Procédures modérées

1 760 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est isolé jusqu'à sept jours dans une cage à métabolisme, le dos rasé et recouvert d'un dispositif collé, pendant qu'une molécule chimique appliquée sur la peau est suivie dans son organisme. Le porteur reconnaît que l'isolement, la contention sur grille et le dispositif provoquent stress et inconfort, et que le produit testé peut entraîner démangeaisons ou irritation. Il présente ces essais d'excrétion cutanée comme des études de sécurité réglementaires requises par les autorités, et justifie le choix du rat par la guidance OCDE 427.

Objectifs

Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées chez le rat après l’application cutanée d'un produit chimique dans le contexte de l’approche suivante : la comparaison des résultats obtenus in-vitro sur peau humaine et peau de rat avec les résultats obtenus in-vivo chez le rat pour prédire les résultats lors de l’application chez l’humain. L’objectif de chaque étude réalisée dans le cadre de ce projet est d’évaluer l’absorption, la distribution cutanée au point d'application et l’excrétion d’une molécule chimique chez le rat après l’application cutanée unique de cette molécule. Cette étude permet de connaître la fraction de la molécule chimique d’intérêt qui est susceptible de traverser la peau et d’atteindre la circulation sanguine. Les quantités retenues dans la peau sont également déterminées. Le projet est justifié d’un point de vue de la législation : les études réalisées dans le contexte de cette approche permettent d’évaluer la sécurité de produits chimiques suivant les guidances spéficiques à ces études et sont ainsi requises et inspectables par les autorités. Le projet est également justifié d’un point de vue scientifique : les résultats de l’étude in vivo chez le rat permettent dans le contexte de cette approche de prédire ce qu’il se passe chez l’humain, dans le même contexte d’évaluation de la sécurité des produits chimiques, évaluée par les mêmes autorités.

Bénéfices attendus

Ce type d'étude permet de comprendre comment des molécules sont excrétées de l'organisme et fait partie des études de sécurité obligatoires dans le cadre du développement d'un nouveau produit chimique selon les guidances spécifiques à ce type d’études.

Procédures

Les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme pendant maximum 168h après 3 à 4 jours d’acclimatation sur litière. Un dispositif utilisé pour délimiter et protéger le site d'application cutané est collé sur le dos de l'animal dans une zone rasée pendant toute la durée de l'expérimentation (conformément à la guidance spécifique à ce type d’étude).

Impact sur les animaux

« Le placement individuel en cage à métabolisme pendant un maximum de 168h après 3 à 4 jours d’acclimatation sur litière est une situation d’isolement pouvant entrainer un stress de l’animal, tandis que la mise sur grille dans la cage peut entrainer un inconfort (classe de sévérité modérée). La présence d’un dispositif collé sur le dos de l’animal pendant toute la durée de l’expérimentation pour délimiter et protéger le site d’application cutané dans une zone rasée (conformément à la guidance spécifique à ce type d’étude) peut entrainer un inconfort pour l’animal (classe de sévérité légère). Selon le type de produit appliqué sur la peau, les nuisances peuvent être de l’inconfort telles que des démangeaisons ou une irritation (classe modérée). »

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité de molécule chimique retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.

Remplacement

L’étude est réalisée à la suite d’études menées in vitro : la variabilité observée sur les résultats obtenus in vitro permet d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires in vivo. Ainsi, selon les guidances, le nombre minimum d'animaux est défini à 12 (3 temps de collecte et 4 animaux par temps de prélèvement). En fonction de la variabilité attendue au niveau des résultats et suivant la guidance EFSA, le nombre d’animaux au dernier temps de prélèvement terminal peut être porté à 8 afin d'augmenter la puissance statistique de l'analyse des résultats en réduisant la variabilité.

Réduction

L’étude est réalisée à la suite d’études menées in vitro : la variabilité observée sur les résultats obtenus in vitro permet d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires in vivo. Ainsi, selon les guidances, le nombre minimum d'animaux est défini à 12 (3 temps de collecte et 4 animaux par temps de prélèvement). En fonction de la variabilité attendue au niveau des résultats et suivant la guidance spécifique à ce type d’étude, le nombre d’animaux au dernier temps de prélèvement terminal peut être porté à 8 afin d'augmenter la puissance statistique de l'analyse des résultats en réduisant la variabilité.

Raffinement

Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, toutes les cages sont maintenues dans la même pièce et sur le même portoir afin de favoriser l'instinct grégaire (visuel, odeur, communication). Afin de réduire l’inconfort de l’animal des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort. De plus une plaque métallique recouvrant un tiers de la cage sera systématiquement placée sur la grille de la cage à métabolisme pour permettre à l’animal d’avoir un espace de repos sans gêner la collecte des urines et fèces.

Choix des espèces

Selon la guidance OCDE427 concernant la sélection de l’espèce animale, le rat est l’espèce la plus communément utilisée : Les espèce utilisées sont des espèces présentant un taux d’absorption cutanée proche de celle de l’homme. .Les animaux utilisés ont 6 à 7 semaines conformément aux recommandations de la guidance spécifique à ce type d’étude : (animaux entre 200 et 250g).

Tous mis à mort une fois les expériences terminées, pour que leur cerveau soit prélevé en vue d'analyses moléculaires futures, 300 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun, mâle ou femelle, reçoit sous anesthésie un cathéter à demeure dans une veine, par lequel il peut s'injecter de la cocaïne, tout en ayant accès à de l'alcool à boire. Les rats ont environ deux mois et demi au début, âge que le porteur désigne comme la "période de plus grande vulnérabilité face à l'addiction", et l'expérience enchaîne prise des deux drogues, abstinence et rechute, avec une attrition de 20 % prévue après cinq à six mois. Le porteur présente le rat comme un "compromis phylogénétique", assez proche de l'humain et assez éloigné des espèces qu'il dit "plus sensibles", comme les primates non-humains.

Objectifs

La polyconsommation est la norme, et non l'exception, chez les utilisateurs de drogues. Elle peut prendre plusieurs formes mais elle implique presque toujours le co-usage d'au moins un produit licite (par exemple, ingestion d'alcool) et d'une substance illicite (par exemple, inhalation ou injection intraveineuse de cocaïne). L'objectif principal de ce projet vise à développer et valider un modèle animal de polyconsommation d’alcool et de cocaïne. Il s’agira d’étudier l'influence du co-usage d'alcool sur le développement, le maintien et l’abstinence de la prise de cocaïne chez le rat. Des rats mâles et femelles auront un accès concomitant à l'alcool (par voie orale) et à la cocaïne (par voie intraveineuse). Pendant cet accès concomitant, ils pourront co-utiliser les deux substances librement avant de s'installer dans un profil de polyconsommation donné parmi les nombreux possibles (6 au total, en incluant la possibilité d’un mono-usage d’alcool ou de cocaïne). Ce projet de recherche est conçu pour permettre la découverte et l’étude de différents profils de polyconsommation d’alcool et de cocaïne, de leur développement et de leur fréquence relative, notamment en fonction du sexe (Objectif 1). Ce projet devrait également fournir d’importantes informations sur l'influence du co-usage d'alcool sur le développement initial, le maintien (Objectif 2), l’abstinence et la rechute de la consommation de cocaïne (Objectif 3). Enfin, ce projet permettra aussi la collecte et le stockage de tissus cérébraux issus d’individus ayant développé différents profils de polyconsommation pour des analyses neuromoléculaires futures.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera la validation d’un modèle animal de co-usage d’alcool et de cocaïne. Un tel modèle n’existe pas actuellement. Les autres bénéfices attendus incluront le recueil d’informations uniques sur les différents profils de polyconsommation d’alcool et de cocaïne, sur leur développement, sur leur fréquence relative, notamment en fonction du sexe, et, à plus long terme, sur leurs corrélats moléculaires dans le cerveau. Enfin, ce projet devrait également fournir d’importantes informations sur l'influence du co-usage d'alcool sur le développement initial, le maintien et l’abstinence de la prise de cocaïne.

Procédures

Tous les rats seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure. Cette chirurgie est effectuée sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie chimique et sous analgésie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront testés dans des procédures dont le degré de gravité ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire…), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir suite à la chirurgie ou pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection ; une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée ; une perte des points de suture avant cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool mais les animaux seront sous surveillance pendant les premières séances de polyconsommation pour repérer et prévenir tout problème éventuel.

Devenir

Les animaux ayant complété toutes les procédures expérimentales seront mis à mort afin de prélever leurs cerveaux pour des analyses moléculaires futures.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal se justifie pour les raisons éthiques suivantes : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces relations causales et 2) les polyconsommations de substances dans l’addiction ne peuvent pas être récapitulées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à la bonne réalisation du projet sera réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis rationnel entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales propres au projet et les différents objectifs à remplir. Pour répondre à chaque objectif du projet, il faudra deux cohortes de 50 rats chacune (une de mâles et une de femelles). Ce nombre permettra d’avoir assez d’individus répartis dans les nombreux profils de polyconsommation possibles (6 au total, en incluant la possibilité d’un mono-usage d’alcool ou de cocaïne), tout en tenant compte d’un taux d’attrition estimé à 20 pourcents après 5 à 6 mois d’expérience. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour répondre aux trois objectifs du projet sera égal à 300 rats. Les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies (30 min en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie (anti-inflammatoire non-stéroïdien), sous anesthésie chimique (mélange de kétamine et de xylazine) et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl) pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement. Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures pour faciliter l'accès à l’alimentation (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique (anti-inflammatoire non-stéroïdien). L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl). Enfin, si cela ne suffit pas au bon rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire (R. Norvegicus) constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche d’H. Sapiens d’un point de vue phylogénétique (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 millions d'années) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple, les invertébrés, à l’exception sans doute des céphalopodes) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (par exemple les primates non-humains). Les espèces invertébrées (par exemple, C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider certains mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux des drogues mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’être humain pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés seront tous de jeunes adultes en fin d’adolescence au début des expériences (âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une double injection d'une solution qui dégrade l'articulation du genou pour provoquer une arthrose, puis une injection de la thérapie testée, avant d'être tué pour prélever le genou. Le projet vise à évaluer une combinaison de cellules-médicament et d'une molécule anti-vieillissement chez des souris jeunes et âgées, les bénéfices pour les patients arthrosiques restant formulés au conditionnel. Sur le remplacement, le porteur affirme que les organoïdes et les organes sur puce sont des pistes prometteuses mais encore trop peu maîtrisées pour remplacer le modèle animal.

Objectifs

L’arthrose est la maladie la plus répandue en rhumatologie. Elle consiste en une dégradation progressive du cartilage pour laquelle, aucun traitement curatif n’est disponible. Parmi les propositions thérapeutiques applicables à l’arthrose, l’injection de cellules-médicament dans le genou a démontré des effets prometteurs chez le modèle de souris d’arthrose traumatique. Néanmoins, les essais cliniques chez les patients arthrosiques âgés n’ont présenté que des résultats très limités. Dans de nombreuses pathologies liées à l’âge telle que l’arthrose, il a été démontré que les tissus âgés malades accumulaient des cellules dites « sénescentes ». Ces dernières sont responsables de la dégénérescence du tissu, et peuvent induire le vieillissement prématuré des cellules environnantes par effet domino. In- vitro, ce même profil de sécrétion a un impact négatif sur les propriétés régénératrices des cellules-médicament. L’environnement articulaire du sujet âgé pourrait donc expliquer le manque d’efficacité de ces thérapies cellulaires chez le patient arthrosique. Cependant, à notre connaissance, aucune étude concernant ce dernier aspect n’a été menée dans le cas de l’arthrose chez la souris âgée. Au laboratoire, nous avons pu démontrer in- vitro que la combinaison d’agents anti-vieillissement cliniquement approuvés et de cellules-médicament, induisait des effets synergiques favorables à la régénération du cartilage. Ce projet de 2 ans a pour but d’étudier in- vivo, l’action d’une telle combinaison afin de développer une biothérapie 2.0 pour le traitement de l’arthrose du sujet âgé. Nous proposons : 1- d’identifier la présence de cellules sénescentes dans un modèle d’arthrose induite par la collagénase chez les souris jeunes et âgées, 2- d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’une combinaison cellules-médicament/médicament anti-vieillissement, 3- de déterminer l’impact de l’âge sur ces mêmes conditions.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont multiples. Dans un premier temps, il permettrait d’évaluer les propriétés thérapeutiques, de manière séparée ou combinée, d’une drogue anti-vieillissement et de cellules-médicament, sur un modèle expérimental et maitrisé d’arthrose. Ensuite, ce projet permettrait une étude de l’effet de l’âge de la souris sur l’efficacité des thérapies cellulaires. Nous envisageons une perte du potentiel de nos cellules-médicament chez la souris âgée, qui pourrait être contrebalancée par l’action d’une molécule anti-vieillissement. En effet, nous avons démontré in- vitro que ce type de drogue réduit l’impact négatifs des cellules sénescentes, favorise la régénération et accroit les propriétés régénératrices des cellule-médicament. Le but de ce projet est donc de proposer une thérapie cellulaire 2.0 en ciblant l'environnement articulaire âgé du patient arthrosique.

Procédures

Toutes les procédures chirurgicales seront effectuées sur des animaux anesthésiés à l’isoflurane avec application d'une analgesie locale avant chirurgie. Nos procédures, depuis l’endormissement au réveil des animaux, prennent environ 5 minutes par souris. Chaque animal recevra trois injections prenant en moyenne 30sec par souris : une double injection de solution dégradant l’articulation à j0 et à j2 et une injection de la thérapie à j7.

Impact sur les animaux

L’injection de la solution dégradant l’articulation peut induire une douleur passagère au niveau du genou

Devenir

A la fin du projet, les souris seront euthanasiées pour permettre le prélevement de l'articulation du genou.

Remplacement

L'arthrose est une maladie de l'ensemble de l'articulation impliquant les cellules qui y résident mais également le système immunitaire circulant dans le sang. En effet, les différents tissus qui composent une articulation sont atteints et par conséquent, l'analyse du rôle de la senescence cellulaire et de son traitement sur un modèle d'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants. Parmi les alternatives aux modèles animaux, les organoïdes et les organes artificiels sur puces sont des pistes prometteuses néanmoins, ces systèmes sont encore peu maitrisés/caractérisés et ne peuvent remplacer, à l'heure actuelle, un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrose chez la souris (~75%) et de mise en évidence d'effet significatif sur les paramètres histologiques mesurés en fin d'expérience. A l’origine du projet, 5 candidats médicaments ont été présélectionnés. Nos expériences in-vitro nous ont permis de réduire à une seule molécule pour éviter d’accroitre le nombre de souris nécessaires pour ce projet.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Les injections intra-articulaires se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter au maximum la douleur infligée aux animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement. Les points limites seront déterminés à l'aide d'une grille d'évaluation permettant d'identifier les signes de douleur ou d'inconfort des animaux. Ces points limites se basent sur un score obtenu en évaluant comportement, la respiration, l'alimentation ou encore, les expressions faciales des animaux. et sont décidés d'un commun d'accord avec la service du Bien-Etre Animal (SBEA). L'échelle de cette grille, allant de 0 à 23, nécessite une intervention analgésique dès le grade 6 et une consultation de la SBEA à partir du grade 12 pour décider des modes de soulagement.

Choix des espèces

Le modèle murin d'arthrose induite chimiquement présente l’avantage de reproduire fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’Homme, c’est-à-dire chez le sujet jeune après le traumatisme articulaire ou chez le sujet âgé par une arthrose spontanée. Afin de montrer les effets thérapeutiques synergiques d’une combinaison drogue anti-vieillissement/cellules-médicament mais également l’impact de l’âge sur ces mêmes propriétés, les souris seront utilisées à 2-3 mois (groupe jeune) et à 18-20 mois (groupe âgé).

195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour porter le récepteur humain du SARS-CoV-2 dans le muscle, elles sont infectées par injection intramusculaire, gavées de tamoxifène cinq jours, saignées tous les deux jours et soumises pendant six mois à des tests d'effort, grip test, tapis roulant et actimétrie. Le porteur n'attend pas de dommage musculaire important, seulement une fatigue, et reconnaît devoir d'abord mettre au point cette infection encore jamais tentée. Il indique compléter par de la culture cellulaire mais juge la souris nécessaire, le modèle devant aussi servir "l'industrie pharmaceutique" pour d'autres projets sur la COVID.

Objectifs

Si la grande majorité des malades infectés par le SRAS-CoV-2 se remettent de cette infection (98,7% au 09 mars 2022, https://COVID19.who.int/) ; certains d’entre eux continuent à présenter des symptômes, parfois des mois après leur guérison. Ce type de manifestations cliniques, qualifié de syndrome post-COVID (PCS), concerne 30 à 60% des malades, principalement des femmes. Le PCS touche plusieurs organes et demande une surveillance et un suivi à long terme des patients, ce qui en fait aujourd’hui un véritable problème de santé publique. Parmi les principaux symptômes observés, on note en troisième position les troubles musculo-squelettiques. Les exercices physiques permettent parfois de réduire ces symptômes suggérant une atteinte directe du muscle. Cependant, à notre connaissance, il n'existe aucune étude sur les effets à long terme de la COVID-19 sur le tissu musculaire. Depuis 2020, la littérature scientifique atteste de la pertinence et de l’intérêt des modèles rongeurs pour l’étude de l’infection par le SRAS-CoV-2 et de la physiopathologie de la COVID-19. Un modèle de souris transgénique HSACreERT2: ACE2(GFP)hACE2 a été développé exprimant le récepteur humain du SRAS-CoV-2, l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (hACE2), uniquement au niveau du tissu musculaire. Nous proposons de l’utiliser pour (i) caractériser l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2 et (ii) comprendre les bases moléculaires de la physiopathologie musculaire de la COVID-19.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d’établir une cartographie détaillée des conséquences fonctionnelles et physiopathologiques de l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2. Cette étude jamais réalisée jusqu’à présent permettra de mieux comprendre les symptômes musculaires observés chez les patients COVID Long. Le développement de thérapies ciblées et la prise en charge adaptée des patients pourraient bénéficier de ces observations inédites. Si aucun effet n’est observé à la suite de l’infection directe du muscle, cela apportera néanmoins un élément de réponse à la compréhension du phénotype musculaire dans le cas des patients de COVID Long. Nous pourrons dans ce cas envisager d’orienter nos investigations futures vers le réseau vasculaire ou le système inflammatoire. De plus, notre modèle restera tout de même un outil important pour la communauté scientifique et l’industrie pharmaceutique dans le cadre d’autres projets sur les formes aigues ou persistantes de la COVID.

Procédures

Pour la réalisation des infections virales, les animaux seront anesthésiés sous isofluorane (induction 4%; maintien 2%) et soumis à des injections intramusculaires du SARS-CoV-2. L'intervention sera faite une seule fois par souris et la durée de l'intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux). Le prélèvement du sang tous les deux jours sera fait sous anesthésie à l'isoflurane. La durée de la prise de sang sera d'environ 30 secondes. Pour réaliser les manipulations, le tamoxifène est administré par gavage pendant 5 jours à la concentration finale de 85 mg/kg de poids corporel. La séance de gavage dure environ 2 minutes pour chaque souris avec une fréquence d'une fois par jour pendant 5 jours. Les études functionelles seront realisées une fois par mois pendant 6 mois. La durée du grip test sera de 30 secondes et la durée de la séance du tapis roulant sera de 20 minutes. Pour finir, l'activité de déplacement mesuré par l'Activmètre aura une durée d'acquisition réglée sur 24/48 heures pour quantifier l'activité tout au long du cycle circadien.

Impact sur les animaux

Le projet porte sur l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2. En raison de l’absence de données préalables, il est nécessaire de mettre au point l’infection expérimentale. Cette étape repose sur notre grande expérience des injections intramusculaires et de la virologie du SRAS-CoV-2. Toutefois, il n’est pas attendu de dommages musculaires importants chez la souris. En effet, seule de la fatigue musculaire est signalée chez les patients COVID Long et un phénotype similaire devrait être observé chez la souris infectée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour les prélevements prévus dans chaque procédure.

Remplacement

Notre projet s’intéresse à l’étude des processus biologiques associés aux interactions entre le virus SRAS-CoV-2 et les cellules ou tissus de l’hôte et de leur évolution au cours du temps (6 mois). De fait, l’analyse de ces interactions au sein d’un organisme, où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication, nécessite des observations chez l’animal et ne peut être substituée qu’en partie par des études in vitro. Des résultats préliminaires ont montré que les cellules musculaires humaines sont susceptibles à l’infection par le SRAS-CoV-2. De plus, nous avons démontré que le récepteur ACE2 est exprimé au niveau du tissu musculaire. La culture cellulaire restera un outil que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans le but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de protocoles publiés et de l’expérience acquise précédemment. Un des enjeux est de pouvoir obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses prévues. Ce nombre de souris n’a pas été défini à l’aide de méthodes statistique mais est basé sur notre expérience dans l’obtention de différent matériel biologique pour chaque technique. Les conditions expérimentales de l’infection sont établies sur la base d’une approche par escalade de doses. Cinq souris par condition seront utilisées pour des analyses histologiques et virologiques. La sensibilité de ces techniques est importante et l’effet attendu est fort, ce qui permet de limiter le nombre d’individus. Pour les autres expériences, la sensibilité attendue est moindre, obligeant à augmenter la taille des groupes à 10 individus pour les analyses fonctionnelles. Afin de respecter la règle des 3R, les animaux seront utilisés pour plusieurs études (par exemple, analyses fonctionnelles et investigation de la physiopathologie de l’infection musculaire) et, quand cela est possible, un même tissu sera exploité pour différentes analyses (par exemple, un même muscle pour les analyses histologiques et les analyses moléculaires) dans le but de réduire au maximum le nombre des animaux. Des tests statistiques seront mis en œuvre.

Raffinement

Pour minimiser le stress induit aux animaux, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%, maintien 2%) avant inoculation intra-musculaire du virus. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide permettant la réalisation de la procédure en un temps court et d’assurer un réveil rapide tout en minimisant l’hypothermie. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les souris seront hébergées par 6 mois dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger. Des points limites (perte excessive >20%, lordose, dyspnée, poil piqué, difficultés locomotrices) seront utilisés afin de garantir le bien-etre des animaux après l'infection.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) constitue un outil essentiel pour la recherche par sa facilité de manipulation, sa petite taille, ses cycles de reproduction courts, et sa grande disponibilité. Cependant, la souris n’est pas sensible à l’infection par le SRAS-CoV-2, puisque la protéine spike “S” ne reconnaît pas le récepteur murin ACE2. Des stratégies d’insertion du gène humain ACE2 dans les modèles transgéniques ont été réalisées, mais son expression est ubiquitaire alors que chez l’homme, elle est restreinte, notamment aux voies respiratoires supérieures et inférieures. Afin de contourner ces différentes limitations et dans l’objectif de fournir à la communauté scientifique un modèle préclinique murin versatile, nous avons généré une lignée murine humanisée (ACE2(GFP)hACE2) exprimant le récepteur hACE2 au locus de mAce2 de manière conditionnelle et inductible. En effet, il n’existe pas à notre connaissance de knock-in inductible, tissu-spécifique et conditionnel de hACE2 chez la souris. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 6 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé.

610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par gavage d'un ver intestinal puis par un parasite de la malaria, subissent des prélèvements sanguins trois fois par semaine, puis une ponction cardiaque suivie de la mort par dislocation cervicale. Le porteur décrit une infection le plus souvent asymptomatique et une anémie transitoire liée à une souche de plasmodium "non létale", et tue toute souris dont l'état se dégrade. Il présente la souris comme le "modèle de choix", ces interactions à trois partenaires ne pouvant selon lui être reproduites in vitro, l'étude portant d'abord sur la capacité d'adaptation du ver.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’adaptation à la coïnfection entre un nématode intestinal et un des agents de la malaria murine, en termes de la capacité à réguler la réponse immunitaire de l’hôte. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et en effet on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection peut entrainer des dynamiques très différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela peut également avoir des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, un des paramètres clé déterminant la dynamique de la coïnfection est la capacité des nématodes intestinaux à moduler la réponse immunitaire de l’hôte. Cette capacité d’immunomodulation a pour objectif de favoriser la persistance des vers au sein de l’hôte. Cependant, un hôte dont la réponse immunitaire est sous exprimée devient également plus susceptible à l’infection par d’autres pathogènes. La question que nous souhaitons aborder ici est donc la suivante : Y a-t-il un potentiel d’adaptation du nématode aux conditions de coïnfection qui limite le niveau d’immunosuppression de l’hôte ?

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier le potentiel d’adaptation d’un nématode intestinal à la coïnfection avec plasmodium en termes de sa capacité à immunomoduler l’hôte. Ces deux parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Notre projet vise donc à contribuer à élucider le rôle que la manipulation de la réponse immunitaire par le nématode pourrait jouer dans le risque encouru par ces populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : gavage (200 µl d’eau de boisson à l’aide d’une sonde souris, une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Nous attendons peu d’effets indésirables sur les animaux. Le nématode intestinal produit des infections asymptomatiques dans le sens qu’aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté et ceci basé sur de centaines de souris infectées au cours de ces 10 dernières années. Dans des très rares cas, l’émergence des vers adultes dans la lumière intestinale peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale et un passage de LPS dans le sang. Etant donné que les animaux sont surveillés quotidiennement et deux fois par jours pendant la période d’émergence des vers, si on constate une détérioration de l’état de santé des souris (p.ex. état de prostration) elles sont immédiatement retirées de l’expérience et euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane. La souche de Plasmodium yoelii que nous allons utiliser s’appelle 17X NL où l’acronyme NL signifie « non létal ». Nous avons déjà effectué des infections de C57BL/6JRj avec cette souche de plasmodium et avons pu constater qu’aucune mortalité n’intervient. Le seul symptôme observable associé à l’infection par Plasmodium yoelii 17X NL est une diminution du nombre de globules rouges (anémie). Cette diminution est cependant transitoire (elle se produit entre les jours 14 et 22 post-infection) et après J26 les valeurs reviennent à la normale. Le gavage est réalisé en quelques secondes, à l’aide s’une sonde souris, et ne comporte de nuisances particulières si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal. Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois avec un petit volume d’eau (200 µl). Les injections i.p. sont réalisées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Comme pour le gavage, chaque individu ne reçoit qu’une seule injection. Les micro prélèvements de sang à l'extrémité de la queue sont aussi réalisés après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Les prélèvements de fèces sont effectués en isolant les souris (afin de pouvoir identifier l’appartenance de l’échantillon à chaque individu). Cependant, les souris ne sont isolées que pendant 1 heures, étant pour le reste hébergées en groupe (5 souris par cage). Etant donné que deux prélèvements sont effectués par semaine, le temps passé en isolement ne constitue que 1% du budget temps hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres expériences, n’ayant plus une réponse immunitaire naïve par rapport aux parasites utilisés.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’évaluer l’adaptation d’une espèce de nématode intestinal à la coïnfection par plasmodium en termes d’immunosuppression de l’hôte. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans cette expérience a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 5 souris par passage pour chaque groupe expérimental, et 15 souris tests dont l’objectif est de vérifier si les paramètres mesurés ont dévié par rapport à la génération initiale. Le nombre de 15 souris est le plus petit possible car 5 souris sont mises à mort pour chaque jour de prélèvement. Afin de réduire ultérieurement le nombre total de souris, nous avons décidé de ne répéter l’expérience qu’une fois. Par ailleurs cette répétition ne concerne que les souris tests et non pas les souris utilisées pour les passages. Au total, avec les répétitions, 610 souris seront nécessaire sur une période de 3 ans.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans cette expérience. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (minimum 5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Lors des prélèvements de fèces, les animaux ne sont isolés que pendant 1 heure, ce qui représente 1% du temps hebdomadaire passé en isolement. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Les injections et prélèvements de sang sont effectués après application d’un anesthésiant local pour éviter toute douleur. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

33 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres expériences. Ils subissent une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter veineux central, destiné à faciliter les prélèvements et injections d'études ultérieures de pharmacocinétique, de toxicité ou d'efficacité menées en prestation pour d'autres chercheurs. Le porteur reconnaît un risque de perte importante de sang pendant l'opération mais affirme que les lapins supportent "très bien" le cathéter et le gilet, sans douleur attendue. Il justifie le recours au lapin par sa taille commode pour poser le matériel et présente le remplacement comme difficile, l'effectif pouvant augmenter selon la "demande d'industriels".

Objectifs

Un cathéter veineux central (CVC) est un tube mince et flexible, introduit dans une veine de la base du cou (jugulaire) ou du thorax (sous clavière) jusqu’à atteindre la veine cave supérieure. Ce dispositif, couramment mis en place chez l’homme en clinique, peut permettre l’injection de traitements par voie intra-veineuse (IV), la perfusion de sang ou de plaquettes, le prélèvement d’échantillons sanguins ou encore la mise en place d’une nutrition parentérale (injection d’éléments nutritifs par voie IV). Le but de ce projet est d’offrir les mêmes possibilités à notre modèle animal qu’est le lapin dans le cadre de prestations ou collaborations avec d’autres chercheurs. 33 lapins cathétérisés sont prévus pour l’année 2023.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un CVC apporte plusieurs avantages : -réduction du nombre d’injections et de piqûres d’aiguille ; -atténuation de l’endolorissement/sensation de brûlure parfois causés par un traitement IV administré par une perfusion standard périphérique ; -accroissement du confort et réduction de l’anxiété chez les lapins nécessitant un traitement IV ou des prélèvements sanguins à répétition.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’environ 20min sous anesthésie et analgésie pour la pose d’un cathéter veineux central.

Impact sur les animaux

La nuisance la plus importante est lié à l’opération chirurgical en elle-même. Durant cette dernière, les animaux sont susceptibles de perdre une quantité importante de sang pouvant entrainer une mauvaise récupération post-opératoire. Cependant, tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur des animaux (anesthésie + analgésie pré et post-opératoire). D’après notre expérience, les animaux supportent très bien le cathéter ainsi que le gilet. Aucune douleur n’est attendue.

Devenir

Au terme de la procédure, tous les animaux seront utilisés pour des expériences nécessitant des prélèvements ou des injections qui seront facilités par le cathéter limitant ainsi les effets néfastes pour les animaux.

Remplacement

Différents types d’étude seront réalisés chez les lapins cathétérisés : analyse pharmacocinétique d’un nouveau composé, tests de toxicité, évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies. L’ensemble de ces utilisations met en jeu l’organisme dans son entièreté et rend le remplacement du modèle animal difficile.

Réduction

Dans un objectif de Réduction, le nombre d’animaux choisi correspond au minimum de lapins qui nous est habituellement commandé sur une année. Cependant il est possible que ce chiffre varie à la hausse (demande d’industriels). Dans le cas d’une demande plus importante, une nouvelle demande d’autorisation de projet sera rédigée. Le nombre de lapins sera de 33 sur 1 an.

Raffinement

Dans un objectif de Raffinement, la procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale par du personnel qualifié. Le design du gilet utilisé pour le maintien du cathéter permet la libre circulation de l’animal dans sa cage sans risque d’arrachement. Les conditions d’hébergement ont également été optimisées par l’enrichissement du milieu. Enfin, l’utilisation de l’analgésique buprénorphine a été mise en place pour réduire la douleur liée à l’opération.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle de choix pour les essais impliquant des actes chirurgicaux. Sa taille facilite la mise en place de matériel médical tels que les cathéters. De plus, le lapin est en certains points (notamment immunitaire), plus proche de l’homme que la souris, notamment pour les études s’intéressant aux infections bactériennes. Les lapins seront utilisés lorsqu’ils auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont souvent nécessaires. Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.

534 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques de la maladie d'Alzheimer, elles subissent des prélèvements mensuels de sang et de liquide céphalorachidien, ce dernier via une chirurgie stéréotaxique de pose de canules, et des tests de mémoire, labyrinthe en Y, reconnaissance d'objet et piscine de Morris. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales et un risque d'hypothermie lors du test aquatique, et n'attend qu'un stress léger des épreuves comportementales. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace ces modèles murins pour étudier ensemble les lésions d'Alzheimer et les déficits de mémoire, les retombées thérapeutiques restant hypothétiques.

Objectifs

Les personnes atteintes du syndrome de Down présentent des niveaux accrus de DYRK1A dans le tissu cérébral et de plasma. Une expression accrue des transcrits DYRK1A a été signalée dans des échantillons d'hippocampe provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, bien que les niveaux de protéine DYRK1A dans des homogénats de cortex frontal se soient avérés similaires entre les patients atteints de la maladie d'Alzheimer et les témoins. Récemment, il a été demontré que les personnes âgées souffrant de troubles de la mémoire et présentant une imagerie amyloïde positive présentaient des taux plasmatiques de DYRK1A plus faibles que celles présentant une imagerie amyloïde négative. En outre, il a éte également observé que les adultes âgés cognitivement normaux et sans dépôts amyloïdes présentaient des niveaux plasmatiques de DYRK1A plus élevés que les individus plus jeunes, ce qui pourrait suggérer que l'augmentation de DYRK1A associée à l’âge protègerait de la maladie d'Alzheimer. Dans cette étude, nous cherchons à préciser le lien entre les niveaux cérébraux et plasmatiques de DYRK1A et les deux neuropathologies de la maladie d'Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à mieux comprendre le rôle de la surexpression/downregulation de DYRK1A dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer, en particulier les pathologies amyloïdes et tau. Ce projet contribuera également à une meilleure compréhension de l'apparition précoce de la neuropathologie de la maladie d'Alzheimer chez les personnes atteintes du syndrome de Down, étant donné que le gène codant pour la DYRK1A est situé sur le chromosome 21 et qu'il est donc surexprimé dans cette population. L'étude de biomarqueurs plasmatiques capables d'identifier les individus à haut risque pour la maladie d'Alzheimer de manière rapide et efficace permettrait d'initier un traitement pré-symptomatique de cette maladie, en particulier dans les populations à haut risque. Enfin, les efforts visant à élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les pathologies amyloïdes et tau pourraient également ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques visant à modifier le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Des prélèvements sanguins et de LCR seront effectué une fois par mois entre l'âge de 2 et 6 mois. La souris sera manipulée (pour 3-5 minutes par animal) pour le prélèvement sanguin et de LCR. Les capacités cognitives des souris seront évaluées dans 3 différents tests d'apprentissage et de mémoire: Y maze (8 minutes par animal), reconnaissance de nouvel objet (4 sessions de 10 minutes – 1 session par jour - par animal) et piscine aquatique de Morris (4 sessions de 1 minute par jour pendant 7 jours et 1 session - “probe test” - de 1 minute le jour 8 par animal). 224 souris seront soumises à une injection i.p. d'un mélange d'anesthésiques (2 à 3 minutes par animal ; 1 injection i.p. par animal).

Impact sur les animaux

Pendant le prélèvement de l’échantillon de sang, l'animal est retenu avec précaution par la peau du cou et du dos afin d'immobiliser la tête. Un stress passager peut survenir en raison de l'immobilisation. Une ponction trop profonde peut entraîner la pénétration du sang dans la cavité buccale et un risque d'hémorragie. Un hématome sur le côté du visage peut se produire occasionnellement. L'anesthésie générale utilisée pour la chirurgie stéréotaxique (mise en place de canules pour le prélèvement du LCR) peut entraîner une altération de la thermorégulation, une dépression des systèmes cardiovasculaire et respiratoire, une diminution de l'activité métabolique et une vasodilatation périphérique pouvant conduire à une baisse de la température corporelle. Des douleurs et une détresse post-chirurgicales peuvent également survenir. Les tests comportementaux sont basés sur les comportements spontanés de l’animal avec une procédure graduelle d’habituation-familiarisation aux dispositifs de test. En général, les tests comportementaux utilisés dans ce projet peuvent causer un stress léger. Pour les tests dans l'eau (Labyrinthe aquatique de Morris), il y a un risque d'hypothermie. La contention et la manipulation par l'injection IP peut provoquer un léger stress à l'animal.

Devenir

Deux méthodes d'euthanasie seront utilisées pour atteindre les objectifs du projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative autre que le recours aux modèles souris de maladie d'Alzheimer et aux croisements avec des souris surexprimant ou sous exprimant DYRK1A, pour atteindre les objectifs du projet: analyses de la pathologie Alzheimer (amyloide et tau) ainsi que des déficits d'apprentissage et de mémoire.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédemment élaborées et publiées, notamment des études du laboratoire. Des groupes de 15 souris seront nécessaires afin d’atteindre un poiuvoir statistique suffisant permettant de détecter des variations significatives dans les données comportementales. Nous utiliserons sur 3 ans un total de 534 souris.

Raffinement

Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, la surveillance quotidienne, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, en accord avec le comité de bien-être animal. Un animal sera immédiatement euthanasié après atteinte de l’un des points limites. Les points limites sont définis ci-dessus. Les zootechniciens conseillent sur l’état sanitaire de l’animal identifié et suggèrent les procédures à appliquer, les soins et éventuellement le recours à l’euthanasie. Nous suivrons des recommandations de la cellule bienêtre et vétérinaire avec application de produits disponible par la plateforme. En outre, nous effectuerons un suivi par l’utilisateur journalier avec pour critère l'aspect général de l'animal, comme le poids, le pelage, l'hydratation, l'activité, etc.

Choix des espèces

Deux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer seront utilisés dans ce projet. L'un développe une pathologie amyloïde étendue, tandis que l'autre est un modèle de tauopathie, développant des enchevêtrements neurofibrillaires, une perte neuronale et une atrophie cérébrale. Les deux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer présentent des déficits cognitifs. Nous utiliserons également un modèle de souris qui porte trois copies du gène Dyrk1a de la souris, comme dans la trisomie 21. Un modèle de souris qui porte une seule copie de ce gène complète cette étude. Dans ce projet, nous analyserons les effets de la surexpression du gène Dyrk1a, ainsi que de sa sous-expression sur les pathologies amyloïdes et tau en croisant ces différentes lignées de souris. Des échantillons de sang et de LCR seront prélevés sur des souris adultes à différents âges afin de détecter différents biomarqueurs. Les performances cognitives seront évaluées à l'âge de 4 mois, et des tissus cérébraux seront prélevés sur les souris à l'âge de 6 mois.

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer les troubles moteurs et sensoriels d'une maladie neuromusculaire humaine, elles reçoivent un vecteur viral de thérapie génique, cinq prélèvements sanguins et cinq séries de tests comportementaux sur douze mois, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur qualifie le stress des tests de faible à modéré, sans détailler les cinq tests employés, et n'attend aucun autre effet indésirable. Il indique avoir déjà obtenu des résultats sur cellules et neurones en culture mais juge "essentiel" de valider la thérapie chez la souris, cette étape restant un "premier pas" avant l'humain.

Objectifs

Ce projet concerne le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme grâce à un vecteur viral. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. Notre premier objectif est d’optimiser les conditions de notre protocole (choix du meilleur promoteur, doses à utiliser) en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (prélèvements sanguins, analyses moléculaires). Ensuite, notre deuxième objectif est d’évaluer les bénéfices de ce protocole thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ces bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.

Bénéfices attendus

La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique. De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidences des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives.

Procédures

Les souris recevront le vecteur viral (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Les souris auront 5 prélèvements sanguins (durée : 5mn). Les souris réaliseront 5 fois la série de tests comportementaux (5 tests comportementaux, durée : entre 30s et 15mn) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.

Impact sur les animaux

L’administration du vecteur viral, les prises de sang pourront induire un stress faible chez les animaux. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modérer. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.

Devenir

Ce projet compte 2 procédures. La première permettra de valider le protocole de thérapie génique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessitant leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses). La deuxième permettra d’évaluer les bénéfices de la thérapie au niveau comportemental et tissulaire nécessitant la mise à mort des souris (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyses nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet.

Raffinement

Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’administration du vecteur viral est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée et mise en place d’une analgésie si besoin. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation valider notre approche de thérapie génique. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) et le stade adulte (2 à 12 mois). Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels à partir de 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie à moyen- et long-terme.

679 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de lymphome humain, sous la peau ou dans le tibia, puis des traitements répétés par gavage, injection ou voie intraveineuse et une imagerie hebdomadaire pendant trois à six mois. Le porteur décrit une douleur aux sites d'injection, une perte de poids et une mobilité réduite à mesure que la tumeur grossit, et programme la mise à mort dès l'atteinte de points limites. Il reconnaît utiliser des lignées cellulaires in vitro mais juge le modèle murin "indispensable", les retombées pour les patients atteints de lymphome restant renvoyées "à terme".

Objectifs

Les lymphomes NK/T extraganglionnaires de type nasal sont des entités rares de lymphomes T périphériques associés au virus Epstein Barr. Ils se localisent le plus souvent au niveau de la sphère ORL mais peuvent également atteindre d’autres organes dans le cadre de formes disséminées extranasales. La survie globale à 5 ans des formes localisées est actuellement de l’ordre de 70%, alors que celle des formes disséminées ne dépasse pas les 40%. Ceci justifie le développement de nouvelles approches thérapeutiques basées sur des thérapies plus ciblées incluant des approches d’immunothérapie. Les thérapies ciblées permettent en effet une meilleure tolérance au traitement par la réduction des effets indésirables toxiques mais également une meilleure éradication de la tumeur. Elles peuvent s'utiliser seules ou en association avec la chimiothérapie conventionnelle. La compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des lymphomes NK/T est essentielle pour identifier et tester de nouvelles cibles pharmacologiques afin de compléter l’arsenal thérapeutique du clinicien et améliorer significativement les chances de guérison et de survie des patients. Plusieurs molécules candidates ont été identifiées grâce à des données préliminaires obtenues dans des modèles in vitro. Pour certaines d’entre elles, leur efficacité semble être modulée par la présence d’une mutation dans un gène d’intérêt. Ce projet a donc pour objectif de valider l’efficacité de ces molécules dans des modèles murins in vivo. Certaines molécules ont une action cytotoxique directe sur les cellules tumorales et peuvent donc être testées dans des modèles murins immunodéficients alors que d’autres ont pour mécanisme d’action une modulation de l’immunité anti-tumorale et doivent donc nécessairement être évaluées dans des modèles immunocompétents. Le projet se déroulera en deux étapes : -1ère étape : générer les modèles murins appropriés, qu’ils soient immunodéficients ou immunocompétents -2ème étape : tester l’efficacité des thérapies candidates dans ces modèles en évaluant l’impact du statut mutationnel pour notre gène d’intérêt.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité d'inhibiteurs pharmacologiques et d’immunothérapies déjà disponibles dans un modèle préclinique. L’objectif à terme sera de proposer un rationnel d’utilisation de ces médicaments dans les futurs protocoles cliniques de prise en charge des lymphomes NK/T.

Procédures

>Injection des cellules tumorales humaines (lignées) en sous-cutané : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 640 animaux >Injection des cellules tumorales humaines (cellules primaires) par voie intratibiale : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 39 souris >Prélèvement sanguin jugal : • souris vigile • bimensuelle puis hebdomadaire si présence de cellules tumorales circulantes, pendant 3 à 6 mois • durée : 1 min • 49 souris >Imagerie in vivo par bioluminescence : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • hebdomadaire pendant 3 à 6 mois • durée : 30 min • 679 souris >Administration de molécules thérapeutiques par gavage oral : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour pendant 14 jours • durée : 30 secondes • 60 souris >Administration de molécules thérapeutiques par injection intrapéritonéale : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour (ou tous les deux jours) pendant 14 jours (5 jours / semaine) • durée : 30 secondes • 450 souris >Administration de molécules thérapeutiques par voie intraveineuse caudale : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour pendant 14 jours (5 jours / semaine) • durée : 30 secondes • 180 souris >Transfert adoptif de lymphocytes T OT-1 par voie rétroorbitaire : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 120 souris

Impact sur les animaux

Douleur aux sites d’injection des cellules tumorales (maxi : 3 jours) / Perte de poids / Mobilité réduite à cause de la croissance tumorale (1 semaine) / Stress lié à l’administration par gavage oral (14 jours)

Devenir

Mise à mort pour tous les animaux de toutes les procédures lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : • Atteinte des points limites (cf grille de score établie pour chaque procédure) • Indication à une greffe dans des receveurs secondaires • Absence de prise de greffe au-delà de 3 ou 6 mois (selon les procédures)

Remplacement

Compte tenu du coût des études cliniques chez l’homme et de la réglementation actuellement en vigueur, une étape intermédiaire de vérification des hypothèses dans un modèle préclinique est indispensable. Dans le cadre de notre projet : •Les cellules tumorales de patients (dites cellules primaires) ne peuvent pas être obtenues en quantité suffisante pour tester in vitro l’efficacité des molécules d’intérêt. De plus, ces cellules sont fragiles et ne peuvent être maintenues en culture suffisamment longtemps pour pouvoir mener des expériences pharmacologiques in vitro. •Les lignées cellulaires n’étant pas le reflet exact de la biologie des hémopathies, il est indispensable de tenter d’amplifier les cellules primaires via un modèle murin afin d’objectiver la pertinence thérapeutique d’une drogue en tenant compte de sa pharmacodynamie et pharmacocinétique. •Pour évaluer la réponse immune anti-tumorale et de sa modulation par les immunothérapies, le rôle du micro-environnement tumoral est absolument majeur dans la réponse au traitement, une dimension qui ne peut naturellement pas être appréciée dans les études in vitro / ex vivo. Pour toutes ces raisons, la souris reste le modèle préclinique indispensable pour l’étude des lymphomes NK/T et pour tester l’efficacité in vivo de nouvelles thérapeutiques, et ce, avant de pouvoir les proposer aux humains dans le cadre d’essais cliniques.

Réduction

Méthologie de réduction du nombre des animaux nécessaires à l’expérimentation : •Evaluation pharmacologique in vitro approfondie sur lignées cellulaires pour optimiser les concentrations de drogues et pour sélectionner un nombre restreint de drogues d’intérêt (déjà réalisé) •Quantification de la viabilité cellulaire avant toute injection dans les souris •Optimisation du matériel issu de xénogreffe par productions multiples •Réduction du nombre d’animaux au minimum, après estimation des effectifs afin de garantir l’obtention de résultats statistiquement recevables. •Utilisation d’un même groupe de souris contrôles traitées par placebo pour évaluer l’efficacité de plusieurs drogues administrées selon la même voie •Utilisation de l’imagerie par bioluminescence : ce système d'imagerie optique préclinique permet d’évaluer la croissance tumorale. Des signaux de bioluminescence et/ou de fluorescence peuvent être suivis de manière longitudinale ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux. Un suivi quotidien des souris sera effectué dans les 3 jours suivant l’injection des cellules tumorales. En cas de signes évocateurs d’infection ou de douleurs au site d’injection, du meloxicam sera administré. Nous avons également défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi bihebdomadaire de ces points limites permettra de minimiser la douleur des animaux en programmant leur mise à mort si nécessaire. Les procédures seront par ailleurs raffinées par un enrichissement des cages d'animaux. Les cages seront enrichies à l’aide de coton et de cabanes, pour répondre aux besoins de nidification et ludiques des souris. Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Les souris NSG seront hébergées dans une zone SOPF, en portoirs ventilés et manipulées sous hotte ou PSM, leur permettant ainsi de ne pas exprimer de phénotype dommageable. Les injections de cellules en sous-cutané, rétroorbitaire ou intratibiale, les prélèvements sanguins et l’imagerie par bioluminescence nécessaires au suivi seront réalisés sous anesthésie. Concernant les traitements nécessitant un gavage oral, les souris seront habituées progressivement aux procédures de gavage avant la phase de traitement.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes ont été décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des hémopathies humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Concernant l’évaluation de la réponse immune anti-tumorale, le modèle de greffe dans des souris contrôles a déjà été validé dans la littérature. Pour les souris immunodéficientes : souris adultes entre 8 et 12 semaines, âge durant lequel la probabilité de prise de greffe est maximale selon les données de la littérature et l’expérience du laboratoire. Pour les souris contrôles : souris adultes entres 6 et 8 semaines, âge conforme aux données de la littérature