Procédures modérées

100 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses pour développer une carcinose du péritoine, un suivi tumoral par bioluminescence sous anesthésie, puis trois tests comportementaux que le porteur ne détaille pas, censés mesurer une "dépression". Elles sont tuées à J14 ou J28 pour analyses, un point limite de mise à mort étant fixé à 20 % de perte de poids. Le porteur affirme que le modèle murin ne peut être remplacé et espère qu'un antidépresseur pourrait freiner le développement des carcinoses chez les patients.

Objectifs

Un patient porteur d’un cancer va exprimer des troubles psychologiques. Le fait de se savoir malade d’une pathologie mortelle à court terme, d’y associer une possible prédisposition familiale, ou une exposition à des toxiques, va aussi affecter la thymie (siège des passions et de l’humeur) des patients. Une des manifestations est la dépression. Pour les cancers qui sont métastatiques au péritoine, nommés carcinose, la dépression est fréquente, 30% des carcinoses coliques et 70% des carcinoses ovariennes selon certaines publications. L’objectif de notre étude est d’évaluer cette dépression chez la souris développant une carcinose péritonéale et d’évaluer l’effet des traitements antidépresseurs ou/et chimiothérapie sur le développement de la carcinose et de la dépression.

Bénéfices attendus

Si l'utilisation d'un antidépresseur diminue la dépression des animaux et le développement de la carcinose péritonéale, nous pourrions mettre en évidence un nouveau type de traitement non invasif qui diminuerait le développement des carcinoses chez les patients. Aujourd’hui les patients qui reçoivent un traitement antidépresseur lors de leur soins, le reçoive souvent à l’initiative de leur médecin généraliste et non de l’oncologue et cela comme un traitement visant à améliorer leur qualité de vie et non la durée de leur survie.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes) qui sera associée associé à une chimiothérapie (3 à 4 fois 30 secondes) ou à un anti-dépresseur (dilué dans l’eau de boisson pendant la durée de l’expérience). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 4 fois 20 minutes pour les C57BL/6) après une injection de luciférine (3 x pour les Balb/c (4X pour les C57BL/6) 0,1ml pour 10g, poids des souris). A J14 pour les Balb/c et à J28 pour les C57BL/6, les souris suivront 3 tests comportementaux (3 x 15 min par souris répétées deux fois donc 6 x 15 min). Ces tests comportementaux ont pour objectif la mesure de la dépression des animaux.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer une carcinose péritonéale et nous observerons si le traitement par un antidépresseur va diminuer le développement tumoral au même titre que la chimiothérapie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à J28 post-injection des cellules cancéreuses pour des analyses post mortem.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin car un comportement dépressif corrélé à un développement de la carcinose péritonéale ainsi qu’une réponse du comportement à un anti-dépresseur et/ou une chimiothérapie ne peut être évalué in vitro.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles, en nombre de nodules ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, le suivi par bioluminescence d'un même animal tout au long de l'expérience permet de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests Student et Anova en comparant le groupe CTRL avec les groupes traités par la chimiothérapie ou l'antidépresseur.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement. Lors du suivi de la croissance tumorale par bioluminescence, les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse et avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie et seront ensuite sous anesthésie générale Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids (>20%), la déshydratation, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante (signal de bioluminescence étendu à tout l’abdomen) mais surtout de confirmer le développement de la carcinose et ne pas inclure des animaux non malades dans l’expérience.. Les cellules utilisées exprimant la luciférase, la bioluminescence correspond à l’émission de lumière à partir du substrat injecté en intrapéritonéale des souris, la luciférine, lue par un luminomètre. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Les CT26 correspondent à une lignée de cellules cancéreuses du côlon murin qui est issue des Balb/C alors que les ID8 correspondent à un lignée de cellules cancéreuses ovarienne murines qui est issue des C57BL/6. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent l'injection d'un agent bactérien pro-inflammatoire, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le projet se limite à valider des souris dites "humanisées", porteuses d'un gène humain à la place du gène murin, étape préalable à des études ultérieures faisant l'objet d'une demande séparée. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative in vivo" et renvoie au conditionnel et au long terme les retombées annoncées pour le développement de médicaments chez l'humain.

Objectifs

Le but de ce projet est de valider des modèles génétiques de souris où un gène de souris est remplacé par un gène humain. Si le modèle fonctionne, la protéine humaine sera ensuite exprimée dans les cellules et les tissus où la protéine de souris était auparavant exprimée. Dans ce projet, la validation de l’expression des gènes humains chez la souris nécessite un challenge avec une injection d’un agent bactérien. Cette injection induira une réponse inflammatoire nécessaire à l’expression des gènes d’intérêt dans les organes de la souris. Pour chaque modèle génétique analysé, nous prévoyons de comparer des groupes de 5 animaux pour chaque génotype soit 15 animaux par modèle étudié. Durant la durée de ce projet, nous anticipons 5 études par année, soit un total de 15 animaux * 5 projets * 3 ans, soit 225 souris au maximum. Chaque étude se focalisera sur un gène d'intérêt disposant d'éléments de la littérature justifiant la création du modèle. Les gènes humains étudiés sont de potentielles cibles pour les thérapies dans les domaines de l’oncologie, la neurologie, les troubles cardiaques et métaboliques. Cette étape de validation de modèle est nécessaire pour étudier plus tard sur une plus large cohorte l’effet sur les fonctions biologiques de l’expression de ces gènes humains chez la souris. Cette étape préliminaire est donc requise avant d’étudier les processus biologiques humains in vivo qui sont associés aux gènes exprimés. Cette étude future nécessitera une demande éthique à part.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider des modèles de souris exprimant des gènes humains. Il nous apportera plus de connaissances sur le fonctionnement de ces gènes humains dans un organisme entier comme la souris. Les données générées nous permettront plus tard d'étudier l'effet de l'expression de ces gènes sur les fonctions biologiques. Ces modèles permettront de modéliser des maladies humaines où ces gènes sont impliqués. Plus tard, cela permettra d'envisager des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies neurologiques, cardiaques, métaboliques ou encore les cancers. A plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicaments chez l'Homme.

Procédures

Une injection de produit pro-inflammatoire : durée moins d'une minute. Un prélèvement sanguin sera effectué. Ce prélèvement dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Durant ce projet les animaux subiront une injection de produit pro-inflammatoire qui entraine une réponse inflammatoire dans l'organisme et une faible réduction de l’activité locomotrice. Un prélèvement sanguin sous anesthésie avant d’être euthanasiés.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les organes d'intérêt afin d'évaluer le niveau d'expression du gène d'intérêt.

Remplacement

Ce projet vise à valider des modifications génétiques chez la souris de gènes humains impliqués dans les systèmes : nerveux, métabolique, cardiaque et les pathologies associées. Aujourd’hui il n’existe pas d’alternative in-vivo aux modèles animaux pour étudier les systèmes biologiques humains sans mettre les individus en danger. Les souris dites « humanisées » s'avèrent être très utiles pour les tests précliniques et pour l'étude de nombreux processus biologiques humains. Le génome de la souris étant bien caractérisé et son organisme présentant de similitudes avec celui de l’Homme, en fait un modèle d’intérêt.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 5 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous analyserons l’expression des gènes dans les organes d'intérêt de la souris entre les groupes de différent génotype grâce à un test statistique non paramétrique.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mises en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble de la procédure, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée et adaptée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques...)

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée. Nous avons donc décidé de valider la présence de gènes humains dans ce modèle. Ce mammifère permet de fournir de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte soit à partir de 8 semaines, âge où le système immunitaire est mature.

48 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant 56 jours ils reçoivent des additifs alimentaires à base de plantes, subissent des pesées et deux prélèvements sanguins à la jugulaire par immobilisation au lasso, avant d'être tués pour prélever leur contenu intestinal, leurs muscles et leur graisse. L'objet du projet est de valider des additifs commerciaux réduisant les émissions d'ammoniac de l'élevage porcin intensif, en vue de leur mise sur le marché. Le porteur affirme que l'inconfort se limite au stress de la contention et présente l'expérimentation in vivo comme la suite de tests in vitro déjà probants.

Objectifs

Le projet présenté ici a pour objectif d’évaluer une solution pour atténuer les émissions gazeuses, spécialement d’ammoniac, enregistrées en élevage intensif des porcs. Les émissions atmosphériques de composés polluants sont au centre des préoccupations environnementales et concernent notamment le secteur de l’agronomie avec l’élevage porcin qui constitue un gros émetteur de gaz. Les émissions proviennent des déjections des animaux qui dépendent de la composition des régimes alimentaires et des performances des animaux. Les aliments à teneur élevée en protéines non valorisée par les animaux conduit à une excrétion d’azote importante sous formes d’azote fécal et d’azote urinaire composé d’urée, pour éliminer l’ammoniaque issu du catabolisme des protéines, rapidement converti en azote ammoniacal. Cet azote ammoniacal conduit à des émissions d’ammoniac (NH3) et de protoxyde d’azote (N2O), en bâtiment, au stockage et à l’épandage. Les mesures de réduction des apports azotés et donc de l’excrétion d’azote pourraient être utilisées à la fois pour réduire les émissions de gaz à effets de serre (GES) mais aussi et en priorité pour réduire les émissions d’ammoniac, compte tenu de ses effets sur la santé humaine, la santé animale, l’acidification et l’eutrophisation. Depuis plusieurs années, des stratégies ont été développées pour réduire les émissions d’azote, dont l’ammoniac. Une des stratégies vise notamment à optimiser l’alimentation animale (volailles et porcins), avec l’ajustement des apports protéiques dans les rations. En effet, une alimentation à basse teneur en protéines permet de réduire les quantités de protéines ingérées par les porcs, et donc les excrétions azotées des animaux ainsi que les pertes gazeuses associées, sous forme d’ammoniac. Une autre stratégie consiste aussi ces derniers temps à utiliser des extraits de plantes (extrait du thé vert, d'olive, de réglisse) comme additifs naturelles pouvant être ajoutées à la ration alimentaire pour empêcher efficacement la libération d’ammoniac dans l’air à différents niveaux.

Bénéfices attendus

Les émissions d'ammoniac provenant des élevage d'animaux font fréquemment l'objet de plaintes pour odeurs et de préoccupation en raison de la possibilité de leurs effets négatifs sur la santé des humains et des animaux. Les animaux peuvent développer une variété de troubles lorsqu'elles sont exposées à des niveaux élevés d'ammoniac pendant des périodes prolongées. Il est donc très important de développer des stratégies efficaces pour réduire les émissions de NH3 provenant des lisiers. Les résultats de ce projet permettront donc de valider l’utilisation d’inhibiteur d’uréase comme stratégie de réduction des émissions gazeuses en élevage porcins et comprendre leur mode d’action, et d’identifier de nouvelles substances qui contribueront à la rétention de l’azote.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 56 jours. Les animaux seront soumis au cours de la procédure à deux prélèvements sanguins au niveau de la veine jugulaire. Les deux prélèvements sanguins seront réalisés avec une période de récupération de 4 semaines entre les deux. Pour chaque prise de sang le temps de prélèvement ne dépassera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

Perte de poids, ralentissement de la croissance en cas de réduction de l'ingestion alimentaire (palatabilité), refus d'alimentation. Stress dû à la conduite des animaux en vue de leur pesée individuelle. Inconfort et stress dus à l’immobilisation des animaux à l'aide d'un lasso pour la prise de sang.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort à l'issu de la procédure afin de réaliser des prélèvements d'échantillons biologiques (contenus intestinal, muscle, mesure d'épaisseur de graisse)

Remplacement

Le projet envisagé fait suite aux tests in vitro réalisés au préalable afin d'évaluer l'efficacité des substances testées. Les résultats ayant montré des résultats probants, la finalité de la démarche consiste ensuite à démontrer l’effet bénéfique de l’ajout des substances d’origine végétale sur la réduction de l’émission gazeuse tout en maintenant l’efficacité de croissance des animaux.

Réduction

Sur la base des résultats rapportés dans la littérature, l'addition de substance d'origine végétale a des effets positifs sur différents paramètres liés à l'accrétion protéique, la rétention d'azote par l'animal, paramètres cibles de décision dans ce projet pour montrer les effets bénéfiques de la supplémentation des additifs testés. Une approche statistique a permis d'évaluer la taille de l'échantillon nécessaire afin de montrer un effet attendu de 5 % .L'analyse statistique a montré que 12 animaux par lot étaient necessaires pour montrer une difference significative.

Raffinement

Le stress dû à la conduite des animaux en vue de leur pesée individuelle est réduit en réalisant les opérations de conduite jusqu’à la balance en évitant de claquer les portes des cages métalliques, en déplaçant les porcs en groupe (cage par cage) dans le calme en prenant en compte le point de balance de l’animal qui avance si l’opérateur est placé en arrière du point de balance et qui recule si l’opérateur est placé en avant du point de balance. L’opérateur doit porter une tenue de couleur sombre, et stimuler les animaux par la voix et la main afin de guider leur déplacement. Des panneaux de conduites, des tapettes en plastiques sont autorisés pour la conduite des animaux. La mesure du gras dorsal est réalisée au moment de la pesée au niveau de la balance afin d'éviter une manipulation supplémentaire des animaux ou directemnt dans la cage pour éviter de manipuler l'animal. Lors des prises de sang, chaque animal est présenté à l'aide d'un lasso en acier souple en bon état, maintenu à la main et tiré vers l’avant afin que la tête soit alors présentée légèrement relevée pour des porcs de plus de 30 kg. L’inconfort et le stress dus à l’immobilisation des animaux sont réduits par une manipulation compétente et rapide des animaux par les applicateurs de la procédure, par un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. A la fin de la prise de sang, l’animal peut être caresser au niveau du groin ou sous le cou. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (ballons, croix, chaine), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie…) procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur (Arrêté du 01/02/2013). Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact olfactif, auditif et visuel avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux..

Choix des espèces

Les additifs alimentaires développés sont destinés à être incorporés dans les aliments destinés aux porcins (porcs en croissance) qui représentent de ce fait la cible privilégiée des produits que nous voulons mettre sur le marché. Porcs : études avec des animaux sevrés à 28 jours d’âge au niveau de l’élevage et réceptionnés avec un poids vif de 28-32 kg en moyenne Les animaux sont utilisés au stade de l'engraissement qui constitue le stade de développement qui génère le plus d'émissions gazeuses, permettant ainsi d'évaluer les solutions proposées par ce projet.

1000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité expédiés vers d'autres laboratoires après l'opération et les autres tués. Chaque animal subit l'ablation de la rate sous anesthésie, une chirurgie que le porteur associe à des risques de douleur, de saignement, de mauvaise cicatrisation et d'infection. Ce prestataire produit ainsi 100 rats et 100 souris par an sans rate, destinés aux projets de ses clients. Il reconnaît qu'"aucune approche statistique" n'a fixé les effectifs et présente l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'humain.

Objectifs

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires et l'immunologie. Ce projet a pour but de fournir des rongeurs sans la rate donc déficient pour la production de globules rouges, la cicatrisation, la coagulation et dans l’immunité en vue de leur utilisation dans les études expérimentales de nos clients. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année pour nos clients sur nos animaux : 100 rats et 100 souris par an.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Chaque animal subira une ablation de la rate sous anesthésie d'une durée maximale de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie et celle en post-opératoire, le risque de saignement continu, de mauvaise cicatrisation et un risque infectieux (baisse du système immunitaire).

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés. Les autres animaux seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans les études expérimentales.

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce entre rat et souris est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet. Puis, 5-6 jours après l'opération, les animaux lui seront envoyés après un examen vérifiant la bonne récupération des animaux de la chirurgie.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées de façon répétée par une génotoxine bactérienne, elles subissent des injections, des imageries et des prélèvements de sang étalés sur six à dix-huit mois, pour tenter de démontrer que cette toxine cause un cancer du foie. Le porteur mentionne une perte de poids liée à l'inflammation hépatique et une fatigue liée aux prélèvements répétés. Il justifie l'euthanasie par le prélèvement des organes et affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour reproduire ce processus.

Objectifs

Nous sommes fréquemment infectés par des bactéries qui produisent des toxines qui endommagent l’ADN de nos cellules et seraient à l’origine de cancers digestifs. Parmi ces toxines, la génotoxine CDT est répandue chez de nombreuses bactéries. L’objectif est de démontrer que cette génotoxine induit le cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de démontrer le rôle direct et causal de la génotoxine dans la transformation maligne, démontrant que l'infection chronique et/ou répétée par des bactéries productrices de cette génotoxine cause le cancer.

Procédures

L'ensemble des gestes sera réalisé sur animaux anesthésiés. Injection dans la circulation sanguine (inférieur à 3 minutes) : une seule fois pour 100 animaux, tous les 2 mois environ pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux). Imagerie nécessitant une injection dans le péritoine (inférieur à 10 minutes) : 2 fois par semaine pendant 2 semaines (40 animaux), 1 fois par semaine pendant 1 mois (20 animaux), 2 mois (20 animaux) ou 4 mois (20 animaux), 2 fois par mois pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux). Prélèvement sanguin (inférieur à 3 minutes) : 2 fois par semaine pendant 2 semaines (40 animaux), 1 fois par semaine pendant 1 mois (20 animaux), 2 mois (20 animaux) ou 4 mois (20 animaux), 2 fois par mois pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux).

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée au développement d’une inflammation au niveau du foie et voir d’une carcinogénèse. Fatigue liée aux prélèvements sanguins répétés, dans ce cas les prélèvements seront davantage espacés.

Devenir

Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.

Remplacement

Nous souhaitons voir les effets d’une infection longue et répétée de bactéries productrices de la génotoxine CDT. Notre hypothèse est que la CDT induit le développement de cancer hépatique. L’étude chez la souris est indispensable pour permettre de voir le développement éventuel d’un cancer au niveau hépatique après des mois d’infection constante à la CDT. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour mimer ce processus.

Réduction

L'imagerie de bioluminescence nous permet de faire un suivi longitudinal sur un même animal. Nous sommes également capables de réaliser des bilans hépatiques à partir de petits volumes de sang au cours du temps, sur un même animal. Ces 2 procédés nous permettent de réduire le nombre d'animaux. Des analyses seront aussi effectuées sur les tissus récoltés.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de woodwoll). Une mise en place de points limites évalués par une grille de scoring spécifique a été mise en place pour le suivi des souris. Les souris seront pesées 2 fois par semaine, en cas de perte de poids nous mettrons de la nourriture humidifiée dans la litière et les souris seront pesées quotidiennement durant les prochaines 48H. Si la perte de poids persiste les souris seront euthanasiées. Afin de pallier à une éventuelle déshydratation liée aux prélèvements sanguins, du sérum physiologique sera administré à l’animal après chaque prélèvement.

Choix des espèces

De par notre expérience l’inflammation hépatique provoquée par une infection bactérienne se fait très bien chez la souris. Le modèle souris est également un modèle de choix vis-à-vis de la technique de suivi en imagerie que nous avons mis en place. Nous travaillerons avec des jeunes adultes car nous souhaitons garder les animaux jusqu’à 18 mois suivant les lots. Le cancer touchant les 2 sexes, nous travaillerons avec des mâles ou des femelles.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un cancer de la prostate, elles subissent une castration chirurgicale et des injections intrapéritonéales répétées d'anticorps, pour étudier la résistance des tumeurs à l'hormonothérapie. Le porteur décrit des douleurs postopératoires "mineures" et une perte de poids transitoire d'environ 10 % chez la majorité des animaux traités. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des lésions précancéreuses, ce qui rendrait le recours in vivo "nécessaire".

Objectifs

Afin de mieux comprendre la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate (CaP), ce projet vise à étudier les effets de la castration chirurgicale dans plusieurs modèles de souris de cancers prostatiques. En effet, le traitement du cancer de la prostate chez l'homme repose sur la prostatectomie et l'utilisation de de traitement qui bloquent la voie de signalisation des androgènes (hormonothérapie). Malheureusement, après un temps limité de sensibilité aux traitements, 20% des patients développent des résistances à ces traitements et les cancers "résistants à la castration" sont de très mauvais pronostic. Il est donc primordial de mieux comprendre la résistance à la castration, c'est à dire l'échappement des tumeurs à l'hormonothérapie. Les études récentes menées au laboratoire mettent en évidence l'implication forte du facteur de transcription HIF1a induit par l'hypoxie dans le développement de la résistance à la castration. Plus précisément, nous avons démontré que l'inactivation de Pten, un gène suppresseur de tumeur, spécifiquement dans les cellules épithéliales de prostate engendre le développement de tumeurs cancéreuses de prostate qui sont résistantes à la castration et que l'inactivation de HIF1a et Pten, dans les cellules épithéliales de prostate engendre des tumeurs cancéreuses de prostates qui sont sensibles à la castration. Nous voulons étudier le mécanisme moléculaire sous-jacent pour mieux comprendre par quel biais l'inactivation de HIF1a rend ces tumeurs sensibles à la castration. Nos données préliminaires soulignent l'importance jouée par le microenvironnement tumoral dans l'apparition de la résistance. L'objectif est donc de conduire une étude dans laquelle plusieurs manières de bloquer la production de lymphocytes T cytotoxiques seront testées afin de voir la réponse sur la croissance des tumeurs après castration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si les élements du microenvironnement permettent de rendre les tumeurs de prostate sensibles à la castration dans le cancer de la prostate et par quels mécanismes. Si cela s'avère être le cas, cette étude pourra ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate résistant à la castration qui confère actuellement aux patients un pronostic très sombre avec une durée de vie de moins de 15 mois.

Procédures

Les souris subiront 5 injections intra-péritonéales sur 5 jours, puis une intervention chirurgicale (castration/sham) 3 mois plus tard et les injections péritonéales 1 à 3 fois par semaine pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas. Les anticorps monoclonaux ont été déjà administrés dans de nombreuses études chez la souris et sont administrés en routine par un laboratoire collaborateur sans observation d'effets secondaires. L'administration de ces traitements peut engendrer une perte de poids transitoire d'environ 10% chez 60% des souris traitées dans les 48h suivant l'administration, les souris reprennent habituellement leur poids de départ dans la semaine qui suit l'injection. La croissance des tumeurs de prostate est lente et donc les variations de poids liée à leur croissance ou régression sur 2 semaines est négligeable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les organes et de les analyser.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de différencier les rôles de différentes molécules pouvant être impliquées dans le développement du cancer de la prostate, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 2 lignées de souris différentes. Afin d'obtenir des résultats signicatifs, de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués et en raison de l'hétérogénéité des souris, nous avons réduit au maximum le nombre de souris nécessaires et nous étudierons à la fois les tissus (histologie), les gènes exprimés et les différents sous types de cellules qui composent les tumeurs. Nous comparerons systématiquement les souris mutants versus les contrôles et au sein d'un génotype donné nous comparerons les souris ayant eu une orchiectomie versus pas d'orchiectomie et les groupes traitées avec le composé actif versus traités avec le véhicule. Nous comparons des paramètres quantitatif (expression de gènes, nombre de cellules positives pour certains marqueurs histologiques, taux de prolifération cellulaires, poids des tumeurs, pourcentage de glandes atteinte des tumeurs) et également qualitatifs (expression ou non d'un marqueur au niveau histologique).

Raffinement

Les souris subiront une anesthésie générale et recevront des médicaments antalgiques afin de prévenir l'apparition de douleurs. Elles seront surveillées de manière très rapprochée durant les jours qui suivront la chirurgie. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le cancer de la prostate humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de cancer de la prostate afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes, de 8 semaines, à 6 mois.

228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour étudier la prévention de la douleur en cancérologie, elles reçoivent des injections de capsaïcine dans la patte et d'adjuvant inflammatoire, portent des tumeurs et subissent une exérèse chirurgicale et des prélèvements de sang. Le porteur reconnaît que la capsaïcine présente un "risque de douleur" et une sensation de chaleur, et que l'adjuvant provoque une inflammation. Il affirme que la douleur et l'inflammation, "non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier", rendent "indispensable" le recours à l'animal.

Objectifs

i) Démontrer que les découpleurs mitochondriaux (aux propriétés anti-tumorales) possèdent les mêmes propriétés analgésiques et anti-inflammatoires que les anesthésiques locaux ii) Démontrer que la prévention de la douleur, de l'inflammation et du stress glucocorticoïde diminue l'oncogénèse et les récidives

Bénéfices attendus

Nous espérons démontrer que la prévention de la douleur et de l'inflammation (et aussi du contrôle du stress glucocorticoïde) puisse freiner l'évolution tumorale. De tels résultats motiveraient les équipes cliniques à contrôler drastiquement la douleur aiguë et chronique des patients d'oncologie.

Procédures

Iinjection intraplantaire (1 fois) sous anesthésie générale (durée 1 minute), sur d'autres animaux: injection sous-cutanée (1 fois) sous anesthésie générale (durée 1 minute); sur d'autres animaux: injection intraveineuse (1 fois) sous anesthésie générale (durée 1 minute); sur d'autres animaux: injection sous-cutanée (1 fois) sous anesthésie générale (durée 1 minute), 1 injection intraplantaire tous les 2 jours pendant 7 jours sous anesthésie générale (durée 1 minute), 3 prélèvements sanguins sous anesthésie générale (durée 2 minutes); sur d'autres animaux: injection sous-cutanée (1 fois) sous anesthésie générale (durée 1 minute), 1 injection intraplantaire tous les 2 jours pendant 7 jours (durée 1 minute) et 3 prélèvements sanguins sous anesthésie générale (durée 2 minutes); sur d'autres animaux: 1 injection intra-mammaire sous anesthésie générale (durée 2 minutes), 3 prélèvements sanguins sous anesthésie générale (durée 2 minutes) et 1 exérèse chirurgicale de tumeur sous anesthésie générale (durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Génération de tumeurs (gêne physique) -injection intraplantaire de capsaicin (risque de douleur à l'injection et de sensation de chaleur) et d'adjuvant (inflammation)-injections sous-cutanée, intraveineuse et intra-mammaire (risque de douleur mais réalisée sous anesthésie générale) -prélèvement sanguin (risque de douleur aux prélèvements mais réalisés sous anesthésie générale).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

La douleur et l'inflammation impliquent des processus multiparamétriques impliquant des sécrétions humorales et des répercussions immunitaires non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier. Nous ne pouvons les étudier in vitro, il est indispensable d'avoir recours à l'animal de laboratoire. Notre hypothèse est que la prévention de la douleur et de l'inflammation puisse freiner l'évolution tumorale et les récidives grâce à un contrôle du stress glucocorticoïde. L'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour étudier cette hypothèse sur la réponse anti-tumorale. La mise en évidence de cette hypothèse et sa compréhension ouvrirait la possibilité de freiner l'évolution tumorale en clinique en contrôlant ddrastiquement toute douleur aiguë et chronique chez les patients.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, nous avons calculé les tailles des groupes selon les procédures pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Au vu du faible effectif, les données seront analysées par des tests non-paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, au moins une fois par semaine et avant euthanasie lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids (sizzlenests), de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement social, animaux hébergés au calme. Les interventions chirurgicales seront faites sous anesthésie générale. En cas de besoin, des antalgiques à base de crème d'anesthésiques locaux ou d'anitinflammatoires seront appliqués. En cas de douleur après les exérèses chirurgicales, les souris recevront un analgésique et un anesthésique local si nécessaire. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous souhaitons prouver que la prévention de la douleur et de l'inflammation diminue l'évolution tumorale et les récidives chez l'homme qui est un mammifère. Avant de passer à des études cliniques, il est absolument nécessaire de réaliser des études pré-cliniques sur le modèle mammifère afin de tester notre hypothèse. Le modèle souris permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, facile à manipuler, et suffisamment grand pour pouvoir avoir des injections de cellules tumorales. Souris adultes de 6-8 semaines. Les tumeurs murines générées sont des tumeurs survenant chez l'adulte, nous ne réaliserons donc pas le projet sur des souriceaux.

10 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, des gavages sous contention ferme et des prélèvements de sang répétés, pour établir la cinétique d'une association d'antibiotiques utilisée dans la filière porcine. Le porteur souligne une pose "moins invasive" et des prélèvements "totalement indolores" une fois le cathéter en place, et réutilise chaque animal pour deux voies d'administration. Il justifie la mise à mort par le prélèvement des muscles, du foie et des reins pour y doser les antibiotiques.

Objectifs

L'association d'antibiotiques sulfamides/triméthoprime est classiquement utilisée en médecine vétérinaire, notamment dans la filière porcine, pour traiter certaines infections. Le ratio de doses sulfamides/triméthoprime dans la quasi-totalité des spécialités vétérinaires mises sur le marché est de 5:1. Or, ce ratio n’a pas été établi à partir de données animales, mais est une transposition directe du ratio correspondant à l’association sulfaméthoxazole/triméthoprime (SMX/TMP) utilisée chez l’Homme. Un biais majeur de cette transposition réside dans le fait que les vitesses d’élimination des sulfamides (illustrées par leurs temps de demi-vie plasmatiques, t1/2 vie) peuvent être très variables selon l’espèce animale. Chez l’Homme, le SMX et le triméthoprime ont des t1/2 vie assez proches, permettant de maintenir un rapport de concentrations entre les deux antibiotiques constants au cours du temps et de conserver ainsi l’effet synergique entre eux. A l’inverse, chez les animaux de rente par exemple, certains sulfamides ont des t1/2 vie beaucoup plus longs que celui du triméthoprime. Les sulfamides seront alors présents beaucoup plus longtemps chez l’animal, d’où une perte probable de l’effet synergique recherché et par voie de conséquence de l’efficacité de l’association. L’ensemble de ces facteurs questionne la pertinence du ratio 5:1 des formulations vétérinaires, mais aussi les posologies recommandées (doses et/ou intervalles d’administration). Cette procédure expérimentale s’ajoute à une autre demande déjà validée par le comité d’éthique dans laquelle deux associations de sulfamide/TMP (sulfadiazine(SDZ)/TMP et sulfadiméthoxine(SDMX)/TMP), ayant des propriétés pharmacocinétiques distinctes, ont été étudiées chez le porc. L’objectif de cette nouvelle demande est d’ajouter une étude cinétique avec une 3e association (sulfaméthoxazole(SMX)/TMP) pour compléter les données pharmacologiques in vivo déjà obtenues avec les deux précédentes associations, permettant par la suite de consolider l’approche de modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PKPD) afin d’optimiser les posologies et schéma d’administration de ces molécules chez le porc.

Bénéfices attendus

La promotion de solutions thérapeutiques à base d’associations – entre antibiotiques ou entre antibiotiques et nonantibiotiques – tient une place importante dans les stratégies de lutte contre l’antibiorésistance. Lorsqu’elles associent 2 antibiotiques, ces solutions doivent viser à limiter l’émergence de résistances et non à élargir le spectre d’activité. Les formulations associant le TMP avec un sulfamide peuvent entrer dans la première catégorie, ce qui en fait une exception « vertueuse » parmi les associations disponibles en médecine vétérinaire dont la plupart ont été développées avec un objectif d’élargissement du spectre. Malheureusement, les formulations TMP/sulfamides destinées aux animaux ont été développées par transfert « aveugle » des données de la médecine humaine relatives à l’établissement d’une synergie, sans tenir compte des spécificités des espèces animales ou de leurs bactéries pathogènes. Les études pharmacocinétiques in vivo couplées au études pharmacodynamiques sur des bactéries pathogènes les plus fréquemment rencontrées vont à terme, permettre d’optimiser l’administration de l’association triméthoprime/sulfamide (doses, posologies) chez le porc.

Procédures

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé au niveau de la veine jugulaire externe grâce à un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale et échoguidé. Cette technique utilisant un échographe permet de réduire la durée de l’intervention par rapport à une chirurgie « classique » (de 1h30-2h à 30-45 minutes par animaux) tout en minimisant le risque infectieux (acte moins invasif). Cet acte chirurgical peut être source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Une fois le catéther posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores, sans contention particulière et réalisé en moins d'une minute. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme quisera effectuée par des opérateurs formés, assurant ainsi la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes (entre 3 et 4 minutes).

Impact sur les animaux

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé au niveau de la veine jugulaire externe sous anesthésie générale, de façon écho-guidée et en respectant une asepsie rigoureuse. Cette technique permet de minimiser le risque infectieux (acte moins invasif qu’une chirurgie « classique ») ainsi que le temps d’anesthésie de l’animal. Une fois le cathéter posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention qui sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes (2 à 3 minutes).

Devenir

Chaque porc sera mis à mort à l’issu de l’expérimentation dans des conditions éthiques et les tissus d’intérêts (muscles, foie, reins) seront récoltés pour le dosage des antibiotiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthodes non-animales de remplacement pour suivre la cinétique plasmatique (tout en incluant les variabilités inter-individuelles) des molécules qui est une étape préliminaire à l’approche PK/PD envisagée.

Réduction

L’utilisation de 5 animaux par voie d’administration (IV ou voie orale VO) soit un total de 10 animaux est un minimum pour pouvoir correctement estimer la variabilité inter-individuelle des paramètres pharmacocinétiques (clairance, etc) par une approche de population (modèle non-linéaire à effet mixte). De plus, l’approche en « cross-over » permet de limiter le nombre nécessaire d’animaux en les ré-utilisant pour tester les deux voies d’administration (IV et VO) pour l’association sulfaméthoxazole (SMX)/TMP en incluant une période de wash-out adaptée pour garantir la fiabilité des résultats. Une fois le modèle PK développé et fiable, il permettra d’étendre l’exploration à d’autres posologies sans la nécessité d’utiliser d’autres animaux.

Raffinement

Les porcs seront hébergés par 2 lors de la phase d’acclimatation (7 jours) puis seront seuls par case (sur caillebotis) après la pose du cathéter afin de limiter les risques d’arrachement. Néanmoins, des barrières entre cases permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : balle, ainsi que jouets à macher suspendus. Les prises de sang répétées seront effectuées après la pose chirurgicale de cathéters (avec anesthésie et analgésie suffisante pour les animaux) pour limiter la douleur lors des prélèvements sanguins ainsi que le stress généré. Les cathéters seront protégés avec un bandage adéquat vérifié régulièrement et changé s’il devient trop souillé. Un suivi-post opératoire individuel des animaux sera effectué et une analgésie sera mise en place si nécessaire (paracétamol +/- analgésique de type morphinique) même s’il est peu probable d’avoir un tel recours en raison de la méthode très peu invasive de pose du cathéter. Le début de la cinétique ne se fera qu’au minimum 24h après la pose du cathéter. La contention lors du gavage sera effectuée par des opérateurs formés pour assurer la sécurité des animaux et des opérateurs tout en minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Cependant, des points limites et critères d’arrêt ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux.

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible pour l’étude pharmacocinétique de l’association sulfamethoxazole(SMX)/TMP. Au début de l’expérimentation, les porcs seront sevrés, et auront un poids d’environ 25-30 kg. Cet intervalle de poids permet une manipulation aisée des animaux (sécurité des opérateurs, diminution du stress des animaux).

24 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée d'organoïdes cérébraux humains, puis une ouverture de la cage thoracique et une exsanguination sous anesthésie, avant le prélèvement des greffons. Le porteur avance que valider ces organoïdes vascularisés pourrait à terme "réduire fortement l'utilisation d'animaux" pour l'étude des tumeurs cérébrales, un bénéfice conditionné à la réussite du modèle. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour vérifier la vascularisation, faute de circulation sanguine hors d'un animal vivant.

Objectifs

Les organoïdes cérébraux sont composés de différents types de cellules (neurones et cellules gliales) d’origine humaine constituant le cerveau. Nous développons une nouvelle génération d’organoïdes cérébraux qui sont pourvus également de vaisseaux sanguins, car la vascularisation joue un rôle essentiel dans la physiopathologie du cerveau. En particulier, dans le contexte de tumeurs cérébrales, la vascularisation favorise la survie et la croissance tumorale. Ce projet a pour but de valider que la vascularisation de ces nouveaux organoïdes est fonctionnelle. Cette validation sera obtenue par transplantation des organoïdes à des animaux. Ce nouveau modèle permettra d’étudier les mécanismes de la croissance des tumeurs cérébrales et de développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de vérifier que notre modèle d’organoïde comporte une vascularisation fonctionnelle. La présence de vascularisation est importante dans le cadre des études des tumeurs cérébrales car elle joue un rôle important dans le développement tumoral. Si la vascularisation des organoïdes est fonctionnelle, de nombreuses expériences sur les cancers cérébraux et, en particulier, les tests des médicaments anticancéreux ne nécessiteront plus l’utilisation d’animaux. Ce modèle réduira donc fortement l’utilisation d’animaux ; en particulier dans le cadre des études sur les tumeurs cérébrales comme le glioblastome.

Procédures

L’opération de greffe sous-cutanée des organoïdes cérébraux comporte 4 étapes (injection d’un antalgique, une anesthésie gazeuse, une incision cutanée et un point de suture) pour une durée totale de moins de 15 min/souris. Un mois après la greffe, un produit fluorescent sera administré sous anesthésie afin de colorer les vaisseaux sanguins. Cette opération comporte 5 étapes (injection d’un antalgique, injection d’anesthésique, ouverture de la cage thoracique, perfusion de la solution fluorescente et exsanguination) cette opération est suivie de la mort de l’animal. L’opération dure 15-20 min (sans compter la période de 30 min après l’injection d’antalgique);

Impact sur les animaux

Les opérations de greffe sous-cutanées ne sont pas très invasives et devraient n’entraîner que des perturbations physiologiques et cliniques mineures. Néanmoins, un stress opératoire et une douleur post-opératoire sont attendus mais cette dernière sera limitée par une pharmacologie adaptée. L’anesthésie pourrait entraîner une détresse respiratoire voire un arrêt cardio-respiratoire et ceux-ci seront surveillés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les organoïdes afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’existe pour vérifier que la vascularisation des organoïdes est effective. Les expériences de transplantation permettront à la vascularisation de l’organoïde de se « connecter » à la vascularisation de l’hôte grâce à une néo-vascularisation. En revanche, cette dernière ne peut être obtenue que si l’animal est vivant et permettre une circulation sanguine dans l’organoïde.

Réduction

La procédure sera réalisée sur un total de 6 lots d’animaux afin d’analyser des organoïdes d’âges différents obtenus avec deux lignées de cellules souches pluripotentes. Les analyses histologiques révèlent que la grande majorité des organoïdes que nous avons obtenus à ce jour présentent des structures ressemblant à des vaisseaux dès un mois. Ainsi, nous testerons deux groupes d’âge : organoïdes jeunes (1 mois) et organoïdes âgés (4-6 mois) pour les 2 lignées dont nous disposons. Par ailleurs, nous avons estimé qu’un nombre de quatre animaux par lot d’organoïdes serait suffisant pour appréhender la variabilité expérimentale. Ainsi, un maximum de vingt-quatre souris devra être utilisé pour ce projet (6 lots x 2 ages x 2 lignées). Les expériences seront réalisées de façon séquentielle afin d’arrêter le protocole si cela est suggéré par les premiers résultats.

Raffinement

Un protocole d’anesthésie/analgésie sera mis en place pour les greffes d’organoïdes. Par la suite, une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier l’état clinique des animaux et les critères d’arrêt de souffrance sont prédéfinis.

Choix des espèces

De nombreuses études ont montré la néovascularisation de greffons ou d’organoïdes humains lorsqu’ils sont greffés chez la souris adulte. Les xénogreffes seront réalisées chez des souris adultes âgées de 2 mois. La formation de nouveaux vaisseaux sanguins, ou néovascularisation, est toujours observée chez la souris adulte.

10432 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie gardée en vie comme modèles d'étude, les autres tués après l'imagerie pour prélever le cerveau. Ils subissent une à deux chirurgies stéréotaxiques, une anesthésie terminale pouvant durer six heures pour l'imagerie et des microdialyses répétées, afin de développer des techniques de microscopie de l'espace extracellulaire cérébral. Le porteur ramène les atteintes à un "stress de l'anesthésie", des infections de sutures et des douleurs chirurgicales, pour l'un des plus gros effectifs du lot. Il indique que la caractérisation de cet espace "nécessite" des modèles animaux mimant la complexité des maladies humaines.

Objectifs

La recherche sur le cerveau a fait d'énormes progrès au cours des dernières décénnies dans presque tous les domaines à l'exception de l'exploration de l'espace extracellulaire (EEC). C'est pourtant un compartiment élémentaire qui permet la communication entre les cellules cérébrales, grâce aux nombreuses molécules qui y transitent. L'espace extracellulaire est un système de compartiments interconnectés et limités par des membranes cellulaires. Il est composé par le fluide interstitiel et un échanfaudage dynamique connu comme la matrice extracellulaire (MEC). Environ 20% du volume cérébral est occupé par l'espace extracellulaire qui sert de microenvironnement pour le cerveau et forme un canal de communication chimique intercellulaire (appelé transmission de volume). Cette trasmission en volume peut être modulée par les propriétés biophysique de l'EEC, en particulier les paramètres de diffusion. Il a été montré que la structure et la diffusion de l'eec sont hétérogènes et qu'elles dépendent de conditions internes et externes à l'organisme. De plus, l'EEC est un reservoir pour les ions impliqués dans l'activité électrique des neurones et joue un rôle clé dans la transmission de substances neuro-actives entre les cellules. Ainsi, l'EEC n'est pas seulement le siège de toutes sortes d'intercations cellules-cellule, mais peut également jouer un rôle important dans des fonctions neuronales cruciales, telles que la mémorisation ou la formation de circuits neuronaux. Déterminer comment les molécules se déplacent dans l'espace extracellulaire est un défi très important, non résolu, qui freine l'étude des mécanismes cérébraux pathologiques et thérapeutiques. Le manque de connaissances résulte de l'absence de technologies spécifiques, permettant l'étude résolutive in vivo du microenvironnement.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’utiliser deux nouvelles approches de microscopie super résolutive développées dans nos laboratoires pour fournir une description détaillée de l’EEC et du réseau structurel de la MEC dans le tissu sain et pathologique : (i) technique de Shadow imaging (SUSHI) qui est une méthode de marquage où un fluorophore est injecté localement dans le cerveau afin de visualiser l’EEC avec une résolution nanométrique, (ii) technique d’imagerie de nano-objets uniques (suivi des nanotubes/nanoparticules de carbone). Ces approches permettront de composer, à une échelle nanométrique, une carte de l’espace extracellulaire et de sa matrice dans les régions d’intérêt. C’est pourquoi, nous proposons à travers cette étude qui regroupe quatre laboratoires phare en neurosciences à Bordeaux, de caractériser l’EEC via des technologies nouvelles et inédites de microscopie de super-résolution

Procédures

Chirurgie stéréotaxique (1h maximum), au maximum deux chirurgies stéréotaxiques pour les modèles pathologiques Anesthésie pendant la chirurgie (1h) et en terminal pour l'imagerie (jusqu'a 6 h), une fois par animal Imagerie (6h) une fois par animal Collecte d'échantillon par microdialyse sur animaux vigiles et non contraints, 4 fois espacées au minimum d'une semaine.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par l’utilisation de la chirurgie : stress de l'anesthésie, infection des points de suture, douleurs chirurgicales, déshydratation, perte de poids.

Devenir

Les animaux issus des procédures représentent la fabrication des modèles d'études seront gardés en vie. Les animaux issus de l'imagerie seront euthanasiés afin de récupérer les cerveaux pour une analyse histologique.

Remplacement

L'étude de l'espace extracellulaire a connu des avancées récentes, grâce au développement de techniques comme la microscopie en super résolution appliquée aux modèles ex vivo. Pour compléter les connaissances sur le sujet il est nécessaire d'obtenir des données sur l'animal sain et pathologique, à travers des modèles animaux réalisés chez le rongeur. Nous souhaitons caractériser l’espace extracellulaire sain et pathologique, nécessitant l’utilisation de modèles animaux pouvant mimer la complexité des maladies chez l’humain.

Réduction

Cette étude concerne un consortium composé de 4 laboratoires français qui à la fin de l’étude récupèreront des échantillons afin d’effectuer des études histologiques, complétant ainsi les études in vivo et ainsi la base de données scientifiques, limitant l’expérimentation animale à cette seule étude.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité.

Choix des espèces

L'utilisation de rongeur dans le développement d'outil de microscopie en super résolution est pertinente dans cette première phase de notre projet. En effet, la taille réduite de l'animal, son cycle de vie court et la disponibilté des modèles pathologiques permettent d'optimiser le développement d'outils pour l'imagerie in vivo de l'environnement extracellulaire. Souris : les animaux seront utilisés à l'âge de 2 mois et jusqu'a 4 mois, pour permettre de travailler avec des animaux sains et pathologiques adultes. Rats : les animaux seront utilisés au stades post nataux de P1 et jusqu'a P60 (2 mois) pour les animaux sains et pathologiques, qui correspond à un stade de jeune adulte, qui est la période où des troubles psychotiques peuvent apparaître