Procédures modérées

10 chiennes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées dans d'autres projets avant d'être proposées à l'adoption. Elles subissent deux anesthésies générales pour des endoscopies des voies urinaires, des prélèvements de sang et d'urine répétés et l'instillation d'une suspension bactérienne dans la vessie. Le porteur décrit un inconfort léger et n'attend aucune séquelle, l'objectif étant de vérifier l'innocuité d'un probiotique avant un usage clinique. Il justifie le choix de la chienne par la ressemblance de ses infections urinaires avec celles de la femme.

Objectifs

L’infection bactérienne du tractus urinaire est l’une des maladies infectieuses les plus fréquentes aussi bien chez l’Homme que chez le chien et l’une des principales causes de prescription d’antibiotiques. Ces traitements peuvent favoriser la sélection de souches résistantes. Face à l’augmentation croissante de germes résistants, il est nécessaire d’envisager des méthodes alternatives aux antibiotiques. L’utilisation in situ de souches bactériennes (Escherichia coli ) a été décrite et utilisée avec succès pour traiter des infections urinaires récidivantes spontanées. Notre objectif est de démontrer l'innocuité d'une instillation vésicale d'une suspension bactérienne contenant Escherichia coli chez la chienne avant une utilisation en contexte clinique. Notre hypothèse est que cela n'entraîne aucune répercussion sur l'état général et les voies urinaires de l'animal, comme suggéré par les données de la littérature et les études in vitro et qu'elle devrait en revanche présenter des propriétés antimicrobiennes contre plusieurs espèces d'entérobactéries.

Bénéfices attendus

Les souches probiotiques ont pour vocation d'être utilisées pour traiter des infections urinaires entraînant des manifestations cliniques, dues à des bactéries résistantes aux antibiotiques. Si l'expérimentation démontre l'innocuité, ces souches pourront faire l'objet d'essais cliniques chez l'animal de compagnie puis chez l'Homme dans des situations où l'administration d'antibiotiques est impossible ou néfaste pour l'animal ou la santé publique (émergence de résistances).

Procédures

Les chiennes vigiles seront soumises à des prélèvements sanguins (2 prélèvements de 8 mL à la jugulaire à 7 jours d'intervalle) et urinaires (5 prélèvements de 10 mL sur 1 semaine). Elles subiront par ailleurs 2 examens endoscopiques à 15 jours d'intervalle sous anesthésie générale (incluant de l'analgésie) pour une durée de 20-30 min chacune. Une instillation dans la vessie de la solution bactérienne sera également faite sous sédation.

Impact sur les animaux

Les chiennes subiront lors de la phase expérimentale 2 anesthésies générales à 15 jours d'intervalle pour la procédure endoscopique. L'endoscopie des voies urinaires n'est associé qu'à un inconfort léger qui sera traité par l'administration d'un analgésique adapté. La procédure dure environ 20 minutes. Chaque chienne bénéficiera de la pose d'une cathéter veineux périphérique dans la veine céphalique et d'une intubation trachéale pour sécuriser la procédure anesthésique. Les phases d'induction, de maintien et de réveil seront surveillées constamment par un vétérinaire jusqu'au réveil complet de l'animal. Aucune séquelle n'est attendue sur les chiennes. Chaque chienne subira un sondage urétral sous sédation. Le sondage urétral ne présente qu'un inconfort léger et ne dure que quelques minutes. Aucune séquelle n'est attendue. La suspension bactérienne placée dans la vessie n'est ni visqueuse, ni irritante. Durant la phase expérimentale, les chiennes subiront au total 2 prélèvements sanguins veineux de 8 mL à chaque fois (ponction jugulaire), à 1 semaine d'intervalle. La ponction veineuse n'est associée qu'à un inconfort léger. Les chiennes subiront enfin 5 prélèvements urinaires de 10 mL sur une semaine. Ce geste sera pratiqué sous contrôle échographique pour assurer sa réussite et sa rapidité. Aucune séquelle n'est attendue suite à ces prélèvements.

Devenir

Les chiennes utilisées pourront participer à d'autres projets conduits par l'unité de recherche avant d'être proposées à l'adoption.

Remplacement

Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet dont le but est d'étudier l'innocuité chez l'animal de souches probiotiques non pathogènes d'E. coli dans les voies urinaires du chien. Par ailleurs, le choix de ce modèle est justifié par la volonté de se rapprocher d'une future utilisation dans un contexte clinique chez l'animal de compagnie, puis chez l'Homme, la chienne présentant des infections urinaires dont la physiopathologie et l'expression clinique sont similaires à ce qui est rencontrée en médecine humaine, particulièrement chez la femme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé en anticipant l'apparition d'effets indésirables chez moins de 10% des individus. Il n’existe que peu de données sur l’innocuité d’une telle procédure. La seule publication récente fait état de l’absence complète d’effets indésirables identifiables à partir de 6 chiennes. Cette étude a été réalisée dans des conditions très similaires : même race, même sexe, même âge. Avec ce résultat (seul disponible) il n’est pas possible d’utiliser un test statistique de calcul d’effectif. Dans l’optique d’une utilisation clinique future, pour augmenter la puissance statistique et améliorer la sensibilité, un effectif de 10 chiennes recevant la suspension bactérienne est considérée pertinente. Ce nombre s'avère être le minimum requis pour atteindre notre objectif de démontrer l'absence d'effet néfaste d'une instillation vésicale de notre solution bactérienne.

Raffinement

Les chiennes seront hébergées dans des conditions compatibles avec leurs besoins (logement en binôme dans des chenils suffisamment grands sur litière adaptée). Elles auront accès à l'extérieur au moins une fois par jour et auront constamment accès à l'eau. A l'exception des journées où les chiennes seront anesthésiées ou sédatées, elles seront nourries une fois par jour, le matin. Lors des anesthésies/sédations, elles ne seront nourries qu'après réveil complet. A l'occasion des endoscopies, un protocole d'analgésie adapté est mis en place pendant et dans les heures qui suivent afin de garantir l'absence de douleur. Les prélèvements sanguins et urinaires seront réalisés par du personnel formé à ces actes, après un entraînement préalables des animaux à la contention pour minimiser le stress lors de la procédure expérimentale. Les chiennes sont a minima visitées deux fois par jour. Après chaque procédure sous anesthésie, elles font l’objet d’une surveillance accrue (toutes les heures) dans les 4h post-examen puis 2 fois par jour pendant la semaine qui suit. Sont alors notés : le comportement général, la prise alimentaire, les signes d’atteinte du bas appareil urinaire (douleur à la miction, sang dans les urines, difficulté à uriner, mictions répétées, léchage génital excessif), signes de douleur abdominale. Quotidiennement, un examen clinique est réalisé incluant notamment la prise des constantes vitales. Ces informations sont consignées dans un tableau de scoring et gradé de 0 (absent/normal) à 4 (très marqué/modifié). Toute modification pouvant trahir la présence de douleur (score ≥1) sera utilisée comme point limite. L'animal concerné sera examiné immédiatement par l'un des vétérinaires impliqués dans l'étude et, selon le contexte, des examens complémentaires pourront être réalisés pour déterminer l'origine de ces signes (bilan sanguin/urinaire, imagerie). Autant que de besoin, un traitement analgésique sera mis en place immédiatement (méloxicam 0,1 mg/kg). La réponse inadéquate à l’ administration du traitement analgésique et/ou la mise en évidence d’une complication inattendue constitueront un critère d’arrêt. La chienne atteinte ne suivra pas la fin de la procédure expérimentale. Un traitement antibiotique visant la bactérie utilisée (amoxicilline 10 mg/kg matin et soir) sera utilisée en première intention, une culture urinaire avec antibiogramme sera réalisée pour ajuster éventuellement le traitement.

Choix des espèces

La chienne est une espèce particulièrement concernée par les infections urinaires, il s'agit de l'une des maladies infectieuses les plus fréquentes dans cette espèce. L'expérimentation doit se placer le plus proche possible du contexte clinique de l'utilisation de EcN2.0. Cliniquement, l'infection urinaire de la chienne est proche de celle de la femme. Ainsi nos résultats pourront être en partie extrapolés dans l'optique d'une utilisation en médecine humaine. Les chiennes seront âgées de 1.5 an, les infections urinaires étant davantage fréquentes chez les adultes.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'intestin est provoquée par un produit qui altère la barrière intestinale, avec perte de poids et sang dans les selles, avant gavages, prélèvement de sang par ponction du cœur et mise à mort pour prélever plusieurs organes. Le porteur restreint l'étude aux mâles, décrits comme plus sensibles, au nom de la réduction du nombre d'animaux. Le projet teste si un produit laitier riche en certains lipides prévient cette inflammation.

Objectifs

L’intestin a plusieurs fonctions essentielles à l'intégrité de l'organisme et au maintien d'une santé optimale dont une fonction de barrière sélective limitant le passage de molécules délétères et une fonction d'absorption indispensable aux apports nutritionnels. L'inflammation intestinale modérée est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme l'obésité, le syndrome métabolique, le diabète de type II et les maladies cardiovasculaires. L'inflammation est un mécanisme physiopathologique pouvant altérer l'intégrité de l'intestin. L’alimentation joue un rôle important dans le développement et la sévérité de l’inflammation intestinale. La consommation de certains produits laitiers contenant notamment des lipides polaires laitiers pourrait contribuer à réduire l’incidence ou les symptômes liés à l’inflammation intestinale. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence, dans un modèle de souris avec inflammation intestinale modérée induite par un produit altérant la barrière intestinale pendant 8 jours, les effets préventifs d’une supplémentation en babeurre (riche en lipides polaires) sur l’inflammation, l’intégrité et la fonction de barrière intestinale, le microbiote et d’identifier les mécanismes en lien avec le métabolisme et le devenir intestinal des lipides polaires laitiers.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin est en forte augmentation sur les dernières décennies (environ 4 millions en 1990 à environ 7 millions en 2017), non seulement dans les pays occidentaux mais aussi les pays émergents. Ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes reliant la consommation de produits laitiers riches en lipides polaires et la modulation de la barrière intestinale. Les résultats pourraient contribuer à proposer des pistes de nutrition préventive associées au babeurre et aux lipides polaires laitiers dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ainsi que dans les pathologies humaines marquées par une inflammation modérée comme l’obésité ou le diabète de type 2.

Procédures

Toutes les souris seront gavées oralement une seule fois au cours du test lactulose-mannitol-sucralose pour tester fonctionnellement la perméabilité intestinale. Après un jeûne réduit à 4h sur litière propre, les souris recevront une injection d’une dizaine de secondes en deux points sous-cutanés de 0.5 mL de solution saline afin de stimuler la miction. Après 30 minutes, les souris seront gavées en 10 secondes avec 0.2 mL de solution de lactulose/mannitol/sucralose. Pour le prélèvement de sang par ponction cardiaque, les animaux recevront un analgésique par voie sous-cutanée en moins de 5 secondes afin de réduire au maximun la douleur liée à ce type de prélèvement. Après 30 minutes, les animaux seront anesthésiés par un mélange analgésique/anesthésique par voie sous-cutanée en moins de 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation intestinale par le traitement des animaux avec un produit altérant la barrière intestinale peut induire après quelques jours et en fonction de la dose administrée une perte de poids significative, une altération de la consistance des selles et la présence de sang dans les selles. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsables d’une douleur ou d’un stress de l’animal provoquant alors des comportements anormaux. Une étude pilote a été menée en amont afin de déterminer une dose et un temps pouvant induire une inflammation modérée avec augmentation de la perméabilité intestinale. Au-delà de 8 jours de traitement à 1%, les effets du produit altérant la barrière intestinale sont plus marqués avec une diminution du poids corporel (

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin des procédures. En effet, le sang des animaux doit être collecté pour mesurer les marqueurs sanguins de l'inflammation tels que les cytokines. Certains organes (le côlon, l'intestin grêle, rate, foie, reins) seront également prélevés pour mesurer leur poids et leur taille et étudier leur histologie. Il est alors impossible d’obtenir ces mesures sans la mise à mort des souris.

Remplacement

Il est trop invasif d’étudier les désordres intestinaux inflammatoires humains à travers des biopsies, des coloscopies qui ne sont pas autorisées dans le cadre de la recherche. Il est donc important d’étudier les inflammations intestinales dans un contexte où l’ensemble du système organique peut être étudié et où les données obtenues sont transposables à l’homme. La physiologie des souris, en particulier l’inflammation intestinale et systémique est similaire aux humains. Ces stratégies nutritionnelles pour diminuer ou prévenir l’inflammation devraient permettre d’accroitre les connaissances quant au développement et à la manière de prévenir l’inflammation..

Réduction

Il est désormais clairement établi que le sexe joue un rôle non négligeable dans divers facteurs physiologiques, métaboliques et comportementaux chez la souris. Les données de la littérature ont montré que les souris mâles sont plus prédisposées à développer une inflammation intestinale par un produit altérant la perméabilité intestinale que les souris femelles. Dans un but de réduction du nombre d’animaux, cette étude sera réalisée uniquement sur des souris mâles. Des calculs statistiques ont été réalisés afin de déterminer le nombre minimum d’animaux pour obtenir un effet significatif.

Raffinement

Durant le protocole, les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne (Week-End inclus) pour déceler un potentiel mal-être. Si des signes de souffrance des animaux sont observés, la surveillance sera accrue avec éventuellement la réhydratation des animaux, la mise de la nourriture dans la cage, le changement de la litière. Si l’état des animaux ne s’améliore pas dans des délais définis, la procédure sera stoppée.

Choix des espèces

Les travaux effectués dans ce domaine dans la communauté scientifique sont majoritairement réalisés chez la souris permettant ainsi la discussion et la comparaison des résultats entre eux. De plus, la régulation du métabolisme lipidique chez la souris est proche de celle de l’Homme. Pour les études sur l’inflammation induite par un produit altérant la perméabilité intestinale, les souches de souris les plus utilisées sont les souris C57BL/6J. De plus, les modèles d’inflammation intestinale induite par un produit altérant la perméabilité intestinale chez la souris sont considérés comme modèle pertinent des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin pour la transposition des résultats à l’Homme. Les souris seront commandées à 6 semaines de vie et le protocole débutera à 7 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Ce protocole doit être réalisé sur des animaux jeunes adultes pour que les effets des traitements ne soient pas liés à la croissance ou au vieillissement des animaux.

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie cérébrale reproduisant la maladie de Parkinson, des injections quotidiennes pendant six semaines et un isolement de cinquante jours, avant une perfusion mortelle dans le cœur. Le porteur reconnaît que l'isolement rompt le groupe social et provoque un stress, et décrit un ralentissement des mouvements lié à la lésion. L'objectif est de créer un modèle de prise compulsive de nourriture, un effet secondaire des traitements chez une partie des patients parkinsoniens.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont multiples. Il s'agit donc de modéliser la prise compulsive de nourriture, un effet secondaire non moteur des traitements anti-Parkinsoniens retrouvé jusqu'à chez un tiers des patients, afin de mieux en comprendre la pathophysiologie. Pour cela, nous regarderons, d'une part les effets des traitements seuls, et d'autre part les effets des traitements cumulés à la lésion dopaminergique caractéristique de la maladie de Parkinson. Effectivement, aucun modèle animal de trouble de contrôle des impulsions (effet secondaire non-moteur des traitements) n'est actuellement disponible et l’étude de leurs développement et conséquences reste donc difficile. De plus, l’incidence de la maladie de Parkinson ne cesse d’augmenter du fait du vieillissement de la population. Les troubles du contrôle des impulsions affectent de façon non négligeable la qualité de vie des patients, notamment la prise compulsive de nourriture qui entraîne des perturbations importantes du sommeil (les patients grignottent beaucoup, notamment au cours de la nuit) et des difficultés sociales au sein de l'entourage proche. Les troubles du contrôle des impulsions touchant jusqu’à un tiers des patients parkinsoniens traités, la compréhension des causes et conséquences est un réel enjeu de santé publique.

Bénéfices attendus

Ce projet va avoir deux pans majeurs d’avancées scientifiques : il va permettre la création d'un modèle de prise compulsive de nourriture, à l’heure actuelle inexistant, par le biais d’une évaluation comportementale et va également permettre d’étayer les connaissances sur les causes biologiques, biochimiques de leur développement ainsi que les conséquences induites dans la maladie de Parkinson. Les analyses sanguines pourront permettre l'identification de biomarqueurs du développement des troubles du contrôle des impulsions. Au point de vue clinique la compréhension des causes et conséquences de l'apparition de troubles du contrôle des impulsions est cruciale pour adapter les stratégies thérapeutiques proposées aux patients parkinsoniens.

Procédures

Le projet est composé d'une procédure regroupant 5 interventions réalisées sur la totalité des animaux inclus dans le projet: une chirurgie cérébrale sous anesthésie gazeuse avec antalgique périphérique et locale (240 animaux), trois prélèvements sanguins sous anesthésie (240 animaux), une évaluation comportementale de 7 semaines (240 animaux) associé à un traitement par injection quotidienne intrapéritonéale sur animaux vigiles (1minute d'injection, 42 injections, 120 animaux) ou sous cutanée sur animaux vigiles (30secondes d'injection, 42 injections, 180 animaux) dépendamment de la molécule testée. Enfin, une perfusion intracardiaque après une injection létale d'anesthésique en fin de procédure (20minutes, 240 animaux).

Impact sur les animaux

- La chirurgie stéréotaxique peut induire une légère perte de poids et un stress notamment au réveil - L'induction de la dégénérescence neuronale permettant de modéliser la maladie de Parkinson va induire un léger ralentissement de la courbe de croissance des animaux ainsi qu'un ralentissement global de l'activité locomotrice - L’isolement de plusieurs semaines (50 jours d'isolement après 85 jours de vie en groupe) induira un stress dû à la rupture du groupe social pendant l'évaluation comportementale - Les prélèvements sanguins peuvent ponctuellement induire un hématome au niveau de la veine caudale - Les injections répétées quotidiennement du traitement au cours des 6 semaines d’expérimentation peuvent induire un stress potentiel de l’animal au moment de la piqûre ou un hématome à l'endroit de l'injection.

Devenir

Tous les animaux (n=240) seront mis à mort à la fin de l'étude de façon à coupler les résultats comportementaux à des analyses de biologie moléculaire sur les échantillons sanguins ainsi qu'à des anaylses histologiques et biochimiques des cerveaux.

Remplacement

Certaines recherches sur la maladie de Parkinson peuvent être effectuées à l'aide de modélisation basée sur des cultures cellulaires (in vitro) dans le cadre d'études sur les causes de la mort neuronale observée dans la maladie de Parkinson. En revanche, cette approche n'est pas adaptée lorsque l'on s'intéresse aux modifications comportementales. Notre étude ayant pour objectif de modéliser des comportements de prise alimentaire ainsi que d'étudier leurs conséquences cérébrales, ne peut se faire que sur l’animal entier car nécessite l’intégrité des réseaux neuronaux et ne peut donc pas être réalisée in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance. Ces critères impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 15 animaux par traitement testé, par condition expérimentale, et par sexe soit 240 rats afin d'obtenir des résultats statistiques interprétables. De plus, trois prélèvements sanguins seront effectués sur chaque animal de façon à réaliser une étude longitudinale de la modification des facteurs sanguins par la lésion dopaminergique et/ou le traitement permettant une réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (actes réalisés par du personnel expérimenté, médicamentation définie avec le vétérinaire référent et prise de nourriture basés sur le comportement spontané des animaux dans leur cage d'hébergement et ne nécessitant pas d’intervention directe de l’expérimentateur). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec monotoring de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivie au lendemain de la chirurgie voire 48h post-opératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances, appelés points limites terminaux sont définis au bout de arbre décisionnel. Les rats sont hébergés deux par cage dès que possible, avec eau et nourriture ad libitum, sauf à partir de J85 et pendant 50 jours soit jusqu'à J135. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement par bâton de bois à rogner est disponible. Un tunnel sera également rajouté lorsque les animaux seront isolés. Les animaux sont manipulés de façon hebdomadaire dès la chirurgie puis quotidiennement au cours du protocole comportemental, leur permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Le rat possède des réponses neuronales proches de celles observées chez l'Homme. Aussi, la modélisation de la maladie de Parkinson est détaillée et maîtrisée chez cette espèce. Le rat est un animal couramment utilisé dans les évaluations comportementales, notamment dans ce test de prise compulsive de nourriture. Nous utiliserons des rats avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus afin de modéliser au mieux la variabilité interindividuelle humaine. Les animaux utilisés seront adultes, permettant de se rapprocher du stade de développement de la maladie de Parkinson.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une atrophie musculaire est déclenchée chez la souris adulte par injections, puis une partie reçoit un métabolite dans l'eau de boisson, avant la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur indique que les animaux ne montrent pas de signe de souffrance avant sept mois et fixe les expériences au plus tard à douze semaines après le déclenchement. L'étude teste si ce complément freine la fonte musculaire liée au cancer, aux myopathies ou au vieillissement.

Objectifs

Une fonte musculaire sévère est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme le cancer, les myopathies et le vieillissement. Cette perte de masse musculaire (atrophie) est très délétère pour le patient, affectant sa qualité de vie mais aussi réduisant la réponse aux traitements et la survie. Il n’existe aujourd’hui pas de traitement efficace permettant de freiner cette fonte musculaire. Un nouveau modèle de souris génétiquement modifiées a été généré, développant une perte de masse musculaire progressive, induite chez l’animal adulte, et récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Les travaux portent sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cette atrophie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. L’atrophie est induite chez l'animal adulte par des injections d'une molécule inductrice. Avant ce traitement inducteur, les animaux ne présentent aucune pathologie. Les premiers résultats expérimentaux sur ce modèle, montrent que la perte de masse musculaire est en partie causée par un déséquilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines musculaires. Une diminution d’un métabolite essentiel à de multiples fonctions cellulaires a été mise en évidence dans les muscles atrophiés. L'objectif du projet est de tester, dans un premier temps, si la restauration de ce défaut par supplémentation orale avec le métabolite pendant 4 à 12 semaines pourrait avoir un effet bénéfique sur le muscle, comme cela a déjà été observé dans d’autres modèles de pathologie musculaire. Les souris seront mises à mort à 4 et 12 semaines après le traitement inducteur. Dans un second temps, l'évaluation de la pathologie musculaire nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie et la mesure de l’accumulation de protéines marqueurs dans le muscle des animaux. Les souris seront mises à mort 24 heures après les injections de l'inhibiteur. Les muscles seront prélevés et analysés. Pour ce projet un maximum de 200 souris seront nécessaire.

Bénéfices attendus

A ce jour il n’existe pas de traitement permettant de maintenir ou de récupérer la masse musculaire dans les cas d’atrophies pathologiques ou lors du vieillissement. Le métabolite auquel nous nous intéressons est une piste prometteuse dans le traitement de l’atrophie et l’amélioration de la qualité de vie et la survie des patients, il a déjà fait ses preuves dans d'autres modèles de pathologie musculaire. En supplémentant les animaux ,nous espérons voir une amélioration de l'état du muscle, un ralentissement de l’atrophie.

Procédures

Tous les animaux recevront 4 injections consécutives à l’âge de 10 semaines environ, espacées de 24heures. Ensuite, 4 semaines après ces injections, un lot d'animaux recevra 2 injections, espacées de 12 heures. Les souris seront mises à mort après ces injections. Les animaux seront vigiles lors des injections qui ne durent que quelques secondes et sont réalisées par des personnels expérimentés. Une partie des animaux sera traitée par voie oral via une solution buvable contenant un métabolite pendant 4 à 12 semaines après induction du transgène. Ce traitement sera introduit dans l'eau de boisson. Un prélèvement de sang sera fait en point terminal sous anesthésie générale profonde et ces souris seront mises à mort sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La présence du métabolite dans l’eau de boisson pourrait induire une diminution transitoire de consommation de boisson, notamment par la présence d’un gout inhabituel. Nous vérifierons que l'hydratation des animaux est correcte en évaluant les plis de peau. Suite au traitement inducteur de notre mutation, chez la souris adulte, les animaux développent une perte de masse musculaire progressive récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Les souris ne présentent pas de signe de souffrance avant 7 mois après cette induction. Les expériences seront réalisées au plus tard 12 semaines après l’induction du processus d’atrophie musculaire, à un stade où leur état général n’est pas altéré, et où aucune modification de leurs déplacements et prise de nourriture n’est observée. L’évaluation du flux de dégradation des protéines nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie. Les souris seront mises à mort maximum 24 heures après les injections de l'inhibiteur. Les injections régulières sur 4 jours et sur 24h peuvent induire une douleur transitoire au point injection.

Devenir

mise à mort afin de collecter les muscles et les organes pour des analyses biochimique, histologiques et métabolomiques approfondies

Remplacement

Des expériences dans les cellules seront réalisées en amont, et de manière complémentaire. Cependant, les modèles in-vitro ne permettent pas une étude de traitement au-delà de quelques jours. Le modèle murin est essentiel pour étudier les conséquences musculaires des maladies chroniques et également étudier l’impact des défauts musculaires sur le métabolisme global de l’organisme.

Réduction

Le nombre d’animaux minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs sera utilisé. Le maximum de données pouvant être générées à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une consultation approfondie de la littérature permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Des effectifs de 10 animaux maximum par groupe seront utilisés. Des tests statistiques seront utilisés pour s'assurer de la robustesse des résultats obtenus. Afin de réduire le nombre d’animaux, la seconde partie du projet ne sera réalisée que si le traitement, réalisé en première partie du projet, montre un effet satisfaisant sur le maintien de la masse musculaire. Enfin, des échantillons collectés dans la première partie seront utilisés comme controle de la seconde partie du projet.

Raffinement

Le traitement avec le métabolite d'intérêt sera ajouté à l'eau de boisson, cela limitera le stress chez l’animal. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée pour détecter les signes de mal-être ou de souffrance. Les animaux seront pesés 2 à 3 fois par semaine pendant les 4 premières semaines de traitement (en même temps que le renouvellement de l’eau tous les 2 à 3 jours) puis toutes les semaines. La durée du traitement pourra être ajustée en fonction du comportement, du poids et de l'état des animaux. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront mis à mort immédiatement si signes de souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d'animaux génétiquement modifiés. La physiologie musculaire des souris est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour que l’on puisse en tirer des données extrapolables. La souris est un modèle très accessible, de maintien aisé et manipulable génétiquement afin de répondre au questionnement scientifique. Le projet porte sur la compréhension des mécanismes impliqués dans l'atrophie musculaire induite par l'activation d'une signalisation d'intérêt, après la phase de croissance post-natale du muscle, dans le muscle adulte. L’induction du transgène est donc réalisée à la fin de cette croissance post-natale vers 10 semaines environ. L'étude à deux stades 4 semaine et 12 semaines après l'induction de l'expression du transgène est motivée par des résultats expérimentaux préalables.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie est créée chirurgicalement sous anesthésie, puis un substitut de peau humaine est greffé sous leur peau, avant leur mise à mort échelonnée à deux, quatre et douze semaines pour prélever la zone greffée. Le porteur signale la douleur de la chirurgie et le stress de l'isolement d'une semaine, atténués selon lui par l'analgésie et des cages transparentes. Le projet évalue la tenue dans le temps d'un substitut cutané destiné à traiter des plaies humaines.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer chez la souris la fonctionnalité au cours du temps d’un substitut cutané humain greffé sous la peau, ainsi que la dégradation progressive de la matrice support de ce substitut cutané humain. Le substitut cutané humain est un produit de thérapie innovante développé en utilisant des cellules humaines isolées à partir d’un prélèvement de peau humaine et cultivées sur une matrice biologique support. Le substitut cutané humain, ou la matrice biologique support, sera greffé sur des souris dépourvues d’un système immunitaire fonctionnel, afin d’éviter tout rejet. Des prélèvements de la région greffée seront effectués à différents temps après réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support afin de réaliser un ensemble d'analyses.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer tout ou partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. De nombreux substituts cutanés biosynthétiques ont été développés et sont pour certains utilisés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique,… mais leur efficacité et leur tenue dans le temps ne sont pas très bonnes. Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies ou de remplacer une peau nécrosante.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support effectuée sous anesthésie générale. Un substitut cutané humain ou une matrice biologique support sera placé sous la peau par l’intermédiaire d'une incision qui sera ensuite refermée. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures après. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes seront observées quotidiennement et photographiées 2 fois par semaine, et un scoring de différents paramètres sera effectué. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Le maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant une semaine après la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les points de suture effectués au niveau de la peau incisée, et qu’elles ne se retirent le substitut cutané humain ou la matrice biologique support placé sous la peau, puis elles seront replacées à 2 par cage.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support peut engendrer une souffrance mais sera limiter au maximum pa r l'utilisation d’une couverture analgésique. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées pendant une période transitoire d‘une semaine, nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les points de suture au niveau de la peau incisée et qu’elles ne se retirent le substitut cutané humain ou la matrice biologique support placé sous la peau, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque souris au cours de cette période transitoire d’une semaine de voir au moins une de ses congénères. A l’issue de la semaine d’hébergement en cage individuelle, les souris seront replacées à 2 par cage.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 30 souris seront mises à mort à différents temps après réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support, 2 semaines, 4 semaines et 12 semaines, avec 5 souris par temps de prélèvement, par injection intrapéritonéale d’une surdose d’euthanasique effectuée sous anesthésie gazeuse . Un prélèvement sera effectué au large de la zone de greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support pour la réalisation d’un ensemble d'analyses qui permettront de caractériser la fonctionnalité du substitut cutané humain évalué et de suivre la dégradation progressive de la matrice biologique support au cours du temps.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes obtenus sur modèle de greffe cutané. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction de la plaie cutanée puis de la réalisation de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) ainsi qu’après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant la réalisation de greffes cutanées. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein dans la glande mammaire, puis des injections répétées d'un candidat médicament sous contention, avant d'être tuées par rupture des vertèbres cervicales. Le porteur signale une possible cachexie et une gêne à la marche liée au volume de la tumeur. Il affirme n'avoir "pas d'autre choix" que la souris pour reproduire un "organisme entier", l'étude constituant une étape vers un dossier réglementaire commercial.

Objectifs

Depuis plus de 10 ans, le cancer est la première cause de mortalité en France. Or il a été démontré qu'une molécule est exprimée, voire fortement surexprimée, au sein du microenvironnement tumoral (humain et murin). Ainsi, cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, principal cancer retrouvé chez les femmes en France. Il y a donc une nécessité de développer de nouveaux traitements à l’heure actuelle afin d’améliorer la survie des patientes. Ce projet a pour but d’évaluer le potentiel anti-tumoral d’un candidat médicament qui en plus d’inhiber la vascularisation tumorale, a d’ores et déjà démontré des effets anti-tumoraux dans différents modèles murins de cancer tels que le cancer de la peau, cancer cérébral et le cancer ovarien. Il a également été montré dans ce dernier modèle la capacité du candidat médicament à activer l’immunité anti-tumorale. L’objectif de notre projet sera donc d’évaluer le potentiel thérapeutique et la pharmacologie du candidat médicament. Pour cela, un effet dose sera évalué en analysant la croissance tumorale au sein d'un modèle de cancer mammaire ainsi que la vascularisation grâce à la technique dite de "matrigel plug". Ces deux premières procédures permettront la détermination des paramètres pharmacologiques et pharmacocinétiques. Une fois la dose efficace déterminée à l'aide de ces deux premières études, nous analyserons l’effet de la dose efficace sur la réponse immunitaire dans les tumeurs. Pour cela, le modèle de tumeur mammaire est un modèle intéressant pour étudier les relations entre la tumeur et le système immunitaire en respectant la physiologie de développement tumoral. Enfin, le 3e volet de l’étude consistera à comparer quatre formulations du candidat médicament afin de déterminer celle qui pourrait améliorer l'efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus par le candidat médicament sont une diminution de la croissance tumorale liée à une augmentation de la réponse immunitaire ainsi qu’une diminution de la vascularisation tumorale selon un effet dose. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de valider les résultats obtenus in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée au candidat médicament dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo (tumeurs vascularisées et système immuno-compétent). Cette étape, associée à la détermination d’une dose efficace de traitement et d’une formulation adaptée, constitue un prérequis à la constitution de dossier réglementaire lors du developpement pharmaceutique.

Procédures

Pour toutes les procédures (toutes les souris) : identification des souris par tatoo au niveau des oreilles (durée: moins d'1min) sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois). Procédures 1, 3 et 4 (pour toutes les souris) : - Injection de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois, durée: moins de 5min) - Injection de traitement par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur animaux vigiles placés dans un tube de contention (durée: 5min) 3 fois par semaine pendant 3 semaines Procédure 2 (pour toutes les souris) : - Injection d’une solution de protéines matricielles, contenant un facteur favorisant la vascularisation, dans le flanc des animaux, sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois, durée: moins de 5min) - Injection de traitement par voie intraveineuse, dans la veine de la queue, sur animaux vigiles placés dans un tube de contention (durée: 5min), 3 fois par semaine pendant 2 semaines. Procédure 1 (souris du groupe satellite) : - Prélèvements sanguins sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (5 fois : submandibulaire gauche, submandibulaire droite (durée: 1min), rétoorbital gauche, rétroorbital droit (durée: moins d'1min), ponction intracardiaque après euthanasie) répartis au cours du temps jusqu'au sacrifice des animaux.

Impact sur les animaux

Une cachexie : d'après la bibliographie, la cachexie apparaît principalement au stade métastatique du développement tumoral environ 5 à 6 semaines suivant l’inoculation des cellules tumorales. Il est donc peu probable que la cachexie apparaisse après les 3 semaines de traitements néanmoins le risque que quelques animaux en présente n’est pas totalement exclu. Une gêne à la locomotion due au volume tumoral en raison de la localisation de la tumeur. Un stress des animaux lors des injections sur animaux vigiles ainsi que préalablement à l'imagerie. Une douleur transitoire lors de l'injection intraveineuse. Une inflammation et/ou une dépilation dans de rare cas à l'emplacement de la tumeur croissante ou de la solution matricielle.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés par rupture des vertèbres cervicales sous anesthésie générale (isoflurane 4%).

Remplacement

Une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. En effet, il est notamment très difficile de recréer exactement, in vitro, l’environnement tumoral. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique du candidat médicament et de définir sa dose efficace et la formulation adaptée avant l’éventuelle réalisation d’essais cliniques.

Réduction

Afin d’être adapté au modèle de cancer mammaire, uniquement des souris femelles seront considérées dans les procédures comportant ce modèle. Pour le modèle in vivo de vascularisation, il s’agira de souris mâles et femelles afin de pouvoir identifier, si nécessaire, une réponse différentielle liée à la synthèse hormonale. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Une attention particulière sera portée à l’observation des points limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera mis à mort. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne) Des outils d’imagerie non invasifs seront utilisés.

Choix des espèces

Souris Balb/c, syngéniques de la lignée de carcinome mammaire 4T1 Travaux antérieurs justifiant de la pertinence de ce modèle murin dans le cadre de l’évaluation de nouveaux agents thérapeutiques dans le traitement de différents cancers. Homologie de la protéine cible Animalerie agréée pour l’espèce souris Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte (jusque environ 1 an chez la souris).

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un stress subi en début de vie, elles reçoivent deux injections d'un vecteur viral dans le cerveau par chirurgie, une puce sous la peau, puis sont soumises à des tests dont une suspension par la queue de six minutes, avant d'être tuées pour analyse du cerveau. Le porteur décrit la suspension par la queue comme génératrice de stress et une douleur locale après l'opération. L'objectif est de comprendre comment un stress juvénile installe l'anxiété à l'âge adulte, avec l'espoir de cibles thérapeutiques.

Objectifs

Pendant la petite enfance, l'enfance et l'adolescence, l'expérience et l'environnement façonnent l'organisation des neurones qui forment la base de la perception et du comportement des adultes. Les circuits cérébraux s'adaptent en fonction des stimulations sensorielles, motrices et sociales pendant des périodes dites critiques. Un certain nombre de troubles neurodéveloppementaux, notamment les troubles du spectre autistique et la schizophrénie, sont connus pour être associés à des anomalies de ces voies cérébrales. Certains neurones du cerveau sont impliqués dans ces périodes critiques et participent à la consolidation des circuits. Un facteur de transcription est capté par ces neurones dans le cerveau, et cela de manière concomitante avec le début de la période critique. Des souris soumises à un stress juvénile précoce présentent des comportements de type « anxieux » à l'âge adulte. Chez ces souris, des changements d'expression de ce facteur dans le cerveau sont aussi observés. De manière générale, le but de ce projet est donc de savoir comment le stress juvénile affecte le cerveau et les troubles de l’humeur comme l’anxiété. Ce projet étudiera les changements du comportement lors de l'installation de l’anxiété chez les souris adultes ayant subi un stress postnatal. De cette façon nous pourrons identifier les mécanismes qui se mettent en place lors de périodes critiques. Ainsi, des souris naïves subiront un stress postnatal précoce. Nous réaliserons ensuite des injections avec un outil viral qui permettra de rapporter une molécule d’intérêt pour augmenter l’expression du facteur de transcription. Grâce à une batterie de tests comportementaux, nous étudierons le comportement anxieux de ces souris à l’âge adulte. Nous nous attendons à obtenir une réduction du comportement anxieux chez les souris ayant reçu les injections de l’outil viral. De plus, une modification dans le fonctionnement et le développement des neurones est attendue.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l'origine des symptômes liés à l'anxiété. Il fournira aussi de nouvelles cibles de traitement pour les troubles du développement du cerveau caractérisés par une maturation et un fonctionnement défectueux d'une population de neurones appelés les interneurones.

Procédures

Deux injections (une par hémisphère) seront réalisées dans le cerveau avec des outils viraux chez chaque souris au début de l'âge adulte. Le temps total de la procédure de chirurgie est d'environ 30 min (incluant 10/15 min d'injection). Implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes). Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. Un test comportemental étudiant le stress durera 6 minutes. Une injection de produits anesthésiques : durée moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Ce projet comprend des injections intracérébrales, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'injection. Lors du test étudiant le stress, les souris seront suspendues par la queue pendant 6 minutes, ce qui peut engendrer un stress.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Nos recherches portent sur les effets du stress postnatal sur la plasticité du cerveau. Elles nécessitent des modèles animaux pour comprendre comment l'environnement juvénile affecte le comportement à l'âge adulte. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent du développement du cerveau de la naissance à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'étudier un système dans son ensemble, à cet égard la souris est un modèle pertinnent car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme.

Réduction

Des travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections intracérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales ainsi que des prérequis statistiques nous ont permis de démontrer qu'un nombre de 12 souris par condition expérimentale est nécessaire. Ceci nous permet d'obtenir une puissance statistique satisfaisante tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. En fonction de la répartition en cloche des données nous utiliserons un test statistique paramétrique ou non paramétrique pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux (stressée, contrôles et stressées + traitées avec un vecteur viral).

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Toute la procédure chirugicale sera réalisée sous anesthésie. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les injections pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. En post-opératoire une solution d’une crème cicatrisante sera appliquée localement sur les plaies. Une surveillance du site d'injection après les injections et de l'état des animaux sera réalisée pour réagir à tout signe de souffrance La modification du comportement (posture voûtée, poil hirsute, lenteur des mouvements, rétrécissement orbitaire) sera traitée par analgésique en intrapéritonéale. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'Homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la plasticité du cerveau et des effets du stress en début de vie. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines, en particulier dans le cadre de maladies neurologiques étant donné que la souris présente une organisation du système nerveaux proche de celle de l'Homme. Les animaux seront utilisés à l'adolescence. Des injections intracérébrales seront effectuées pour modifier l'effet du stress reçu lors de la période postnatale car à cet âge cette région du cerveau est encore plastique. Le comportement sera évalué à l'âge adulte, lorsque le phénotype anxieux se manifeste.

104 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés seuls pendant dix-sept jours, reçoivent des administrations orales quotidiennes puis un composé anti-obésité, et passent en cage à calorimétrie avant d'être tués pour prélever le foie et le tissu adipeux. Le porteur qualifie l'isolement d'"incontournable" au nom de la "nécessité" de mesurer individuellement les dépenses énergétiques, alors que le rat est un animal social. Les composés testés relèvent d'un développement commercial visant une éventuelle mise sur le marché.

Objectifs

Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de composés développés en tant que traitements anti-obésité sur le métabolisme énergétique chez le rat sauvage.

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur les dépenses énergétiques, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux recevront des administrations quotidiennes de véhicule pendant 7 jours avant traitement pour les habituer à la procédure d'administration. Le traitement en lui-même est aigu et donc limité à une seule administration. Le poids corporel des animaux sera mesuré 7 fois au cours de l'étude. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d'un système de mesure par calorimétrie indirecte pendant 72h (24h d'habituation suivies de 48h de mesure).

Impact sur les animaux

L'hébergement individuel peut induire une nuisance chez les rats qui sont des animaux sociables, mais il s'avère incontournable de par la nécessité de mesurer les dépenses énergétiques, l'activité locomotrice et la prise alimentaire individuels lors du passage dans les cages métaboliques. Si les animaux n’étaient isolés que pendant les mesures en cages métaboliques, cet isolement soudain pourraient induire un stress sur les animaux et perturber la validité des mesures. C’est pourquoi nous préférons isoler les animaux dès réception, et les laisser s’habituer à cet état pendant ls 14 jours que précèdent la mesure en cages métaboliques. . Il est à noter que pour ces dernières, les méthodes d'enregistrement employées sont totalement non-invasives. Les traitements par voie orale et les mesures de poids corporel à l'état vigile peuvent être source de stress ou de nuisances. Enfin, à l'issue de l'étude, les rats seront mis à mort par administration d'Euthasol (Virbac).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les organes prélevés (tissus adipeux, foie) qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur les dépenses énergétiques, le poids corporel, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant les 17 jours de l'étde du fait de la nécessité de mesurer précisement l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de tubes en carton et de briquettes spécifiques pour rongeurs. Les expérimentateurs en charge de la manipulation des animaux et des administrations orales sont rodés à ce type de pratique. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Dans ce cadre, en cas de besoin, une analgésie sera mise en place par administration de buprénorphine.

Choix des espèces

Le modèle rat Sprague Dawley a été choisi afin de conserver le même modèle que celui employé dans des études précédentes réalisées par le client, notamment des études préalables de pharmacocinétiques. Les animaux seront utilisés à l'âge jeune adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

100 moutons vont être utilisés, brebis gestantes et agneaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et une partie des brebis réutilisée dans d'autres projets. Chaque brebis subit trois laparotomies sous anesthésie générale, tandis qu'une malformation de la moelle épinière est créée chirurgicalement chez son fœtus à mi-gestation, puis réparée, avant une naissance par césarienne et six mois de vie suivis de la mise à mort. Le porteur indique un taux de fausse couche d'environ 40 %, imposant d'opérer 50 fœtus pour obtenir 30 agneaux vivants. L'objectif est de tester une thérapie cellulaire avant un éventuel passage chez le fœtus humain, les bénéfices annoncés restant au conditionnel.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer le bénéfice de l’utilisation de la thérapie cellulaire comme traitement adjuvant de la chirurgie in utero (pendant la grossesse) des myéloméningocèles (MMC) dans le modèle ovin, avant les essais chez le fœtus humain. La MMC est une malformation congénitale ayant des conséquences neurologiques sévères. Les lésions cérébrales associées peuvent entraîner une déficience intellectuelle en général modérée. Les personnes atteintes peuvent présenter un handicap moteur (déficit moteur et angle anormal des jambes, raideur) nécessitant une assistance orthopédique, des anomalies de la colonne vertébrale, de l’incontinence urinaire et/ou anale nécessitant des auto-sondages, un traitement par laxatifs et des lavements rectaux. Il est démontré que la chirurgie des MMC in utero apporte un bénéfice pour les enfants, comparée à une chirurgie réalisée après la naissance, en améliorant leurs fonctions motrices (capacité à marcher) et les potentielles complications cérébrales liées à cette malformation. Cependant ce bénéfice reste moindre puisque 71% des enfants restent dans l’incapacité de marcher sans orthèses à l’âge scolaire et 62% d’entre eux sont contraints à réaliser des sondages urinaires quotidiens. Depuis 2 ans la thérapie cellulaire est expérimentée comme traitement adjuvant de la chirurgie in utero à ciel ouvert des myéloméningocèles chez le fœtus ovin. Les derniers résultats sont extrêmement prometteurs avec une nette amélioration des capacités de déambulation à la naissance chez les agneaux. Il existe deux techniques de chirurgie in utero des MMC chez le fœtus humain : la chirurgie “à ciel ouvert”(c’est-à-dire avec ouverture de l'utérus) et une chirurgie moins invasive dite foetoscopie impliquant la réalisation de mini-incisions pour le passage des instruments, ce qui permet de limiter le risque d’accouchement prématuré et qui permet un accouchement par les voies naturelles. À ce jour, les expérimentations de la thérapie cellulaire n’ont eu lieu que lors de chirurgies à ciel ouvert. Il est maintenant nécessaire d’expérimenter l’utilisation de ces cellules en utilisant la fœtoscopie, avec l’utilisation d’une solution liquide de cellules plutôt qu’un patch pour pouvoir l’introduire par ces mini-incisions.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer une amélioration du pronostic des agneaux ayant eu une greffe de cellules au cours de la chirurgie in utero par fœtoscopie, sans induction de tumeurs: - bénéfices cliniques à court et moyen terme (6 mois de vie) : amélioration du score de motricité des agneaux, score SLR (Sheep Locomotor Rating) - bénéfices histologiques : augmentation de la densité neuronale au niveau de la moelle épinière et diminution de la fibrose entre la moelle et le tissu cutané pour les agneaux ayant reçus les cellules souches - absence de tumeur 8 mois après la greffe des cellules (53 jours de vie prénatale + 6 mois de vie postnatale)

Procédures

Chaque brebis sera soumise aux procédures chirurgicales suivantes, toutes réalisées sous anesthésie générale : 1/ temps n°1 au 75e jour de gestation : laparotomie et ouverture de l’utérus sous anesthésie générale Durée : environ 30 minutes 2/ temps n°2 au 90e jour de gestation : laparotomie et mise en place de trois trocarts intra-utérins pour fœtoscopie sous anesthésie générale (passage de trois tubes au travers de la paroi utérine pour passe une caméra et des instruments) Durée : environ 90 minutes 3/ temps n°3 au 143e jour de gestation : laparotomie et ouverture de l’utérus sous anesthésie générale Durée : environ 15 minutes Chaque agneau (n= 50) sera soumis aux procédures chirurgicales suivantes, toutes réalisées sous anesthésie générale : 1/ création chirurgicale de la myéloméningocèle au 75e jour de gestation sous anesthésie générale : Durée : environ 20 minutes 2/ réparation chirurgicale de la myéloméningocèle à 90 jours de gestation Durée : environ 30 minutes 3/ Naissance par césarienne à 143 jours de gestation Après la naissance, les agneaux sont maintenus en vie pendant 6 mois. Aucun prélèvement n’est prévu pendant ces 6 mois. 4/ Mise à mort à 6 mois de vie Chaque agneau sera mis à mort après 6 mois de vie pour dissection anatomique et analyse histologique afin de rechercher une amélioration de la réparation de la moelle épinière ainsi que l’absence de tumeurs chez les agneaux ayant bénéficié de la thérapie cellulaire lors de la chirurgie in utero de leur myéloméningocèle.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes Pour les brebis : - mobilité réduite de J70 de gestation à J143 de gestation (temps pendant lequel elles sont hébergées en vue des chirurgies) : effet indésirable diminué par la possibilité de sortir les animaux des cages afin de favoriser une déambulation plus libre - douleurs post opératoires : effet indésirable prévenu par une surveillance très rapprochée et un protocole précis de prise en charge de la douleur. Pour les agneaux au cours de la vie prénatale : - Douleurs per opératoires : effet indésirable prévenu par un protocole d'anesthésie/analgésie passant la barrière placentaire (similaire à ce qui est réalisé chez le fœtus humain) Pour les agneaux au cours de la vie postnatale : - mobilité réduite : effet indésirable diminué par la possibilité de sortir les animaux des cages afin de favoriser une déambulation plus libre - potentiels troubles locomoteurs secondaires à la création de la malformation : il est possible que les agneaux présentent des troubles de la déambulation à l’instar des symptômes observés chez les enfants présentant une MMC. - potentiels troubles sphinctériens secondaires à la création de la malformation : il est possible que les agneaux présentent une incontinence urinaire à l’instar des symptômes parfois observés chez les enfants présentant une MMC.

Devenir

Les brebis gestantes seront maintenues en vie après la chirurgie de création et après la chirurgie de réparation. Elles seront mises à mort au cours de la césarienne, après clampage du cordon ombilical. Les brebis ne peuvent être réhabilitées car elles auront eu trois laparotomies. En revanche, 40% de l’effectif des brebis seront réutilisées dans d’autres projets de recherche au cours de procédures sans réveil, à l’issue des césariennes. Les agneaux seront maintenus en vie jusqu’à l’âge de 6 mois, après avoir été opérés in utero à deux reprises et être nés par césarienne. Leur maintien en vie permettra de rechercher un effet pérenne de la thérapie cellulaire ainsi que de l’absence de formation tumorale 8 mois après la greffe des cellules. La mise à mort à 6 mois permettra une analyse histologique pour comprendre le potentiel bénéfice clinique observé (amélioration des capacités de déambulation) en examinant la moelle épinière et les muscles des pattes postérieures. Cette analyse histologique permettra également de s’assurer de l’absence de développement de tumeur avec certitude.

Remplacement

Les expérimentations in vitro préliminaires aux expérimentations in vivo ont permis de s’assurer en amont de la vitalité des cellules greffées, de leurs fonctions neuroprotectrices ainsi que de déterminer le nombre de cellules à greffer. Ce projet de recherche a pour objectif l’expérimentation d’une thérapie à visée humaine. Bien qu’une activité paracrine ayant un effet neuroprotecteur ait été démontré in vitro, l’expérimentation de cette thérapie chez des modèles chirurgicaux animaux est indispensable pour pouvoir étudier la réelle efficacité de ces cellules in vivo et l’absence d’effets secondaires néfastes.

Réduction

Des expérimentations in vitro menées en amont ont permis de potentialiser les expérimentations in vivo, notamment en déterminant le nombre de cellules à inclure dans les patchs. Des brebis présentant une gestation singleton (un seul agneau) seront dans le mesure du possible sélectionner afin de limiter le nombre d’agneaux jumeaux. Des résultats préliminaires nous ont permis de calculer le nombre minimal d’animaux à inclure pour permettre une analyse statistique et de tirer des conclusions pertinentes. Le critère de jugement principal sera le score de motricité validé chez le modèle ovin. Les autres paramètres statistiques étudiés seront : la présence de mouvements de la queue, la miction spontanée, l’amyotrophie des pattes postérieures, l’aire de la moelle épinière, la densité neuronale, l’épaisseur de la fibrose. Les variables quantitatives seront comparées en utilisant un test de Mann-Whitney et les variables qualitatives en utilisant un test du Chi2. Le taux de fausses couches après réalisation de deux chirurgies in utero est élevé, atteignant environ 40 %. Il est donc nécessaire d’opérer 50 agneaux pour obtenir 30 agneaux vivants à la naissance (15 dans chaque groupe). Il est malheureusement difficile d’imaginer une réhabilitation des brebis car elles auront subi trois laparotomies. Cependant, il est prévu de réutiliser les brebis sur des procédures de recherche sans réveil.

Raffinement

Les animaux sont pris en charge dans des locaux adaptés pour l’accueil des brebis et des agneaux avec la possibilité de sortir les animaux. Le personnel est qualifié et diplômé et a une grande expertise en expérimentation animale. Un habitat adapté et enrichi sera mis en place, en limitant l’isolement des brebis à 5 jours après chaque chirurgie et en leur permettant de voir et d’entendre les autres brebis pendant cette période. Chaque intervention sera réalisée sous anesthésie générale maternelle avec une analgésie fœtale complémentaire si nécessaire. Un traitement antalgique sera administré de manière systématique durant les 5 jours qui suivent chaque chirurgie. La surveillance des agneaux sera réalisée toutes les trois heures pendant les 48 premières heures de vie, puis au minimum trois fois par jour au-delà. Plusieurs fonctions seront évaluées (locomotion continence anale et uriniare, capacité à se nourrir) et seront la base des points limites, avec des scores. En fonction des scores obtenus, une réponse graduée sera effectuée avec mise en place de traitement de physiothérapie, laxatifs, aide à la miction et biberonnage. En cas de non réponse aux traitements mis en place ou en cas de score trop sévère, les décisions d’arrêt seont prises de façon conjointe entre vétérinaires expérimentés.

Choix des espèces

Le modèle ovin de MMC représente le modèle animal le plus proche de la malformation observée dans l’espèce humaine. Ce modèle permet de retrouver les anomalies cérébrales présentes dans l’espèce humaine en cas de MMC (malformation de Chiari de type 2). Il a été validé par de nombreuses équipes dont la nôtre. En plus de mimer la pathologie humaine, le modèle ovin présente de nombreux avantages pour la réalisation de notre projet. Premièrement, ces animaux sont porteurs de grossesses gémellaires ou singletons ce qui facilite le parallèle avec l’espèce humaine. Deuxièmement, la taille de l’animal permet aisément de réaliser une chirurgie sur les fœtus. Enfin, le temps de gestation (145 jours) permet l’organisation de deux chirurgies successives tout en étant suffisamment court pour limiter la durée de l’étude dans des délais tolérables. Il s’agit de brebis sexuellement matures. La création chirurgicale de la MMC aura lieu au 75e jour de gestation (soit à la moitié de la gestation) : cet âge gestationnel est celui validé par les nombreux auteurs ayant travaillé sur ce sujet. Le terme de 75 jours a été choisi car il paraissait difficile d’intervenir chirurgicalement sur les fœtus plus précocement du fait de leur fragilité. La réparation de la MMC aura lieu 90e jour de gestation (0,6 gestation): ce délai a été choisi entre les deux interventions car il est est nécessaire à la survenue de la malformation deChiari. Un délai plus court ne permettrait pas de conclure au succès de la technique chirurgicale en cas de correction de la hernie cérébelleuse. La naissance des agneaux est prévue à 143 jours afin de n’induire aucune prématurité qui pourrait mettre en péril la survie des agneaux et nuire à l’obtention des critères de jugements, notamment cliniques.

29 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie pour implanter une mini-pompe qui diffuse un édulcorant directement dans le cerveau, puis des prélèvements sanguins répétés sur animal vigile lors de tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le porteur signale une perte de poids après l'opération et prévoit la mise à mort de tout animal perdant plus de 10 % de son poids. L'objectif reste de comprendre pourquoi les édulcorants dérèglent le métabolisme du glucose, sans application thérapeutique annoncée.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont l’une des principales causes de décès des personnes atteintes de diabète de type 2 ou d’obésité. Plusieurs études scientifiques ont montré un lien de cause à effet entre l’apparition de ces pathologies et la consommation excessive de sucre. C’est pourquoi, l’utilisation de substituts de sucre, les édulcorants (sucres non nutritifs : SNNs) est en augmentation. L’utilisation de ces édulcorants tout en remplaçant la saveur sucrée n’entraine pas d’augmentation de la glycémie à court terme. Cependant, consommés régulièrement, les substituts de sucres non nutritifs (SNNs) peuvent provoquer une augmentation de la prise alimentaire et une augmentation de la glycémie. Il a été montré que la consommation de SNN sur une courte période pouvait diminuer la sensibilité à l’insuline en réponse à un test de tolérance au glucose réalisé chez des sujets sains. Ces dysfonctionnements métaboliques seraient dus aux récepteurs au goût sucré qui lient ces SNNs. Ces récepteurs sont retrouvés sur la langue mais aussi dans tout l’organisme et en particulier dans le cerveau, au niveau de l’hypothalamus. L’objectif de ce projet sera d’étudier l’effet (les effets) d’un édulcorant à long terme sur la (les) réponse(s) de l’hypothalamus, en particulier de déterminer si les SNNs diffusés dans le cerveau induisent une augmentation de la glycémie, augmentent l’expression des récepteurs liant les SNNs dans l’hypothalamus et si l’hypothalamus joue un rôle primaire ou secondaire dans la commande qui entraîne le contrôle nerveux de la sécrétion d’insuline et la prise alimentaire. Un ensemble de marqueurs sanguins pouvant également affecter la réactivité des vaisseaux sanguins sera dosé. Ce projet sera réalisé chez 29 rats.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations nous permettront de mieux comprendre pourquoi et comment la consommation d’édulcorants entraine un dysfonctionnement du métabolisme du glucose et quel est le rôle de l’hypothalamus.

Procédures

Les 29 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse en présence d’analgésique et d’antiinflammatoire. Cette chirurgie devrait durer ½ heure par animal. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles sont prévus : 5 fois 55 à 105 µl durant deux heures pour le test de tolérance au glucose pour les 29 rats, quatre jours plus tard, 5 fois 5 µl durant deux heures pour le test de sensibilité à l’insuline pour 20 rats, 5 fois 55 à 105 µl pendant 10 minutes à la fin de la procédure 2.

Impact sur les animaux

Les 29 rats subiront des chirurgies. Des injections ainsi que des prélèvements de sang sur animaux vigiles sont prévus. L’effet indésirable attendu est la perte de poids après chirurgie : c’est pourquoi les rats seront observés quotidiennement, pesés tous les 2 jours après la chirurgie et la consommation de nourriture et de boisson mesurées tous les deux jours. L’état général des animaux sera examiné minutieusement (poids, posture, comportement, cicatrisation, état de la plaie). Dans le cas de signes de douleur (posture, mobilité) le traitement analgésique pourra être prolongé et le début des tests retardés. Si un animal présentait une perte de poids persistante pendant plus de deux jours (10% du poids initial), il sera écarté de l’étude et mis à mort (par inhalation progressive de CO2) si son état ne s’améliorait pas.

Devenir

Les 29 rats ayant subi une chirurgie pour la mise en place d’une mini pompe osmotique ne pourront être utilisés dans un autre projet. C’est pourquoi ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez le rat, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.

Réduction

Les procédures concernant l’installation du modèle expérimental et les prises de mesures ont été optimisées et standardisées. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier les différences significatives entre les groupes expérimentaux ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Les analyses simultanées des groupes expérimentaux seront réalisées par. Les conditions d’application des analyses seront vérifiées (seront réalisés selon ces conditions. Des études précédentes ont servi à définir le nombre d’animaux par groupe. Les expériences à mener imposent de tester différentes doses d’édulcorants. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet, la dose la plus faible sera étudiée en premier. Si celle-ci s’avérait suffisante pour induire une hyperglycémie(différence significative par rapport au lot contrôle), les autres concentrations ne seront pas testées.

Raffinement

Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h inversé. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à bâtonnet de bois et rouleaux de carton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent le bien-être des animaux. Le personnel a été formé et maîtrise tous les actes à réaliser. Le travail avec les animaux s’effectue en conditions calmes et maitrisées. Les chirurgies seront réalisées par des personnes compétentes sous anesthésie générale gazeuse. Du matériel stérilisé sera utilisé. Un traitement analgésique et antiinflammatoire sera donné en pré-opératoire, ce qui réduit la douleur post-opératoire. Une injection d’anesthésique local sous cutanée sera réalisée avant incision. Un traitement analgésique et antiinflammatoire post-chirurgical sera donné pendant 2 jours après chirurgie. La chirurgie sera réalisée en maintenant la température corporelle (tapis chauffant). Un gel oculaire sera appliqué pour éviter le dessèchement des yeux pendant l’opération. Le champ opératoire sera filmé avec un microscope et l’opération sera suivie sur un écran afin d’augmenter la précision des gestes chirurgicaux. Des lampes froides seront utilisées pour éclairer le champ opératoire. Une injection dans la cavité abdominale de liquide physiologique réchauffé sera donnée en fin d’opération pour réhydrater les animaux et favoriser l’élimination des toxines. Après opération, les animaux seront allongés dans des cages de réveil chauffées puis transférés dans leur cage individuelle standard avec enrichissement du milieu (rouleau de carton et bâtonnet de bois). Des croquettes humides seront disposées sur la litière. Habituellement, cette chirurgie n’entraine pas de mortalité postopératoire et montre un retour au poids normal après 2 jours. Une surveillance particulière quotidienne (2x par jour, avec inspection approfondie) sera faite pour s’assurer du bien-être de chaque individu.

Choix des espèces

Le rat est une espèce très étudiée par la communauté scientifique, la bibliographie est abondante nous apportant des données d’intérêt dans notre projet, et permettant ainsi la réduction du nombre d’animaux utilisés. Les expériences seront réalisées sur des rats jeunes adultes, âgés de 8 semaines lors de la chirurgie, cet âge correspond aux coordonnées fournies par l’atlas stéréotaxique du rat, et de 12 semaines à la fin des tests ce qui nous permettra de comparer ces résultats à ceux des rats ayant consommés les édulcorants par voie orale que nous avons obtenus dans un autre projet.

4 725 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une forme de la maladie des os de verre, elles présentent des fractures spontanées et subissent biopsies de l'oreille, prélèvements sanguins, injections répétées et jusqu'à dix scanners sous anesthésie, pour tester une biothérapie. Le porteur décrit les fractures comme seul symptôme et affirme n'attendre aucun effet indésirable des gestes techniques. Il conclut que le recours à des souris malades reste "inévitable" et renvoie l'effet pour les patients à un "bénéfice probable à long terme".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer un traitement pour la maladie des os de verre. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour la maladie des os de verres. Il s’agit d’une maladie rare de fragilité osseuse responsable de fractures spontanées pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice probable à long terme pour ces patients.

Procédures

Biopsie d'oreille sur animal vigile 2-3mm durée 10 sec Prélèvements de sang 10-20 sec, 1 par semaine maximum sur animal vigile ou anesthésié Injection IntraPéritonéale (animal vigile) et IntraVeineuse (animal anesthésié) 10-30 sec, 1 à 3 par semaines maximum, Scanner avec anesthésie gazeuse d'une durée maximum de 10 min par scanner et au maximum 10 scanners dans la vie de l'animal.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé est un modèle de la maladie des os de verres qui présentent les memes symtomes que les patients soit des fractures spontanées. Cependant, les animaux ne présentent pas de problèmes pour se mouvoir ou s’alimenter aux âges où nous les utiliserons. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les gestes techniques réalisés sur ces animaux, il n'y a pas d'effets indésirables prévues. Il s’agit d’injection et de prélèvements réalisés par des personnes compétentes et formées. Les tampons qui sont prévus d’être utilisés sont à pH physiologique et peu visqueux.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés dans le but de prélever des organes pour réaliser une caractérisation histologique des tissus.

Remplacement

Globalement, la construction des molécules et l’optimisation de ces dernieres se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Seules les molécules efficaces in vitro vont être testées in vivo. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation de souris malades est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à utiliser le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus.

Raffinement

Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les problèmes dentaires. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et euthanasiés dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant d’Ostéogénèse imparfaite, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il est connu pour mimer les principales caractéristiques de la pathologie. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.