Procédures modérées

250000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie expédiée aux scientifiques qui les ont commandés et le reste tué. Ce projet d'élevage industriel de lignées génétiquement modifiées prévoit identification, jusqu'à quatre biopsies à l'oreille ou à la queue et des prélèvements sanguins par animal, certaines lignées exprimant un phénotype dommageable comme un diabète, une hémophilie ou une immunodéficience. Le porteur indique que les animaux "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. Il présente l'élevage sur mesure de rongeurs "à fournir aux scientifiques" comme un service rendu à la communauté de recherche.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la création, caractérisation et/ou l’élevage de lignée transgéniques à phénotypes dommageables ainsi que la réalisation d'une biopsie par méthode invasive séparément du geste d'identification sur des lignées transgéniques dans le but d'héberger ou de maintenir des lignées de rongeurs génétiquement modifiés pour le compte de la communauté scientifique. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique comme par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées transgéniques, si la présence d’un phénotype dommageable n’a pas été analysée, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre la gestion optimale des possibles expressions cliniques du phénotype dommageable, leur prévention ou leur traitement adéquat. Lorsque le phénotype dommageable est avéré et connu, la gestion de cette lignée sera adaptée à ce dernier par la définition / surveillance des possibles signes cliniques associés à l'expression de ce phénotype ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique hébergée/élevée, il est important de connaitre le génotype des animaux, ainsi, en plus de l’identification, une biopsie avec une méthode invasive sera réalisée. Le but de cette biopsie est donc d’analyser le génotype de chaque animal afin de sélectionner celui d'intérêt. En 2022, sur 505 projets transgéniques au total (225 000 animaux), seulement 95 lignées étaient signalées avec un phénotype dommageable (19%, soit 43 000 animaux). Parmi ces 19%, moins de 1% ont réellement exprimé un phénotype dommageable. Ces phénotypes peuvent être catégorisés en tant qu’immunodéficient ; hémophile ; maladie métabolique ; trouble neurologique ; pathologie musculaire et articulaire ou cancer, mais nous ne pouvons prévoir précisément le nombre de lignées par catégories, cela dépend des sujets de recherche des scientifiques. Pour ce projet, nous comptons 250 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets d’élevage de lignées transgéniques différentes. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes dommageables.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.

Procédures

Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A une identification unique, acte d’une durée maximale de 20 secondes, à maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire en cas d’animal fragile ou d’animal agressif. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

Expression possible d’un phénotype dommageable due à la mutation génétique (immunodépression, arthrite, diabète, hémophilie, …). Chaque effet indésirable est notifié si connu à l’arrivée des animaux ou estimé lors de l’hébergement. Un suivi adapté et des mesures de raffinement spécifiques sur avis vétérinaire sont mis en place en fonction de l’impact observé / attendu chez l’animal. Sur la base du suivi rapproché effectué sur ces souches et des raffinements mis en place, la nuisance sur l’animal est légère à modérée. Stress suite à la contention pour identification Douleur et stress dus aux biopsies (nombre maximum de 4) si besoin d’identifier le génotype d’intérêt. La biopsie à l’oreille est privilégiée (environ 3mm x 3mm ou languette de 5mm de large maximum, plusieurs biopsies peuvent être faite si nécessaire et justification, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone (oreille peu sensible), la nuisance sur l’animal est légère. Les biopsies à la queue sont possibles sur justification scientifique (biopsies de queue de 5mm maximum, une 2eme biopsie peut être réalisée sous justification du scientifique, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone, la nuisance sur l’animal est légère pour les animaux de moins de 3 semaines (queue peu sensible) et modérée pour les animaux de plus de 3 semaines. Douleur et stress dus aux prélèvements de sang (volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur et les bonnes pratiques et raffinements internes). Une anesthésie pourra être appliquée en fonction du lieu du prélèvement. Hébergement isolé la période de récupération post opératoire pour les femelles réimplantées ou en cas d’agressivité au sein du groupe social afin de limiter la douleur et le stress liés à cette agressivité. Mise en place d’enrichissements supplémentaires et adaptés en cas d’hébergement isolé.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).

Remplacement

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).

Raffinement

Les observations par le personnel permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en contactant les techniciens qualifiés, compétents et le vétérinaire. Si un point limite est atteint, le technicien met en place des soins particuliers, un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place et géré par des techniciens qualifiés, compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les règles éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s'assurer de sa récupération immédiate.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont les plus développées, les mieux maitrisées et pour lesquelles les données scientifiques sont nombreuses. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d’études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Lors de la caractérisation des lignées, l’observation détaillée et l’analyse de la présence du phénotype dommageable sont réalisées à la naissance, au sevrage et 8 semaines d'âge. Il est également possible de prolonger sur l'âge adulte si les animaux sont conservés plus longtemps. - Hébergement des lignées à phénotypes dommageables fait à tout âge. -Biopsies réalisées le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une recoupe à l’âge adulte peut être demandé par le client. - Prélèvement de sang dans la plupart des cas fait en submandibulaire après 4 semaines d’âge minimum (adulte).

400 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'érythropoïétine, pour une partie une greffe de cellules de cancer mammaire triple négatif et des injections rétro-orbitaires, ainsi que des prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever un maximum d'organes. L'objet du projet est de comprendre comment l'érythropoïétine, donnée aux patients cancéreux anémiques, altère la réponse immunitaire anti-tumorale. Le porteur affirme qu'aucun système ne reflète la complexité des interactions entre cellules immunitaires et tumorales.

Objectifs

Chez les patients atteints de cancer et traités ou non par chimiothérapie, une anémie peut se développer. Afin de pallier cet effet secondaire, les patients reçoivent de l'érythropoïétine (EPO) améliorant ainsi leur qualité de vie. Cependant, plusieurs méta-analyses récentes ont montré qu’à la suite du traitement à l’EPO, certains patients pouvaient présenter une réduction de survie globale indépendamment du type de cancer ou du protocole de chimiothérapie. Nous savons maintenant qu’en plus de l’augmentation de la production de globules rouges, l’EPO agit sur de nombreuses autres cellules et notamment les cellules immunitaires. L’EPO affecte négativement la réponse immunitaire de souris greffées avec des cellules de carcinome mammaire triple négative, les plus difficiles à traiter et a notamment un effet systémique sur les lymphocytes T qui ont un role central dans la réponse immunitaire anti-cancéreuse. Nous souhaitons maintenant caractériser, dans ce modèle murin, les altérations induites par le traitement à l’EPO sur un autre type de cellules immunitaires importantes dans la réponse anti-tumorale : les cellules Natural Killer.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser l’impact de l’EPO sur les cellules NK. Cela nous permettra de mieux comprendre les effets secondaires indésirables que certains patients atteints de cancer peuvent développer suite au traitement de leur anémie par l’EPO et par la suite donc de traiter seulement les patients qui ne développeront pas ces effets indésirables.

Procédures

pro40 femelles C57BL/6J subiront tous les deux jours une injection sous cutanée pendant 14 jours (moins de 20 secondes) et 1 prélèvement sanguin caudal (J13) (moins d'une minute). 200 femelles C57BL/6J subiront trois fois par semaine (lundi mercredi et vendredi) une injection sous cutanée pendant 14 jours (moins de 20 secondes), une injection intrapéritonéale d'un adjuvant (J13) (moins de 20 secondes) et 1 prélèvement sanguin caudal (J13) (environ 30 secondes). 80 femelles C57BL/6J subiront une injection sous cutanée trois fois par semaine pendant 15 jours (moins de 20 secondes), une injection intrapéritonéale d'un adjuvant (J13) (moins de 20 secondes), 1 prélèvement sanguin caudal (J13) (environ 30 secondes) et une injection rétro-orbitaire de cellules cibles sous anesthésie gazeuse (J14) (environ 3 min). 80 femelles C57BL/6J subiront une injection sous cutanée trois fois par semaine pendant 35 (moins de 20 secondes), une injection de cellules tumorales (J14) (moins de 20 secondes) et deux prélèvements sanguins (J13 et J34) (environ 30 secondes)

Impact sur les animaux

Lors des premières injections, les souris peuvent être légèrement stressées au moment de la contention. Les injections sous cutanées, intrapéritonéales et intradermiques engendrent une douleur légère et de très courte durée. L’injection rétro-orbitaire s’effectuant sur animal anesthésié, la douleur après réveil due à ce geste est légère et de courte durée. La croissance tumorale peut être dans certains cas, gênante mais nous n’avons jamais observé chez ces souris de douleurs importantes. Les prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale induisent une douleur légère et de très courte durée.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever le maximum d'organes pour l'étude des cellules natural Killer qui représentent une population minoritaire.

Remplacement

Notre projet vise à évaluer l’effet de l’Erythropoïétine sur la réponse immunitaire anti-tumorale. A ce jour, il n’existe pas de modèle et de système permettant de refléter la complexité des interactions entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales. L’expérimentation animale s’avère donc nécessaire.

Réduction

Dans notre étude, chaque souris sera utilisée pour analyser un maximum de tissus. Le premier type d'expérimentation qui s’effectue dans un contexte non pathologique, nous permettra dans un premier d’étudier l’effet de l’Erythropoïétine sur le développement des cellules Natural Killer dans la moelle osseuse mais également dans les organes lymphoïdes secondaires (ganglions lymphatiques et rate) et dans le sang. Dans un deuxième temps, nous analyserons l’effet de l’Erythropoïétine sur leurs fonctionalités grâce à des tests in vitro d’activation en présence d’anticorps activateurs ou de cellules cibles. La rate et le sang seront prélevés afin d’obtenir le maximum de cellules Natural Killer qui représentent une population cellulaire minoritaire. Enfin, nous analyserons l’impact de l’Erythropoïétine sur leurs fonctionalités in vivo grâce à des tests de réjection de cellules cibles obtenues à partir de souris non hébergées dans notre animalerie. Lors de la mise à mort des souris, la rate et le sang seront prélevés également afin de mesurer l’activation des cellules Natural Killer dans ce test in vivo. Nous analyserons ensuite dans un contexte tumoral, l'impact de l'Erythropoïétine sur le développement des cellules Natural Killer dans la moelle osseuse, ainsi que les fonctionalités des ces cellules matures dans les organes lymphoïdes secondaires, dans le sang et dans les tumeurs. Ces analyses multiparamétriques nous permettront de réduire le nombre d’animaux employés tout en conservant une validité statistique appropriée. Etant donné que nous travaillons sur des populations cellulaires minoritaires (les cellules NK représentent environ 3% des cellules présentes dans la rate des souris et 5% des globules blancs du sang), et que certaines souris sont réfractaires au traitement à l’EPO ou à la pousse tumorale (environ 20%), ces études nécessitent 20 souris par groupe et par type d'expérimentation. Ce nombre d’animaux a été calculé selon notre expérience acquise en tenant compte de la variabilité interindividuelle et afin d’obtenir des résultats statistiquement représentatifs.

Raffinement

Toutes les souris du projet bénéficient des conditions d’hébergement, conformes à la réglementation et contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. L’expérience acquise sur ce type d’expérience nous a permis d’établir que l’injection d’EPO n’induit pas de phénotype dommageable chez la souris. De plus nous avons mis en place une grille de points limites adaptée afin d’évaluer le bien être de l’animal et de limiter sa souffrance.

Choix des espèces

La souris Mus musculus est l’espèce la plus utilisée en expérimentation pour étudier l’immunité anti-cancéreuse. De nombreuses bases de données sont disponibles dans la littérature et nos propres résultats servent de base expérimentale pour nos protocoles. Les souris adultes que nous utilisons sont âgées de 7 à 12 semaines, âge auquel le système immuntaire est mature.

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement invalidées pour le gène ASB2, elles reçoivent des injections répétées et le développement de tumeurs ou de métastases sous-cutanées pouvant gêner leurs mouvements, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. L'objet du projet est fondamental, comprendre le rôle d'un régulateur des cellules immunitaires NK dans la réponse anti-tumorale. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne convient et met en avant les "faibles coûts" et la "facilité de manipulation" de la souris.

Objectifs

Augmenter le portefeuille des approches thérapeutiques est crucial pour répondre aux besoins cliniques et proposer des traitements personnalisés aux patients atteints de cancer. Les cellules tueuses naturelles (appelées aussi lymphocytes NK) ont de multi-facettes fonctionnelles en contribuant notamment à l’élimination de cellules cancéreuses, ce qui en fait une arme idéale en immunothérapie. Leur avantage est qu’elles sont faciles à isoler, à amplifier ex vivo et à manipuler. Les thérapies actuelles utilisent différentes stratégies pour augmenter l’efficacité de ces cellules basées sur l’utilisation d’anticorps thérapeutiques, de drogues modulant la réponse immunitaire ou encore de la thérapie génique. Il est néanmoins important d’ajuster très finement ces thérapies pour éviter des effets secondaires indésirables. Il apparait donc essentiel de comprendre de façon précise la diversité fonctionnelle des cellules NK pour élaborer des traitements efficaces. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet qui vise à élucider le rôle d’un nouveau régulateur de l’activité anti-tumorale des lymphocytes NK que nous avons identifié et à faire la preuve de concept que moduler l’activité de ce régulateur est bénéfique pour éradiquer certains types de tumeurs. Nos données montrent en effet que ce régulateur est exprimé dans des sous-populations spécifiques de cellules NK en particulier celles jouant un rôle majeur dans la réponse anti-tumorale et régule la migration de ces cellules. Le rôle de ce régulateur des cellules immunitaires NK in vivo en conditions de développement tumoral n’a jamais été étudié. Le projet proposé constitue une étape clé de notre étude du rôle de ce régulateur dans le cancer grâce au modèle d’invalidation de ce gène par recombinaison homologue chez la souris précédemment développé. Enfin, il est important de mentionner que les modèles expérimentaux proposés miment des situations physiologiques, pathologiques ou physiopathologiques de l’Homme.

Bénéfices attendus

Ce projet qui allie des approches in vitro et de l’expérimentation in vivo caractérisera pour la première fois une nouvelle voie contrôlant les fonctions des cellules NK dans le contexte de l’immunité anti-tumorale. Le bénéfice attendu est que cette nouvelle voie régule des processus liés à la motilité cellulaire et réorganisation du cytosquelette d’actine des cellules NK mais aussi liés aux fonctions pro-inflammatoires et anti-tumorales de ces cellules. Le rôle des cellules NK dans l’immunité innée et leur fonction de production de cytokines et cytotoxique indépendante de la présence d’un antigène par rapport aux cellules tumorales en font une des premières lignes de défense de l’organisme contre les cellules tumorales. En utilisant différents modèles de développement tumoraux chez la souris, nous appréhendons que cette nouvelle voie joue un rôle actif et positif dans la réponse anti-tumorale que çà soit dans des modèles métastatiques ou de tumeurs solides en recrutant de façon optimale des cellules NK vers les cellules cibles tumorales. Les avancées remarquables récentes sur la biologie des cellules NK permettent dorénavant de proposer des thérapies innovantes et combinées impliquant des processus spécifiques. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires dans les sous-populations de cellules NK et leurs propriétés fonctionnelles respectives pourrait apporter des clés dans des applications thérapeutiques chez les patients atteints de cancer. En effet, la connaissance générée par nos travaux pourrait être exploitée en santé humaine puisque la voie identifiée peut être ciblée d’un point de vue pharmacologique. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans l’immunothérapie anti-tumorale et en particulier dans des situations de métastases qui constituent une des premières causes de mortalité lié au cancer.

Procédures

Ce projet inclut des injections intraveineuses (durée d’intervention : 5 min/animal), sous-cutanées (durée d’intervention : 10 min/animal) ou intra-péritonéales (durée d’intervention : 1 min/animal). Un premier groupe de souris recevra uniquement une injection en intraveineux (veine caudale) ou une injection sous-cutanée pendant l’anesthésie. Un deuxième groupe de souris recevra une injection intraveineuse (veine caudale) ou une injection sous-cutanée pendant l’anesthésie, suivie de 2 injections intrapéritonéales sur 2 jours consécutifs, suivie d'une injection intraveineuse (sinus rétro-orbital) pendant l’anesthésie soit au total 4 injections par souris sur la totalité du protocole. Enfin, un troisième groupe de souris recevra une injection intrapéritonéale ou une injection intraveineuse (sinus rétro-orbital) pendant l’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les protocoles de développement tumoraux et de métastases mis en place dans ce projet pourraient conduire à une légère perte de poids des animaux ainsi qu'une baisse d’activité. Le développement de tumeurs sous-cutanées pourrait également géner les animaux pour leur toilettage ou leur mouvement ou engendrer des lésions au niveau cutané. Ces effets indésirables ou nuisances ne dépasseront pas 4 jours correspondant à la fin du protocole total entre 10 et 14 jours. Les procédures d’injection en intrapéritonéale n’engendreront pas de nuisances particulières et pour les procédures nécessitant des injections en intraveineux, les animaux seront anesthésiés et surveillés jusqu'à leur réveil.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans les procédures expérimentales seront euthanasiés en fin d'étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

L'étude des mécanismes physiologiques reliés à l'immunité anti-tumorale nécessite des modèles in vivo capables d’intégrer différents processus cellulaires intégrés telles que l'activation et la différenciation et l’activation des cellules immunitaires in vivo, la migration cellulaire et l'infiltration dans le tissu tumoral. Il n'existe pas actuellement de méthodes alternatives à ces études in vivo pour l'obtention de résultats scientifiques exploitables, pertinents pour la pathologie humaine. Le remplacement par substitution n’est actuellement pas envisageable, aucun modèle cellulaire in vitro ne permet de mener les études proposées, puisque ces mécanismes impliquent des micro- et macro-environnements cellulaires, incluant de nombreux types cellulaires notamment dans des modèles de métastases. Cependant, ce projet est basé sur une étude de preuve de concept réalisée in vitro. D’autre part, ce projet utilise un modèle d’invalidation de gène chez la souris. C’est pourquoi ce projet de recherche ne peut se faire qu’en utilisant la souris comme modèle d’étude afin de comprendre les mécanismes d’activation des cellules immunitaires en absence du gène d’intérêt en condition de développement tumoral. Les résultats de ces travaux devraient contribuer à optimiser les traitements chez les patients.

Réduction

Dans les différentes expérimentations et pour réduire la variabilité expérimentale, la détermination sexuelle étant importante, les souris des 2 sexes pourront être utilisés, mais indépendamment. Nous privilégierons des lots de souris issues de mêmes portées avec le fond génétique le plus proche possible en vu de diminuer également la variabilité expérimentale. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux. D’autre part, nous optimiserons l’utilisation de chaque animal et maximiserons le nombre de données à partir d’un seul animal. Nous mettrons également en banque des données utilisables à postériori par d’autres utilisateurs notamment des blocs de tissus, des analyses de large base de données. Analyse statistique : Les niveaux de significativités permettant la comparaison entre les échantillons seront déterminés par un test statistique. Nous utiliserons pour chaque procédure le nombre minimal d’individus permettant la réalisation de ce test statistique, tout en assurant la fiabilité des résultats (reproductibilité et significativité).

Raffinement

Les points limites ont été anticipés mais toute souris ayant atteint le point limite sera euthanasiée. Tout traitement anti-inflammatoire n’est pas compatible avec les études menées (perturbation de la réponse immunitaire et inflammatoire) cependant un traitement visant à réduire ou supprimer la douleur (par exemple, par traitement avec des analgésiques) sera proposé. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Le design expérimental a été établi en vue de limiter au maximum toute douleur ou souffrance de l’animal, notamment le nombre de cellules tumorales injectées, la taille maximale des tumeurs ainsi que la durée des traitements. D’autres part, les conditions d’hébergement permettent l’utilisation de méthodes d’enrichissement adaptées et les animaux seront suivis régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est un modèle adapté à la complexité de la physiologie humaine, elle a de grandes similitudes génétiques avec l’homme. La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines comme le développement tumoral. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. La souris est aussi le modèle de choix pour réaliser l’invalidation de gènes spécifiques afin d’en étudier la fonction. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux comme les anticorps qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. L’ensemble de ces critères font que la souris est le modèle le mieux adapté à notre activité d’expérimentation animale. Des souris de 8-16 semaines seront utilisées pour réaliser les différents traitements proposés dans ces procédures expérimentales correspondant au stade optimal de développement pour étudier la fonction des cellules immunitaires et leurs réponses anti-tumorales.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections d'autoanticorps et, pour une partie, une chirurgie d'implantation d'une canule pour injections répétées, afin de reproduire une neuropathie inflammatoire, puis sont tuées pour prélever les nerfs périphériques. Le porteur indique attendre une faiblesse musculaire et des difficultés à se mouvoir, tout en affirmant l'absence de douleur. Il conclut qu'il n'existe "pas d'autre stratégie" que le modèle animal, trop complexe selon lui pour être reproduit in vitro.

Objectifs

La neuropathie inflammatoire est une maladie rare affectant les nerfs périphériques et pouvant entraîner des paralysies importantes allant jusqu’à une hospitalisation en soins intensifs. Au cours des dernières années, nous avons identifié chez certains patients la présence d'autoanticorps (anticorps ciblant le soi). Ces autoanticorps sont associés à des formes très sévères de la maladie pouvant nécessiter un séjour en unité de réanimation. A l'aide de modèles animaux, nous avons montré au cours des cinq dernières années que certains anticorps sont responsables de la pathologie. Ces modèles ont été très importants et ont permis de motiver l'utilisation de traitement spécifique qui se sont avérés très efficaces chez les patients. Les mécanismes par lesquels ces anticorps entraînent les paralysies n'ont par contre pas encore été identifiés. L'objectif de ce projet sera d’utiliser des modèles murins afin d’élucider comment ces anticorps agissent et trouver des traitements ciblés. Un deuxième objectif de ce projet sera de créer un nouveau modèle plus proche de l’homme qui permettra de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques à l’aide de souris transgéniques. Nous testerons ici l’importance de ce modèle.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes responsables des paralysies chez les patients est indispensable pour permettre la sélection des traitements chez les patients. Aujourd’hui de nombreux médicaments sont disponibles, par contre il est difficile de savoir quel médicament est le plus efficace pour un type de pathologie. Nos travaux auront pour but de montrer comment les autoanticorps agissent et d’identifier les thérapies ciblant ces mécanismes d’action. Ensemble, ces données feront avancer les connaissances sur les maladies rares invalidantes et permettront de faire émerger de nouvelles thérapies.

Procédures

Tous les prélèvements seront réalisés post-mortem. Les animaux recevront trois types différents d'intervention. 1) Une à deux injections intrapéritonéales espacées d'une semaine et qui dureront moins de trente secondes). 2) Une immunisation réalisée grâce à une injection sous-cutanée. La procédure dure 15 minutes et est réalisée une fois sous anesthésie. 3) Une procédure chirurgicale qui consistera à permettre des injections journalières d'anticorps sans douleur. La procédure dure 1 heure et n'est réalisée qu'une seule fois. Elle n'entraîne pas de gênes par la suite.

Impact sur les animaux

Les modèles que nous développerons sont censés mimer une maladie neuromusculaire invalidante. Les patients ne présentent pas de signes de douleur, et les anticorps utilisés n'entraînent pas d'inflammation. Donc nous ne nous attendons pas à voir des signes de douleur chez les animaux. Par contre, les animaux devraient développer une faiblesse musculaire et donc des difficultés à se mouvoir. Pendant cette période, l'environnement sera adapté à l'état de l'animal et les nuisances seront prises en charge. Les animaux seront observés et manipulés tous les jours afin d'éviter un stress ou une détresse des animaux lors des procédures. Pour les procédures 1 et 2, les nuisances seront légères. Les procédures entraîneront une douleur lors de la piqûre et un stress lié à cette procédure, mais de courte durée. Pour la procédure 3, la procédure chirurgicale va entraîner une nuisance modérée pouvant durer deux jours après l'opération. Pendant cette période, les animaux peuvent présenter des gênes qui seront prises en charge avec des anti-douleurs et une adaptation de l'environnement à l'état de l'animal.

Devenir

Les animaux impliqués dans les procédures seront tous euthanasiés à l'issue de chaque procédure car notre étude porte sur les nerfs périphériques.

Remplacement

Malheureusement, il n'existe pas d'autres stratégies permettant de remplacer ce modèle. Il n'existe que des modèles animaux pour cette pathologie soit chez la souris soit chez le rat. Ces modèles de pathologies neuroimmunes sont trop complexes pour pouvoir être recréés in vitro.

Réduction

Nous avons déjà mis en place une étude semblable dans le passé. Notre expertise nous permet d'utiliser le minimum d'animaux possibles. Grâce à nos études précédentes, nous connaissons la taille des effets attendus et nous pouvons estimer la taille minimale de la cohorte d'animaux dont nous aurons besoin. Notre cohorte contient déjà le moins d'animaux possible. Si nous obtenons les résultats désirés avec la procédure 1, nous ne réaliserons pas la procédure 3.

Raffinement

Le bien être des animaux sera suivi de façon journalière afin de nous assurer de leur état réel de bien-être et nous avons établi un score pour évaluer les nuisances. Les animaux seront placés dans un environnement enrichi et seront manipulés tous les jours. Le scoring a pour but de suivre les atteintes locomotrices, mais permettra également l'application des points limites. Si un animal présente une paraparésie des membres inférieurs, il sera euthanasié. La douleur sera prise en charge en per-opératoire et post-opératoireLa douleur sera prise en charge en per-opératoire et post-opératoire. Pour éviter que les procédures entrainent un stress, tous nos animaux seront manipulés à la main plusieurs fois par semaine avant les procédures afin qu'ils soient accoutumés aux manipulations. Les animaux seront élevés dans un environnement calme et propice à l’expression des comportements naturels. Si les animaux ont des difficultés temporaires à se nourrir ou boire, nous introduirons de la nourriture sous forme de gel dans les cages. Pour éviter les problèmes de déshydratation lors des procédures chirurgicales, les animaux recevront une ou des injections sous-cutanées de solution saline.

Choix des espèces

Récemment, une étude de GBS a été établie avec succès par transfert passif d'autoanticorps chez la souris C57B/6. Les souris transgéniques exprimant le récepteur humain FcγRIIA ont également été utilisées avec succès pour étudier les maladies autoimmunes. Nous utilisons des animaux adultes uniquement (de 2 à 4 mois) pour trois raisons : 1) La neuropathie inflammatoire est plus difficile à déclencher chez des animaux trop âgés (>6 mois) et trop variables chez des animaux trop jeunes. On préfère donc de jeunes adultes de 2 à 4 mois. 2) Nous nous intéressons à des atteintes des nerfs, il nous faut donc des animaux chez lesquels les nerfs sont bien développés (plus de 2 mois). 3) Pour l’implantation des canules d'injection, il faut des animaux de plus de 2 mois, car les implantations peuvent générer des traumatismes chez des animaux trop jeunes.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendus dyslipidémiques par un régime gras et sucré, ils subissent des tests de tolérance au glucose, des gavages et, pour une partie, une course sur tapis roulant où une stimulation électrique les oblige à courir, avant d'être tués par exsanguination sous anesthésie. L'objet du projet est d'évaluer des compléments alimentaires à base de micro-algues destinés à la nutrition humaine et à une "valorisation" commerciale. Le porteur affirme que le modèle rat est "nécessaire", notamment pour disposer d'assez de sang et de tissus.

Objectifs

La sédentarité augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires en association avec des troubles du métabolisme pouvant induire des dyslipidémies voire un diabète. Plusieurs mécanismes cellulaires sont impliqués dans l’installation de ces troubles. Parmi ceux-ci, peuvent être cités, les mécanismes de l’inflammation, le stress oxydant, les troubles hormonaux ou une dérégulation du métabolisme des lipides ou des glucides. De nombreuses études nutritionnelles ont déjà montré l’intérêt d’utiliser des compléments alimentaires contenant des molécules à activité biologique pour prévenir l’installation de ces troubles. Parmi ces compléments alimentaires, des sources animales et végétales d’origine marine, riches en oméga-3, caroténoïdes et phytostérols, sont bien connues pour avoir des effets préventifs sur les risques cardiovasculaires, les dyslipidémies et les troubles du métabolisme des glucides. L’objectif de cette thèse est d’évaluer les effets bénéfiques d’une activité physique modérée, combinée avec la prise de compléments alimentaires d’origine marine sur la prévention de l’installation d’une dyslipidémie.

Bénéfices attendus

Amélioration des paramètres physiologiques et biochimiques associés à une dyslipidémie d'origine nutritionnelle. Effets combinés d'une activité physique d'endurance et de compléments alimentaires. Au-delà du modèle animal, cette étude a pour objectif de valoriser certains compléments alimentaires en nutrition humaine, afin de limiter l'installation d'un syndrome métabolique voire d'une obésité chez des sujets prédisposés à ces pathologies. De façon plus précise, les bénéfices sont les suivants: - observer les potentiels effets des compléments alimentaires sur l’amélioration de la performance physique et sur les adaptations du tissu musculaire. - observer les potentiels effets des compléments alimentaires pour limiter le développement d’une obésité issue d’un régime riche en gras et sucre. - observer les effets des compléments alimentaires couplés à de l’exercice physique pour prévenir l’obésité.

Procédures

Les animaux suivront les différentes procédures comme détaillées et seront manipulés par un personel qualifié, ce qui ne va pas induire de nuisance particulière. En ce qui concerne les différentes interventions sur animaux vigiles, celles-ci sont détaillées ci-après: Pour les rats sédentaires, deux tests sur la résistance à l'insuline (durée de 2 heures) et la réponse à un test d'hyperglycémie orale (durée de 2 heures) permettront d'obtenir des informations sur les mécanismes de régulation de l'utilisation du glucose et donc de la régulation de la glycémie - Un autre test va permettre de suivre la synthèse des protéines, ce marqueur étant d'importance puisqu'il s'agit d'un marqueur étrotiement lié à l'exercie physique (durée 20 minutes). Enfin, l'anesthésie générale est nécessaire afin de pouvoir prélever totalement le sang (environ 10 minutes) pour analyser différents paramètres biochimiques. Une fois l'animal mort, différents organes sont aussi prélevés pour analyses biochimiques et moléculaires. Pour les rats « coureurs », les interventions sont identiques à celles précisées ci-dessus avec en plus, un entrainement de course sur tapis roulant (30 à 90 minutes), afin d'évaluer les capacités physiques des animaux soumis à différents régimes alimentaires contenant des molécules susceptibles d'être efficaces sur les paramètres biochimiques mesurés.

Impact sur les animaux

Cette étude se base sur des expériences antérieures acquises dans notre laboratoire, au cours desquelles, il n'a pas été observé de nuisances ou d'effets indésirables. En effet : 1) le passage d'un régime équilibré à un régime hyperlipidique n'induit pas de modifications comportementales (alimentation, activité, interactions, développement) ou de phénomènes de stress ou d'anxiété 2) en ce qui concerne les animaux devant courir sur un tapis roulant, une semaine d'acclimatation est prévue afin de limiter tout phénomène de stress lié à l'équipement qui sera utilisé et afin de déterminer les animaux coureurs. De plus, des points limites établis et les observations faites durant les protocoles de course permettent d'éviter l'installation d'un stress. En effet, ces points limites adaptés seront établis sur la base des observations faites précédemment dans notre laboratoire. Au cours du protocole d’entrainement (30 à 90 minutes), afin d’obliger les animaux à courir, une stimulation de courte durée peut être appliquée. L'intensité de la stimulation électrique sera adaptée au poids des rats. De plus, il est possible de réduire l’intensité du choc électrique pendant la course individuellement pour chaque rat.

Devenir

Six procédures sont utilisées dans ce projet. Cinq procédures où les animaux sont réintroduits dans les lots expérimentaux avec leurs congénères. En effet, cinq procédures ne nécessitent pas d'anesthésie locale ou générale, ni de chirurgie, ni de geste invasif, ce qui permet de maintenir en vie les animaux,chaque animal étant utilisé dans ces 5 procédures. A l'issue des ces 5 procédures, les animaux sont tous mis à mort: cela est fait sous anesthésie générale de l'animal qui précède son exsanguination. Cette procédure de mise à mort par exsanguination est nécessaire pour le prélèvement de différents tissus: sang, muscles squelettiques, foie, coeur.

Remplacement

La thématique porte sur le suivi et la régulation de paramètres biochimiques et physiologiques du métabolisme musculaire et hépatique au cours de l'exercice physique, ce qui requiert l'utilisation du modèle animal. Etant donné que les analyses portent sur le dosage de plusieurs paramètres plasmatiques, musculaires et hépatiques, le modèle rat est nécessaire afin d'avoir suffisamment de volume de sang et de quantités de tissus. Il ne nous est donc pas possible de remplacer le modèle animal par une méthode alternative in vitro. Le modèle rat est nécessaire par rapport aux objectifs (nutrition humaine et modèle rat proche du modèle humain) et par rapport aux analyses à effectuer (non remplaçable par le modèle souris). De plus, le projet nécessite des séances d'entrainement de course, ce qui oblige l'utilisation d'un modèle animal.

Réduction

Un nombre de 8 animaux par lot testé est un nombre minimum afin de pouvoir valider les résultats par le traitement statistique utilisé. Cette analyse nécessite un nombre minimum de 8 animaux pour avoir un lot homogène expérimental lors d’une étude nutritionnelle. Ce nombre d’animaux permettra de déterminer des moyennes associées à des écarts types.

Raffinement

En ce qui concerne le protocole d'entrainement: les rats seront mis en adaptation sur un tapis roulant équipé de cinq pistes de courses, pendant une semaine. Afin d'obliger les rats à courir, chaque piste de course est munie d'une grille au niveau de laquelle une stimulation de faible intensité électrique peut être administrée. Afin de limiter tout phénomène de stress ou d'angoisse, une grille d'évaluation de la réponse du rat vis-à-vis de cet apprentissage est mise en place. Un suivi de la prise alimentaire est effectué chaque jour et le suivi de la prise de poids est effectué régulièrement. Celai permettra d'avoir un suivi de l'état sanitaire régulier des animaux. Il nous sera possible d’observer le comportement et l’intégrité physique. En cas de problème observé (non prise de poids ou comportement non adapté (agressivité, posture recluse, poil hérissé, absence de réponse à des stimuli) l'animal présentant un de ces signes sera isolé des congénères et sera suivi de façon plus attentive. En cas d'une non reprise d'activité normale, le rat sera exclu du protocole. Les animaux seront hébergés dans une animalerie contrôlée. Quatre animaux sont placés par cage adaptée à leur poids, avec changement de litière régulier. Le milieu sera enrichi en objets permettant aux animaux de créer un environnement propice à leur développement et à leur épanouissement. La nourriture étant changée tous les jours, il n’y aura pas de risque d’avoir une altération de la qualité des régimes mis à disposition. Les injections lors des tests de tolérance à l'insuline et de synthèse protéique sont effectuées en intrapéritonéal, avec une aiguille adaptée au poids et à la taille de l'animal et par du personnel compétent. Le gavage pour le test d'hyperglycémie provoquée oralement est effectué avec une sonde adaptée à la taille et au poids des rats et effectués par du personnel habilité. Durant les temps d'attente précédant les prélèvements, les rats sont remis avec leur congénères. Les rats sont anesthésiés par voie intrapéritonéale, avant exsanguination. La totalité du sang est prélevée par ponction aortique abdominale. Il s'agit d'une procédure classe "sans réveil" avec l'utilisation d'un anesthésique adapté au modèle animal utilisé, ce qui ne génère aucun stress ou aucune douleur.

Choix des espèces

La thématique porte sur le suivi et la régulation de paramètres biochimiques et physiologiques du métabolisme musculaire et hépatique au cours de l'exercice physique, ce qui requiert l'utilisation du modèle animal. Etant donné que les analyses portent sur le dosage de plusieurs paramètres plasmatiques, musculaires et hépatiques, le modèle rat est nécessaire afin d'avoir suffisamment de volume de sang et de quantités de tissus. Il ne nous est donc pas possible de remplacer le modèle animal par une méthode alternative in vitro. Le modèle rat est nécessaire par rapport aux objectifs (nutrition humaine et modèle rat proche du modèle humain) et par rapport aux analyses à effectuer (non remplaçable par le modèle souris). De plus, les rats ont un métabolisme et une structure musculaire proche de l’humain et sont couramment utilisés dans des études pré-cliniques pour tester l’efficacité de compléments alimentaires. Les rats utilisés sont des rats jeunes en cours de développement. L'objectif de l'étude étant de tester l'efficacité de compléments alimentaires lors de l'exercice physique chez le jeune jusqu'à l'âge adulte, et le protocole d'entrainement durant 8 semaines, à terme, les animaux seront toujours à l'âge adulte, sans que le facteur vieillissement vienne interférer dans l'expérience.