Procédures modérées

768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucune ne restant vivante à la fin. Génétiquement modifiées, elles subissent un prélèvement de queue au sevrage, une injection déclenchant un lupus, puis des prélèvements sanguins mensuels, la maladie provoquant une inflammation pulmonaire, une perte de poids, une alopécie et des atteintes articulaires handicapantes. Le porteur indique que 90 animaux sont d'abord utilisés comme reproducteurs pendant un an avant d'être tués, les autres étant tués en fin de procédure pour prélever poumons, rate et reins. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un "organisme entier", ce qui justifierait selon lui le recours aux souris.

Objectifs

Le lupus systémique est le prototype de la maladie auto-immune non spécifique d’organes. Elle est parmi les plus fréquentes des maladies rares avec une prévalence variant en fonction des pays entre 15 à 50 cas pour 100000 habitants. Les manifestations cliniques sont nombreuses incluant fréquemment des atteintes cutanées, articulaires, hématologiques ou rénales. De plus, bien que souvent sous-évaluées, les manifestations pulmonaires sont retrouvées dans 30 à 50% des cas suivant les études. Certaines formes de ces atteintes pulmonaires comme l’hémorragie intra-alvéolaire se grèvent d’une mortalité supérieure à 50% incitant à mieux comprendre la physiopathologie, étant donné l’urgence thérapeutique qu’elle constitue. D’autres atteintes notamment rénales peuvent se compliquer dans 25 % des cas d’une insuffisance rénale terminale. La pathologie est caractérisée par la présence d’auto-anticorps anti-ADN. Ces complexes anticorps/ADN forment des agrégats qui participent au développement et au maintien d’une inflammation chronique qui engendre des dégâts tissulaires. Le rôle du récepteur Fc néonatal (FcRn), dans la physiopathologie des maladies auto-immunes est étudié depuis de nombreuses années. Les principales fonctions du FcRn sont associées à la biologie des IgG et de l’albumine. Le FcRn est un récepteur de recyclage et de transfert des IgG et de l’albumine, permettant leur maintien dans la circulation sanguine mais aussi leur transport au travers des barrières épithéliales. Le rôle de FcRn dans le routage des complexes immuns a permis de suggérer son implication dans la physiopathologie de différents types de maladies auto-immunes dont le lupus. Par ailleurs, l’inflammation déclenchée par ces complexes immuns entraine une activation des cellules immunitaires et notamment de certaines populations de lymphocytes T spécialisées dans la production rapide de cytokines comme les lymphocytes T innés (e.g. les cellules NKT et les cellules MAIT). Ces cellules sont ainsi impliquées dans différentes maladies auto-immunes et notamment dans le lupus systémique. Par exemple, plusieurs études ont montré un défaut de NKT chez des patients lupiques ou dans des modèles expérimentaux. L’objectif de ce projet de recherche est de caractériser l’implication de la protéine FcRn et des lymphocytes T innés, dans la physiopathologie du lupus afin de permettre de développer de nouveaux axes de traitements ciblant ces cellules.

Bénéfices attendus

Les stratégies de recherches visant à identifier des cibles thérapeutiques de l’immunité adaptative tout particulièrement humorale ont montré une certaine efficacité dans l’amélioration de la prise en charge des malades lupiques. Cependant leurs indications restent limitées pour l’instant, les formes les plus graves de la maladie comme les atteintes neurologiques, pulmonaires et rénales reposant toujours sur des thérapeutiques non ciblées exposant à des effets secondaires non négligeables. Explorer de manière plus poussée le rôle de l’immunité innée, notamment des lymphocytes T innés pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques s’intégrant aux stratégies actuelles de manières non exclusives. Avec ce projet il s’agira 1) de comprendre l’homéostasie de ces cellules en situation physiologique et pathologique 2) d’identifier les interactions entre ces cellules et les cellules clés de la physiopathologie du lupus comme le lymphocyte B 3) d’analyser la nature de leur participation au cours des différentes atteintes d’organes et 4) d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques pouvant permettre de moduler leur action.

Procédures

Toutes les hypothèses, issues de la littérature, seront évaluées, au préalable, sur des modèles in vitro (culture cellulaire) et ex vivo (cellules issues de donneurs de sang humains et de patients atteints de lupus). Seuls les paramètres d’intérêts seront sélectionnés afin d’être testés in vivo chez la souris. En effet, il n’existe pas de modèles in vitro ou ex vivo capables de reproduire la complexité d’une réponse immunitaire d’un organisme vivant. Les animaux transgéniques devront être génotypés au moment du sevrage (3 semaines après la naissance). Pour cela un prélèvement d’un 1 mm de queue sera réalisé sous anesthésie générale (anesthésie gazeuze). Ce protocole dure moins de 3 minutes en tenant compte du temps d’anesthésie, du prélèvement (instantané) et du réveil de l’animal et ne sera pas renouvellé. Afin de reproduire le développement d’un lupus chez l’Homme, les souris adultes (8 semaines minimum) recevront 1 injection unique de 500µL par voie intrapéritonéale. Ce protocole dure moins de 1 minute en tenant compte de la contention de l’animal et de l’injection et une seule injection par animal sera réalisée. Des prélèvements sanguins seront réalisés 1 fois par mois à partir de J15 après l’injection (donc les animaux auront entre 1 et 7 prélèvements sanguins (pour les animaux conservés jusqu’à J180) afin de suivre les paramètres inflammatoires et l’apparitions des anticorps auto-immuns marquant le développement de la pathologie. 100 µL de sang seront prélevés en prélèvement submandibulaire en utilisant des lancettes et le sang sera collecté dans des tubes héparinés. Cette procédure dure quelques secondes. Les souris seront toujours anesthésiées avant de procéder au prélèvement sanguin. Tout au long des expériences, les souris seront soigneusement surveillées quotidiennement pour détecter les changements physiques ou comportementaux. Ainsi, le poids et les comportements, seront relevés de façon journalière les 1ers jours après l’injection puis 3 fois par semaine entre 15 jours et 180 jours après l’injection.

Impact sur les animaux

Notre modèle de lupus est induit par une injection intrapéritonéale ce qui provoque un stress et une douleur au point d’injection (piqûre). Quelques semaines après l’injection, l’inflammation pulmonaire peut entrainer des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal et provoquer des troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité. A plus long terme (plusieurs mois) les souris développent des symptômes inflammatoires variés pouvant prendre différentes formes. Les plus courantes étant une alopécie derrière la tête et sur le dos et l’apparition de problèmes articulaires, notamment au niveau des extrémités (pattes), pouvant être handicapant pour l’animal. Une diminution de l’activité des souris peut ainsi être observée.

Devenir

Les animaux utilisés pour l’entretien des lignées transgéniques seront réutilisés, en tant qu’animal reproducteur, pendant 1 an. Ces animaux seront ensuite euthanasiés et d’autres animaux plus jeunes seront mis en accouplement. Tous les autres animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les poumons, la rate et les reins pour analyser les réponses immunitaires se développant dans ces organes. Il ne restera donc pas d’animaux vivants en fin de procédure.

Remplacement

Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme entier pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Cependant, nous utilisons au laboratoire, des systèmes de culture in vitro (hybridomes de cellules immunitaires), pour étudier certains paramètres avant de réaliser des expériences in vivo. De plus, nous avons développé des modèles d’analyses des cellules humaines issues de donneurs sains ou de patients atteints par de lupus systémique. En effet en parallèle de cette étude réalisée chez l’animal, nous avons développé une étude clinique dont l’objectif est de caractériser les lymphocytes T innés de patients atteints de lupus et hospitalisés dans le service de Médecine interne du CHU. Ces modèles nous permettent d’analyser et d’affiner certaines hypothèses avant de les tester in vivo chez la souris. Ils permettent également de confirmer chez l’Homme, les résultats obtenus chez la souris.

Réduction

Tout d’abord, nous tenons à souligner que les expériences in vitro et ex vivo avec des cellules humaines, limiteront le nombre d’hypothèses et donc le nombre de souris à utiliser. De plus, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Lors de nos expérimentations, nous comparerons les souris traitées aux souris non traitées, en utilisant des tests statistiques. Nous souhaitons une puissance de test de 90% de détecter une différence à un niveau de significativité de 5%. Pour chaque condition, 12 souris ayant reçu l’injection induisant le lupus et 12 souris ayant reçu l’injection d’huile minérale seront nécessaires. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …). L’objectif initial est de tester 4 lignées de souris transgéniques comparées à 2 lignées consanguines contrôles. Le nombre total de souris est ainsi estimé à 768 pour l’ensemble de ce projet d’équipe planifié sur 5 ans. Cet objectif sera évalué au cours de l’avancement des expériences et de la validation des hypothèses et pourra être revu à baisse. En effet, si certains génotypes s’avèrent ne pas être pertinents in vitro et/ou ex vivo par rapport à la maladie lupique, alors les expériences in vivo ne seront pas réalisées. Ainsi, nous avons actuellement une étude clinique analysant la fréquence et les fonctions des cellules MAIT chez des patients atteint de lupus. Si aucun impact de la pathologie sur les cellules MAIT n’est observé alors les expériences sur les souris CAST et CAST-MR1-/- ne seront pas réalisées. De plus, les analyses en cinétique seront réalisées au fur et à mesure des résultats. Ainsi, les expériences des temps les plus précoces (J15 et J30) seront réalisés dans un premiers temps et si nous n’observons pas de différences entre les différentes lignées de souris alors les temps tardifs (J90 et J180) ne seront pas réalisés.

Raffinement

Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée par toujours les mêmes expérimentateurs afin d’habituer les animaux et de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. De plus, une pesée régulière des animaux sera effectuée. Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi des points limites et les animaux présentant un de ces critères seront euthanasiées.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous utiliserons des souris consanguines. Nous avons choisi la souris, car elle offre les avantages suivants : - La souris est l’espèce la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires limitant de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. - Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. - Notre laboratoire dispose de différentes lignées de souris transgéniques adaptées à l’analyse du rôle du FcRn et des lymphocytes T innés. De plus, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 à 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant. Les animaux utilisés pour le maintien des lignées seront mis en reproduction à partir de l’âge de 7 semaines et jusqu’à 1 an.

1 060 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent un prélèvement d'un à deux millimètres de nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, l'administration de molécules candidates par l'eau ou par injection, et un test comportemental de tunnel de nage prolongé jusqu'à la fatigue de l'animal. Ce projet est le volet jumeau d'une même étude sur une maladie neuromusculaire humaine sans traitement curatif, et le porteur affirme qu'un essai dans un "organisme entier" est nécessaire, l'in vitro ne permettant pas d'étudier le comportement. Tous les poissons sont tués pour des analyses post-mortem.

Objectifs

Ce projet s’intéresse à une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène entrainant des troubles moteurs chez les patients dès l’enfance. Deux modèles poisson zèbre de la pathologie ont été créés et présentent les défauts de motilité au stade larvaire. Des molécules ont été identifiées comme capables de restaurer la motilité à ce stade de développement. Le premier objectif du projet est de définir s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la maladie. Le deuxième est de déterminer si les molécules ont un potentiel thérapeutique lorsqu’elles sont administrées à un stade présymptomatique ou symptomatique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale en permettant de déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie. Il s’inscrit également dans une démarche de recherche translationnelle puisqu’il permettra de déterminer quelle fenêtre de temps est adéquate pour le traitement.

Procédures

- Génotypage par prélèvement d’une petite partie de la nageoire caudale (1 – 2 mm) sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 15mn) : réalisé 1 fois – concerne 240 poissons - Administration de molécules candidates au stade développemental (durée d’administration de 8 à 48 heures post-fertilisation) directement dans l’eau : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Administration de molécules thérapeutiques au stade adulte par injection sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 20mn) : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Test du tunnel de nage sur animal vigile (Durée totale : 9 x 15mn) : réalisé 1 seule fois – concerne tous les poissons

Impact sur les animaux

Le génotypage des poissons par fin clip (prélèvement de 1 à 2 mm de la nageoire caudale) se fera à 4 mois sous anesthésie générale. La nageoire se reconstituant au cours du temps, il s’agit d’un acte pour lequel aucun effet indésirable n’est attendu (durée totale comprenant balnéation, prélèvement et réveil : 20mn – stress faible). Avant de réaliser le test du tunnel de nage, chaque individu est placé dans le tunnel de nage (phase d’habituation – durée : 15h) avec mise à jeun pour éviter toute contamination de l’eau avec les déjections et une altération des performances de nage. Le tunnel de nage (durée : 9 x 15mn – stress moyen) se déroule sur animal vigile dans un environnement proche de son habitacle naturel (faible court d’eau, oxygénation) et s’arrête dès lors que l’animal est fatigué, visualisé par le recul de l’animal dans le tunnel. L’administration des molécules thérapeutiques au stade développemental se fera par balnéation (durée : 40h – stress faible). L’administration des molécules thérapeutiques au stade adulte se fera par injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (durée totale comprenant balnéation, injection et réveil : 20mn – stress faible). Les molécules thérapeutiques ne devraient apriori n’avoir aucun effet indésirable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issu de chaque procédure pour permettre des analyses post-mortem.

Remplacement

Le projet vise à déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie par analyse comportementale, et de déterminer le potentiel thérapeutique de molécules candidates sur les défauts moteurs de deux modèles poisson zèbre de la maladie. Les modèles in vitro ne permettant pas d’étuder le comportement, seul le modèle animal est donc possible. Le poisson zèbre est particulièrement adapté à ce projet puisque son système neuromusculaire est similaire à celui de l’Homme et fonctionnel au stade larvaire. De plus, l’utilisation de molécules candidates nécessite en première intention un essai dans un organisme entier. La formulation et l’administration de ces molécules sont simplifiées chez le poisson zèbre par rapport aux mammifères.

Réduction

Le projet est mené sur un nombre d’animaux réduit tout en permettant une analyse statistique suffisante. L’unique procédure de ce projet repose sur un test comportemental (tunnel de nage) qui permet d’évaluer les performances de nage dans un couloir qui reproduit le flux d’eau des habitats naturels. Un seul test par animal suffit à déterminer différents paramètres (temps de nage, distance de nage, vitesse de nage…) qui sont quantifiés par analyses statistiques. L’expérience indique qu’il est nécessaire d’avoir 20 animaux par condition. Le criblage pharmacologique effectué dans une étude antérieure in vivo nous permet également de réduire le nombre de molécules candidates à tester et donc le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les modèles poissons utilisés dans le projet permettent un élevage en conditions d’hébergement standards avec une surveillance quotidienne. Le temps entre le prélèvement de la nageoire caudale pour génotypage (4 mois) et le test du tunnel (6 mois) de nage permet de laisser le temps à la nageoire de se régénérer et de permettre une performance de nage optimale pour nos poissons. Les conditions du test comportemental sont proches de celles de son habitat naturel et des points limites adaptés ont été déterminés en amont pour éviter toute souffrance à l’animal. Dans le cas de l’injection intrapéritonéale, les animaux seront mis à jeun 24h avant pour permettre la rapidité du geste.

Choix des espèces

Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et d’organisme entier. Il permet également de tester des approches pharmacologiques grâce à une formulation et administration simplifiées. L’étude de nos modèles a permis de démontrer des défauts moteurs durant les stades de développement. Il est maintenant nécessaire d’évaluer le phénotype au stade adulte pour considérer la robustesse de nos modèles, et de valider l’effet bénéfique de nos molécules candidates au regard de la pathologie humaine. Notre projet vise à déterminer si l’absence d’expression du gène causant la maladie durant le développement conduit à un phénotype moteur lors d’une stimulation (épreuve motrice) chez l’adulte. Pour cela, les poissons passeront le test du tunnel de nage à 6 mois, considéré comme stade adulte. Notre projet a également pour but de déterminer l’effet bénéfique de molécules candidates à deux temps différents, au stade développemental et au stade adulte. Les poissons seront donc traités avec les molécules candidates soit durant le développement (2 jours), soit à 4 mois.

24 moutons et cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée et six tués à l'issue. Ils subissent des prélèvements sanguins très fréquents, jusqu'à dix-neuf par jour, et la pose de cathéters veineux et de sondes urinaires, pour étudier le devenir de molécules pharmacologiques chez ces espèces. Le porteur indique que les moutons privés d'accès veineux sont réformés puis, selon leur état, euthanasiés pour des travaux pratiques d'autopsie ou réutilisés pour des exercices de contention, tandis que les cochons sont tués mais réutilisés autant que possible pour l'entraînement chirurgical. Il conclut que la complexité des organismes impose une étude in vivo.

Objectifs

Que ce soit pour le développement de nouvelles méthodes d’investigation clinique pour l’homme ou l’animal en médecine vétérinaire ou que ce soit pour l’évaluation de molécules pharmacologiques, il est nécessaire de procéder en deux phases : - le développement préclinique, - puis le développement clinique. Ici, nous nous intéressons uniquement à la phase préclinique. Le développement préclinique a, entre autres, pour objectif de définir l’activité pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique des molécules étudiées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme de développer de nouvelles méthodes d’investigation cliniques utiles à la fois en médecine vétérinaire (notament sur les espèces de rentes qui sont souvent négligées) et en recherche préclinique. Ce projet permettra également d’identifier les effets pharmacologiques des molécules étudiées ou leur devenir chez le mouton ou le porc, ainsi que d’évaluer leur toxicité éventuelle. Ce projet devrait donc permettre à long terme d’améliorer les soins cliniques apportés aux animaux d’élevage et fournir des informations précliniques (grace aux données pharmacocinétiques ou pharmacodynamiques) qui peuvent être utilisées par la suite par l’ensemble de la communauté scientifique.

Procédures

Des prélèvements sanguins fréquents sont prévus. Notre protocole prévoit de réaliser au maximum 19 prélèvements de 3 ml par jour. Ceci représente 57 ml de sang prélevés par animal par jour ce qui correspond à moins de 2% du volume sanguin du mouton. Des prélèvements d'urine peuvent être nécessaires et se feront à l'aide d'une sonde urinaire préalablement mise en place. Les prélèvements sanguins ou urinaires ne durent pas plus de 30 secondes chacun y compris le temps de rinçage du cathéter pour les prélèvements sanguins.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont classés selon leur fréquence d’apparition. Les mesures correctives mises en place sont précisées. Catheter veineux : - Rare (moins de 10 cas/an dans notre structure): Risque de thrombose du catheter. En l'absence d'arguments bibliographiques, il n’est pas possible de proposer une recommandation concernant l’utilisation d’un verrou héparine, ou d’un verrou au sérum physiologique seul le rinçage régulier et biquotidien avec du serum physiologique hépariné semble efficace à titre préventif. Si cet événement survient, le cathéter est retiré. Soit un nouveau cathéter est mis en place sur un autre site sous anesthésie/tranquilisation, soit l’animal est exclu de l’étude. Dans tous les cas l’animal reste sous surveillance pendant plusieurs jours. - Assez Rare (Moins 1 cas/an dans notre structure): Inflammation locale ou infection. Afin d’éviter cela, toutes les précautions d’aseptie et d’antisepsie lors de manipulation du cathéter sont mises en place. Avant la manipulation du cathéter, un traitement hygiénique (gants et bouchon du catheter) par friction désinfectante à l'aide d'un gel ou d’une solution hydro-alcoolique est réalisé. Le site d’insertion du cathéter est examiné au moins une fois par jour à la recherche de signes locaux. La réfection du pansement est réalisée uniquement s’il est décollé ou souillé. Le cathéter est retiré en cas de complication locale ou de suspicion d’infection systémique. Effet sur l’animal : gène et douleur au niveau du site de l’affection et signes généraux possibles. Lors de la survenue de cette affection, l’animal est exclu de l’étude, traité et placé sous surveillance. - Très Rare : phlébite suite à la pose du cathéter veineux. Effet sur l’animal : gène et douleur au niveau du site de l’affection et signes généraux possibles. Dans ce cas l’animal est exclu de l’étude, traité et placé sous surveillance. Dans les cas les plus graves l’animal est euthanasié. Sonde urinaire : - Risque d’infection urinaire : La sonde est retirée, l’animal est traité et placé sous surveillance. - Risque d’arrachement de la sonde : rare. L’animal est traité et placé sous surveillance. Afin de limiter les risques d’arrachement les sondes urinaires sont suturées lors de la pose. Les moutons peuvent rester en groupe mais les porcs sont placés en cage individuelles tout en leur permettant de conserver des interractions sociales avec leurs congénères placés dans les cages adjacentes.

Devenir

Pour les moutons : Les animaux n’ayant plus d’accès vasculaires jugulaires ne peuvent être réutilisés et sont donc réformés. Parmi ces animaux réformés, certains (en accord avec le vétérinaire responsable) sont euthanasiés puis utilisés à des fins pédagogiques (TP d’autopsie). Les animaux n’ayant plus d’accès vasculaires jugulaires ne peuvent être réutilisés et sont donc réformés. Parmi ces animaux réformés, ceux présentant un bon état de santé peuvent être ré-utilisés à des fins pédagogiques (TP contention, TP tonte). Les animaux non réformés peuvent être ré-utilisés en expérimentation après une période de repos d’au moins trois semaines avec un suivi médical. L’avis d’un vétérnaire sera requis avant toute réutilisation. Pour les porcs : Les animaux sont tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Toutefois, nous ferons en sorte qu'un maximum d'animaux soient réutilisés, notamment à des fins pédagogique (TP autopsie, entrainement à des gestes chirurgicaux spécifiques, …).

Remplacement

La finalisation de méthodes d’investigation cliniques ou l’application de méthodes d’investigation clinique d’une espèce à une autre ne peuvent être réalisées par définition qu’in vivo. Les effets des molécules pharmacologiques étudiées peuvent être évaluées au préalable par l’obtention de données in vivo ou ex vivo. Cependant, du fait de la complexité des organismes, les effets multiples sur plusieurs organes ne peuvent être étudiés qu’in vivo. Les études in vivo permettent ainsi une analyse et une prédiction plus fiable de la pharmacocinétique animale et également humaine d'après des données d'études scientifiques. Néanmoins, avant nos études, les caractéristiques physico-chimiques des produits sont évaluées in vitro et une recherche bibliographique approfondie est menée.

Réduction

Nous utilisons le nombre le plus réduit possible d’animaux notamment en réalisant lorsque cela est possible des essais croisés avec des périodes de washout. Les études de pharmacocinétique sur animaux s’effectuent habituellement (selon la littérature) avec des groupes de 6 à 8 animaux par test. Une approche statistique permet de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire pour l'étude.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés et maintenus en groupe tant que c'est possible. Ils ne sont isolés que lorsqu'ils sont équipés de cathéters qu'un congénère pourrait détériorer. Auquel cas on maintient entre eux un contact visuel et olfactif et notre équipe continue à entretenir un contact social. Les catheters sont entretenus régulièrement pour éviter qu'ils ne se bouchent. Toutes les phases douloureuses sont anticipées par des traitements analgésiques. Au terme des protocoles, un examen clinique permet de déterminer si les animaux sont réutilisables pour un autre protocole. Nous veillons à limiter le nombre d'utilisations, pour éviter de trop solliciter les animaux qui sont soit placés, soit inclus dans un protocole qui termine par l'euthanasie. Par ailleurs, le plan de prélèvements sanguins est conçu de sorte à ne jamais prélever un volume de sang supérieur à 7,5% du volume circulant de l'animal. De même, les volumes administrés ne dépasseront pas les recommandations communément admises dans "A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood, Including Routes and Volumes". Les points limites spécifiques sont repris dans une grille de scoring de la douleur. Cette grille est élaborée à partir de critères d'observation des animaux d'une part (porcs : posture, activité et interraction avec congénères / ovins: idem +rumination) et de critères de mesures objectives comme la prise de boisson, de nouriture, la température corporelle, la prise de poids, les paramètres physiologiques (fréquence respiratoire, fécès). Au niveau des sites d'implantation des cathéters les signes de chaleur ou de douleur et l'évaluation de son intensité est réalisée par du personnel formé. En cas de doute le vétérnaire est imédiatement informé et passe dans l'heure qui suit. En cas d'hyperthermie les animaux sont immédiatement traités par des anti-pyrétiques ou des anti-inflammatoires. Les points limites conduisant à l'éviction de l'animal sont : complications liées à la mises en place des cathéters et de la sonde urinaire comme de la fièvre ne retrocédant pas aux anti-pyrétiques dans les 48h (ou moins si très élevée ou si d'autres signes de douleur), abcès ne régressant pas suite au traitement, déshydratation, léthargie ou prostration persistante associée aux autres signes. Ces situations ne sont que très rarement rencontrées dans ce type d'étude.

Choix des espèces

Les études de pharmocinétique ou de pharmacodynamie réalisées in vivo et ex vivo permettent d’orienter les conclusions et de mieux cibler des molécules intéressantes en santé humaine et animale. Cependant, du fait de la complexité des organismes, l’obtention de résultats précis et fiables nécessite obligatoirement de mettre en place un modèle animal. Par ailleurs, le choix d’animaux de grande taille (tels que le porc et le mouton) permet d’évaluer les effets de molécules d’intérets dans ces espèces qui peuvent constituer les espèces cibles. Ce choix permet également de faciliter les corrélations entre l’animal et l’humain du fait d’un poids similaire (mouton de 60 kg avec un volume sanguin proche de celui de l’homme) ainsi que parfois d’une physiologie plus proche en particulier chez le porc. Par exemple pour l’étude de molécules ayant une distribution hépatique, il est important de vérifier la physiologie de la libération de la bile dans le modèle animal. Or, la composition de la bile chez le porc est très similaire à celle de l’Homme. De même, la physiologie rénale du porc ressemble fortement à celle de l’Homme.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit du tamoxifène puis des injections de vecteurs viraux dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique, avec pose d'une plaque métallique et d'une fenêtre crânienne, avant des séances d'imagerie tête immobilisée, et 70 d'entre elles sont élevées dans l'obscurité depuis la naissance. Le porteur reconnaît que l'immobilisation de la tête et le port de la plaque peuvent stresser les animaux et limiter leur comportement habituel. Il affirme n'avoir pas d'alternative pour étudier les circuits corticaux intacts tout en développant un modèle numérique complémentaire, et toutes les souris sont tuées pour analyse anatomique.

Objectifs

Dans le cerveau des Mammifères, le cortex cérébral est responsable de fonctions cognitives complexes, notamment d'une représentation cohérente du monde extérieur qui est cruciale pour une interaction efficace avec l’environnement. En revanche, la perception sensorielle est fortement influencée par le contexte ainsi que par l'environnement qui entoure les stimuli sensoriels. Cependant, les mécanismes impliqués dans les traitement de l’information sensorielle par le cerveau ne sont toujours pas clairs. Dans le système visuel, le traitement de l'information est largement conditionné par l'état comportemental de l'animal, ses intentions et ses attentes ainsi que la présence d'autres modalités sensorielles. L'intégration d'informations contextuelles (état comportemental) avec des signaux sensoriels (signaux visuelles) se produit déjà aux premiers stades du traitement cortical. Ces signaux contextuels sont transmis aux zones sensorielles corticales par de multiples voies, dont les projections thalamiques et intra-corticales qui innervent fortement la couche 1, la couche la plus superficielle du néocortex. Ainsi, en intégrant les entrées sensorielles et contextuelles, la couche 1 est une structure centrale, clé, qui sous-tend le codage des informations sensorielles. Pourtant, l'architecture fonctionnelle des circuits de la couche 1 est encore mal définie. Malgré les travaux récents étudiant la fonction des interneurones (INs) de la couche 1, la connaissance des mécanismes cellulaires impliqués dans l'activation de ces interneurones et leurs impacts sur le traitement des informations sensorielles est encore limitée. Au cours de ce projet, nous étudierons les propriétés des microcircuits de la couche 1 due cortex et sont role dans le traitement de l'information visuelle.

Bénéfices attendus

Les maladies du cerveau ont des répercussions majeures sur la santé des individus, leur autonomie, leur éducation, leur emploi, leur mobilité et leurs relations personnelles, ce qui représente un lourd fardeau social et économique. Il est d'une importance fondamentale de comprendre les propriétés de base qui régissent la force, le dynamisme, l'étendue spatiale, la localisation anatomique et les composants moléculaires des connexions synaptiques entre des types de neurones spécifiques formant un réseau neuronal dans des états normaux et pathologiques. Plus précisément, nous pensons que le dysfonctionnement du néocortex est à l'origine de déficiences cognitives et de troubles tels que la schizophrénie, l'autisme, la dépression, ou encore de symptômes de douleur chronique. Cependant, nous ne comprenons pas encore comment les circuits du cortex fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nos objectifs sont de caractériser les motifs normaux et anormaux d'activité des circuits qui peuvent se produire dans le cortex visuel et contribuer aux symptômes de ces troubles. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour certaines maladies du cerveau.

Procédures

Au total nos utiliserons 260 souris. A partir de ce total, 140 souris seront d'abord injectées avec du tamoxifène par voie intrapéritonéale (IP) au stade adulte (3 minutes par animal) pendant 3-5 jours e après l’insertion de gènes dans ces souris adultes sera réalisée en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie sous anesthésie générale (1 chirurgie/animal, 40-60 minutes par animal). 70 souris seront hébergées classiquement tandis que 70 autres seront placés dans l'obscurité dès la naissance. Pour cela, les animaux seront placés dans des cages identiques à celles utilisées pour les souris sauvages, mais teintées en rouge. Les humains peuvent voir à travers, mais la longueur d'onde de la lumière ambiante à laquelle les souris sont sensibles sera filtrée par la cage. Dans un autre group, 120 souris transgéniques, seront d'abord injectées avec du tamoxifène par voie intrapéritonéale (IP) au stade adulte (3 minutes par animal) pendant 3 jours. Ces 120 souris transgéniques au stade adulte recevront aprés sous anesthésie générale, l’insertion de gènes en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie, le scellement d’une plaque métallique sur le crâne et la pose d’une petite fenêtre crânienne avec une lamelle de verre (1 chirurgie par animal, 30-90 minutes par animal). Les souris seront ensuite utilisées pour l'imagerie intravitale à biphotons 2 semaines après la chirurgie. Les souris seront d'abord habituées à la fixation de la tête pendant 5 jours, en commençant par des périodes de petite durée (premier jour 15 min) jusqu'au dernier jour d'habituation qui peut durer 1 heure:30. La période d'habituation peut être prolongée d'une semaine si, au cours de cette période, on observe que l'animal lutte contre la fixation de la tête et n'est pas à l'aise dans le dispositif expérimental. Après cette période de familiarisation, les animaux seront imagés pendant 5 jours consécutifs à raison de 1h30 par session. Cinq jours consécutifs d'imagerie seront toujours suivis d'au moins une semaine de période sans imagerie pour permettre aux animaux de récupérer. Ces sessions d'imagerie et de non-imagerie peuvent être répétées jusqu'à un maximum de 3 mois après la chirurgie initale.

Impact sur les animaux

Le traitement par tamoxifène peut induire du stress, de l'inactivité et une perte de poids. De plus, le traitement au tamoxifène nécessite la manipulation des animaux et des injections intrapéritonéales. L'implantation d'une plaque métallique sur la tête des animaux pour l'imagerie biphotonique nécessite une procédure chirurgicale. Une telle procédure implique une anesthésie générale avec des risques de douleur et/ou de développement d'infections chez les animaux. De plus, après l'implantation dela plaque métallique, l'animal devra vivre dans la cage avec une plaque métallique sur la tête, ce qui peut limiter son comportement habituel. Afin d'imager l'animal sous un éclairage à deux photons, les animaux seront éveillés mais la tête sera immobilisée, ce qui limitera les mouvements de la tête qui peuvent être stressants pour les animaux.

Devenir

À la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés . Dans un cas les tranches de cerveau vont être utilisées pour réaliser des expériences. Por les experiences d’ imagerie in vivo biphotonique nécessitent des analyses anatomiques post-mortem (localisation anatomique des implants, injection de virus, expression de différents gènes).

Remplacement

Il n’y a malheureusement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car des modèles adéquats du circuit cortical contenant le nombre, les types et la localisation appropriés des récepteurs dans les réseaux excitateurs et inhibiteurs ne sont pas disponibles. L'objectif de nos expériences est de découvrir l’action des gènes, des neuromodulateurs et des médicaments sur les circuits neuronaux dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie neuronale des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles en culture cellulaire. Il est important de noter que notre projet scientifique globale comporte une composante alternative à l’expérimentation animale: l’analyse de modèles in silico. Nous utiliserons l’expertise théorique du laboratoire pour générer un modèle numérique du circuit neuronal étudié incluant les résultats de notre caractérisation expérimentale. Ce modèle sera diffusé publiquement et constituera une alternative à l’expérimentation animale pour l’étude du rôle fonctionnelle des interneurones de la couche 1 pour nos futurs travaux ainsi que pour ceux d’autres équipes.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 260) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront des injections virales et l’imagerie simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de complications chez les animaux et de minimiser les dommages durables. Toutefois, les avantages de la réutilisation des animaux seront mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte de l'expérience de toute une vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris à être fixées par la tête dans l'installation d'imagerie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Des tests paramétriques et non-paramétriques seront utilisés en fonction de la distribution normale ou non-normale des données. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur un plateforme en ligne ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.

Raffinement

Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire au maximum l'impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton et maison) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. Toutes les interventions chirurgicales seront effectuées sous anesthésie et des analegésiques seront administrés avant et après les intervention pour limiter la douleur. Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Des croquettes adaptées à la gestation/allaitement seront mise à disposition pour les animaux en accouplement. Les animaux qui subissent une intervention chirurgicale seront mis sous surveillance étroite, au moins deux fois par jour pendant les trois premiers jours suivant la chirurgie. Nous définirons des points limites qui, s'ils sont atteints, nous conduiront immédiatement à l'euthanasie de l'animal afin de réduire les souffrances inutiles. Nous prévoyons également d'utiliser des gels et de la nourriture molle pour les animaux qui se récupèrent d'une intervention chirurgicale

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types d’interneurones que nous étudions. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et les portées sont importantes, permettant de produire suffisamment d’animaux pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. Le développement du cerveau est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Nous maîtrisons suffisamment les techniques proposées dans ce projet pour réduire le nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Les lignées que nous utiliserons ne présentent pas de phénotype dommageable. Des animaux adultes (>P40) seront utilisés pour toutes les procédures (50% males et 50 % femelles). Toutes les procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. En outre, toutes les expériences seront réalisées chez des souris adultes, lorsque les circuits corticaux ont atteint un stade de maturation final.

1 060 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent un prélèvement d'un à deux millimètres de nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, l'administration de molécules candidates par l'eau ou par injection, et un test comportemental de tunnel de nage prolongé jusqu'à la fatigue de l'animal. Le projet porte sur une maladie neuromusculaire humaine sans traitement curatif, et le porteur affirme qu'un essai dans un "organisme entier" est nécessaire, l'in vitro ne permettant pas d'étudier le comportement. Tous les poissons sont tués pour des analyses post-mortem.

Objectifs

Ce projet s’intéresse à une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène entrainant des troubles moteurs chez les patients dès l’enfance. Deux modèles poisson zèbre de la pathologie ont été créés et présentent les défauts de motilité au stade larvaire. Des molécules ont été identifiées comme capables de restaurer la motilité à ce stade de développement. Le premier objectif du projet est de définir s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la maladie. Le deuxième est de déterminer si les molécules ont un potentiel thérapeutique lorsqu’elles sont administrées à un stade présymptomatique ou symptomatique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale en permettant de déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie. Il s’inscrit également dans une démarche de recherche translationnelle puisqu’il permettra de déterminer quelle fenêtre de temps est adéquate pour le traitement.

Procédures

- Génotypage par prélèvement d’une petite partie de la nageoire caudale (1 – 2 mm) sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 15mn) : réalisé 1 fois – concerne 240 poissons - Administration de molécules candidates au stade développemental (durée d’administration de 8 à 48 heures post-fertilisation) directement dans l’eau : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Administration de molécules thérapeutiques au stade adulte par injection sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 20mn) : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Test du tunnel de nage sur animal vigile (Durée totale : 9 x 15mn) : réalisé 1 seule fois – concerne tous les poissons

Impact sur les animaux

Le génotypage des poissons par fin clip (prélèvement de 1 à 2 mm de la nageoire caudale) se fera à 4 mois sous anesthésie générale. La nageoire se reconstituant au cours du temps, il s’agit d’un acte pour lequel aucun effet indésirable n’est attendu (durée totale comprenant balnéation, prélèvement et réveil : 20mn – stress faible). Avant de réaliser le test du tunnel de nage, chaque individu est placé dans le tunnel de nage (phase d’habituation – durée : 15h) avec mise à jeun pour éviter toute contamination de l’eau avec les déjections et une altération des performances de nage. Le tunnel de nage (durée : 9 x 15mn – stress moyen) se déroule sur animal vigile dans un environnement proche de son habitacle naturel (faible court d’eau, oxygénation) et s’arrête dès lors que l’animal est fatigué, visualisé par le recul de l’animal dans le tunnel. L’administration des molécules thérapeutiques au stade développemental se fera par balnéation (durée : 40h – stress faible). L’administration des molécules thérapeutiques au stade adulte se fera par injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (durée totale comprenant balnéation, injection et réveil : 20mn – stress faible). Les molécules thérapeutiques ne devraient apriori n’avoir aucun effet indésirable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issu de chaque procédure pour permettre des analyses post-mortem.

Remplacement

Le projet vise à déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie par analyse comportementale, et de déterminer le potentiel thérapeutique de molécules candidates sur les défauts moteurs de deux modèles poisson zèbre de la maladie. Les modèles in vitro ne permettant pas d’étuder le comportement, seul le modèle animal est donc possible. Le poisson zèbre est particulièrement adapté à ce projet puisque son système neuromusculaire est similaire à celui de l’Homme et fonctionnel au stade larvaire. De plus, l’utilisation de molécules candidates nécessite en première intention un essai dans un organisme entier. La formulation et l’administration de ces molécules sont simplifiées chez le poisson zèbre par rapport aux mammifères.

Réduction

Le projet est mené sur un nombre d’animaux réduit tout en permettant une analyse statistique suffisante. L’unique procédure de ce projet repose sur un test comportemental (tunnel de nage) qui permet d’évaluer les performances de nage dans un couloir qui reproduit le flux d’eau des habitats naturels. Un seul test par animal suffit à déterminer différents paramètres (temps de nage, distance de nage, vitesse de nage…) qui sont quantifiés par analyses statistiques. L’expérience indique qu’il est nécessaire d’avoir 20 animaux par condition. Le criblage pharmacologique effectué dans une étude antérieure in vivo nous permet également de réduire le nombre de molécules candidates à tester et donc le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les modèles poissons utilisés dans le projet permettent un élevage en conditions d’hébergement standards avec une surveillance quotidienne. Le temps entre le prélèvement de la nageoire caudale pour génotypage (4 mois) et le test du tunnel (6 mois) de nage permet de laisser le temps à la nageoire de se régénérer et de permettre une performance de nage optimale pour nos poissons. Les conditions du test comportemental sont proches de celles de son habitat naturel et des points limites adaptés ont été déterminés en amont pour éviter toute souffrance à l’animal. Dans le cas de l’injection intrapéritonéale, les animaux seront mis à jeun 24h avant pour permettre la rapidité du geste.

Choix des espèces

Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et d’organisme entier. Il permet également de tester des approches pharmacologiques grâce à une formulation et administration simplifiées. L’étude de nos modèles a permis de démontrer des défauts moteurs durant les stades de développement. Il est maintenant nécessaire d’évaluer le phénotype au stade adulte pour considérer la robustesse de nos modèles, et de valider l’effet bénéfique de nos molécules candidates au regard de la pathologie humaine. Notre projet vise à déterminer si l’absence d’expression du gène causant la maladie durant le développement conduit à un phénotype moteur lors d’une stimulation (épreuve motrice) chez l’adulte. Pour cela, les poissons passeront le test du tunnel de nage à 6 mois, considéré comme stade adulte. Notre projet a également pour but de déterminer l’effet bénéfique de molécules candidates à deux temps différents, au stade développemental et au stade adulte. Les poissons seront donc traités avec les molécules candidates soit durant le développement (2 jours), soit à 4 mois.

3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont colonisées par gavage avec des souches d'Escherichia coli, soumises à un régime gras pendant plusieurs semaines à plusieurs mois et à des tests répétés de tolérance au glucose, certaines souches pathogènes pouvant entraîner une perte de poids déclenchant leur mise à mort. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"irremplaçable" pour ces bactéries et reconnaît ne pas avoir prévu d'analyse statistique préalable du nombre d'animaux. Toutes les souris sont tuées pour disséquer leurs tissus, un effectif de 3 360 justifié par la recherche d'un "seuil statistiquement valable".

Objectifs

Comprendre : i) les altérations du métabolisme du glucose et du microbiote intestinal induites par les infections à E. coli; ii) le rôle de l'inflammation intestinale dans les phénomene du point i); iii) comoprendre les mécanismes moléculaires selon lesquels les maladies métaboliques type obésité et diabète de type 2 predisposent aux infections.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge des patients métaboliques et qui souffrent des maladies infectieuses à E. coli

Procédures

9 procédures : voir point 4. Durée de la procédure 1 de colonisation ~5 seconds, le temps du gavage; pour la procédure 2 high-fat diet courte durée, 4 semaines; pour la procédure 3 high-fat diet longue durée, ~3 mois; pour la procédure 4 IPITT 1 heure; pour la procédure 5 IPGTT 2 heures; pour la procédure 6 OGTT 2 heures; pour la procédure 7 IPPTT 2 heures; pour la procédure 8 injection de MCC950, ~5 seconds, le temps de l'injection; pour la procédure 9 de la NFS, durée de ~15 seconds, le temps du prélevement du sang.

Impact sur les animaux

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites.

Devenir

Les souris resterons en vie à la fin de chaque procédure. Les souris seront mises à mort à la fin de chaque protocole complet indiqué en 3.4.10. La mise a mort est nécessaire afin de permettre la dissection des tissus pour réaliser les analyses moléculaires et identifier les facteurs moléculaires à la base des phénotypes observés.

Remplacement

Pas adaptable dans ce cas car si les études avec des cellules ont permis d’identifier et caractériser les dommages à l'ADN provoqués par les génotoxines, le recours à l’animal est irremplaçable pour ce type d'étude avec des souches bactériennnes. En effet, aucun modèle cellulaire ne permet de récapituler les processus de la colonisation intestinale bactérienne, de la translocation, c’est-à-dire la diffusion des bactéries vers les autres organes, ni d’évaluer, au niveau de l’individu, le rôle de la colonisation par des bactéries produisant des génotoxines sur la santé.

Réduction

Le chiffre de 3360 souris nous permettra d’atteindre un seuil statistiquement valable et donc de pouvoir interpréter les résultats obtenus. Cela permettra donc de ne pas répéter les expérimentations tout en respectant la réduction du nombre d’animaux employés (règle de 3 R). En ce qui concerne les points limites (critères d'interruption) pour le raffinement des protocoles, l’inhibition pharmacologique de l’inflammasome intestinal NLRP3 et les procédures de colonisation n’ont pas été rapportées pour induire de douleur chez l’animal et sont bien tolérées sauf avec certaines souches pathogènes. Pour ces souches spécifiquement, le temps d’expérimentation sera réduit afin de minimiser la mortalité. Une perte (non attendue) du poids initial supérieure à 20% ainsi que des éventuels états de prostration ou isolement nous conduiront à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Nous envisageons d’utiliser de souris mâles, dont la littérature montre une vaste gamme de données sur le microbiote intestinal.

Raffinement

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites. Nous ne prévoyons pas une étude statistique à l’avance (analyse de puissance) car nous n’avons pas un pourcentage précis de modulation de variables que l’on va analyser.

Choix des espèces

Le microbiote intestinal chez la souris est désormais bien connu et sa structure ressemble à celle du microbiote intestinal chez l’homme. Pour cela, la translation des résultats obtenus chez la souris vers l’homme pourrait être faite rapidement (Serino et al., Acta Diabetol. 2013). Nous utiliserons des souris de 12 semaines d’âge au moment de la colonisation avec les souches bactériennes d’intérêt. Cette âge tient compte du temps d’acclimatation des souris en zootechnie (2 semaines), de l’éventuel protocole antibiotique (2 semaines) avant colonisation et du traitement par régime gras 60%HFD (4 semaines ou 3 mois, selon le protocole). Dans ce dernier cas les souris arriveront à l’âge de 6 semaines. Cette âge permet une réponse optimale des souris au régime gras diabétogène/obésogène pour l’induction des maladies métaboliques. Dans les autres cas sans régime gras les souris arriveront en zootechnie à l’âge de 10 semaines.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par exsanguination sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent du tamoxifène, subissent des tests sensoriels et moteurs sur animal vigile, une mesure de la conduction nerveuse par électromyographie sous anesthésie et une hyperglycémie provoquée après six heures de jeûne. L'objectif est de comprendre le rôle de l'enzyme PCSK9 dans les nerfs périphériques et d'évaluer un risque possible des traitements anti-cholestérol qui la bloquent. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours aux animaux vivants et d'"inestimable" le système génétique employé, la neuropathie étant selon lui impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Le projet a pour objectif principal de comprendre le rôle de PCSK9 dans le système nerveux périphérique. PCSK9 est une enzyme fortement exprimée dans le foie où elle joue un rôle clé dans le métabolisme lipidique. PCSK9 est un inhibiteur naturel du récepteur au LDL-cholestérol, LDLR. Des cibles thérapeutiques pour PCSK9 ont été développées récemment et sont actuellement utilisées en clinique pour traiter des patients atteints de dyslipidémie, dont des patients diabétiques. L'utilisation d'inhibiteurs de PCSK9 chez l'homme permet de bloquer sa fonction et de diminuer les taux de LDL-cholestérol plasmatique suite à l'augmentation du nombre de récepteurs au LDL-cholestérol au niveau du foie. Nos précédents travaux ont pu mettre en évidence que PCSK9 est également exprimé dans le système nerveux périphérique au niveau des nerfs où son role reste pour l'instant totalement inconnu. Suite à cette observation, il est essentiel de déterminer la fonction de PCSK9 dans cette structure afin d'évaluer le risque potentiel de l'utilisation des thérapies bloquant son activité sur les fonctions sensorielles et motrices des patients traités. Afin d’étudier la fonction de PCSK9 dans les nerfs périphériques, nous utiliserons plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées permettant d'éliminer spécifiquement son expression dans différents tissus. Nous évaluerons les fonctions sensorielles et motrices des animaux en réalisant des tests comportementaux. Nous évaluerons également le bon fonctionnement des nerfs sensoriels en faisant des mesures de la vitesse de conduction par la technique de l'électromyographie.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera de nouvelles données sur la fonction de PCSK9 dans les nerfs périphériques. PCSK9 est un inhibiteur naturel du récepteur au LDL-cholestérol, LDLR. Des cibles thérapeutiques pour PCSK9 ont été développées récemment et sont actuellement utilisées en clinique pour traiter les patients atteints de dyslipidémie, dont des patients diabétiques de type 2. L'utilisation d'inhibiteurs de PCSK9 chez l'homme permet de bloquer sa fonction et de diminuer les taux de LDL-cholestérol plasmatique suite à l'augmentation du nombre de récepteurs au LDL-cholestérol au niveau du foie. Suite à la mise en évidence de l'expression de PCSK9 dans les nerfs périphériques, il est essentiel de déterminer sa fonction dans cette structure afin d'évaluer le risque potentiel de l'utilisation des inhibiteurs de PCSK9 sur les fonctions sensorielles et motrices chez les patients traités. Ce projet permettra de déterminer le rôle de PCSK9 dans les nerfs périphériques et de déterminer si son inhibition en clinique peut avoir un impact sur le développement de neuropathie chez les patients traités.

Procédures

Le prélèvement de tissus pour le génotypage des souris et la mise en place d’une bague d’oreille numérotée sera réalisé sous anesthésie générale sur l’ensemble des animaux et la technique sera d’une durée de 5min par animal. Les tests comportementaux seront réalisés sur animaux vigiles sur l’ensemble des animaux et le geste technique sera d’une durée de 20min par animal. La vitesse de conduction nerveuse sera effectuée sous anestéshie générale et sur l’ensemble des animaux pour une durée de 20 min par animal. L’hyperglycémie provoquée se fera sur animaux vigiles et sur l’ensemble des animaux pour une durée de 120 min par animal avec des prélèvements à différents temps. L’exsanguination sera effectuée sur l’ensemble des animaux du projet qui seront mis sous anesthésie générale et la procédure durera 5min par animal.

Impact sur les animaux

Concernant les nuisances ou effets indésirables possibles sur les animaux, nous avons identifié certaines manipulations qui pourraient entrainer des nuisances ou des effets indésirables sur les animaux. L’injection de tamoxifène sur animal non anesthésié peut entrainer un certain niveau de stress. Afin de limiter le stress, les animaux seront manipulés par des expérimentateurs formés à la préhension et à la contention des animaux de laboratoire. Le tamoxifène est un anti-estrogène administré dans le cancer du sein de la femme. Même si quelques effets secondaires peuvent être observés tels qu'une mortaité embryonnaire, une infertilité temporaire ou un blocage intestinal, en recherche, elle est couramment utilisée chez la souris pour activer la recombinase Cre dans des lignées de souris génétiquement modifiées. Au vu des doses utilisées et de la période d’injection (5 jours), nous ne nous attendons pas à des effets indésirables sévères. Concernant les tests sensoriels et moteurs, l’isolement des animaux pour effectuer les tests peut entrainer un certain niveau de stress. Afin de limiter ces effets, les animaux seront habitués à la salle de test, à son environnement et au matériel pendant 3 jours consécutifs (30 minutes par jours). Pour l'hyperglycémie provoquée, la mise à jeun de l’animal pendant 6 heures peut entrainer des effets indésirables. Afin de limiter le stress, la mise à jeun se fera pendant la journée afin que les expérimentateurs puissent surveiller le comportement des animaux pendant cette période.

Devenir

L'ensemble des animaux est maintenu en vie au cours des procédures 1 à 7. A la fin de la procédure, l'ensemble des animaux subiront une exsanguination suite à une ponction cardiaque après anhestésie à l’isoflurane.

Remplacement

Les objectifs de cette étude sont de déterminer le rôle de PCSK9 de manière spécifique dans le système nerveux périphérique. Elle nécessite donc l’utilisation de lignées de souris transgéniques dans le but de supprimer l’expression de la protéine PCSK9 dans différents types cellulaires composant le nerf. Par ailleurs, le recours à l’expérimentation sur des animaux vivant est indispensable car la neuropathie est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés (ex : culture cellulaire), de même que les tests de phénotypage sensoriel et moteur. De plus, le système Cre-loxP est un système inestimable pour le contrôle de la délétion de différents gènes au niveau du système nerveux chez la souris et est très fréquemment utilisé chez les modèles de souris transgéniques. Les études seront systématiquement optimisées d’après la littérature et/ou les observations réalisées au laboratoire.

Réduction

L’utilisation des animaux sera réduite au maximum et les expériences seront planifiées et réalisées les unes après les autres afin d’éviter des pertes inutiles. L’application de cette politique de réduction mise en place permettra d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer un maximum d’information d’un minimum d’animaux. Le nombre d'animaux minimum a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les protocoles ont été établis afin de réduire la douleur et la détresse de l’animal. Les animaux seront sous la surveillance de personnes habilitées et la diffusion par ces personnes de leur savoir-faire permettra de réaliser nos expérimentations dans le respect du bien-être animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Pour les tests sensoriels et moteurs, les souris bénéficieront d'une acclimatation à la salle de test (30 minutes/jour pendant 3 jours) afin d’éviter le stress de l’animal. Les tests seront effectués sur plusieurs jours dans le but de limiter le nombre de stimulations (mécaniques, nociceptives et motrices). Si lors d'une procédure des signes de douleur ou de détresse sont observés alors l'animal se verra administré une dose d'analgésique (buprénorphine) à 0,01 mg/kg en sous-cutané. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne des zootechniciens et expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être et de détecter tout signe éventuel de douleur (prostration, isolement, passivité, pelage, respiration, vocalisations)

Choix des espèces

La souris représente une espèce validée dans l’étude des neuropathies. Elle permet l’évaluation des déficits sensoriels et moteurs par la possibilité d’effectuer des tests sensoriels et moteurs non invasifs établis de longue date chez ce modèle animal et récapitulant les tests sensoriels réalisés chez l’homme. Nous utilisons des souris car elles sont déjà à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris transgéniques permettant l’étude de protéines d’intérêt impliquées dans les neuropathies. Nous utiliserons des souris âgées de 10 semaines. Nous avons choisi ce stade de développement car le système somatosensoriel est mature et fonctionnel à partir de 8-10 semaines.

4 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrées à un troupeau laitier et susceptibles de repasser dans d'autres protocoles après deux mois. Pendant quatorze semaines, dont quatre périodes de dix-huit jours à l'attache, elles subissent une vingtaine de prélèvements de contenu digestif et des prises de sang par période, des collectes d'urine et de fèces, et le port de harnais que le porteur reconnaît susceptibles de provoquer des irritations. L'objectif est de comparer la valeur nutritionnelle de tourteaux extraits avec un composé bio-sourcé plutôt qu'à l'hexane, un solvant neurotoxique, et d'estimer le rôle du rumen dans l'absorption du phosphore. Le porteur affirme qu'une mesure de référence est une "nécessité" faute de données suffisantes pour des modèles mathématiques ou des tests in vitro.

Objectifs

Les tourteaux sont le résidu solide obtenu lors du traitement des graines oléagineuses en vue de l’extraction d’huile. Du fait de leur forte teneur en protéines, ils constituent une matière première clé pour équilibrer les rations des animaux d’élevage. Aujourd’hui, la majorité des tourteaux résultent d’une extraction des huiles à l’hexane qui est une substance neurotoxique, ainsi qu’un perturbateur endocrinien. Une alternative à l’hexane pourrait être un composé bio-sourcé, issus de coproduit alimentaire. Une question est de déterminer si la valeur nutritionnelle pour les vaches laitières des tourteaux issus de l’extraction par ce composé bio-sourcé reste suffisamment similaire aux tourteaux extraits à l’hexane pour permettre leur usage généralisé en élevage. Par ailleurs, un autre enjeu autour de l’usage des tourteaux est l’impact de l’usage du tourteau de soja dans les émissions de gaz à effet de serre, via notamment la déforestation que sa culture provoque. Le tourteau de colza produit plus localement semble une bonne alternative à la seule limite qu’il est plus riche en phosphore. Son usage dans des rations de vaches laitières entraine ainsi une excrétion accrue de phosphore, susceptible de provoquer des phénomènes d’eutrophisation. Une partie significative du phosphore contenu dans les tourteaux est sous forme de phytates, non absorbable au niveau intestinal. Chez les animaux monogastriques, l’addition de phytases dans les rations a permis de réduire significativement les apports de phosphore en permettant une meilleure absorption intestinale de ce dernier. Chez les ruminants, la flore microbienne ruminale produirait des phytases mais on ne sait pas si leur quantité est suffisante pour que le phosphore soit bien absorbé dans les rations à base de colza. Du fait du développement de l’usage du tourteau de colza, il est donc aujourd’hui nécessaire d’évaluer le rôle des phytases ruminales sur des rations à base de tourteau de colza afin de juger de la pertinence d’ajouter aux rations des ruminants des phytases de synthèse comme chez les monogastriques.

Bénéfices attendus

Si les résultats de ce projet sont concluants, c’est-à-dire si la valeur nutritionnelle des tourteaux résultant d’une extraction au composé bio-sourcé est comparable à celle des tourteaux extraits à l’hexane, l’adoption de ce nouveau procédé d’extraction permettra de réduire les risques de maladies professionnelles des ouvriers des usines d’extraction liés à la manipulation de l’hexane et à limiter la diffusion de résidus d’hexane dans les produits animaux destinés à la consommation humaine. Des tests urinaires réalisés en Europe ont montré que la moyenne de la population présente des teneurs urinaires en 2,5-haxanedione résultant du métabolisme de l’hexane supérieurs au niveau d’exposition jugé comme acceptable pour la santé. A contrario, l’EFSA (European Food Safety Authority) a tranché que le composé bio-sourcé testé dans ce projet ne présentait pas un risque de résidus problématiques dans les produits animaux. D’autre part, l’estimation du rôle du rumen dans le devenir des phytates sur des rations à base de tourteau de colza chez les vaches laitières permettra d’objectiver les bénéfices d’une supplémentation en phytases de synthèse. Ceci pourra constituer une piste pour ajuster au mieux les supplémentations en phosphore des vaches sur ce type de ration, afin de répondre à leur besoin physiologique tout en limitant les rejets de phosphore dans l’environnement et les risques d’eutrophisation.

Procédures

Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront mobilisés durant 14 semaines (2 semaines de mesures de référence, puis 4 périodes de 3 semaines). Cette durée inclura 4 périodes de 18 jours pendant lesquelles les vaches seront à l'attache. Des prélèvements de contenus digestifs et de sang dans la veine caudale seront réalisés sur la dernière semaine de chaque période. Les prélèvements de contenu digestifs seront au nombre de 20 par vache et par période et chaque prélèvement durera moins de 5 minutes. Les prises de sang en veine caudale seront au nombre de 4 par vache et par période et chaque prélèvement durera moins de 2 minutes. Des collectes totales d’urine et de fèces seront aussi réalisées pendant 5 jours consécutifs par période, en continu. Des mesures de l’activité fermentaire du rumen seront aussi réalisées.

Impact sur les animaux

Pour ce projet les vaches devront être maintenues à l’attache pendant une période de deux semaines et quatre périodes de 18 jours. Pour limiter les effets d’une telle pratique sur les articulations, chacune de ces périodes sera espacée de trois jours pendant lesquels les vaches seront laissées en liberté dans la stabulation afin qu’elles puissent marcher librement. Pour limiter le stress lié à l’isolement social, les vaches attachées seront logées dans la même pièce et séparées par des pare-bottes, ce qui leur permettra de se sentir et de s’entendre. Pour limiter les stress sociaux liés aux séquences de 3 jours pendant lesquels les vaches seront en liberté ensembles, elles seront regroupées en liberté dans une case de la stabulation qui leur sera dédiée et isolée du reste du troupeau. Pour la collecte séparée de l’urine et des fèces, des harnais de collecte d’urine seront posés sur les vaches à la fin de chaque période expérimentale, soit pendant 5 jours à 4 reprises espacées de 16 jours. Ces derniers peuvent induire un risque d’irritations. Ces périodes avec harnais sont limitées en nombre et en durée au maximum pour limiter ce risque, et espacées pour permettre aux vaches d’avoir totalement cicatrisé entre les périodes le cas échéant. Par ailleurs, les dispositifs de prélèvement digestif entrainent peu de nuisances avérées chez les vaches équipées par rapport aux autres vaches. Ceci est garanti par un suivi journalier afin de vérifier que les dispositifs sont bien bouchés en dehors des périodes de prélèvements.

Devenir

A l’issue de la procédure les animaux seront réintégrés dans un troupeau de vaches laitières soumis à une conduite classique d’élevage laitier. Après un délai d’au moins 2 mois, certaines de ces vaches pourront réintégrer de nouveaux projets expérimentaux.

Remplacement

Une difficulté pour prédire la valeur nutritionnelle des rations chez les ruminants résulte du fait que les bactéries du rumen transforment largement les aliments, dont certains nutriments peuvent être dégradés par le métabolisme microbien et d’autres synthétisés de novo. Cependant, du fait du faible nombre de données engrangées actuellement, il est difficile d’estimer la proportion de phytates dégradés dans le rumen par des modèles mathématiques et/ou des tests in vitro. L’acquisition de mesure de référence est une nécessité. De même, très peu de données ont été produites à ce jour pour connaitre les dégradations et les synthèses des vitamines dans le rumen et d’acides aminés intestinaux. Cette expérimentation sera doublée de tests in vitro pour valider leur pertinence pour estimer la digestion des protéines.

Réduction

Le schéma expérimental utilisé dans ce projet (4X4) fait qu’on peut obtenir une puissance statistique satisfaisante avec un faible nombre d’animaux. Ce type de schéma est possible ici car les traitements qui sont à comparer n'ont pas d’effet induit sur la période suivante (pas d’effet rémanent). En effet, les rations alimentaires ne varieront que par le type de tourteau utilisé, et les teneurs des régimes en protéines restent dans une gamme de variation qui n'induit pas de régulation physiologique interne très marquée. De plus, une autre condition à ce type de schéma est une certaine stabilité du stade physiologique des vaches sur la durée de l’essai, ce qui est le cas ici avec des vaches suivies en milieu de lactation.

Raffinement

La conduite des animaux dans ce projet sera aussi respectueuse que possible du bien-être des animaux. Un suivi régulier du comportement et des paramètres indicateurs de la souffrance des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de perturbations et de traiter si besoin les animaux malades. Les pratiques dans ce projet les plus susceptibles d’entraîner un mal-être chez les animaux seront le fait de les maintenir attachés et la pose de harnais de collecte des urines. Pour limiter les risques de mal-être, voire de stress lié à l’attache, les vaches seront logées dans une même salle pour se sentir et s’entendre, et les périodes d’attaches seront ponctuées de périodes de remises en liberté. La durée des périodes à l’attache est limitée au maximum pour permettre aux animaux d’être complétement habitués au fait d’être attachés avant les mesures. Les périodes en liberté auront aussi pour objectif de permettre de limiter les risques articulaires et de mieux les détecter et les traiter le cas échéant. Pour limiter les risques d’irritation chronique de la peau pendant les collectes d’urine, ces dernières seront les plus courtes possibles si on intègre le fait que l’on a toujours une variabilité journalière du volume et de la composition de l’urine. Des crèmes cicatrisantes/apaisantes seront appliquées dès la fin des collectes, qui seront par ailleurs suffisamment espacées pour permettre des périodes de récupération importante entre les périodes de pause des harnais.

Choix des espèces

La problématique de l’étude est assez spécifique aux vaches laitières, puisqu'elle concerne des apports protéiques sous forme de tourteaux dans les rations hivernales. Les vaches seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches seront en milieu de lactation qui est le stade physiologique le plus courant des vaches laitières en production en fermes.

415 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 165 proposées à l'adoption et le reste tué. Elles reçoivent une à deux injections hebdomadaires de psychotropes, dont le diazépam et la chlorpromazine, puis servent à quatre tests comportementaux réalisés par des étudiants, dans le cadre de travaux pratiques de pharmacologie en BUT. Une partie est ensuite tuée pour fournir des cadavres aux travaux pratiques d'anatomie de première année. Le porteur affirme qu'acquérir des compétences en expérimentation "nécessite" l'animal vivant, et complète ces séances par des vidéos et des exercices in silico.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de répondre à l’une des attentes du Programme National des IUTs en vue de l’obtention du Bachelor Universitaire de Technologie (BUT), Spécialité Génie Biologique, Parcours Biologie Médicale et Biotechnologie de 2ème année. Les étudiants doivent en effet réaliser une Situation d’Apprentissage et d’Evaluation (SAé) au cours du semestre 4 de la 2ème année intitulée « Etudier l’effet de xénobiotiques en Pharmacologie » dans un contexte de développement de médicament lors de l’étude préclinique. Ce projet permettra ainsi aux étudiants d'appréhender de nouveau les méthodes faiblement invasives (maniement, contention, injection, etc. ; cf DAP n°38855) notamment utilisées en pharmacologie mais aussi d’acquérir de nouvelles compétences comme celle portant sur la caractérisation du mode de fonctionnement et des effets d’un xénobiotique sur un organisme vivant. Dans ce contexte, l’utilisation de l’animal semble nécessaire pour répondre à cet objectif. Les étudiants pourront ainsi au moyen de 4 tests comportementaux étudier les effets bénéfiques et/ou délétères de molécules médicamenteuses, à savoir des psychotropes (diazépam et chlorpromazine). Ces TPs seront également complétés i) par des recherches bibliographiques sur les tests comportementaux employés et les molécules testées, ii) par le visionnage de vidéos montrant d'autres tests comportementaux avec des souris ayant également reçu soit du diazepam soit de la chlorpromazine comme par exemple le test de l'escalier et iiI) par des TPs in silico et in vitro en Ressources afin d’étudier les effets bénéfiques et/ou délétères d’autres médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet correspondant à une Situation d’Apprentissages et d’Evaluation (SAé) permettra aux étudiants d'acquérir la compétence " Mener des études à l'échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé" exigées dans le cadre de cette formation. L'acquisition de cette compétence nécessite pour l'étudiant de maitriser un certain nombre d'apprentissages critiques (AC) qui sont, pour cette compétence et pour ce niveau de formation, : i) Mener des études sur les dysfonctionnements cellulaires, tissulaires et physiologiques et ii) Expérimenter dans le cadre d’études pré-cliniques en évaluant l’effet de xénobiotiques en pharmacologie notamment sur l’animal de laboratoire. Le contenu de ce projet comportant 4 expérimentations répond ainsi à ces apprentissages critiques et entre donc dans le processus d'acquisition de cette compétence en complément des autres enseignements théoriques et pratiques telles que les Ressources intitulées « Etude des dysfonctionnements cellulaires et physiopathologiques » et « Pharmacologie ». Pour résumé, au travers des enseignements théoriques et pratiques (entre autres par ce projet), les étudiants auront ainsi une vision d'ensemble sur ce qu'implique l’étude de l’effet d’un xénobiotique en pharmacologie en utilisant l’animal de laboratoire : réglementation en vigueur, éthique, bien-être, gestes de base, dispositif expérimental, points limites, rendre compte des résultats de manière appropriée...

Procédures

Ces animaux seront soumis uniquement à 1 voire 2 injections par semaine de liquide physiologique et/ou de psychotropes (diazépam, chlorpromazine, imipramine) en intrapéritonéale. Seules les souris témoin des 2 premiers TP seront soumises à 2 injections par semaine car elles serviront pour le 3ème groupe de TP permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux.

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux seront confrontés à différentes nuisances : 1) le maniement par des personnes inconnues. Neanmoins, ce point sera amoindri au cours du temps car nous essaierons qu'ils aient les mêmes souris à chaque TP ; 2) l'utilisation dans 4 expérimentations différentes mais cela permet de réduire le nombre d'animaux utilisés ; 3) injections de substances thérapeutiques à dose active (diazepam, chlorpromazine, imipramine) mais ces substances ont une durée de vie courte dans l'organisme donc les effets s'estomptent quelques heures voire quelques jours après l'injection. Pour palier à cela, les souris ne recevront qu'une seule dose par semaine de substances thérapeutiques à dose active.

Devenir

Pour le bien-être animal, l'adoption est à privilégier. Cependant, pour la ressource « Biologie Animale » en BUT 1 parcours BMB, il nous faut des souris mortes pour les TPs d’anatomie. C’est pourquoi 50 des 83 souris seront mises à mort pour ces TPs. Ce nombre a été décidé car nous avons la possibilité d’avoir entre 45 et 50 étudiants en parcours BMB 1ère année. Le reste de souris sera bien évidemment proposé à l’adoption. Il est à noter que lors des adoptions, un sachet de granulés ainsi qu'un peu de litière de leur cage d'origine seront donnés aux adoptants pour l'acclimatation de l'animal dans son nouvel environnement et des recommandations telles que l'introduction progressive de la nouvelle alimentation seront données. Pour finir, les étudiants comme les associations permettant la réhabilitation des animaux de laboratoire, recevront le certificat sanitaire de notre vétérinaire référent et l'autorisation triennale de la DDPP.

Remplacement

Il est difficile d'acquérir des compétences en expérimentation animale sans l'utilisation de l'animal in vivo c'est pourquoi un remplacement total n'est pas possible mais un remplacement partiel l'est. En complément de ces expérimentations in vivo et dans un objectif de remplacement, des vidéos seront mises à disposition des étudiants pour qu'ils puissent en plus des enseignements théoriques et pratiques, préparer au mieux leurs interventions / expérimentations avec les animaux.

Réduction

Le nombre de souris utilisé est réduit au minimum. Chaque année, 83 souris seront utilisées et seront subdivisées 9 cages de 8 souris et 1 cage de 9 souris. D'autre part, nous avons choisi de faire travailler les étudiants par groupe de 3 ou 4 étudiants réduisant ainsi le nombre de groupe d'étudiants à 4 par TP. D'autre part, ces 83 souris serviront à 4 expérimentations. Les résultats des différents groupes de TP seront poolés et exploités lors de TPs de statistique.

Raffinement

Durant tout leur séjour au sein de notre établissement, les souris auront à disposition et sans restriction de la nourriture et de l'eau. Elles seront également visitées tous les jours par la personne habilitée au sein de l'établissement et seront également observées et manipulées par les étudiants pendant les TPs. Selon la corpulence des souris, elles pourront être répartie dans un nombre plus important de cages. Au cours de ces visites, les animaux seront observés pour détecter tout comportement de souffrance, d'anxiété, etc... De plus, notre établissement a acquis des objets d'enrichissement tels que des tubes/ tunnel en PVC qui seront préalablement désinfectés, ruban de carton, etc. De la même façon, les étudiants pourront eux-mêmes apporter des objets d'enrichissement. Comme mentionné lors de la justification du choix du sexe des animaux, nous utiliserons uniquement des femelles car elles sont plus faciles à héberger sur le long terme (risque de conflits dus à un stress éventuel ou une hiérarchie instable moindre comparé aux mâles). Enfin le comportement à adopter face aux animaux sera rappelé aux étudiants i.e être calme, manipuler les animaux (handling) avec douceur et patience de façon à les habituer à être manipulés.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle d'étude pour ce projet pour plusieurs raisons : 1- c'est l'un des modèles les plus utilisés en recherches bio-médicales et pharmacologiques (75%) 2- c'est un modèle (globalement) représentatif de la physiologie humaine (proximité phylogénétique entre les espèces). 3- leur comportement face à la manipulation, aux injections de molécules est bien documenté et des dispositifs expérimentaux sont disponibles pour le mesurer. 4- c'est une espèce facile à maintenir en captivité Les animaux utilisés auront au moins 2 mois. Il s'agira donc d'adultes car ils possèdent, théoriquement à ce stade, toutes les capacités exploratrices, psychiques et locomotrices.