Procédures modérées

6 macaques, 3 macaques à longue queue et 3 macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun opéré de deux à cinq fois sous anesthésie générale, jusqu'à huit heures par intervention, pour la pose d'un plot de fixation de la tête et de chambres d'enregistrement du cerveau. La tête fixée jusqu'à trois heures par séance, cinq jours par semaine au plus, ils exécutent des tâches visuelles et des tests de réflexes des mouvements des yeux pour des récompenses en eau prises sur leur apport du jour, l'eau à volonté n'étant rétablie que deux fois une semaine par an. Tous seront ensuite réutilisés pour poursuivre les enregistrements sur le même sujet, au nom d'outils d'imagerie ultrasonore que l'équipe espère transférer un jour en clinique. Le porteur affirme que le nombre de macaques a été fixé par des calculs de puissance, puis écrit qu'il dépend "des disponibilités d'approvisionnement (3 par espèce)".

Objectifs

L’étude de la relation entre l’anatomie et les fonctions du cerveau et plus particulièrement le lien entre la vision et les mouvements des yeux est principalement réalisée par IRM (imagerie par résonnance magnétique). Cette technique d’imagerie reste limitée par sa précision dans l’espace et le temps pour les études pour permettre de visualiser l’activité cérébrale. Afin d’améliorer sensiblement l’étude du lien entre la vision et les mouvements des yeux, un système échographique sera utilisé dans ce projet. Cette technique échographique permet de voir les flux vasculaires rapides dans les petits vaisseaux avec une meilleure précision et sensibilité que l’IRM. Notre objectif est double, comprendre le fonctionnement du lien entre la vision et les mouvements des yeux avec une précision jamais atteinte et développer des outils d’imageries performants et robustes pour qu’ils soient transférés en clinique pour le diagnostic de problèmes de traitement de l’information visuelle chez l’Homme. Afin de prouver la cohérence des résultats obtenus par imagerie échographique, nous ferons également des mesures d’enregistrement de l’activité électrique des neurones, des acquisitions par imagerie échographique et des tests de comportement sur les réflexes des mouvements des yeux.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : 1- Mieux comprendre le fonctionnement du lien entre la vision et les mouvements des yeux dans son ensemble avec une précision jamais atteinte et développer des outils d’imageries performants et robustes pour qu’ils soient transférés en clinique pour le diagnostic chez l’Homme. 2- Permettre d’envisager de nouveaux essais cliniques de la technique de neuro-modulation (moduler l’activité des neurones) par ultrasons en améliorant la technique notamment dans le choix des paramètres ultrasonores. 3- Enfin la technique d’imagerie ultrasonore fonctionnelle ultrarapide a également pu montrer son intérêt sur le modèle rongeur. Le développement et la validation de cette technique chez le primate serait une étape importante en vue de son transfert en imagerie médicale chez l’homme sain et les patients.

Procédures

- Tous les animaux sont habitués aux différents dispositifs permettant de diminuer le stress de l’animal afin de réaliser les tâches comportementales, au personnel- Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) : Les 6 animaux réaliseront une seule IRM avec une durée d’anesthésie d’environ 3 heures et 2h environ d’acquisition. - Afin de pouvoir maintenir la tête lors des enregistrements et permettre l’acquisition de données, les 6 animaux sont implantés sous anesthésie générale avec un dispositif placé sur la tête permettant la fixation de la tête et d’une chambre permettant les enregistrements. La mise en place de la chambre facilite l’enregistrement de l’activité cérébrale. Les animaux auront au minimum 2 chirurgies sous anesthésie générale (1 pour la mise en place du plot de fixation de la tête, 1 pour la mise en place de la chambre) et au maximum 5 chirurgies (les deux précédentes, 1 pour la mise en place d’une deuxième chambre et 2 pour la remise en place du dispositif et pour entretiens des implants, si nécessaire). La remise en place du système sera réalisée après l’accord vétérinaire. Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale pour une durée maximale de 8 heures. - Les dispositifs implantés (chambres et plot de fixation) seront nettoyés au minimum 3 fois par semaine pour chaque animal. - Les 6 animaux implantés participeront à des enregistrements de l’activité du cerveau et des neurones pendant qu’ils réaliseront des tâches visuelles. Ces enregistrements dureront au maximum 3 heures et auront lieu quotidiennement, 5 fois par semaine maximum. Afin de favoriser la motivation des animaux pendant les tâches comportementales, ceux-ci seront récompensés à l’aide d’une récompense hydrique qui constituera une partie de leur apport journalier en eau. Les animaux ne réalisent pas de tâches comportementales le week-end, ils ont un apport en eau plus important dans leur hébergement. Un retour progressif à un apport à volonté est effectué 2 fois une semaine chaque année. Une surveillance quotidienne des apports en eau de chaque animal est réalisée afin de toujours couvrir leur besoin afin de garantir un bon état d’hydratation et les maintenir en bonne santé.

Impact sur les animaux

- Des douleurs liées à la chirurgie, après la chirurgie de la pose de l’implant et des chambres d’enregistrements. - Un stress/ contrainte peut être induit lors des séances d'électrophysiologie où l'animal doit être fixé jusqu’à 3h. - Des risques d'infection sur les implants et lors de l'introduction des électrodes peuvent se produire. - La restriction hydrique peut également induire un stress pour l’animal, entrainer une sensation de soif, de la déshydratation, une perte de poids. - Le stress de l’hébergement en captivité peut également être induit chez les animaux notamment pendant la première période d’acclimatation au laboratoire. - Les risques de perte d’implant peuvent survenir suite à un rejet du matériel bio-compatible provoquant chez certains animaux une réponse inflammatoire chronique et un rejet du matériel chirurgical. - Les risques liés à l’anesthésie peuvent également survenir lors des premières anesthésies et spécificité de réponse aux produits pharmacologiques et/ou lors du réveil. Les risques anesthésiques existent pour toutes les interventions qui vont nécessiter cette mise en place, avec la tolérance/réaction individuelle aux molécules utilisées ainsi que la capacité de la récupération propre à chaque animal.

Devenir

Tous les animaux (total 6 individus) seront réutilisés pour poursuivre l’acquisition de données sur ce sujet de recherche afin de privilégier la réutilisation d’un animal déjà entrainé par rapport à un animal naïf (réduction du nombre d’animaux). Cette réutilisation se fera en accord avec l’équipe vétérinaire et dépendra de l’état de bien-être des animaux.

Remplacement

L’étude portant sur un système intégré dans sa globalité (de l’œil jusqu’au cerveau), il est impossible de remplacer les animaux par des cultures de cellules des simulations ou autres. Des comportements cognitifs complexes impliquant des tâches d’inhibitions du mouvement nécessitant le cortex pré-frontal (zone avant du cerveau) sont très difficilement voire jamais atteints chez les rongeurs ou d’autres petits primates non humains (par exemple : tâche où les individus doivent regarder dans la direction opposée à un point en inhibant le mouvement réflexe d’observer le point).

Réduction

Les normes de publication indiquent que les données doivent être reproduites pour au minimum 2 animaux (parfois jusqu’à 4 si les mesures intra-individuelles sont trop importantes) afin d'obtenir des données fiables et interprétables. Les animaux participeront à plusieurs tâches comportementales (la quantité de données récoltées par animal permet un traitement statistique en s’affranchissant du petit nombre d’individu) et/ou de perturbations d'activité cérébrale cela afin de limiter le nombre d'animaux. La participation des animaux aux protocoles de recherche peut également permettre la stimulation sensorielle et motrice ainsi que participer à une occupation interactive journalière. Le nombre d’animaux nécessaire pour cette étude a été déterminé par des calculs de puissance. Il a été ainsi établi que 6 animaux seront essentiels pour la réalisation de ce projet.

Raffinement

L’état de bien-être de l’animal est primordial et à la moindre anomalie des mesures seront prises pour le restaurer. Des points limites ont été établis pour assurer une prise de décision rapide et efficace pour s’assurer que le bien-être de l’animal sera là aussi toujours préservé. L’hébergement, l’enrichissement ainsi qu’une alimentation adaptée seront mis en place pour stimuler les animaux et limiter les comportements anormaux (stéréotypies, prostration…). Une sortie du protocole est possible si le comportement de l’animal est contraire à son bien-être. L’entraînement régulier par renforcement positif permettra d’instaurer une routine limitant les contentions et le stress lors des manipulations et les tâches demandées. Les hébergements en paire sont favorisés, à défaut l’animal sera seul en conservant les contacts visuels/olfactifs avec ses congénères. Le contrôle hydrique sera adapté à la demande de chaque animal en ayant intégré les particularités individuelles. Lors des chirurgies et IRM : ces interventions sont réalisées sous anesthésie générale avec la mise en place d’anti-douleurs adaptés (avant, pendant et après, une réévaluation avec le vétérinaire est disponible si besoin) lors des anesthésies, une surveillance des constances physiologiques (rythmes cardiaque et respiratoire, température…) est toujours mise en place Le dispositif implanté sera le plus petit possible pour le confort de l’animal et limiter la gêne. Il sera posé dans des règles strictes d’asepsie. Le post-opératoire sera surveillé avec une ide à l’alimentation pour faciliter la récupération, des enrichissements et une taille de la cage adaptés pour stimuler l’animal et faciliter les déplacements. La récupération complète est vérifiée avant la poursuite du projet. Une surveillance renforcée des comportements alimentaires, individuels et sociaux. Sur le plan scientifique : - l’acquisition de données sera arrêtée lorsque la quantité obtenue sera statistiquement suffisante pour les analyses pour utiliser les animaux pour ce qui est strictement nécessaire.

Choix des espèces

Les fonctions cérébrales et l’anatomie du système oculomoteur chez le macaque (Macaca mulatta et Macaca fascicularis) se rapprochent fortement de celles de l’Homme, en plus des similitudes cognitives. Notre objectif est d’améliorer, chez l’Homme, les outils d’imagerie ainsi que les connaissances biologiques nécessaires pour le diagnostic des pathologies cérébrales. Pour cela, nous utilisons l’imagerie de l’activité du cortex frontal (zone avant du cerveau) et de modulation de l’activité des neurones avec des ultrasons via la rétine (œil). Ce modèle animal est le plus pertinent car le plus proche et transférable à l’homme. Concernant le système cérébral gérant les mouvements des yeux, aucune donnée comportementale et/ou physiologique n’ont mis en évidence une différence associée au sexe des animaux quant au contrôle des mouvements des yeux chez les primates. Par ailleurs, le nombre d’animaux de chaque espèce est dépendant des disponibilités d’approvisionnement (3 par espèce). Les animaux de ce projet sont adultes ou jeunes adultes (>3ans) car à cet âge, le cerveau est suffisamment mature. Les animaux sont tous identifiables par un tatouage réalisé par l’éleveur après leur naissance qui est obligatoire pour ces espèces et leur exportations/importations au laboratoire.

Un rongeur qui perd plus de 15 % de son poids, ou plus de 10 % pendant plus de trois jours, atteint le point limite de ce projet. 25 500 rongeurs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie. Pour suivre l'absorption et l'élimination de composés chimiques ou biologiques, parfois radioactifs, l'équipe administre ces composés par toutes les voies possibles, jusque dans le cerveau ou la vessie, ou par minipompe posée en chirurgie, avec des jeûnes jusqu'à 16 heures, une privation d'eau jusqu'à quatre heures, un hébergement individuel sans enrichissement pour recueillir urines et fèces, et des phases in vivo jusqu'à douze mois. Le porteur annonce pourtant "pas d'effets indésirables particuliers", avant d'admettre que les composés peuvent se révéler toxiques. 10 220 rongeurs sont déclarés réutilisés, une possibilité que le porteur réserve à ceux restés moins d'une semaine après une dose unique non radioactive, et les autres sont tués pour récupérer organes et grands volumes de sang.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. La première procédure de ce projet permettra de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. La deuxième procédure aura le même objectif mais avec recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Afin d’évaluer la pharmacocinétique de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h, Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vis sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité, ce qui sera surveillée.

Devenir

Après la procédure numéro 2, et dans une grande partie des cas pour la procédure 1, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux de la procédure 1 ayant reçu une administration unique de composé et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids , les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales, intravésicales, les prélèvements de liquide cérébrospinal et les poses de mini-pompes osmotiques ou d’un implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (buprénorphine au moins 30 minutes avant). Pour les pompes et implants, les animaux seront hébergés individuellement et suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie suturée (en général 3-4 jours) et des soins locaux seront apportés si nécessaire. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique (buprénorphine).

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

Les cellules injectées dans le cerveau des souris et des rats de ce projet sont fournies par un client, et les effets indésirables à prévoir seront anticipés d'après les informations que transmettront les donneurs d'ordre. 2 250 rongeurs, 1 125 souris et 1 125 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue puis autopsiés pour prélever leurs organes. Nourris chaque jour d'un aliment contenant 0,2 % de cuprizone pour provoquer une maladie démyélinisante, ils reçoivent selon les groupes une injection unique de cellules par stéréotaxie sous anesthésie, pour des protocoles de deux jours à six mois. Le porteur évoque des phases de douleur aiguë puis chronique, des points limites et un suivi de la locomotion et de la sensibilité mécanique deux ou trois fois par semaine. Sur le remplacement, il recopie mot pour mot son paragraphe sur les effets indésirables, sans citer aucune méthode de substitution.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer les effets d’une injection intracérébrale de cellules thérapeutiques fournies par notre client, chez le petit animal de laboratoire atteint de dégénérescence cérébrale. Ce mode d’administration intracérébrale d’agents thérapeutiques vient bousculer aujourd’hui les schémas thérapeutiques classiques de faible efficacité dans le traitement de certaines maladies induisant la dégénérescence du système nerveux central. De nombreux essais d’administration intracérébrale se multiplient aujourd’hui au stade préclinique voire pour certains au stade clinique, car ils représentent de grands espoirs thérapeutiques sur le long terme. Des études pilotes seront réalisées pour chaque type de cellules thérapeutiques étudiées. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ces cellules ainsi que tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié dans le sang. De même, l’analyse de certains organes préalablement choisis sera réalisée afin de confronter les résultats des différentes observations, mesures, dosages spécifiques. Dans le cadre de ce projet, un autre type cellulaire de référence connu pour ses effets sera choisi dans l’axe thérapeutique ciblé et sera administré pour comparaison. La durée des protocoles d’étude variera de 2 jours à 6 mois, en fonction de la durée d’induction de la dégénérescence cérébrale et des cellules thérapeutiques à évaluer. Des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires. A chaque sacrifice, une analyse des cadavres et des organes sera réalisée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - A court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur les processus de dégénérescence cérébrale ainsi que sur la tolérance et l’efficacité des cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central. - A moyen terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur la détection et le suivi des modifications physiologiques apparaissant au cours du développement de maladies dégénérescentes ainsi que sur l’injection intracérébrale de cellules thérapeutiques chez le petit animal de laboratoire. - A plus long terme : ce projet devrait permettre d’établir des plans de prévention et de diagnostic robustes et précoces indispensables à la prise en charge de du système nerveux central (identification de nouvelles cibles thérapeutiques)

Procédures

L’administration de la cuprizone se fera quotidiennement via la nourriture (à raison de 0.2% du poids de la nourriture). Le temps d’administration dépendra du design du protocole et des résultats des études pilotes. Les injections des cellules thérapeutiques dans le système nerveux central seront réalisées sur animaux anesthésiés et maintenus sur tapis chauffant. L’administration sera unique. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés. Quand nécessaire, une analgésie appropriée sera appliquée à l’animal avant le prélèvement. Les prélèvements au niveau de l’aorte abdominale ne se feront qu’en point final avant sacrifice de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près.

Devenir

A l’issue des procédures, tous les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifiés, les animaux seront autopsiés minutieusement et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser tout marqueur physiologique/physiopathologique et/ou évaluer une toxicité éventuelle par exemple. Les organes seront également utilisés afin de localiser les cellules thérapeutiques et/ou pour réaliser d’autres dosages spécifiques en parallèle des analyses histopathologiques.

Remplacement

Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près. Plus généralement, les différents effets indésirables possibles et les actions correctrices associées sont décrits dans l’Annexe 1.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux différents traitements et en en accord avec le Code rural et de la pêche maritime, 15 animaux par groupe sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par le traitement à la Cuprizone et/ou les différents principes actifs testés afin d’éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’injection stéréotaxique, des traitements antalgiques pré et post chirurgie dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien, et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.

Choix des espèces

Les rongeurs ont été choisis pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central étant fréquemment évaluées chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats à l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.

Greffées de cellules cancéreuses du foie, sous la peau ou directement dans le foie sous échographie selon les groupes, 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines, injecté sans anesthésie, certaines passent deux échographies hebdomadaires de 20 à 30 minutes sous anesthésie générale, et toutes sont mises à mort après un prélèvement de sang terminal pour récupérer tumeurs et foies. L'équipe veut confirmer chez des souris au système immunitaire fonctionnel l'effet de son anticorps, déjà entré en essai clinique pour d'autres maladies du foie, seul ou associé aux immunothérapies existantes. Le porteur qualifie les effets indésirables de "très limités", puis décrit des ulcérations possibles de la peau sur les tumeurs sous-cutanées, une gêne et des douleurs quand la tumeur du foie grossit, et des douleurs aux points d'injection répétés.

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Une autre partie des animaux recevra une injection unique de cellules cancéreuses directement dans le foie grâce à un système échographique, réalisée sous anesthésie générale, sans subir de procédure chirurgicale. Cette procédure prend environ 15 minutes à être réaliser. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Certains animaux subiront une échographie de 20-30 minutes, sous anesthésie générale, 2 fois par semaine, afin de suivre la croissance tumorale dans le foie des animaux. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Pour les souris injectées dans le foie, la tumeur peut entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

45 souris immunodéprimées NOD Scid vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le ventre ouvert sur 5 à 6 millimètres, chacune reçoit dans la prostate une greffe de cellules tumorales prostatiques humaines, puis un traitement de 120 secondes à la torche à plasma froid par la même voie, le protocole durant une semaine. L'équipe veut savoir si ce plasma pourrait éliminer les cellules tumorales restées en bordure de l'ablation chirurgicale de la prostate chez l'homme, et reconnaît que la réaction du site greffé au plasma "reste inconnue", d'où un suivi renforcé d'une possible réponse inflammatoire. Sur le remplacement, le porteur indique avoir mis au point la torche sur lignées cellulaires, et présente la souris comme correspondant "au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines".

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.

Procédures

Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)

Impact sur les animaux

a procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque réduit à 1 semaine. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, celle-ci reste inconnue. Ainsi comme indiqué pour cette procédure, un suivi renforcé des animaux sera mis en place, notamment pour évaluer une potentielle réponse inflammatoire qui pourrais dégrader l'état général de l'animal.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.

Remplacement

Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés.

Raffinement

En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrit dans la présnte demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal

Choix des espèces

Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.

Les femelles sont achetées déjà gestantes chez un fournisseur, et les mâles employés pour la défaite sociale sont d'anciens reproducteurs de plus de quatre mois. 510 souris C57Bl/6 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe met au point un protocole de stress précoce dérivé de la défaite sociale, comparé à une séparation maternelle couplée à un sevrage précoce, pour faire apparaître chez les petits devenus adultes des comportements apparentés à l'anxiété et à la dépression. Une partie des souris subit jusqu'à deux prises de sang à la queue, éveillée, et des séances de comportement cinq jours sur sept pendant trois à quatre semaines, sous une restriction alimentaire qui maintient leur poids à 90 % de la normale, sans que les tests soient nommés. Les petits sont tués pour prélever leur cerveau, et les mâles et les mères sont tués ou réutilisés dans d'autres expériences du laboratoire "à chaque fois que ce sera possible", soit 150 souris déclarées réutilisées.

Objectifs

L’hypothèse de la programmation précoce des maladies de l’adulte souligne l’importance de la période périnatale comme fenêtre critique de sensibilité aux facteurs environnementaux. Ainsi, la littérature scientifique a révélé que l’adversité dans l’enfance (trauma, abus, négligence) augmente le développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte chez l’humain. Le modèle de séparation maternelle chez le rat engendre des altérations physiologiques et comportementales chez la descendance adulte, permettant ainsi l’étude des mécanismes physiologiques sous-tendant les effets à long terme du stress précoce. Cependant, ce modèle a donné des résultats inconsistants chez la souris, limitant grandement l’accès à des modèles génétiquement modifiés, et ainsi à la compréhension des mécanismes sous-jacents. Une des limites des études antérieures est l’utilisation systématique chez la souris du paradigme utilisé chez le rat, alors qu’il s’agit de 2 espèces distinctes. Nous proposons ainsi dans ce projet de caractériser et valider un nouveau protocole de stress précoce chez la souris en nous basant sur le modèle de défaite sociale déjà caractérisé et validé chez cette même espèce. Les conséquences de ce nouveau protocole seront étudiées chez la descendance mâle et femelle à l’âge adulte en évaluant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs ». Ce protocole sera comparé à un nouveau protocole de séparation maternelle couplé à un sevrage précoce publié récemment pour identifier le protocole de stress précoce entrainant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs » les plus robustes. L’objectif à plus long terme de ce projet sera de réemployer ce nouveau protocole en utilisant des modèles génétiquement modifiés qui permettront une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant la vulnérabilité émotionnelle dans un contexte d’adversité précoce.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de stress précoce chez la souris. En effet les souris sont résistantes aux modèles couramment employés aujourd’hui (notamment la séparation maternelle), bloquant ainsi le potentiel accès à des modèles transgéniques. Cependant ces souris constituent le fond génétique de la plupart des modèles transgéniques de la littérature. Il est donc essentiel de valider une procédure robuste et reproductible de stress précoce. Ce projet servira ainsi de base pour de futurs projets s’intéressant à l’adversité dans l’enfance et nécessitant l’emploi du modèle murin. Ce dernier permet en effet d’accéder à des modèles génétiquement modifiés qui permettraient de mieux comprendre les bases moléculaires des liens entres stress précoce et développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte.

Procédures

Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue sur une partie des animaux vigiles pour mesurer les niveaux de stress des animaux. Le volume de sang sera adapté au poids de l’animal et il y aura un maximum de 2 prélèvements par animal. Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire, qui n’entrainera qu’une légère perte de poids surveillée tout au long de la procédure.

Impact sur les animaux

- De par sa nature et son objectif le protocole de stress social que nous allons utiliser pour modéliser les pathologies psychiatriques entraine un stress chez la souris. Celle-ci présente une élévation des comportements de types anxieux. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré d’après notre expérience au laboratoire et la littérature disponible. En effet, les animaux ne perdent pas de poids au cours du protocole et leur activité locomotrice n’est pas affectée. Les animaux sont observés durant les tests et après les tests et des soins appropriés sont mis en place en cas de besoin - Concernant la descendance, les protocoles de stress précoce visent à générer des comportements émotionnels de type « anxieux » et « dépressifs », qui sont l’objet de cette étude. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux. Enfin, les procédures de conditionnement opérant nécessitent une restriction alimentaire légère limitée à la phase d’apprentissage (maintien à 90% du poids ad libitum).

Devenir

Pour les procédures 1, 2 et 3 : - Les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale et les mères seront soit mises à mort soit réutilisées par des membres du laboratoire dans d’autres expériences à chaque fois que ce sera possible pour répondre aux besoins de réduction de la règle des 3R. - Les petits seront euthanasiés à la fin de la procédure par raison scientifique afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

L’objectif du projet étant de caractériser et de valider un nouveau protocole de stress précoce dans un modèle murin et d’étudier les conséquences de ce stress sur le développement de troubles anxieux et dépressifs chez la progéniture à l’âge adulte. L’emploi de modèle animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie pour les prochaines étapes du projet qui nécessiteront l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements.

Réduction

Pour respecter la règle de réduction du nombre d'animaux utilisés, les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale seront employées durant plusieurs sessions consécutives de ce protocole. Ces animaux seront proposées aux autres utilisateurs puisqu'ils n'auront pas reçu de traitements particuliers. De la même manière, les mères pourront être proposées aux autres utilisateurs. Le nombre total maximal d’animaux prévus dans le projet est de 510, mais ce nombre est susceptible d’être revue à la baisse, en fonction du succès des reproductions réalisées.

Raffinement

- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et dans un environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille qui peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet. - Les femelles seront achetées directement gestantes auprès du fournisseur. - Les souris utilisées pour la défaite sociale seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte (après 4 mois). - Les expériences de comportement sur la descendance démarreront sur des animaux âgés de 12 semaines et plus car le phénotype apparaît à l’âge adulte.

Pour étudier l'effet d'un régime riche en graisses sur les rythmes de 24 heures et la mémoire des mâles et des femelles, 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever en même temps leur cerveau et leur sang. Elles vivent seules en cage pendant deux mois et demi, et la moitié reçoit ce régime pendant cinq mois et demi. Un groupe passe trois périodes de deux semaines sous des éclairages modifiés, l'autre cinq jours en cage métabolique et deux tests de comportement, et toutes subissent une brève chirurgie pour un prélèvement de sang terminal. Le porteur reconnaît un "stress d'isolement" chez un "animal grégaire" et indique que les tests "pourront induire de l'anxiété et une douleur modérée", sans dire lesquels.

Objectifs

Une alimentation riche en graisses et en sucres favorise la prise de masse et l’obésité. Chez les souris mâles, une telle alimentation provoque non seulement un surpoids, mais aussi des altérations des rythmes de 24 h et de la mémoire. Les souris femelles avec un régime gras grossiraient relativement moins que les souris mâles. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes par lesquels un régime alimentaire riche en gras modifie la santé métabolique et la mémoire chez des souris mâles et femelles. Notre hypothèse principale est que, chez un même animal, les altérations de la mémoire seront corrélées aux altérations des rythmes de 24 h et du métabolisme. Notre hypothèse secondaire est que les altérations des rythmes de 24 h pourraient être réduites chez les souris femelles, ce qui pourrait se traduire par une résistance métabolique relative au régime gras et à moins de perturbations de la mémoire que chez les souris mâles.

Bénéfices attendus

La nature des facteurs nutritionnels qui modulent les rythmes de 24 h et les liens qui connectent la régulation des rythmes journaliers d'alimentation avec la mémoire sont encore très mal connus. L’identification des mécanismes sous-jacents pourrait permettre d’améliorer la prévention et le traitement des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, ainsi que les altérations de la mémoire par des approches de nutrition prenant en compte les rythmes de 24 h.

Procédures

Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant 2.5 mois. La moitié sera nourrie avec un régime alimentaire riche en gras pendant 5.5 mois. Le premier groupe sera exposé à 3 conditions particulières d'éclairement (d'une durée de 2 semaines) pour étudier les rythmes de 24 h. Chaque étape sera séparée par 2 semaines de récupération. Le second groupe sera placé en cage métabolique (5 jours) et soumis à 2 tests comportementaux (l’un de 2 jours et l’autre de 3 jours)), séparés par 2 semaines de récupération. Un prélèvement terminal de sang sera effectué sur tous les animaux, suite à une chirurgie d'environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les souris seront gardées en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement. Les tests comportementaux pourront induire de l'anxiété et une douleur modérée. Le régime gras devrait entraîner un surpoids progressif des souris, ce qui est l'objet même du modèle expérimental.

Devenir

L’étude de la rythmicité de 24 h de l’expression des protéines dans différentes structures ainsi que celle des rythmes de 24 h des hormones et des métabolites plasmatiques impliquent la mise à mort des animaux pour prélever en même temps leur cerveau et leur sang.

Remplacement

La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles), l’investigation des interactions entre rythmes de 24 h et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro.

Réduction

Notre suivi longitudinal des animaux exposés à des tests physiolgoiques et comprtementaux succcessifs réduit le nombre d’individus utilisés. Le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire pour 4 temps par 24h) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures. La rythmicité à l'échelle de 24 h sera validée par une analyse statistique adaptée. L'effet d'un régime favorisant le surpoids sera évalué sur les rythmes de 24 h, le métabolisme et sur des tests de mémoire chez la souris mâle et la souris femelle par des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Les souris seront maintenues en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles. Pour limiter ce stress d'isolement chez la souris qui est un animal grégaire, les cages seront ouvertes, de sorte que les animaux garderont des contacts olfactifs et auditifs avec leurs congénères de la même pièce. Un morceau de bois à ronger, du matériel de coton pour faire un nid constitueront un environnement enrichi pour la souris et devrait limiter le stress d’isolement. Avant les tests comportementaux, les animaux seront manipulés régulièrement afin de minimiser leur état relatif de stress. De plus, toutes les souris seront manipulées quotidiennement pendant la semaine précédant les tests comportementaux afin de les habituer à la manipulation et réduire ainsi le stress qui peut y être associé. De même, une attention particulière sera apportée lors des tests comportementaux pour qu’ils se déroulent dans les conditions les plus calmes possibles afin de ne pas perturber les souris, ce qui risquerait d’altérer leurs réponses comportementales. Entre chaque test, un délai de deux semaines sera respecté pour permettre aux animaux de récupérer. Tout au long de la procédure nous ferons un suivi de l'état général de l'animal à l'aide d'une grille de score et nous avons établi des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est devenue un modèle animal classique en nutrition et en chronobiologie par l’existence de nombreuses lignées génétiquement modifiées. Une fois ce projet achevé qui permettra d'établir un modèle expérimental, nous pourrons chercher comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris génétiquement modifiées exposées aux mêmes procédures expérimentales. Les souris traitées seront nourries dès le sevrage avec une alimentation riche en gras. Puis les souris seront phénotypées 3 mois plus tard au stade jeune adulte. Ce protocole a été validé chez la souris mâle pour ses effets sur le métabolisme et la mémoire. L'originalité du projet présent est de relier ces fonctions aux rythmes de 24 h et à leurs perturbations, à la fois chez les mâles et les femelles.

Chirurgie du cerveau, enregistrement de l'hippocampe sous anesthésie profonde, biberon d'éthanol pendant six semaines ou contention de quinze minutes selon les groupes : 380 souris de deux lignées mutantes du récepteur nicotinique α5 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe veut relier ces mutations, associées chez l'humain à la dépendance à l'alcool d'après des études génétiques, à la consommation d'éthanol et au comportement socio-émotionnel, mesuré par un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores. Le porteur écrit que l'éthanol, consommé par "choix libre", produit des effets "positifs de type anxioloytiques, relaxant et euphorisants", et que les tests sociaux "peuvent être considéré comme un enrichissement". Il décrit la contention comme un geste "effectué une seule fois", puis comme un stress "auquel les animaux s'habituent".

Objectifs

L’OMS raporte que 5% de décès dans le monde peuvent être attribués à l’abus d’alcool. Le fléau sociétal et de santé publique que repésente l’alcoolisme motive la recherche de facteurs de risques génétiques et environnementaux, dans le but de développer des interventions thérapeutiques plus efficaces. Des études génétiques chez l’Homme ont permis de montrer un lien entre une modification du gène des récepteurs nicotiniques de type α5 et la probabilité de développer une dépendance à l’alcool. Malheureusement, le lien causal entre cette altération génétique et l’alcoolisme est difficile à étudier chez l’homme. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de cette altération dans la consommation d’alcool, la gestion des émotions et comportements sociaux, à l’aide de lignées de souris exprimant la même altération génétique que l’Homme. Afin de connaitre les conséquences de cette altération génétique sur l’activité neuronale, nous enregistrerons la réponse à la stimulation des neurones situés dans les régions du cerveau impliquées dans la reconnaissance des émotions. Enfin, dans le cas ou des déficits sont observés chez les animaux porteurs de la modication génétique, nous tenterons d’améliorer le déficit socio-émotionel en corrigeant, par thérapie génique, l’altération génétique du récepteur α5 dans le cerveau de souris. Ce même traitement pourrait aussi régulariser leur consommation d’alcool.

Bénéfices attendus

Bien que des études génétiques chez l’Homme aient montré un lien entre une modification du gène responsable de l’expression des récepteurs nicotiniques de type α5 et la probabilité de développer une dépendance à l’alcool, les mécanismes à l’origine de cette vulnérabilité demeurent inconnus. Or, il existe différentes formes (ou types) d’alcoolisme associées à des comportements émotionnels et sociaux différents voire opposés, par exemple à une hyperanxiété ou une hypoanxiété. Chez l’Homme, il est très difficile de déterminer si ces traits comportementaux et émotionnels sont dus à la consommation d’alcool, ou s’ils correspondent à des traits de personnalité qui préexistent, voire facilitent cette consommation. A ce jour, les traitements ne prennent généralement pas en compte les différents types alcooliques, ce qui pourrait expliquer au moins en partie le taux de rechute élevé (80 à 90% selon les études). L’un des principaux intérêts de notre projet est donc de mieux comprendre la relation entre les traits comportementauxs socio-émotionnels et la consommation d’alcool, en permettant de dissocier les effets de la consommation chronique d’alcool du profil de personnalité préexistant. De façon importante, ces traits sont aussi fortement liés au sexe, par exemple les profils hyperanxieux sont principalement observés chez les patients de sexe féminin, à l’inverse l’hypoanxiété et l’émoussement émotionnel sont principalement observés chez les patients de sexe masculin. Pour cette raison, nous comparerons les réponses comportementales et neuronales de souris mâles et femelles. Ainsi, l’apport éventuel de notre projet pourrait se situer à plusieurs niveaux. Premièrement, en prenant en compte les profils émotionnels et non simplement le niveau de consommation, il pourrait aider à comprendre les mécanismes par lesquels une mutation des récepteurs a5 induit un risque de dépendance à l’alcool. Si le lien entre profils socio-émotionels et risque de dépendance à l’alcool est observé chez l’animal, cela permettrait de tester certaines interventions thérapeutiques, qu’elles soient pharmacologiques ou psychologiques, pour adapter les traitements de façon « personnalisée » chez l’Homme. De nouvelles stratégies pharmaco et/ou psychothérapeutiques prenant en compte le profil socioémotionnel des patients pourraient ainsi se révéler beaucoup plus efficaces pour faciliter l’arrêt de la consommation d'alcool, voire de diminuer les risques de rechute.

Procédures

Les animaux seront soumis à : • La chirurgie stéréotaxique d’injection de virus et/ou d’implantation de fibre optique (geste réalisé sous anésthesie générale avec suivi analgésique), dure environ 30 minutes (n=180). • L’enregistrement de l’activité electrophysiologique dans l’hippocampe (geste effectué sur animal anesthesié) pendant une période maximale de 60 minutes (n=180). • L’activation neuronale via photostimulation optogénétique sur animal vigile pendant 3 minutes lors d’une session par animal (n=60). • L’exposition volontaire d’un biberon contenant une solution d’éthanol toutes les 24 heures pendant 6 semaines (n=60). • Un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores pendant 5 jours à raison de 10 minutes par jour (n=360). • Un stress de contention sur animal vigile pendant 15 minutes, geste effectué une seule fois (n=60).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à : • La chirurgie stéréotaxique d’injection de virus et/ou d’implantation de fibre optique (geste réalisé sous anésthesie générale avec suivi analgésique) qui dure environ 30 minutes (n=180). Cette procédure induit une perte de poids légère et transitoire normale (1-2j) et une douleur modérée qui répond bien à une injection sous-cutanée d’AINS (INFLACAM©) efficace pendant plus de 12h. • L’enregistrement de l’activité électrophysiologique de deux régions du cerveau : le CA1v et CA1d pendant une période maximale de 60 minutes (n=180). Ce geste est effectué sur animal en anesthésie générale profonde. • L’activation neuronale des voies BLA-CA1v via photostimulation optogénétique sur animal vigile pendant 3 minutes lors d’une session par animal (n=60). Ce geste peut générer éventuellement une anxiété légère qui n’est pas systématique (Feliz-Ortiz et al, 2015). • L’exposition volontaire d’un biberon contenant une solution d’éthanol toutes les 24 heures pendant 6 semaines (n=60). Ce traitement, qui dépend d’un choix libre de l’animal, génère plutôt des effets psychopharmacologiques et physiques positifs de type anxioloytiques, relaxant et euphorisants. • Un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores pendant 5 jours à raison de 10 minutes par jour (n=360). Induit un stress léger, comparable au stress induit par de nombreux tests comportemntaux considérés comme faiblement stressants. • Un stress de contention sur animal vigile pendant 15 minutes, geste effectué une seule fois (n=60) et considéré comme un stress psychogène modéré auquel les animaux s’habituent.

Devenir

A la fin des procédures les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde pour la conservation des tissus (cerveau), qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Le projet étant basé sur la reconnaissance des émotions chez la souris et sa relation avec la consommation d’alcool, il n’est pas possible à ce jour de remplacer l’utilisation d’animaux par une autre approche. En revanche, les effectifs peuvent être optimisés en remplaçant les tests indépendants par l’utilisation d’une batterie de tests longitudinaux qui permet d’optimiser le recueil des données pour chaque animal. Ceci implique d’une part de choisir, sur la base de la littérature et de résultats préliminaires, des tests ne modifiant pas le comportement à long terme; et d’autre part d’espacer ces tests dans le temps. Ainsi, deux tests à court terme réalisés en séquentiel divisent par deux l’effectif total sans impacter significativement les résultats.

Réduction

En plus de l'utilisation de batteries de tests (voir ci-dessus), des études pilotes avec un petit nombre de sujets (n=4-5) permettront de déterminer si les effets justifient l'application d'un protocole complet, ce qui peut réduire de façon importante l'effectif total. Ce nombre n’est pas suffisant pour garantir un effet statistique solide mais il permet de décider, sur la base de statistiques descriptives, de compléter l’expérience à 10 animaux par groupe qui est l’effectif minimum nécessaire pour une significativité acceptable avec les tests statistiques paramétriques d’analyses de moyenne et de variance (Student apparié ou non-apparié, ANOVAs et Bonferroni post-hocs). La normalité des distributions est vérifiée avec le test de Kolmogorov-Smirnoff.

Raffinement

Toutes les dispositions permettant de préserver le bien-être des animaux seront prises: anesthésie générale pour l'opération (Isoflurane), traitement post-opératoire anti-inflammatoire préventif (Meloxycam). Par ailleurs l'ensemble des animaux est maintenu dans des conditions d'environnement enrichi, avec à disposition un matériau pour construction de nid. Après chaque intervention chirurgicale (classe modérée) les animaux seront isolés afin d’éviter tout risque de blessures ou de souffrance. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens formés en expérimentation animale (niveau appplicateur) qui informent le concepteur/expérimentateur immédiatement lorsque que des dispositions doivent être prises en cas de signe de souffrance. L'atteinte des points limites entraine l'application du protocole de réponse en fonction du score défini dans chaque procédure. Il faut noter que les tests sociaux utilisés, en permettant aux animaux d’interagir librement de façon quotidienne pendant la durée des expériences, peuvent être considéré comme un enrichissement. L’ensemble des expérimentateurs/soigneurs intervenant sur les animaux a suivi une formation à l’expérimentation animale (niveau 1 ou 2).

Choix des espèces

La souris représente une espèce de référence pour l’étude du système nerveux central chez les vertébrés supérieurs. L’organisation du système nerveux murin permet une extrapolation raisonnable des résultats obtenus chez la souris à l’espèce humaine. Par ailleurs, la souris est une espèce qui peut être manipulée génétiquement, fournissant des outils essentiels à la compréhension des mécanismes neurobiologiques et des mécanismes neuronaux impliqués dans de nombreuses maladies et déficits cognitifs. Grâce aux modèles transgéniques, il est aussi possible de relier les données de la génétique humaine des maladies à l'altération de molécules/récepteurs spécifiques dont la fonction peut être analysée avec des modèles précliniques de ces maladies. Par exemple, l'implication de mutations des récepteurs cholinergiques nicotiniques dans la dépendance à l’alcool peut être étudiée à l'aide des souris dépourvues (α5KO) de certains de ces récepteurs et à des souris exprimant un polymorphisme génétique humain (α5KI) qui sont utilisées dans le projet présent. Les animaux seront utilisés au stade âge adulte mature (3–6mois). Cet âge constitue une période de stabilité durant laquelle on considère que le développement est achevé et les effets liés au vieillissement minimum.

360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une injection de vecteur viral et, chaque semaine, une injection sous la peau d'une substance luminescente pour suivre le virus par imagerie. La moitié est injectée dans l'abdomen dès le premier jour de vie, l'autre moitié dans la veine de la queue à six semaines, éveillée. L'équipe compare plusieurs dérivés du virus AAV9 pour retenir celui qui cible le mieux le muscle, une étape en amont de futures thérapies géniques des maladies musculaires. Toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs organes, et le porteur ne dit pas combien de semaines dure le suivi, donc combien d'injections chaque souris subit.

Objectifs

Les vecteurs viraux sont des outils largement utilisés en thérapie génique. Parmi eux, les virus adéno-associés (AAV) présentent de nombreux avantages comparés aux autres vecteurs car ils ne sont pas pathogènes chez l’Homme et présentent une faible immunogénicité ainsi qu’une grande stabilité génétique. Il existe plusieurs sérotypes d’AAV dont l’AAV9 présentant un tropisme pour les muscles. Une des limites de l’utilisation des AAV en tant que vecteur est le manque de spécificité. D'autres AAV dérivés de l'AAV9 décrit dans différentes publications présenteraient une augmentation de la spécificité musculaire en vitro et en in vivo. L’objectif du projet est donc de pouvoir comparer l'efficacité des différents dérivés de l'AAV9 avec l'AAV9 ainsi qu'entre eux chez la souris et par la suite de sélectionner celui qui montrera la meilleure optimisation de l’efficacité et la spécificité dans le muscle tout en limitant celle dans les autres organes. Le but final est d’améliorer la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques du système musculaire.

Bénéfices attendus

L’identification du meilleur sérotype d’AAV ciblant le plus spécifiquement les muscles et moins les autres organes permettra une meilleure efficacité des thérapies géniques applicables aux maladies musculaires.

Procédures

Les 180 souris de la cohorte « injections intrapéritonéales » seront soumises aux procédures suivantes : -Injection intrapéritonéale unique au premier jour post-natal, 1 minute par animal -Injection sous cutanée (1minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. Les 180 souris de la cohorte « injections intraveineuses » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intraveineuse (1 minute) unique par la veine caudale chez la souris éveillée -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence

Impact sur les animaux

L’injection peut provoquer chez l’animal un stress dû à l’acte, ainsi qu’une perte de poids. L’injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur transitoire chez l’animal. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal.

Devenir

Notre projet nécessite la collection d’organes pour l’analyse au niveau histologique et moléculaire

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être remplacées par des tests in vitro sur des lignées cellulaires musculaires car celles-ci ne permettent pas l’étude de l’impact de l’AAV sur un organisme entier. En effet seul le modèle animal pourra nous permettre l’étude de la bio distribution d’un produit injecté. De plus, le modèle murin est physiologiquement assez proche de l’Homme, ce qui va nous permettre une étude représentative de l’efficacité et de la spécificité des différents vecteurs viraux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur le nombre de virus et de doses à tester par âge. Ce nombre a été basée sur de précédentes études similaires et permet d’assurer une robustesse statistique nécessaire à l’interprétation des résultats. L’expérience de bioluminescence, qui est une expérience permettant de visualiser la localisation du virus dans l'animal, nous permet d’avoir un suivi hebdomadaire de l'expression du virus chez la souris, ce qui nous évite la création de plusieurs groupes de souris à différents âges.

Raffinement

Une alimentation enrichie en plus de l’alimentation inscrit dans l’agrément de l’EU sera mis en place si une perte de poids (inférieure à 22 grammes) est observée suite à l’injection des virus. Les animaux seront surveillés chaque semaine jusqu’à leur mise à mort. Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. De l’ocrygel sera appliqué dans l'ensemble des procédures expérimentales pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les point limites seront déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement, réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration de l’efficacité et de la spécificité du vecteur viral, nous avons besoin d'effectuer des expériences in vivo sur modèle animal. Des projets similaires sur ce modèle animal ont déjà été publié, l’utilisation de ce modèle s’inscrit donc dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale utilisera des souris dès le premier jour de naissance. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intraveineuse utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative.