nos polymères seront évalués sont les suivantes : (1) promotion d’étanchéité dans le cadre des anastomoses colorectales et (2) après gastrectomie. Cette évaluation sera réalisée sur du court à long terme, et permettra de sélectionner les candidats polymères les plus pertinents pour chacune des indications mentionnées ci-avant. Compte tenu de l'innovation de notre technologie, ces informations ne sont pas disponibles dans la littérature et sont essentielles au développement de nos produits.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider au niveau préclinique l’intérêt de nos polymères à (1) venir en support des méthodes de réparation déjà existantes afin de compléter leur action et d’éviter des effets secondaires tels que les fuites voire (2) remplacer les sutures couramment utilisées lors de ces chirurgies (et présentant des limitations) afin de réduire le traumatisme aux tissus et de faciliter la procédure chirurgicale. Ce projet fait partie de l’étape de recherche et validation de produits qui seront implantés dans le corps humain, qui permettra de réduire le risque pour le patient. Il nous est impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas d’animaux. Ce projet a donc pour but de mettre en évidence l’intérêt du développement de nos polymères adhésifs, dans un modèle rongeur adapté aux cas cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux procédures : 1) Après anesthésie et analgésie de l'animal, un défaut sera réalisé sur le caecum puis scellé avec une ou 2 sutures et l’application d’un polymère adhésif. La durée de la procédure sera d’environ 20 minutes par animal. 2) Après anesthésie et analgésie de l'animal, un défaut sera réalisé sur l’estomac puis scellé avec une ou 2 sutures et l’application d’un polymère adhésif. La durée de la procédure sera d’environ 20 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les risques anesthésiques sont les suivants : hypothermie et assèchement de la cornée. Une infection bactérienne est un effet indésirable potentiel résultant de la section du caecum ou de l’estomac. Suite à la chirurgie, les rats pourront présenter des douleurs abdominales. Les animaux pourraient également manifester des signes de perte de poids, malaise et léthargie associés à la procédure chirurgicale.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire car des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. L’absence de battements cardiaques et réflexes sera confirmée puis une dislocation cervicale sera réalisée selon les directives de la Structure chargée du Bien Etre des Animaux, le vétérinaire référent et l’inspecteur de la Direction Départementale de la Protection des Populations.

Remplacement

Les études ex vivo ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Par conséquent, ce projet a pour but de valider l’efficacité de nos polymères à la prévention de fuite dans le cadre de chirurgies du système gastro-intestinal.

Réduction

Le nombre d’animaux (648) a été rationalisé au maximum en tenant compte des tests préalables réalisés sur les polymères candidats à l’implantation in vivo, afin de réduire le nombre de polymères à tester : 1) Propriétés physico chimiques 2) Etude des capacités de polymérisation 3) Caractérisation ex vivo des propriétés mécaniques et d’adhésion Aussi, le nombre d’animaux par groupe (6) a été défini en se basant sur les analyses statistiques qui seront effectuées.

Raffinement

Le nombre d’animaux par cage (2 animaux) respectera la législation sur la protection des animaux de laboratoire. Les rongeurs disposeront à volonté d’eau et d’aliments jusqu’à 2-3h avant la chirurgie puis post-chirurgie. Les animaux seront soumis à un jeun 2-3h avant la chirurgie (uniquement la nourriture, l’eau restant disponible à volonté) pour minimiser le contenu dans le caecum et l’estomac. Tous les animaux seront hébergés en portoirs ventilés et enrichis avec des maisons, des bâtons, du papier, des balles en bois ou des os en plastique. La totalité des gestes expérimentaux sera pratiqué par du personnel qualifié. Les animaux recevront un traitement antalgique avant toute procédure chirurgicale qui se fera sous anesthésie générale. A la suite de la procédure chirurgicale, un traitement antalgique systémique sera administré, ainsi qu’un traitement antibiotique pour prévenir des infections. Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin d’évaluer de potentiels signes de mal-être. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. En cas d’atteinte des points limites (variation relative du poids corporel supérieure ou égale à 20 pour cent par rapport au poids maximum mesuré, persistante sur 2-3 semaines ou dégradation de l’état général de l’animal), l’euthanasie de l’animal sera effectuée. La lignée de rats impliquée sera Wistar, et le nombre maximum d’animaux utilisé sera de 648.

Choix des espèces

L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentiel à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. La taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison des porcs ou des brebis. De plus, les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour évaluer la réparation des défauts dans le système gastro-intestinal. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude. Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. Simultanément les animaux seront jeunes et donc auront une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement. Les animaux seront bagués sur l’oreille dès leur arrivée dans l’animalerie.

1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un cathéter posé dans la veine jugulaire, des administrations orales jusqu'à deux fois par jour et des prélèvements sanguins et urinaires répétés, pour mesurer la toxicité osseuse de composés développés par les clients du laboratoire. Le porteur annonce une inflammation transitoire aux sites d'implantation et d'injection ainsi qu'un stress lié à l'isolement en cage métabolique jusqu'à 24 heures, les rats étant tués pour prélever leurs os. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage osseux d'un organisme entier et juge l'usage d'animaux "indispensable".

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’évaluer les atteintes osseuses potentielles qui pourraient survenir lors de traitements thérapeutiques. En effet, des études de pharmacovigilance ont montré que la fragilisation osseuse peut être induite par des médicaments, par carence ou pertes en calcium, phosphate et vitamine D, ou réduction de la minéralisation / densité minérale de l’os. La classe thérapeutique la plus fréquemment en cause est celle des corticoïdes mais d’autres médicaments sont aussi suspectés comme les antirétroviraux, des antiacides, des médicaments antiépileptiques, des antithrombotiques mais aussi des antidépresseurs, des neuroleptiques, et médicaments utilisés par exemple dans le traitement du cancer du sein. A noter aussi qu’un risque d’ostéoporose est évoqué pour les statines, et retrouvé significatif à forte dose. D’autre part, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques citées ci-dessus, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet afin d’évaluer sur l’animal les effets secondaires potentiels de composés thérapeutiques actuellement en développement chez nos clients. Les études permettront de définir les types de lésions osseuses qui pourraient être observées, et d’améliorer les schémas thérapeutiques d’administration des composés évalués afin de réduire et/ou abolir les effets délétères, voire même de stopper le développement de certains composés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la pharmacocinétique ainsi que sur la potentielle toxicité osseuse des composés étudiés. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques osseuses chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie, et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Un cathéter connecté à un dispositif facilitant les prélèvements récurrents de sang sera posé dans la veine jugulaire de l’animal (45 min environ par animal). Les administrations orales de composés seront réalisées sur animaux vigiles (moins de 5 minutes par administration). Les fréquences d’administration (au maximum 2 fois par jour) dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les injections de composés seront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par injection). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles via le dispositif de prélèvement (moins de 3 min par prélèvement). Si des prélèvements à l’aorte abdominale sont effectués, ils ne se feront qu’en point final sous anesthésie avant euthanasie de l’animal. Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux (moins de 5 minutes par prélèvement) ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où l'urine libérée par l’animal pendant ce laps de temps sera collectée.

Impact sur les animaux

Une possible réaction inflammatoire pourra apparaître au cours du temps en cas de toxicité osseuse (due à l’administration du traitement thérapeutique). Pour prévenir ce cas de figure, les animaux sont suivis de près et des grilles d’évaluation clinique ainsi que les conduites à tenir en cas de l’observation de ces signes ont été prévus. Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Inflammation transitoire au niveau du site d’implantation de cathéter - Inflammation transitoire au niveau du site d’injection du traitement - Stress dû à l’isolement des animaux en cage métabolique pour une durée maximale de 24h

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le composé et/ou évaluer la toxicité systémique par numération sanguine et/ou évaluer les modifications éventuellement de biomarqueurs du remodelage osseux et du métabolisme phosphocalcique. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les composés que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs et en accord avec l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié

Choix des espèces

Le rat a été choisi pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. Le rat, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, la taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus de la vaccine ou de la grippe par voie cutanée ou nasale sous anesthésie, puis reçoivent des injections et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle d'une protéine dans la mise en place des lymphocytes T mémoires de la peau et du poumon. Le porteur qualifie les atteintes de légères et affirme que ces infections ne génèrent pas de signes cliniques, les souris étant tuées pour prélever leurs organes. Il présente ce travail de recherche fondamentale comme visant à comprendre les mécanismes de défense, et juge l'étude in vivo "nécessaire" faute de pouvoir reproduire la réponse immunitaire in vitro.

Objectifs

Lors d’une infection virale, les lymphocytes T prolifèrent et acquièrent la capacité d' éliminer les cellules infectées. En parallèle, un petit nombre de lymphocytes T mémoires se développent, qui sont capables de réagir de manière plus rapide et plus efficace en cas de nouvelle rencontre avec le même virus. Il existe différentes sous-populations de lymphocytes T CD8 mémoires. L'une d'entres elles est capable de résider sur le long terme dans le tissu préalablement infecté. Il s'agit des Lymphocytes T mémoires résidents des tissus et ils représentent l'une des premières barrières de défense immune dans les tissus. Une protéine a été identifiée comme étant impliquée dans la mise en place de ces lymphocytes T résidents, dans la peau et le poumon, après infection virale. Ce projet vise à présent à étudier plus en détail le rôle de cette protéine, dans la mise en place d'un compartiment mémoire résident, dans la peau et le poumon. Pour cela, nous utiliserons des modèles murins d'infections virales (par le virus de la vaccine et le virus de la grippe), de la peau et du poumon.

Bénéfices attendus

Les lymphocytes T mémoires qui résident dans les tissus non lymphoïdes représentent la première ligne de défense contre des infections virales. Ce projet permettra de comprendre le rôle spécifique d'une protéine récemment identifiée, dans la mise en place de ce compartiment tissulaire et dans sa capacité à remplir ses fonctions de défense anti-virale.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal concerné – durée 30 secondes par narine - Infection cutanée (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal concerné – durée 2 mn ; - Injection Intraveineuse (sous brève anesthésie gazeuse) – 1 fois par animal – durée de l'anesthésie: 30 secondes; Injection intrapéritonéale pour anesthésie profonde: 1 fois par animal – durée de l'anesthésie: 30 mn; Prélèvements sanguins (sous anesthésie gazeuse)- 1 fois par animal – durée 30 secondes;

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur générée par les injections intra-péritonéales; ii) une légère douleur générée par les injections intra-veineuses et une légère irritation à l'oeil; iii) le stress généré par l’anesthésie et/ou la procédure d’inoculation du virus par voie intranasale ; iv) une légère abrasion de la peau suite à l'infection par voie cutanée; ; v) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang. Les infections virales par voie cutanée ou intranasale sont des procédures bien établies dans la communauté scientifique et dont les conséquences ne génèrent pas de signes cliniques sur les animaux.

Devenir

Des prélèvements d'organes seront réalisés sur les animaux mis à mort, afin d'effectuer des analyses cellulaires et morphologiques sur les lymphocytes T.

Remplacement

Les mécanismes de défense d'un organisme face à une infection virale sont basés sur la capacité des cellules immunes à circuler dans l'organisme : ainsi, une infection au niveau de la peau ou du poumon déclenche une cascade d'évènements qui conduit notamment au recrutement de lymphocytes T circulants, qui acquièrent la capacité de pénétrer dans le tissu infecté. Une fois le virus éliminé, une partie de ces lymphocytes persistent dans le tissus réparé. Ainsi, la réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. L’utilisation de modèles murins est donc nécessaire pour comprendre la complexité des mécanismes qui prennent place lors de la réponse immunitaires face à une infection

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris au maximum, nous utiliserons par exemple qu’un seul groupe control pour toutes nos approches expérimentales afin de réduire par 2 le nombre de ces animaux. Nous avons aussi calculé par des approches statistiques le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir interpréter les variations expérimentales que nous attendons et nous assurer que nos travaux seront interprétables et ne devrons pas être répétés inutilement sur des animaux complémentaires.

Raffinement

Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, l'ensemble des gestes techniques seront réalisés sous anesthésie profonde ou gazeuse. Concernant les anesthésiers profondes, les animaux seront placés sur un tapis chauffant durant toute la durée de l'anesthésie, pour limiter les risques d'hypothermie, et du gel oculaire sera appliqué sur les yeux des souris, afin d'éviter la sécheresse oculaire. De plus, nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée). Enfin, nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, et des points limites définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper toutes souffrances et tout mal être des animaux. de plus, les animaux sur lesquels nous identifierions des signes de douleur seront immédiatement mis à mort pour éviter toute souffrance inutile

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi car il permet de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés et d'étudier les conséquences d'un gène invalidé ou muté, sur la génération et la maintenance d'un compartiment mémoire dans le tissu cutané. Ce type d'expériences est nécessaire pour comprendre la mise en place d'une compartiment résident des tissus, au cours des réponses immunes. De plus, des souris adultes (entre 6 et 12 semaines) seront utilisées: le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection et certains animaux seront gardés jusque 45 jours après infection.

440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit un dispositif implanté dans l'abdomen par chirurgie, l'autre des injections locales, et toutes subissent l'application répétée de pommades irritantes provoquant psoriasis, eczéma ou dermatite, pour tester le potentiel thérapeutique de la cytokine IL-34. Le porteur décrit un épaississement de la peau accompagné de démangeaisons ou de douleur locale, et prévoit la mise à mort pour prélever peau et organes immunitaires. Il affirme que la structure et l'immunité de la peau rendent l'analyse in vivo "indispensable", les retombées pour des maladies humaines fréquentes restant annoncées à terme.

Objectifs

La cytokine IL-34, découverte en 2008, a été principalement décrite pour son implication dans la survie et la différenciation de certaines cellules immunitaires présentes dans le sang et les tissus. Plus récemment, il a également été montré qu’elle est impliquée dans la fonction de cellules régulatrices, aboutissant à une tolérance dans le contexte de la transplantation. Cette protéine a donc un grand potentiel thérapeutique dans la maitrise du rejet de greffe, mais également dans d’autres maladies autoimmunes ou inflammatoires. Celle-ci pourrait en effet offrir une alternative aux traitements donnés à ces patients pour limiter l'action du système immunitaire, dont les effets secondaires sont importants. En parallèle, il a été décrit que les cellules de Langerhans, cellules résidentes de la peau, sont dépendantes de la présence d’IL-34. Cela rend l’étude du rôle de l’IL-34 dans le compartiment cutané très intéressant, au niveau des cellules de Langerhans mais aussi d'autres cellules résidentes du derme. L’objectif principal est donc d’étudier le potentiel thérapeutique de l’IL-34 dans le traitement de pathologies inflammatoires de la peau comme le psoriasis ou l'eczéma par exemple.

Bénéfices attendus

Plusieurs bénéfices, à court et long terme sont attendus avec ce projet. Dans le cadre du projet, l’association des résultats obtenus in vitro et in vivo permettra l’amélioration des connaissances sur les mécanismes d’action de l’IL-34, et de l’impact sur les différentes cellules cibles présentes dans le derme et l’épiderme. Mais l’objectif est surtout la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour la molécule IL-34, ici dans des modèles de pathologies cutanées. Ces résultats permettront de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour ces pathologies très fréquentes chez l’homme. De manière plus générale, la cytokine IL-34 pourrait avoir un potentiel thérapeutique dans plusieurs maladies autoimmunes ou inflammatoires. Celle-ci pourrait en effet offrir une alternative aux traitements immunosuppresseurs dont les effets secondaires sont importants chez les patients, et dont l’efficacité peut être insuffisante.

Procédures

Deux voies d’administration de la molécule thérapeutique seront comparées. 50% des animaux seront traités à l’aide de dispositifs implantables permettant une diffusion continue de la molécule thérapeutique. Le traitement via l’utilisation de ces dispositifs implique une seule chirurgie (environ 30 min) pour leur implantation au niveau de la cavité abdominale. Toutes les précautions sont prises pour limiter le stress, l’inconfort et la douleur induite par la chirurgie, avec une procédure réalisée sous anesthésie gazeuse, une analgésie pré- et post-opératoire, une prévention de l’hypothermie avec placement des animaux sur tapis chauffants, ainsi que la prévention de l’hypotension avec l’injection d’une solution saline. Les animaux sont suivis de manière journalière dans les jours suivant la chirurgie. 50% des animaux recevront le traitement sous forme d’injections locales au niveau des zones lésées de la peau, l’objectif étant d’évaluer l’efficacité locale et de limiter les potentiels effets secondaires. Ces injections seront également réalisées sous anesthésie afin de limiter le stress et garantir la sécurité des animaux, ainsi que la qualité de l’injection thérapeutique. Dans les différents protocoles, l’induction des pathologies se font par application cutanée de pommades ayant un effet irritant localement. Le protocole de psoriasis a une durée de 5 jours avec une application locale journalière. Le protocole de dermatite allergique de contact a une durée de 10 jours avec un total de 2 applications locales. Le protocole d’eczéma a une durée de 20 jours, avec un total de 12 applications locales. Toutes ces applications se feront sous anesthésie générale de courte durée afin de limiter la contention et le stress des animaux.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables modérés et de courte durée sont attendus dans les procédures décrites dans cette saisine. Ces effets sont décrits ci-dessous et seront tous pris en compte afin de limiter leur intensité et leur durée. En plus des soins pré- et post-opératoires ainsi que des traitements analgésiques prévus suite à la chirurgie, les animaux sont suivis de manière journalière dans les jours suivant la chirurgie, bien qu’aucune réduction de mobilité ou inconfort n’est attendue. La réalisation des injections au niveau de la peau ne doit pas être responsable de douleurs au niveau local, mais sera également réalisée sous anesthésie. Dans les différents modèles de pathologies cutanées décrits ici, l’induction des pathologies se font par application cutanée de pommades, ayant un effet irritant localement et spécifiques pour chaque modèle (psoriasis, dermatite allergique de contact, dermatite atopique/eczéma). Ces pommades sont appliquées de manière répétée sur une petite zone de la peau des animaux, soit au niveau d’une zone de l’abdomen, soit au niveau de l’oreille. Les effets attendus sont un épaississement de la peau de l’oreille, associé au non à des démangeaisons ou une douleur locale. Telles que décrits dans la littérature, les effets attendus sont légers avec peu d’impact sur le bien-être et le comportement des animaux traités. Une grille de suivi clinique et un suivi de poids seront réalisés afin de pouvoir repérer une éventuelle aggravation de l’état clinique des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Le but est d'obtenir le maximum d'informations sur les mécanismes d'actions et cellules cibles de la molécule thérapeutique, pour chaque animal traité, et en comparaison avec les animaux non traités. Un prélèvement de sang sera réalisé avant euthanasie afin d'analyser les cellules immunitaires et cytokines circulantes du sang. Des prélèvements d'organes seront réalisés en post-mortem afin d'analyser effets de la molécule thérapeutique sur les différents organes immunitaires (ganglions, rate) mais également au niveau de la peau traitée ou non traitée.

Remplacement

La majorité des résultats obtenus sont issus d'études sur la structure et la fonction de l’IL-34, réalisées in vitro sur cellules de souris et humaines, et ont permis de mettre en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’IL-34. Malgré cela, ces résultats sont limités par l’absence de contexte physiologique et par la complexité du système immunitaire qui ne peut être mimé in vitro. L’utilisation de modèles pré-cliniques est donc nécessaire pour approfondir les mécanismes d’action et cibles thérapeutiques potentielles de l’IL-34, notamment dans les pathologies cutanées ayant une composante immunitaire. La peau possède une structure et une immunologie très spécifique, qui rend l’analyse in vivo indispensable.

Réduction

Un nombre total maximum de 440 animaux est prévu dans ce projet, dont la répartition est décrite ci-après. Le nombre d'animaux a été déterminé de façon à être interprétable statistiquement. Chaque protocole contient 4 groupes de 10 souris maximum, soit 40 souris par modèle. Quatre modèles seront développés, à savoir un modèle de psoriasis, un modèle de dermatite allergique de contact, avec deux agents différents, et un modèle d'eczéma (dermatite atopique). Pour chaque modèle, 2 voies d’administration seront comparées, une administration systémique par l’utilisation de dispositifs implantables permettant une diffusion continue, ou une administration via une injection locale au niveau de la zone lésée de la peau. De plus, l'efficacité du traitement en préventif et en curatif sera comparée. Pour chaque modèle, des expériences préliminaires seront d’abord effectuées sur un petit nombre d’animaux; si les effets observés ne sont pas suffisamment visibles in vivo lors de premiers tests (groupe de 3 à 4 souris par expérience), les expériences ne seront pas reproduites et la totalité des 10 souris ne sera donc pas utilisée. Dans le modèle de dermatite de contact par exemple, un seul agent sera testé en premier lieu, et si le modèle est satisfaisant, le deuxième agent ne sera pas testé. De la même manière, si une voie d’administration donne des résultats bien supérieurs à l’autre, une seule voie d’administration sera conservée afin de diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Le traitement curatif (après apparition des premiers symptômes) ne sera testé qu'avec la voie d'administration choisie dans la première phase, et seulement si les résultats préliminaires sont encourageants en préventif.

Raffinement

Des mesures sont mises en place lors de la chirurgie d’implantation des dispositifs, avec une analgésie pré- et post-opératoire et une anesthésie générale. Les souris sont placées sur un tapis chauffant pendant la chirurgie jusqu’au réveil total. Elles recevront une injection de solution saline, un baume ophtalmique sera appliqué sur leurs yeux. Une analgésie locale sera également ajoutée au moment de la chirurgie. En post-opératoire, les animaux seront suivis quotidiennement pour vérifier l’absence de perte de poids et l’état général, avec suivi quotidien de la cicatrisation. Les injections locales cutanées ainsi que les prélèvements sanguins avant euthanasie seront également effectués sous anesthésie générale. Bien qu’une atteinte de l’état général ne soit pas attendue dans ces différents protocoles, un suivi journalier du poids et de l’apparition de signes cliniques (comportement/mouvement, aspect général, évaluation du poids) sera effectué. Un tableau de score a été mis en place, afin d’agir rapidement en cas de détérioration de l’état clinique, avec mise en place d’une analgésie si besoin, ou sortie du protocole avec euthanasie le cas échéant. Dans ce cas, les animaux concernés seront euthanasiés après anesthésie générale. Les animaux provenant d'élevages agréés sont acclimatés pendant au moins une semaine avant de débuter une procédure. Les souris sont hébergées dans des cages ouvertes par groupe de 5 animaux maximum, et ont des formes d’enrichissements à leur disposition (tube, block, frisottis) afin de réduire leur stress.

Choix des espèces

Les études fonctionnelles réalisées in vitro à partir de cellules humaines mettent en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’IL-34 mais sont limitées par l’absence de contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire qui ne peut-être mimé in vitro. L’utilisation de modèles pré-cliniques est donc nécessaire pour valider ces résultats, pour approfondir les connaissances sur les cellules cibles et mécanismes d’action, et pour obtenir des informations sur le potentiel thérapeutique de l’IL-34. De plus, le compartiment cutané possède une structure et une immunologie très spécifiques, qui rend l’analyse in vivo indispensable. Plusieurs modèles de souris sont utilisés pour différentes pathologies cutanées, et les mécanismes immunitaires sont bien mis en évidence dans la littérature, ce qui permet à ce projet de s’appuyer sur des publications déjà existantes représentant de manière fiable les pathologies humaines. Les fonctions de l’IL-34 de souris sont également bien décrites et sont représentatives des effets observés sur cellules humaines. La souris est donc l’espère la plus pertinente pour faire la preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de l’IL-34 dans des pathologies cutanées. Pour ce projet, les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes de 10 à 12 semaines, afin d’éviter la phase de croissance et d’avoir un poids stabilisé au démarrage de l’expérimentation, permettant un meilleur suivi clinique, mais aussi un poids suffisant pour limiter le risque de complications chirurgicales liées à l’implantation des dispositifs au niveau de la cavité abdominale.

30 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par un virus de la grippe porcine par voie trachéale puis, pour certains, par un second virus respiratoire par voie nasale, ce qui provoque fièvre, baisse d'appétit et troubles respiratoires, avant leur mise à mort pour prélever les poumons. L'étude porte sur l'effet de la grippe sur les cellules immunitaires pulmonaires, avec une visée d'élevage et un rapprochement annoncé avec la grippe humaine. Le porteur reconnaît l'existence de modèles in vitro mais les juge trop éloignés de "l'environnement pulmonaire complet".

Objectifs

En élevage porcin, les problèmes respiratoires sont responsables de pertes économiques importantes. Ces troubles sont fréquemment dus à une association d’agents pathogènes et sont alors rassemblés sous le nom de « Complexe Respiratoire Porcin ». Parmi les virus importants impliqués dans le complexe respiratoire porcin figurent les virus de la grippe porcine (swIAV) et celui du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (PRRSV) qui se retrouvent fréquemment associés en élevage. Pour comprendre les interactions entre ces deux virus, des expériences de co-infections ont été réalisées chez le porc. Ces études ont consisté soit à inoculer les porcs avec les deux virus en même temps ou bien à les inoculer de façon décalée en inoculant d’abord le virus PRRSV puis le virus swIAV quelques jours plus tard. Par ailleurs, la plupart des données récoltées concernent principalement les symptomes, les lésions ou bien la multiplication des virus, mais les réponses immunitaires ont été peu étudiées au niveau des poumons. Notamment, très peu de données sont disponibles sur les macrophages pulmonaires (grosses cellules immunitaires présentes dans le poumon et capables d’ingérer des particules) après infection grippale (swIAV) et/ou infection PRRSV alors que ces cellules font partie de la première ligne de défense contre les agents pathogènes et qu’elles sont la cible principale du PRRSV. Or, des études réalisées chez la souris et le singe ont montré que l’infection par le virus de la grippe pouvait diminuer le nombre de macrophages et influencer leur développement, ce qui pourrait largement influencer le devenir d’une infection ultérieure par un autre virus respiratoire. Dans ce contexte, cette étude a pour objectifs d’évaluer l’impact d’une infection grippale sur la population des macrophages pulmonaires, ainsi que sur les réponses précoces des porcs à une infection secondaire par un virus ayant pour cible ces cellules pulmonaires, à savoir le virus du PRRSV.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude aideront à approfondir les connaissances sur l’immunité pulmonaire chez le porc, plus précisément sur l’impact de l’infection grippale sur les macrophages pulmonaires et sur leur rôle lors d’infections swIAV et PRRSV successives. A terme, ces résultats pourraient permettre d’imaginer de nouvelles stratégies préventives ou curatives des infections virales respiratoires chez le porc ciblant les macrophages. Par ailleurs, compte tenu des similitudes entre les infections grippales chez le porc et chez l’homme, les données récoltées au cours de ce projet pourraient également contribuer à une meilleure compréhension du rôle des macrophages au cours de l’infection grippale chez l’homme.

Procédures

Selon les groupes, les animaux recevront : - du virus grippal swIAV à J0 par voie trachéale puis du PRRSV à J7 par voie nasale (2 groupes de 5 porcs); - du swIAV uniquement à J0 par voie trachéale (1 groupe de 5 porcs); - du milieu de culture à J1 par voie trachéale puis du PRRSV à J8 par voie nasale (2 groupes de 5 porcs); - uniquement du milieu de culture à J1 par voie trachéale (1 groupe de 5 porcs) L’inoculation intra-trachéale prend environ 2 minutes alors que l’inoculation intranasale prend environ 30 secondes. Selon les lots, les porcs seront soumis à : 1/ des écouvillonnages nasaux sur animal vigile : 2 à 5 prélèvements selon les groupes Les écouvillonnages nasaux prennent environ 15 secondes par animal 2/ des prises de sang sur animal vigile : 2 à 5 prélèvements selon les groupes Les prises de sang prennent environ 15 secondes par animal

Impact sur les animaux

Suite à l’inoculation d’un virus grippal par voie trachéale, un épisode de fièvre est attendu, ne persistant guère plus de 4 jours, ainsi qu’une baisse d’appétit pendant les 3 à 4 jours suivant l’infection et des troubles respiratoires (respiration difficile, toux et éternuements) pendant la semaine suivant l’infection. En ce qui concerne l’inoculation par le PRRSV par voie nasale, les signes cliniques attendus se résument à un court épisode de fièvre modérée accompagné d’une légère baisse d’appétit. Chez les animaux co-infectés swIAV/PRRSV, on pourrait éventuellement observer une manifestation clinique légèrement supérieure à celle observée chez les animaux infectés par un seul virus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour pouvoir récolter les poumons à partir desquels seront collectés les macrophages.

Remplacement

Il existe des modèles d’infection in vitro pour les virus swIAV et PRRSV. Ces modèles reposent le plus souvent sur l’infection d’un seul type cellulaire, notamment l’infection de cellules épithéliales pour le swIAV et l’infection de macrophages pour le PRRSV. Nous avons mis au point un modèle de co-culture cellulaire (cellules épithéliales + macrophages) dans lequel nous évaluons l’effet des infections simultanées ou successives par un swIAV et le PRRSV. Si ces modèles de co-culture cherchent à représenter ce qui peut se produire au niveau de l’arbre respiratoire, ils sont malheureusement encore loin de pouvoir reconstituer la grande complexité de l’environnement pulmonaire complet (manque de nombreux types cellulaires, absence de flore bactérienne, …), d’où l’intérêt d’avoir recours à une étude in vivo.

Réduction

Pour répondre aux objectifs de l’étude, il est nécessaire d’avoir 6 lots d’animaux à comparer : 2 lots inoculés au swIAV puis inoculés au PRRSV 7 jours plus tard (dont 1 mis à mort à 3 j et l’autre à 7 j post-infection PRRSV) ; 1 lot inoculé au swIAV uniquement ; 2 lots inoculés au PRRSV uniquement (dont 1 mis à mort à 3 j et l’autre à 7 j post-infection PRRSV) ; et 1 lot inoculé par du milieu de culture (témoin). Le nombre d’animaux a été déterminé de façon à pouvoir comparer statistiquement les résultats.

Raffinement

Chaque lot sera logé dans une animalerie différente contenant 2 parcs hébergeant chacun 2 ou 3 porcs. Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d'atteinte d'un des points limites définis préalablement, les animaux seront mis à mort afin qu'ils ne souffrent pas.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus influenza porcins et du PRRSV. Les animaux seront sevrés à 4 semaines d’âge et inoculés à 8 semaines et demie d’âge. Cet âge correspond à la fin de la période de post-sevrage, à un moment où le système immunitaire est considéré comme mature. Dans nos conditions expérimentales, nous savons que des animaux de cet âge développent des symptômes grippaux lorsqu’ils sont inoculés par voie trachéale avec un swIAV, c’est pourquoi nous prévoyons d’inoculer les animaux à cet âge, par cette même voie.

2 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection d'un virus dans le cerveau, la pose d'une fenêtre crânienne et un contrôle de leur consommation d'eau et de nourriture, pour étudier la mobilité de récepteurs synaptiques et son rôle dans la mémoire. Le porteur annonce comme bénéfice une meilleure compréhension du fonctionnement des synapses, sans application médicale précise. Il affirme que la souris est "l'espèce de choix" et qu'une approche in vivo est "nécessaire" pour observer le cerveau en fonctionnement.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier le rôle de la mobilité et de la nano-organisation des récepteurs à glutamate hétérotétramère formé de quatre sous-unités dans la physiologie des synapses, les fonction cérébrales et le comportement. Dans ce but nous utiliserons des outils moléculaires et génétiques qui permettent d'induire l'immobilisation de récepteurs à glutamate contenant les sous-unités A2 ou A1 . Précédemment, nous avons démontré que la diffusion de surface de ces recepteurs est impliquée dans la régulation de la potentialisation synaptique à long terme et de la mémoire dépendante de l'hippocampe. Nous voulons étudier ce phénomène plus précisément et premièrement, examiner l'implication de la diffusion latérale des AMPAR dans différentes formes de plasticité synaptique comprenant non seulement la plasticité synaptique à long terme mais aussi la plasticité synaptique à court terme, dans différentes régions du cerveau. Deuxièmement, nous voulons également identifier d’autres acteurs moléculaires, répertoriés comme protéines auxiliaires de ces récepteurs, impliqués dans la régulation de leurs mobilités et pouvant modifier la plasticité synaptique. Troisièmement, nous voulons étudier les processus physiologiques qui agissent sur la mobilité de ces derniers pour réguler la plasticité synaptique. Enfin, nous voulons rechercher des paradigmes comportementaux qui sont régulés par la mobilité des recpetuerus à glutamate in vivo.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons découvrir le rôle et la régulation de la mobilité de surface des AMPAR dans la plasticité synaptique et la fonction cérébrale, ce qui contribuera à une meilleure compréhension de la manière dont la transmission synaptique est régulée dans le cerveau. Grâce à l'approche expérimentale conçue, nous voulons découvrir comment les effets de la mobilité de la surface des AMPAR sur la plasticité synaptique sont régulés dans le tissu cérébral intact et in vivo. De manière générale, cela nous permettra de mieux comprendre la fonction des synapses dans le cerveau.

Procédures

Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 10 et 20 min - procédure chirurgicale avec implantation fenêtre crânienne : entre 1 et 2H- régime avec contrôle de la consommation hydrique et alimentaire.

Impact sur les animaux

Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte.

Devenir

Tous les animaux seront mises à mort à l'issue de chaque procédure

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Le concept de l’importance de la mobilité des récepteurs dans les phénomènes de plasticité synaptique a été identifié par notre équipe avec des approches in vitro de culture de neurones de souris de type sauvage comme de neurones de nos lignées transgéniques. Pour vérifier ce concept dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement.

Réduction

La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du systéme nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de P0 semaines à 3 mois. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur viral sous anesthésie, cinq prélèvements de sang et cinq séries de tests comportementaux sur douze mois, pour évaluer une thérapie génique contre une maladie neuromusculaire mortelle chez l'humain. Ce dossier constitue le deuxième volet d'une série de trois autorisations pour le même programme. Le porteur mentionne des tests moteurs et sensoriels sans les nommer et juge la souris "essentielle" pour prouver l'efficacité de l'approche.

Objectifs

Ce projet concerne le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme grâce à un vecteur viral. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. Notre premier objectif est d’optimiser les conditions de notre protocole (choix du meilleur promoteur, doses à utiliser) en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (prélèvements sanguins, analyses moléculaires). Ensuite, notre deuxième objectif est d’évaluer les bénéfices de ce protocole thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ces bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.

Bénéfices attendus

La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique. De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidences des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives.

Procédures

Les souris recevront le vecteur viral (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Les souris auront 5 prélèvements sanguins (durée : 5mn). Les souris réaliseront 5 fois la série de tests comportementaux (5 tests comportementaux, durée : entre 30s et 15mn) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.

Impact sur les animaux

L’administration du vecteur viral, les prises de sang pourront induire un stress faible chez les animaux. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modérer. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.

Devenir

Ce projet compte 2 procédures. La première permettra de valider le protocole de thérapie génique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessitant leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses). La deuxième permettra d’évaluer les bénéfices de la thérapie au niveau comportemental et tissulaire nécessitant la mise à mort des souris (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyses nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet.

Raffinement

Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’administration du vecteur viral est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée et mise en place d’une analgésie si besoin. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation valider notre approche de thérapie génique. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) et le stade adulte (2 à 12 mois). Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels à partir de 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie à moyen- et long-terme.