Procédures modérées

1010 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime gras induisant obésité et diabète, elles subissent des injections quotidiennes, des séances de natation forcée deux fois par jour, des tests métaboliques et des échographies, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur reconnaît une perte de poids et une fatigue liées à l'exercice, et un risque de rupture de l'estomac ou de l'œsophage lors du gavage. Il indique remplacer certaines cellules primaires par des lignées in vitro mais juge l'analyse d'un cœur "entier" impossible à reproduire ainsi, les retombées thérapeutiques restant au conditionnel.

Objectifs

Dans un premier temps, il s’agit d’effectuer une analyse in vivo et histologique de modèles murins pour les tissus d’intérêt comme le cœur, le rein, le foie et le tissu adipeux dont le but est de : 1) comparer la reproductibilité des données en utilisant un protocole unique et standardisé sur les modéles murins de diabète de type 2 induit par un régime riche en graisses, 2) mettre en place une bio-banque d’échantillons de sang et de tissus pour réaliser des analyses multi-translationnelles, 3) étudier le rôle des macrophages résidents du coeur dans un contexte d’obésité. Le deuxième objectif du projet est de définir des nouvelles stratégies thérapeutiques prévenant le développement de cardiomyopathie dont la formation est liée aux altérations induites par des troubles métaboliques (l’obésité et le diabète) et le vieillissement accéléré du cœur dans ce contexte d’obésité (inflammation, dommages faits à l’ADN, dysfonction mitochondriale). Etape 1) Evaluer l’effet de molécules à fin thérapeutique modulant spécifiquement l’action de molécules impliquées dans le métabolisme sur la fonction cardiaque. Etape 2) Valider et optimiser la molécule cible sur les troubles métabolliques. Etape 3) Définir les mécanismes d’action spécifiques de la molécule thérapeutique sur l’amélioration de la fonction cardiaque et sur la résolution de l’inflammation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester la reproductibilité des données en comparant dans différents laboratoires en Europe l’impact d’un régime riche en graisses chez des souris mâles et femelles de type C57BL/6 sur la structure et la fonction cardiaque ainsi que l’évaluation métabolique et l’impact sur d’autres organes comme le foie, le rein ou le tissu adipeux. L’identification du rôle des macrophages dans le vieillissement cardiaque permettra d’identifier de nouvelles voies pathophysiologiques et donc d’envisager de nouvelles thérapies. Enfin, nous attendons une action géroprotrectrice et plus généralement une protection renforcée des tissus avec une haute tolérance du produit chez les animaux traités. De plus, de façon plus spécifique, nous attendons une amélioration des fonctions cardiaques avec une action anti-fibrotique ainsi qu’une amélioration des dommages faits à l’ADN. Ces données pourraient permettre de repositionner certaines molécules dans le traitement des cardiomyopathies métaboliques, pourvoyeuses d’insuffisance cardiaque en pathologie humaine.

Procédures

Echocardiographie : Geste non-invasif d'une durée de 3-4 minutes, permettant d’évaluer les fonctions cardiaques, réalisé au début, au milieu et à la fin de l'expérimentation sur animaux vigiles. Grip test : Test de préhension soutenue non-invasif qui permet d’évaluer la force musculaire, réalisé sur animaux vigiles pour l’ensemble des animaux en début, milieu et fin d'expérimentation. Glycémie : Mesure du taux de glucose sanguin de tous les animaux. Sur animaux vigiles, on prélève une goute de sang à la queue. Injections : Sur animaux vigiles, on effectue une injection quoitidienne en i.p. ou en sous-cutané (selon l’efficacité de distribution du produit) en utilisant de fines aiguilles afin de limiter la souffrance chez l’animal. Exercice physique : Séances biquotidiennes de natation en cuve d’eau chauffée à 33°C ± 2°C espacées de 6h et augmentant progressivement de 5 à 40 min pendant une période de 6 semaines. Insuline-tolérance test (ITT) et glucose-tolérance test (GTT) : Tests métabolliques permettant d’évaluer la résistance à l’insuline et la tolérance au glucose. Sur animaux vigiles mient à jeun pendant 6h, injection en i.p. (vol max 200µl, calculé en fonction du poids de l’animal) soit d’insuline (ITT), soit de glucose (GTT) et de suivre la glycémie à T=0, T=15min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min. La moitié des animaux seront soumis à un test GTT et l’autre moitié au test ITT en début et fin de régime. Gavage : Technique non utilisée sur les animaux âgés (8 et 24 mois) et uniquement dans le contexte d’un produit ne pouvant être administré en eau de boisson. Sur animaux vigiles, on effectue un gavage quoitidien pendant 30 jours à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une sonde de gavage adaptée sans induire de souffrance ou détresse chez les souris.

Impact sur les animaux

Un effet de stress est attendu lors de la réalisation de l’échocardiographie ou du test de tolérance au glucose. L’animal sera alors sous haute surveillance jusuqu’au rétablissement d’une glycémie normale, c’est-à-dire à partir de 80 mg/dL. La pratique de l’exercice physique peut entraîner une perte de poids et une fatigue chez l’animal qui est directement lié à la pratique régulière d’une activité physique. À la suite de ces observations, les temps de pratique de l’exercice physique seront ré-évalués chez les animaux concernés. Le régime enrichi en graisse entraîne une prise de poids et peut conduire à des troubles métabloliques. Les injections quotidiennes peuvent entraîner l’apparition d’un hématome. Nous limiterons l’utilisation de la méthode de gavage pouvant entraîner un stress chez les animaux, surtout âgés et afin de limiter les désagréments chez l’animal et le dépôt de la substance dans le poumon ou la rupture de l'estomac ou de l'œsophage.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Nous remplaçons les cellules primaires par des lignées cellulaires dans nos tests "in vitro": soit en utilisant les lignées cellulaires H9C2 de cardiomyocytes, les lignées 3T3L1 d'adipocytes pour les co-cultures, soit des lignées cellulaires de macrophages murins (raw264) comme cible de l’action sénolytique des molécules thérapeutiques

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à notre étude a été calculé pour nous assurer de l’obtention de résultats concluants afin de répondre aux questions posées en tenant compte des expériences antérieures du laboratoire sur le stress métabolique induit par le régime riche en graisse ayant été étudié préalablement sur ce fond génétique: il faut entre 10 à 15 animaux par lot pour obtenir une réponse statistique fiable des expériences puisque nous n'obtenons pas de réponse équivalente chez tous les animaux en expérimentation. De même, le nombre de souris a été optimisé pour chacune de nos procédures expérimentales tout en assurant une reproductibilité et une robustesse dans nos expérimentations, mettant à profit nos connaissances sur les tranches d’âge auxquelles nous devons réaliser nos expérimentations afin d’être le plus pertinent possible dans l’établissement de nos procédures. Enfin, afin d’utiliser au mieux les animaux, nous regarderons simultanément différents tissus d’intérêt dans un même animal (réduction importante du nombre d’animaux prévus).

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance au régime riche en graisse (par exemple perte de poids non désirée, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en carton et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures. entraîner une hypoglycémie sévère qui pourra être détectée par mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre et qui sera immédiatement prise en charge par l’administration d’une dose de glucose. La surveillance hebdomadaire de la prise de poids puis un contrôle de la glycosurie en cas de prise de poids trop importante assurera le suivi nécessaire au bien être animale pendant le régime riche en graisse. Pour éviter l’apparition d’un hématome, les injections seront pratiquées en changeant de côté régulièrement pour laisser du temps à la résorption d’un éventuel hématome. Enfin, l’administration orale du produit se fera autant que possible dans l’eau de boisson.

Choix des espèces

La cardiomyopathie est bien caractérisée chez les mammifères avec des méthodes d’analyse facilement accessibles et reproductibles. Le développement d’une cardiomyopathie métabolique liée à l’obésité induite par un régime riche en graisses est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. Par ailleurs, l’évaluation de l’action combinée de l’obésité et de l’âge sur les mécanismes conduisant au développement d’événements cardiovasculaires nécessite l’analyse de la fonction cardiaque (organe entier) dont la complexité est impossible à reproduire in vitro. Le modèle expérimental choisi est donc la souris. Ce modèle murin présente l’avantage de développer un vieillissement relativement rapide et d’offrir des conditions très reproductibles de développement d’une cardiomyopathie métabolique. Enfin, la souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme sur les paramètres liés au métabolisme du glucose et la surcharge pondérale. L’étude se fera sur des souris à un stade de jeune adulte (5 mois) et à deux stades âgés (12, 18 mois) et à un stade très âgé (24 mois). Pour l’étude portant sur le vieillissement cardiaque, nous utiliserons des animaux mâles âgés de 12, 18 et 24 mois. Pour l’étude de l’obésité conjugué au viellissement, nous utiliserons des souris jeunes adultes de 5 mois dont le fonctionnement du système cardiovasculaire commence à subir les effets du vieillissement et de 12 mois d’âge dont leur système cardiovasculaire est altéré spontanément par le vieillissement.

20 béliers vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis vermifugés et replacés via une association. Ils sont infestés à répétition par un ver parasite hématophage sur 21 mois, avec jusqu'à 129 prélèvements de fèces par animal, pour produire des larves infestantes destinées à des centres de sélection ovine. Le porteur indique que l'infestation provoque une anémie faible, "généralement bien tolérée". Il présente le recours au petit ruminant comme "nécessaire", aucune production de ces larves n'étant possible in vitro, la finalité étant de réduire à terme l'usage d'antiparasitaires en élevage.

Objectifs

Dans les élevages ovins, les parasites du tube digestif, dont notamment les strongles gastro-intestinaux (SGI) peuvent être responsables de troubles sanitaires et de pertes économiques majeures. La lutte contre ces parasites a longtemps reposé quasi-exclusivement sur l'administration régulière de molécules chimiques à activité antiparasitaire aux animaux, mais le développement de résistance à ces produits parmi les populations de vers, les problématiques écologiques liées à leur utilisation et la demande sociétale croissante de réduction des intrants chimiques dans les élevages ont conduit les acteurs de la filière ovine à chercher des moyens de lutte alternatifs. La recherche et la mise en évidence d'un déterminisme génétique de résistance ou de sensibilité aux SGI chez les ovins s'est inscrit dans cette démarche, avec, pour finalité, la sélection d'animaux naturellement moins sensibles au parasitisme. Dans ce contexte, l’objectif du projet est de fournir aux organismes de sélection de la filière ovine, les quantités de larves infestantes d'un espèce de SGI nécessaires à la réalisation d’infestations de béliers reproducteurs afin d’estimer, chez ces individus, l'héritabilité du caractère de résistance, en première et en seconde infestation. La qualification de résistant ou de sensible, attribuée à des ovins, ne s’entend que s’ils ont été soumis à la même pression parasitaire, ce qui n’est pas possible dans les conditions naturelles d’infestation où le nombre de larves infestantes sur les pâtures dépend de facteurs climatiques et est réparti de façon hétérogène, d’où la nécessité de recourir à des infestations contrôlées dans lesquelles le nombre de larves administrées et la durée de l’infestation sont rigoureusement identiques pour tous les individus testés.

Bénéfices attendus

Les béliers infestés vont permettre de fournir durablement des larves infestantes d'Haemonchus contortus aux centres ovins engagés dans la sélection d’animaux résistants aux SGI. A long terme, cette démarche doit permettre de diminuer significativement l’utilisation d’antiparasitaires dans les élevages ovins, par diffusion du caractère de résistance aux SGI via des béliers sélectionnés, et donc de réduire leurs effets négatifs sur l'environnement.

Procédures

Interventions sur animaux vigiles : 1/ drogages par voie orale : au maximum 4 par bélier, correspondant à la vermifugation initiale, avant la première infestation puis les vermifugations à chaque fin de cycle d'infestation (3 au maximum), 3 minutes par intervention 2/ prélèvements de fèces dans le rectum : 1 avant chaque cycle (coproscopie de contrôle d'efficacité de la vermifugation) + 42 par bélier et par cycle d'infestation, soit au maximum 129 par bélier sur 21 mois (3 cycles) ; 3 minutes par prélèvement

Impact sur les animaux

Haemonchus contortus étant un parasite hématophage (qui se nourrit de sang), la dose infestante administrée va induire une anémie faible chez les béliers. Celle-ci est généralement bien tolérée par les animaux ; leur état général ne devrait donc pas être affecté.

Devenir

L'infestation expérimentale contrôlée ne devrait pas altérer la santé des animaux. Après vermifugation en fin de procédure, rien ne s'oppose donc à leur replacement par l'intermédiaire d'une association spécialisée (GRAAL).

Remplacement

Dans le cycle biologique d'Haemonchus contortus, l'hôte définitif, au sein duquel la reproduction sexuée du parasite a lieu, est un petit ruminant (ovin ou caprin). Le recours à une espèce de petits ruminants est nécessaire pour obtenir des larves infestantes d'Haemonchus contortus car il est actuellement impossible d'en produire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Le nombre de béliers prévus (n=20) est le minimum nécessaire estimé pour permettre la production d'une quantité suffisante de larves d'Haemonchus contortus pour mener à bien les études sur le déterminisme génétique de la résistance aux strongles gastro-intestinaux, tout en restant à des niveaux d'infestation générant peu de troubles sanitaires chez les animaux et en se réservant la possibilité d'exclure temporairement, si nécessaire, un ou deux individus, sans mettre en péril le projet. Dans le détail, les besoins des organismes de sélection de la filière ovine sont de 20 millions de larves/an. Il est difficile d’avoir une estimation précise, a priori, de la production individuelle de larves car deux facteurs non maitrisables influent sur la production d’œufs par les nématodes présents dans la caillette : le taux d’implantation et l’intensité de la réponse immune de l’hôte. Malgré cette variabilité, d’après l’expérience passée que nous avons de ce modèle et en tenant compte du rendement du processus de coproculture (récupération de seulement 50 % des larves), une production attendue de 1 million de larves/animal/an nous semble réaliste.

Raffinement

Les béliers bénéficieront d'une période d'acclimatation de 4 semaines avant d'être infestés expérimentalement. Ils seront hébergés en groupe, sur litière paillée, dans des enclos équipés de brosses sur lesquelles ils pourront se frotter et de filets à foin. La contention et les prélèvements seront effectués par du personnel expérimenté. Au cours des prélèvements, les animaux garderont un contact visuel avec leurs congénères, ce qui limitera le stress.

Choix des espèces

Les ovins sont des hôtes définitifs naturels d'Haemonchus contortus. Les animaux utilisés seront âgés d'au moins 7 mois. Il s'agit de l'âge à partir duquel ils peuvent supporter une infestation expérimentale avec 10000 larves infestantes d'Haemonchus contortus sans que cela ait un impact sur leur développement staturo-pondéral.

5 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés ou rendus à l'élevage plutôt que tués. Chaque animal subit deux chirurgies crâniennes avec pose d'un plot de tête et une craniotomie de 18 mm, puis des mois d'entraînement à des tâches d'attention et des enregistrements par électrodes enfoncées dans le cerveau. Le porteur reconnaît un risque d'infection des chambres d'enregistrement et des lésions cérébrales possibles à chaque session, qu'il juge rares. Il revendique une recherche fondamentale sur l'attention, transposable à l'humain "par extension", et présente le macaque comme le modèle le plus proche, la mise à mort n'étant qu'un dernier recours.

Objectifs

La fonction attentionnelle est une fonction cognitive essentielle à l’implémentation de la plupart des autres fonctions cognitive. Elle améliore ainsi les fonctions d’apprentissage, de mémorisation, de planification, de raisonnement etc. Lorsqu’elle fait défaut, suite à un accident cérébral, une maladie neurodégénérative ou encore des troubles neurodéveloppementaux, les personnes se retrouvent en difficultés cognitives dans leur vie quotidienne et leurs apprentissages. Notre objectif est d’identifier les processus neuronaux et métaboliques qui sous-tendent cette fonction à la fois localement (c’est-à-dire comprendre comment chaque neurone et les neurones d’une même région cérébrale fonctionnent ensemble lorsqu’on utilise notre attention), et dans le réseau cérébral attentionnel (c’est-à-dire entre les différentes aires cérébrales qui sont activées lorsqu’on utilise notre attention). Nous analyserons ces réponses neuronales locales et distantes pendant l’exécution de tâches comportementales impliquant l’attention, en situation normale, ou lors de l’utilisation de molécules stimulant le système noradrénergique et ainsi l’attention, ou encore, en utilisant des approches visant à modifier l’activité corticale par le sujet lui-même et lui permettant d’apprendre à optimiser le fonctionnement de ces régions cérébrales. Le projet combine analyse du comportement, et injections pharmacologiques systémiques et intracérébrales, enregistrements électrophysiologiques, et enregistrements métaboliques. Nous ciblerons spécifiquement le cortex pariétal et le cortex préfrontal, deux régions impliquées dans la fonction attentionnelle. Il sera réalisé chez le primate non humain, le seul modèle animal doté d’un système visuel et attentionnel comparable à celui de l’Homme et capable d’effectuer des tâches aussi complexes que celles réalisées par l’Homme. Ce projet nous permettra d’atteindre une meilleure compréhension de la façon dont le cerveau met en œuvre la fonction attentionnelle, et de proposer des pistes thérapeutiques pharmacologiques ou interventionnelles (invasives ou non-invasive) pour sa réparation ou son amélioration.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et la fonction attentionnelle du primate non-humain, et de l’homme par extension. Grâce à ce projet, nous pourrons comprendre comment l’activité neuronale et métabolique du cortex pariétal et du cortex préfrontal organise la fonction attentionnelle et quel rôle la neuromodulation noradrénergique joue dans ce contexte. Nous serons également en mesure de caractériser les bénéfices des approches visant à modifier l’activité corticale par le sujet lui-même (neurofeedback) sur la dynamique cérébrale ainsi que sur la performance comportementale. Ces questions relèvent clairement du domaine des neurosciences fondamentales, et notre principale ambition est de mieux comprendre comment le cerveau met en œuvre la fonction attentionnelle chez l'homme et les primates non humains. Cependant, nous pensons que les réponses que nous apporterons pourront alimenter les neurosciences cliniques.

Procédures

Habituation à la sortie de cage (3 mois) ; 2 Chirurgie sous anesthésie générale (3h/ Chirurgie); Habituation aux tâche comportementales (6 mois); Enregistrements électrophysiologiques et métaboliques (3 mois); 2 Anesthésies générales pour examens d’imagerie anatomique (3h/ examen). La procédure dans son ensemble est considérée comme modérée.

Impact sur les animaux

La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en céramique et en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. Les chambres d’enregistrement pariétale et préfrontales donneront sur une craniotomie (circulaire 18mm de diamètre) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode (d’enregistrement neuronal ou métabolique) au moment des sessions d’expérimentation. La présence de ces chambres d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les différentes phases du projet soit délétère pour la santé de l’animal. Toutes les étapes du projet étant classées en procédure légère, à l’exception des interventions chirurgicales classées en modérée, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives. Les animaux ayant un plot implanté seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant les mêmes approches expérimentales. De ce fait, nous ne prévoyons de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole que sur les animaux pour lesquels une sortie de protocole sera décidée. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques. Les animaux sortis de protocole seront candidats à un replacement dans un sanctuaire. En dernier recours, si aucune solution alternative n’est possible, les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude de recherche fondamentale, utilisant des approches d’électrophysiologie et de pharmacologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Aucun autre modèle animal ne présente ces caractéristiques. Par ailleurs, cette approche d’électrophysiologie telle que décrite dans le projet ne peut être à ce jour réalisée chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations. Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 5 animaux dans le protocole (4 en réutilisation et 1 en nouvelle inclusion). Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques comportementales avec des méthodes d’électrophysiologie chez le primate non-humain, étant données les conditions expérimentales envisagées, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=1). Tous les protocoles seront lancés sur les mêmes animaux ce qui nous permettra de comparer différentes acquisitions sur les mêmes sujets et ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les animaux en réutilisation, pour cette étude, sont déjà entrainés aux tâches comportementales et hébergé dans le laboratoire. Deux sont déjà implantés des chambres d’enregistrements. Cette réutilisation est d’autant plus importante que ces animaux doivent être entraînés sur une longue durée de temps, avec renforcement positif, pour arriver à un comportement stable, avant de pouvoir passer à la phase de collecte de données.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bienêtre des animaux. L’expérimentation implique l’utilisation simultanées de plusieurs types d’enregistrements (neuronaux, métaboliques) avec ou sans manipulation pharamacologique, permettant ainsi de maximiser la qualité et la diversité des données recueillis permettant ainsi le recueil de données de haute valeur scientifique, habituellement recueillis dans le cadre de plusieurs protocoles indépendants. L’implantation du plot, réalisée chirurgicalement sera réalisée avec les meilleures techniques d’asepsie possible, par un neurochirurgien, afin de réduire le risque d’infection ou de désimplantation. Les animaux ne seront implantés avec les chambres d’enregistrement qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes/sondes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiquerons comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques et métaboliques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire. De plus, la mise en place de points limites précoces nous permettra un suivi régulier du stress des animaux.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Cette étude s’intéresse à des mécanismes neurobiologiques chez le macaque pour des raisons de connaissance fondamentale. - Phylogénétiquement, ce modèle animal est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle la rendant notamment plus « facilement » comparable pour des études cognitives -Toutes informations physiologiques ou physiopathologiques obtenues chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les quatre animaux réutilisés sont des animaux matures. Les animaux reçus de nos fournisseurs sont de jeunes adultes (3.5-4 ans). Ils arrivent généralement déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. L’étude portant sur des sujets adultes, les variations de maturation ou de vieillissement au sein de cette tranche d’âge restes minimes et ne devrait pas engendrer de variations significatives des réponses neuronales dans les taches étudiées

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour être dépourvues du récepteur plaquettaire G6b-B, elles reçoivent cinq injections d'un stimulant plaquettaire, jusqu'à quatre prises de sang sous anesthésie et un prélèvement terminal, la moitié subissant en plus une section de la queue pour mesurer le temps de saignement. Le porteur affirme que le traitement n'entraîne aucun effet négatif et attribue la gravité modérée au seul cumul des gestes. Il conclut que ces mécanismes doivent être étudiés dans un "organisme entier" et que la souris est la seule espèce porteuse de cette mutation.

Objectifs

La thrombocytopénie est un trouble plaquettaire fréquent dont les causes et les conséquences sont variées. Les souris dépourvues du récepteur plaquettaire G6b-B (G6B KO) naissent avec un défaut des mégacaryocytes (MK), cellules formant les plaquettes, et des plaquettes elles-même. Ces souris présentent entre autres une macrothrombocytopénie sévère (diminution du nombre de plaquettes circulantes avec augmentation de leur taille). Les mêmes caractéristiques ont été récemment signalés chez des patients présentant les mêmes mutations dans le gène codant pour le récepteur G6b-B. Pour mieux comprendre la cause et le traitement de cette pathologie, nous avons utilisé des approches génétiques et pharmacologiques pour rétablir le nombre et la fonction des plaquettes chez les souris G6b KO. Notre intérêt s’est porté sur le traitement par le romiplostim, agent stimulant la production de plaquettes sanguines, qui a permis de remédier à la thrombocytopénie. Ceci laisse penser qu'il pourrait s'agir d'une thérapie prometteuse pour les patients dépourvus de G6b-B fonctionnel. De part la similarité entre les caractéristiques souris et patients dépourvus de G6b-B, cette étude permet d’étudier le potentiel thérapeutique du romiplostim sur la thrombopénie induite. Le romiplostim étant un traitement déjà utilisé sur les patients pour d’autres pathologies. Nous avons précédemment montré que le romiplostim permettait le rétablissement de la thrombocytopénie chez les souris déficientes en G6b. Ce projet vise à étuder l’effet du traitement sur l’hémostase suite au rétablissement du nombre de plaquette. De plus, il est connu que le traitement au romiplostim peut entrainer une myélofibrose (trouble affectant la moelle osseuse). Ces analyses permettront également d’étudier l’impact de l’utilisation du romiplostim sur la moelle osseuse et ses conséquences.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est, dans la continuité de précédentes expériences, d’étudier la fonctionnalité des plaquettes sanguines des souris G6b KO après traitement au romiplostim. Bien que le traitement au romiplostim permet le rétablissement du nombre de plaquettes circulantes et de leurs propriétés, il reste à savoir si ce traitement permet de rétablir efficacement la fonctionnalité principale de plaquettes, c’est-à-dire l’arrêt de saignement. De plus, il est connu que le traitement au romiplostim peut entrainer une myélofibrose. Ces analyses permettront d’étudier l’impact de l’utilisation du romiplostim sur la moelle osseuse et ses conséquences. Les phénotypes très similaires entre les souris G6b KO et la macrothrombocytopénie et myélofibrose congénitales chez l'homme constituent un modèle intéressant pour étudier la base moléculaire de cette maladie. Ainsi l'efficacité relative des actuels et nouveaux traitements de la thrombocytopénie peut être analysée. Une telle étude est particulièrement pertinente en raison de l'émergence de mutations de G6b comme cause de thrombocytopénie héréditaire dans de multiples familles

Procédures

L’ensemble des animaux recevront le traitement romiplostim par injection (5 injections au total sur 15 jours, sur animal vigile, durée de geste environ 30 secondes). Les animaux auront également un prélèvement de sang (maximum 4 prélèvements par animal sur 15 jours, sous anesthésie générale, durée d’environ 1 minute). Tous les animaux subiront également un prélèvement de sang terminal (1 prélèvement, sous anesthésie générale, durée 5 minutes). La moitié des animaux subiront en plus un temps de saignement (sous anesthésie générale, durée de l’expérimentation 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le traitement romiplostim n'entraine aucun effet négatif, comme chez l'homme. Les nuisances sont essentiellement liées au stress de contention au moment des injections en sous-cutanée (durée de la manipulation estimée à 30 sec). Le produit injecté n’induit pas de douleur. Les injections sous-cutanés seront espacés de quelques jours et un total de 5 injections sera effectué. Nous n’attendons pas de douleur liées aux injections, et le site d’injection sera régulièrement observé pour s’en assurer. Suite au prélèvement de sang, les souris pourront présenter un saignement modéré ainsi qu’une douleur (estimée à 1h post-injection). Ces prélèvements répétés étant assez espacés (5-10 jours entre les prélèvements) nous n’attendons pas de traumatismes et douleurs importantes que pourraient engendrer des prélèvements rapprochés. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement de sang, durée de 30 secondes avant endormissement. Possible difficulté de mobilité/engourdissement au réveil de l’anesthésie gazeuse, durée estimée à 3-5min. Après le temps de saignement, les souris pourront présenter un saignement ainsi qu’une douleur au niveau de la section de la queue. Possible difficulté de mobilité/engourdissement au réveil de l’anesthésie gazeuse, durée estimée à 5-10 min. Les différents gestes pris séparement représentent des nuisances légères, mais nous considérons que le cumul des interventions induit une nuisance de type modéré pour les souris.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour analyses post-mortem.

Remplacement

Ces expériences utilisant la souris ne peuvent être remplacées par des études in vitro, d’une part car ces essais doivent être menés dans un organisme entier afin d'accéder à la complexité des mécanismes, ce qui fait l'objet de notre projet. D'autre part, la souris est la seule espèce pour laquelle nous disposons de modèles dépourvus de la protéine co-inhibitrice G6b-B, ayant un phénotype similaire à celui des patients ayant la même mutation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum afin d’obtenir des données statistiquement significatives. Les données seront traités avec des tests statistiques adaptés permettant de répondre aux questions posées. Nos études précédentes nous ont permis de définir au préalable le protocole de traitement à utiliser.

Raffinement

Les conditions du travail seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux manipulations des souris. Les prélèvements de sang pour suivi cinétique de la numération plaquettaire se feront sur des souris sous anesthésie générale gazeuse afin d’éviter la souffrance mais favoriser un réveil rapide. Dans tous les cas, les souris restent ensemble dans la même cage durant toute l'expérience. Les cages sont enrichies en jouets et coton à déchiqueter pour qu’elles y fassent leur nid, et les animaux sont manipulés avec calme et par des manipulateurs avertis pour limiter le stress de contention, dans l'intérêt du bien-être animal. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie et analgésie. L’état de santé des animaux est suivi tout au long de l’expérimentation à l’aide d’une grille intégrant des points limites, permettant d’interrompre les procédures.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce pour laquelle nous disposons de modèles dépourvus de la protéine co-inhibitrice G6b-B, ayant un phénotype similaire à celui des patients ayant la même mutation. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet, à partir de 8 semaines, âge à partir duquel la croissance se stabilise. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge, de 8 à 20 semaines environ.

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont surveillées et pesées pour suivre l'apparition de tumeurs spontanées de l'endomètre, de la peau, des poumons ou du foie, avant des analyses post-mortem. Le porteur indique que la souffrance modérée découle de l'apparition des tumeurs et non des manipulations, limitées à la contention. Il présente un modèle vivant comme "indispensable" pour confirmer qu'un variant génétique identifié chez des patientes prédispose au cancer, et prévoit de tuer les mâles reproducteurs pour stocker leur sperme.

Objectifs

Chez des patientes présentant des caractéristiques évoquant un syndrome de prédisposition au cancer de l’endomètre, un variant spécifique d’un gène, a été identifié. Ce gène n’a jamais été précédemment impliqué dans la prédisposition au cancer chez l’Homme. Ce variant est absent dans la population générale. La surexpression du gène étudié est un facteur de mauvais pronostic dans plusieurs types de cancers (cancers du sein, de l’endomètre, du poumon et du foie). Par ailleurs, une étude a montré un effet tumorigène spontané au sein d’un modèle murin sur-exprimant le gène d’intérêt. Le variant identifié est situé dans un domaine de la protéine qui pourrait diminuer sa dégradation. Par conséquent ce dérèglement pourrait jouer un rôle dans la formation des tumeurs. Notre hypothèse est que le variant de ce gène conduit à une stabilisation de la protéine qui a un rôle essentiel dans le la machinerie de division des cellules. Ainsi, ce variant pourrait prédisposer à la survenue de cancers. L’objectif de ce projet est de confirmer le caractère pathogène du variant identifié chez des patientes, c’est-à-dire montrer qu’il est causal d’un nouveau syndrome de prédisposition tumorale. Un modèle murin porteur de ce variant est utilisé pour démontrer une prédisposition au développement de tumeurs. Par ailleurs, la compréhension du mécanisme de tumorigenèse associé à cette variation de gène, jamais décrite, présente un intérêt scientifique majeur.

Bénéfices attendus

Le variant et le gène impliqué n’ont jamais été décrits comme pouvant conduire à une prédisposition au développement de tumeurs ou de cancers chez l’Homme. Il y a donc un bénéfice direct pour les patients porteurs à confirmer le caractère délétère du variant pour permettre un diagnostic adapté. A plus long terme, l’analyse des tumeurs permettra sur le plan scientifique de mieux comprendre les mécanismes de la tumorigenèse associés à l’hyperactivation de cet oncogène, voire à tester des approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront uniquement observés et pesés pour vérifier le développement de tumeurs potentielles.

Impact sur les animaux

Des tumeurs sont susceptibles de survenir au niveau de l’endomètre ou bien la peau, les poumons ou le foie. Des méthodes non invasives seront utilisées pour évaluer l’apparition de ces tumeurs. Les nuisances expérimentales se limiteront aux stress de la contention et de la manipulation des animaux et les nuisances modérées sur les animaux seront donc la conséquence de l’apparition des tumeurs

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses post-mortem

Remplacement

La variation génétique identifiée a été caractérisée in vitro. Après confirmation du phénotype tumoral associé à la modification génétique testée, l’analyse des tumeurs développées sera une étape importante dans la compréhension du mécanisme de développement tumoral associé. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement auquel est soumis la cellule contenant la mutation. Un modèle vivant intégré est donc indispensable pour étudier les interactions entre la tumeur et ses organes cibles mais également avec l’organisme dans sa totalité. Ces modèles vont nous permettre d'étudier le développement de la maladie en essayant de mimer et comprendre leur mécanisme oncogénique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé grâce à des outils statistiques. Par ailleurs, les mâles reproducteurs seront mis à mort afin de récupérer leur sperme en vue du stockage long terme de cette lignée et réduire ainsi le nombre d’animaux.

Raffinement

Le présent projet inclut uniquement une surveillance des animaux avec un suivi de croissance tumorale (si développement de tumeurs) par observation et pesée des souris. Aucune manipulation invasive n’est prévue. Nous n’anticipons pas de phénotype dommageable pour les souris sauvages mais pour les souris mutées on attend un développement de tumeurs spontanées. Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront administrés. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limite.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce souris a été fait pour plusieurs raisons : La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l'Homme, Le gène étudié est présent dans les deux espèces et l’acide aminé muté est également identique entre les 2 espèces, La souris est un modèle classique pour les modifications génétiques et est pertinent pour l’étude de la prédisposition génétique au cancer. Jeunes souris sevrées puis adultes

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées 21 jours à un manque d'oxygène simulant l'apnée du sommeil, puis subissent une ischémie du cœur sous anesthésie sans réveil ou un test à l'insuline, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur décrit une accélération de la respiration, une perte de poids et un stress lors des premiers jours d'hypoxie, ainsi qu'un stress lié aux prélèvements. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'étudier ensemble l'hypoxie et l'infarctus sur un "organisme entier", en intégrant le rôle du sexe.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil est une des maladies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, elle peut entrainer des maladies cardiaques. Cette maladie correspond à des apnées répétitives pendant le sommeil, entrainant un manque d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de nombreux problèmes dans l’organisme dont des complications cardiaques. De plus le sexe biologique joue dans le développement de cette maladie,. En effet il y a plus d’hommes que de femmes qui en sont atteints (2 hommes pour 1 femme). Chez les femmes l’apparition de cette maladie augmente après la ménopause et chez les hommes cette maladie entraine une diminution de leurs sécrétions de testostérone. Les connaissances cliniques et fondamentales sur les interactions entre le sexe et le cœur en hypoxie sont très peu connues. Ainsi l’objectif de ce projet est de comprendre précisément le lien entre le sexe, le manque d’oxygène et la dysfonction cardiaque associés,à travers l’ 1) évaluation de l’ infarctus du cœur chez les souris mâles et femelles exposées à l’hypoxie, 2) évaluation des interactions entre les protéines activées pendant le manque d’oxygène en fonction du sexe de la souris. En considérant le rôle du sexe dans cette étude, nous aurons une contribution unique permettant de mettre en lumière des aspects qui n’ont pas été évalués dans les modèles précliniques d’une maladie qui se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles selon l’Organisation Mondiale de la Santé.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre le fonctionnement du syndrome d’apnées du sommeil qui est répandu et fortement associé aux maladies cardiovasculaires qui, selon l’Organisation Mondiale de la Santé, se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles. En considérant le rôle du sexe, , nous aurons une contribution unique permettant de mettre en lumière des aspects qui n’ont pas encore été évalués dans les modèles précliniques.

Procédures

Pour répondre à la première partie du projet, les souris seront placées en hypoxie ou en normoxie pendant 21 jours. A la fin de leur exposition à l’hypoxie ou à la normoxie, elles subiront une ischémie reperfusion du cœur sous anesthésie générale (3h). A la fin de cette procédure, sous anesthésie générale et sans réveil, elles seront mises à mort par prélèvement cardiaque. Pour répondre à la deuxième partie du projet, les souris seront placées en hypoxie ou en normoxie pendant 21 jours. Elles subiront un test de tolérance à l’insuline. Ce test consiste à injecter de l’insuline chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60 et 90 minutes après l’injection (30 secondes par injections). A la fin de leur exposition à l’hypoxie ou à la normoxie, elles seront mises à jeun pendant 6 h puis injectées ou non à l’insuline, puis mises à mort par prélèvement de sang sous anesthésie générale (mise à mort au bout de 30 secondes d’anesthésie générale), puis les organes d’intérêt seront prélevés pour réaliser les études mécanistiques associées au projet.

Impact sur les animaux

L’hébergement des souris dans l’animalerie entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement de la machine permettant la mise en place de l’hypoxie. De plus l’animalerie est susceptible d’accueillir des rats et des souris simultanément. Cette présence peut induire un stress chez les souris. L’exposition à lhypoxie induit une accélération de la respiration, une légère perte de poids, un stress et une diminution de l’activité lors des premiers jours, puis la souris s’adapte rapidement et ces signes disparaissent. Le test de tolérance à l’insuline chez l’animal non endormi nécessite une injection intrapéritonéale d’insuline, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal.

Devenir

A l'issue de la procédure 1, tous les animaux sont anesthésiés, et le cœur est prélevé pour mesure la taille de l’infarctus du cœur. A l'issue de la procédure 2, tous les animaux sont anesthésiés, un prélèvement sanguin est réalisé et les organes sont prélevés pour analyse ultérieure.

Remplacement

Sur des modèles cellulaires, il est possible d’avoir des modèles d’hypoxie ou d'infarctus. Cependant, ces deux modèles nécessitent le même stimulus (i.e. manque d’oxygène). Donc ils ne peuvent pas être étudiés simultanément sur un modèle in vitro. Pour notre projet nous ne pouvons donc pas « remplacer » ce modèle animal par un autre modèle cellulaire puisqu’il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant de comprendre l’effet de l’hypoxie et de l’infarctus du coeur sur les organes et l’organisme entier. Il s’agit d’une étude du corps animal entier, impliquant des modifications de l’organisme et une communication entre les oragnes. Il est donc impossible de la remplacer.

Réduction

Suite à des travaux antérieurs, nous avons « réduit » au maximum le nombre d’animaux par groupe pour observer des éventuelles différences significatives. Nous utiliserons un logiciel statistique pour réaliser des tests adaptés aux paramètres à évaluer. Le nombre d’animaux est calculé par connaissance du nombre de données finales nécessaire par technique pour réaliser des tests statistiques adéquats, et observer des différences significatives (p

Raffinement

Un hébergement selon les règles de bien-être animal dans une animalerie adaptée et autorisée, avec eau et nourriture à volonté, et enrichissements à leur disposition dans les cages. Les animaux seront toujours manipulés après une semaine minimum de repos dans l’animalerie. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie. Ils seront observés quotidiennement dans leur cage pendant toute la durée de l’hébergement et du protocole d’hypoxie, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet. Pour toutes les procédures qui le nécessitent, les animaux seront sous anesthésie générale avec des antalgiques et les animaux ne seront pas réveillés.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’Homme, notamment dans le cadre d’études systémiques, permettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques avant d’entreprendre des études cliniques chez l’humain. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est le modèle de référence dans les publications. Les souris auront 8-14 semaines, ceci correspond à l’âge adulte de l’animal, cela nous permet de minimaliser les variations possibles liées à l’âge de l’animal.

1200 animaux, dont 500 souris, 500 rats, 80 macaques crabiers, 80 porcs et 40 chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la grande majorité étant tuée et environ 38 non-rongeurs réutilisés ou adoptés. On leur induit des lésions par des produits chimiques administrés jusqu'à deux mois, avec prélèvements répétés, pour rechercher des biomarqueurs de toxicité. Le porteur décrit une baisse d'activité, une perte de poids et des atteintes d'organes, la plupart des animaux étant tués pour analyse anatomo-pathologique. Il présente le recours à l'animal comme "requis" pour transférer ces données à la clinique et estime à 10 à 15 % les non-rongeurs réutilisables.

Objectifs

Un médicament n’est mis sur le marché et rendu disponible aux patients qu’après une longue phase de Recherche et de Développement. Le défi majeur pour la recherche biomédicale est de découvrir de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux tolérés. Actuellement, de nouveaux besoins et enjeux apparaissent, notamment le développement et l’intégration de biomarqueurs au sein même des études chez l’animal de laboratoire afin de permettre une meilleure sélection des candidats médicaments, l’accélération du développement, l’amélioration du suivi personnalisé et du taux de réussite. Un biomarqueur est « une caractéristique biologique mesurable liée à un processus normal ou non. En médecine, il est utilisé pour le diagnostic, la réponse à un traitement ou la toxicité d’une molécule et est dosé préférentiellement dans le sang ou l’urine ». Ce projet utilise des modèles animaux de lésions/atteintes fonctionnelles chimio- ou génétiquement induites avec pour objectifs d’une part d’évaluer des biomarqueurs de toxicité précoce (trouver de nouveaux biomarqueurs plus précoces, plus spécifiques, plus sensibles et qualifier leur cinétique d’apparition), et d’autre part d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments (par exemple diminution de toxicité hépatique ou rénale) grâce au suivi de ces biomarqueurs. Il nécessite la mise en œuvre de modèles animaux rongeurs ou non-rongeurs mimant le processus complet le plus proche de l’Homme.

Bénéfices attendus

L’identification, la cinétique d’apparition et la validation de nouveaux biomarqueurs comme indicateurs de toxicité précoce permettra de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter plus précocement le développement de molécules ayant un profil toxicologique non acceptable au regard de l’indication thérapeutique. À plus long terme, les biomarqueurs les plus pertinents pourront être proposés comme outils futurs d’adaptation dans les essais cliniques (diagnostic, médecine personnalisée, etc.). L’évaluation d’efficacité de candidat-médicament sur des atteintes lésionnelles ou fonctionnelles établies, via le suivi de biomarqueurs permettra, à terme, de proposer des médicaments capables d’améliorer le confort des patients et leur observance au traitement.

Procédures

Pour induire une lésion ou une atteinte fonctionnelle modérée, un produit est administré aux animaux, par différentes voies (principalement orale et intraveineuse) de façon quotidienne ou hebdomadaire sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements associés à une contrainte légère de quelques minutes (en début et fin d’étude) sont nécessaires pour caractériser des biomarqueurs d’intérêt ; leur fréquence et volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie quand ils sont invasifs ( entre 15 et 30 minutes). Des mesures comme par exemple la température corporelle (avec une puce électronique), le poids ( 2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. La durée maximale des études sera de 2 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus chez les animaux seront limités à une contrainte modérée. Ils correspondent aux conséquences de l’atteinte fonctionnelle et/ou lésionnelle ainsi que celles de l’administration des candidats médicaments pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une perte de poids, une modification de la température corporelle. Par ailleurs, les prélèvements nécessaires au suivi des biomarqueurs peuvent entraîner des nuisances de courte durée (ex : contention, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).

Devenir

Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse et que les atteintes/lésions sont réversibles que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire est requis pour avoir la possibilité d’identifier ou de valider des biomarqueurs présents dans les fluides biologiques ou certains tissus (ex : sang, salive, urines, fèces, liquide cérébro-spinal, peau, moelle osseuse) et de transférer les connaissances scientifiques acquises au cours de ces études aux études cliniques. La médecine translationnelle s’appuie sur les progrès de la recherche faite avec des modèles animaux pour développer de nouvelles techniques médicales pour le suivi des effets d’un médicament. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, tests in vitro (cellulaires et organoïdes) voire données recueillies chez les patients, ce qui permet de limiter le recours à l’animal de laboratoire.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Ce projet permet indirectement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans d’autres projets de Sécurité Préclinique grâce l’utilisation de ces biomarqueurs.

Raffinement

Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. La contrainte des prélèvements / administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et la distribution de récompenses alimentaires (renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et d’appliquer des mesures spécifiques (changement de dose, arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support/analgésie) mis en place par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce pour les études précliniques de toxicologie générale est défini par les lignes directrices internationales (ex ICH, OCDE) définissant qu’elles doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rats, souris) et chez le non-rongeur (mini-porcs, chiens ou primates non humains). C’est sur ces mêmes espèces que seront réalisées les études d’évaluation ou de validation de biomarqueurs de toxicité afin de pouvoir mettre en évidence un lien entre la toxicité observée et la variation du ou des biomarqueurs. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes pour évaluer de manière satisfaisante le profil des biomarqueurs.

750 rongeurs, 690 souris et 60 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à entraîner des manipulateurs aux gestes techniques, contention, injections par de multiples voies, prélèvements sanguins répétés et perfusion cardiaque terminale, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur signale qu'un geste mal réalisé par un débutant peut provoquer une infection, une nécrose de la queue, une automutilation ou une détresse respiratoire. Il présente cette formation comme "indispensable" au bien-être des animaux non-humains et indique utiliser autant que possible des animaux de réforme ou surnuméraires.

Objectifs

Pour toute les expérimentations menées chez l’animale, la clé de voute du bien être animale, repose sur la formation des manipulateurs. Plus un geste sera maitrisé, moins il sera traumatisant pour l’animal. Aujourd’hui, la réglementation française en matière d'utilisation d'animaux à des fins scientifiques de par l'arrêté du 1er février 2013 oblige à ce que tout personnel des établissements utilisateurs (EU), titulaire d’un diplôme d’expérimentation animal, soit formé et déclaré compétent pour les gestes à réaliser sur les animaux. La responsabilité de la formation aux gestes est reléguée aux établissements utilisateurs, et doit être effectuée par des manipulateurs (concepteur, applicateur ou éleveur) confirmés et aux compétences reconnues. Ces tuteurs sont autorisés à transmettre leur connaissance uniquement sous le couvert d’une autorisation de projet utilisant des Animaux à des Fins Scientifiques. L'objectif est donc de former les utilisateurs aux gestes qu’ils devront effectuer dans le cadre de leur travail chez la souris et/ou le rat. Les animaux utilisés dans le cadre de ces formations seront autant que possible des animaux de réforme et/ou des animaux surnuméraires. Les utilisateurs pourront être formés aux gestes de bases tel que la préhension, la contention de l'animal mais également à l'administration de substances et le prélèvement de sang sur animal vigil ou anesthésié.

Bénéfices attendus

La formation pratique des utilisateurs est indispensable et indissociable du bien être animal. Seule la maitrise des gestes techniques assure que la finalité de ce dernier est été assuré sans remettre en cause le bienêtre de l’animal. L’apprentissage des gestes est réalisé avec un tuteur technique dont la parfaite maitrise du geste et la pédagogie est reconnue par ses pères et la structure du bien-être animal de l'EU. La formation continue au sein de l'EU permet de maintenir une veille des pratiques expérimentales et des évolution éthiques tout en assurant un niveau d’excellence des pratiques et compétences des utilisateurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à une préhension et contention qui ne durera pas plus de 5 minutes le temps de réalisé les injections (durée 1 minute). Ils pourront être soumis à des prélèvements sanguins sur animal vigile qui ne dureront pas plus de 2 à 3 minutes. Ils seront soumis sous anesthésie/analgésie à un prélèvement sanguin terminale d'une durée de 1 à 2 minutes. Chaque animal ne pourra subir qu'un type d'injection ou 1 prélèvement sanguins au cours de chaque session de formation. La fréquence des différentes interventions est définies telle que: I) Apprentissage des différentes techniques de préhension et de contention : Les animaux (souris et/ou rat) seront manipulés autant de fois que nécessaire jusqu’à la parfaite maitrise des gestes sous la forme de courtes séances (10 à 30 minutes en fonction du nombre d’animaux disponible dépendant des autres gestes à acquérir par la suite), 1 à 2 fois par jour maximum. II) Formation aux administrations SC, IP et PO, un maximum de 1 administrations sera réalisé chaque jour pour un maximum de 20 administrations. Lorsque 2 ou 3 de ces voies doivent être maitrisées, elles seront réalisées alternativement. III) Formation aux administrations IV : les administrations seront réalisées dans la veine caudale tous les 3 jours au minimum (typiquement lundi puis jeudi) pour un maximum de 6 administrations par animal. IV) Formation aux administrations IN ou IT : 1 administration suivie de la mise à mort de l’animal. V) Formation aux administrations ID : 2 administrations ID suivie de la mise à mort de l’animal. VI) Formation au micro-prélèvements de sang dans la veine saphène : Le prélèvement sera réalisé sur les pattes postérieures à 24h d’intervalle minimum et pourra être répété 1x par semaine pour un maximum de 6 prélèvements par animal. VII) - Formation au micro-prélèvements de sang dans la caudale : un maximum de 8 prélèvements espacés au minimum de 2h chacun sur une période d’un minimum de 2 jours. VIII) Formation au prélèvement de sang terminal suivi perfusion intracardiaque: 1 prélèvement de sang entraine la mort de l’animal puis la perfusion est réalisée. IX) Formation à la dislocation cervicale : réalisée 1 fois. Les animaux ayant été utilisé pour la formation aux différentes techniques de préhension et de contention seront ensuite utilisés pour la formations aux administrations et/ou prélèvements de sang, perfusion requise et pour la mise à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

La préhension et la contention peuvent provoquer un stress ponctuel pour l'animal. Les administrations et les prélèvements sanguins provoquent un inconfort transitoire et un stress modéré des animaux. Lors de la formation une mauvaise réalisation des gestes par les débutants peut cependant induire des nuisances supplémentaires. Pour les prélèvements de sang, une blessure trop profonde et invasive peut conduire à une infection, une nécrose de la queue ou à une automutilation de l'animal. Lors des administrations orales, une fausse route est possible (étouffement avec reflux induisant une détresse respiratoire aiguë). Les injections intraveineuses peuvent conduire à la formation d’œdème en cas de rupture de la veine caudale. Les injections intrapéritonéales et sous cutanées peuvent entrainer la formation d’œdèmes et/ou un endurcissement de la zone d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la formation pour la formation aux administrations intranasales, intratrachéales, intradermiques, aux prélèvement de sang terminal et à la perfusion intracardiaque ou à la mise à mort par dislocation cervicale

Remplacement

La formation aux gestes techniques en expérimentation animale ne peut être réalisée que sur animal vivant ayant toutes ces capacités à s’échapper, et manifester ou sanctionner tout signe de mal être et d’inconfort. L’utilisation de mannequins et de vidéo servira à expliquer le principe de chaque geste, les attentes et les difficultés afin de rendre la pratique plus sereine et respectueuse des animaux. Ces alternatives ne peuvent cependant pas produire les réactions d’un animal vivant pour l’entraînement aux méthodes d’administration et de prélèvement. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons la souris et/ou le rat, car ce sont les espèces animales concernées par ces procédures. L’apprentissage sera effectué autant que possible sur des animaux de réforme et/ou surnuméraire en provenance de notre élevage et/ou de fournisseurs externes, sous le contrôle permanent et assidu du tuteur. Nous ferons notre maximum pour qu’aucun animal n’ai été élevé dans le seul but de la formation.

Réduction

Les gestes techniques sont réalisés avec comme objectif premier de nuire au minimum au bien-être des animaux et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. Cela n’est rendu possible que pas la parfaite connaissance et maitrise de ces gestes par les expérimentateurs. Afin de garantir la maitrise et l’excellence de nos expérimentateurs, il est indispensable que l’apprenant puissent apprendre et répéter le/les gestes utiles autant de fois que nécessaire jusqu’à ce que sa compétence puisse être reconnue et validée par le tuteur. Le nombre d'animaux/procédure sera estimé par le tuteur, en fonction du niveau des apprenants et du ou des gestes réalisés, sous le contrôle de la SBEA. Plusieurs gestes pourront être réalisés sur le même animal afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour exemple, lorsque 2 ou 3 voies d’administration doivent être maitrisées, elles seront réalisées alternativement chez le même animal suivant la formation à la préhension et à la contention. Ces mêmes animaux peuvent ensuite être utilisés pour la formation au prélèvement de sang et à la perfusion terminale ou à la dislocation cervicale. De fait, notre expérience montre qu’un nombre moyen de 15 animaux/apprenant est réaliste. L’apprentissage sera effectué autant que possible sur des animaux de réforme ou surnuméraire en provenance de notre élevage et/ou de fournisseurs externes. Aucune analyse statistique ne sera réalisée dans le cadre de la formation.

Raffinement

La formation est réalisée avec pour objectif de garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. Lorsque cela sera nécessaire, pour des raisons liées aux gestes réalisés (administration intranasale, intratrachéale, intradermique, ponction dans la veine cave ou intracardiaque et perfusion intracardiaque) ou dans le but d’assurer l’absence de souffrance de l’animal lors des premières applications pratiques (dislocation cervicale chez la souris), les animaux seront anesthésiés. Les animaux sont maintenus en groupe sociaux dans des cages enrichies d’un tunnel de change, de ouate, de bâtonnet à ronger et de tubes en carton. La gêne occasionnée par la manipulation, la contention des animaux et les administrations est ponctuelle, réversible et fera l’objet d’une surveillance de l’animal, en présence du tuteur, pour visualiser tout signe de mal être imprévu qui impliquerait de soustraire l’animal à ses souffrances.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les 2 espèces présentes au sein de notre établissement utilisateur. Leur choix est donc dicté par la nécessité de former les manipulateurs pour la/les espèce(s) concernée(s) pour les études menées dans l’établissement. Souhaitant utiliser des animaux de réforme ou des animaux surnuméraires, l’âge des animaux n’est pas défini à l’avance. Sauf absolue nécessité requise par les objectifs scientifiques des futures études à mener par l’utilisateur, les animaux seront adultes (> 6 semaines).

110 miniporcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent la pose d'un cathéter et d'une sonde, une chirurgie digestive de une à quatre heures et des prélèvements sanguins répétés, pour comparer des techniques de chirurgie de l'obésité et leurs effets sur le glucose. Le porteur décrit une douleur post-opératoire, une perte de poids, une mobilité réduite et des stéréotypies pendant les trois à quatre semaines du protocole. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'étude de ces interactions entre organes et que les biopsies terminales ne sont pas compatibles avec la survie des animaux.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont donc : - L’amélioration des connaissances sur le fonctionnement de l’intestin et sur son implication dans la survenue du diabète de type 2 - L’évaluation d’un nouvel outil permettant de quantifier l’absorption du glucose par l’intestin en vue de l’utiliser ultérieurement dans des études cliniques chez des patients présentant un diabète de type 2 - La meilleure compréhension des effets de la chirurgie de l’obésité - Le développement de nouvelles techniques de chirurgie de l’obésité et la compréhension de leurs effets sur le métabolisme

Bénéfices attendus

A court et moyen termes, ce projet donnera lieu à plusieurs publications scientifiques ainsi que des communications orales lors de congrès nationaux et internationaux. A long terme, la validation du D-xylose comme marqueur de l’absorption intestinale du glucose permettra de pouvoir évaluer cette variable in vivo chez l’homme, et quantifier de manière fiable l’absorption intestinale, afin de pouvoir personnaliser la prise en charge chirurgicale en réduisant les effets indésirables. L’étude des mécanismes d’action sur l’homéostasie glucidique des nouvelles techniques de chirurgie bariatrique en cours de diffusion permettra une meilleure compréhension de celles-ci, ce qui permettrait une meilleure adéquation du type de procédure selon les patients, en vue d’une amélioration de l’efficacité et la diminution des effets indésirables post opératoires.

Procédures

- Pose de catheter central sous anesthésie générale, sur tous les animaux, 1 fois, 30 min. - Pose de sonde nasogastrique sous anesthésie générale, sur tous les animaux, de 2 fois à 6 fois, 30min. - Prélèvements sanguins via le cathether central, animaux vigiles, sur tous les animaux, de 2 fois à 6 fois par animal, les prelèvements auront lieu à T-120, T0, T15, T30, T60, T90, T120, T180, T240, T300, T360 minutes ou à T-10, T0, T15, T30, T60, T90, T120 et T180 (minutes), le volume total par prélèvement n’excèdera pas 160ml par animal. -Réalisation d’un repas test standardisé par voie orale (par la sonde nasogastrique) ou jéjunale, animaux vigiles, 2 à 6 fois, 10min. -Chirurgie digestive, sous anesthésie générale, sur tous les animaux (1 par animal), de 1h à 4h. -Pose de sonde urinaire, sous anesthésie générale, sur 6 animaux, 30 min. -Réalisation d’un transit oesogastroduodénale par la sonde nasogastrique, sur 20 animaux (partie 2), 2 fois, 1heure. -Sacrifice et biopsies chirurgicales, sous anesthésie générale, tous les animaux, 1 fois, 2heures.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables post opératoires attendus sont les suivants : douleur, perte de poids, diminution de l’appétit, mobilité réduite, confusion, stéréotypies. Ces effets pourront survenir pendant toute la durée du protocole (3-4 semaines) mais sont particulièrement attendus en période post opératoire.

Devenir

Aucun animal n'est gardé en vie à l'issue de chaque procédure. En effet, la réalisation de biopsies terminales en fin de procédure, en particulier intestinales, n'est pas compatible avec la survie de l'animale.

Remplacement

Nous ne pouvons pas « Remplacer » l’utilisation d’animaux car nous étudions des mécanismes physiologiques. En effet, nous étudions les interactions entre les différents organes à un niveau de biologie intégrative et nous étudions des nouvelles techniques chirurgicales ce qui rend impossible l’utilisation de modèles in vitro. En revanche, les données recueillies sur miniporcs serviront à l’élaboration de modèles computationnels visant à modéliser le contrôle glycémique post prandial chez des patients après chirurgie bariatrique. Ainsi même si nous ne pouvons nous passer du modèle animal actuellement, nous espérons pouvoir à terme nous en affranchir grâce à l’utilisation de ce nouveau modèle computationel.

Réduction

Nous utiliserons un minimum d’animaux pour notre étude qui correspond à une étude préclinique en vue d’une étude clinique future. Il est à ce jour impossible de calculer le nombre nécessaire d’individu dans chaque groupe car nous ne pouvons pas encore quantifier l’effet attendu de chaque technique en cours d’évaluation sur le phénotype. Cependant, par rapport aux études antérieurement réalisées sur le miniporc dans notre laboratoire, un nombre minimal standardisé de miniporc nécessaire par groupe a été établi. Les estimations déclarées ici sont maximales et nous pourrons réduire le nombre d’animaux en cours de protocole si l’effet attendu a pu être constaté.

Raffinement

Les procédures de raffinement suivantes seront appliquées : -Condition standard d'hébergement conformément à la réglementation : hébergement individuel, 12 heures d'éclairage par jour, enrichissement du milieu : jouets. -Prélèvements et expérimentations menés dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d’hébergement. -Administration d’anesthésiques et d’analgésiques adaptés : Fentanyl 1.3mg/kg par voie transdermique au niveau du cou (efficacité analgésique 7 jours), buprénorphine 0.5ml/10kg toutes les 8 heures en intra-musculaire, anti-inflammatoire non stéroidien (méloxicam) 1ml/10kg en intra-musculaire. -Soins apportés au besoin après avis vétérinaire (infection cathéters, ...). -Les animaux présentant au moins un point limite sont retirés de l’étude et mis à mort (prostration, immobilité, appétence, perte de poids) si nécessaire. -Une période de 10 jours d’adaptation sera appliquée à chaque animal entrant.

Choix des espèces

Des études précédentes menées au laboratoire ont permis de valider des techniques de chirurgie bariatrique sur modèle de Miniporc. Ce modèle nous a déjà permis de comprendre les effets métaboliques du gastric-bypass. Dans le but de comparer les résultats de ce projet avec ceux des études antérieures, il est important de conserver ce même modèle qui a déjà prouvé sa validité. Par ailleurs, le porc présente des similarités métaboliques et morphologiques avec l'Homme permettant de transposer les mêmes techniques chirugicales ainsi que les mêmes évaluations métaboliques que chez les patients. Enfin, par rapport au porc charcutier adulte, le mini-porc est une souche dont la taille et le poids adulte permettent une stabulation moins compliquée que des porcs classiques (300kg à l’age adulte), plus lourds chez lesquels il aurait fallu utiliser des individus juvéniles au métabolisme différent de l’individu adulte. Animaux jeunes adultes (1 an environ)