Procédures modérées

7500 rongeurs, 3750 souris et 3750 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une mise à jeun de quatorze heures sur grille, ils reçoivent par gavage ou injection les composés testés ou des agents ulcérogènes comme l'éthanol ou des anti-inflammatoires, avant le prélèvement de l'estomac après la mise à mort. Ces études réglementaires évaluent le potentiel de nouvelles molécules à provoquer ou atténuer des ulcères. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative validée n'existe pour étudier un système digestif "intègre".

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer : - les effets potentiels ulcérogènes gastriques de nouveaux composés, - la capacité de modulation par de nouveaux composés des effets ulcérogènes gastriques de composés comme l’éthanol, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (acide acétylsalicylique, indométacine), les acides (HCl). Les modèles expérimentaux développés chez le rongeur (principalement chez le rat) sont très largement décrits.

Bénéfices attendus

Dans le cadre d'étude de type pharmacologie de sécurité, ces études vont permettre de déterminer d'éventuels effets délétères sur la muqueuse gastrique de candidats médicament et fournir ainsi des indications réglementaires dans le champ de la pharmacologie de sécurité de nouveau candidat médicament. Dans le cadre d'étude d'efficacité/pharmacologie de sécurité de candidat médicament, ces études vont permettre de déterminer le potentiel de modulations par le candidat médicament des ulcères gastriques induits par des agents comme l’éthanol, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (acide acétylsalicylique, indométacine). Cela apportera des indications réglementaires dans le champ de la pharmacologie de sécurité de nouveau candidat médicament ou en terme d'efficacité thérapeutique.

Procédures

Mise à jeun avec hébergement sur grille de 14h pour éviter les phénomènes de coprophagie (1 fois) avant traitements par gavage ou administration intra péritonéale (maximum deux traitements à 1h d'intervalle, durée d'un gavage ou d'une injection intrapéritonale de 15 secondes environ) suivi 6 heures au plus tard après le premier traitement d'une anesthésie pour prélèvement sanguin et prélèvement de l'estomac (et éventuellement d'autres tissus) après la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à l'administration du produit à tester et à son éventuelle toxicité. Les nouvelles molécules ont déjà passé une batterie de tests in vitro qui permet de déterminer les molécules les plus sélectives et sans effet sur certaines cibles pouvant être à l'origine d'effet non désiré. Des nuisances peuvent être liées aux administrations (infection au site d’injection, lésion œsophagienne liée au gavage ou erreur de gavage). Les effets indésirables liés aux produits testés pourront être des troubles du comportement ou les nuisances consécutives de l'ulcération qui peuvent in vivo être objectivées par la présence de traces de sang dans la région périanale. Enfin, la mise à jeun sur grille est également source de nuisance pour les animaux, mais est requise pour éviter les phénomènes de coprophagie.

Devenir

Mise à mort selon les procédures réglementaires pour prélèvements terminaux post mortem requis

Remplacement

L’utilisation de souris ou de rats pour l'évaluation d'effet sur la muqueuse gastrique est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de nouvelles molécules sur un système gastrointestinal intègre, y compris dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative connue et validée à ce jour.

Réduction

Les tests de plusieurs molécules pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un groupe testant les effets de molécule(s) de référence. Une prise en compte des données de pharmacocinétique et de pharmacodynamie dans le choix de doses sera effectuée. L'analyse statistique évaluera les scores d'ulcérations comparant les effets des traitements.

Raffinement

La mise à mort des animaux est réalisée dans une pièce séparée de la pièce de traitement afin de minimiser le stress pour les animaux en attente. Lors du change des animaux (une fois par semaine) une feuille de Suivi Bien Être Animal est remplie en fonction d’une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu’une action puisse corriger ces déviations, alors la mise à mort de l’animal est envisagée. Ces grilles de critères bien-être animal sont archivées. Les animaux resteront hébergés en groupe et des tunnels seront utilisés comme enrichissement.

Choix des espèces

L’évaluation de l’efficacité thérapeutique et de la sécurité pharmacologique des molécules destinées à devenir des médicaments est requise par les autorités. La 1ère évaluation préclinique des effets sur la sphère gastrique est généralement conduite chez les rongeurs (rats, souris). Le stade adulte sera généralement utilisé pour tester l’efficacité de nouvelles entités pharmacologiques, les applications thérapeutiques visant la population adulte. Néanmoins, des investigations pourront être réalisées sur des animaux après sevrage pour répondre à des besoins relatifs au plan d’investigation pédiatrique le cas échéant.

6500 rongeurs, 6200 souris et 300 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une induction tumorale, parfois une irradiation et un implant, puis des traitements répétés et des prélèvements de sang et de moelle osseuse, pour évaluer des composés contre des leucémies et des métastases. Le développement tumoral provoque une perte de poids et des difficultés à se déplacer. Le porteur reprend mot pour mot son argumentaire de remplacement pour justifier le nombre d'animaux, et affirme qu'aucune méthode alternative ne prédit l'efficacité in vivo.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 2 heures). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 minute) Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 1 minute) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : -Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Technique d’imagerie, potentiellement répétée: sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal: -Identification des animaux -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée ou radiothérapie -Suivi des animaux par imagerie Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang ou de moelle osseuse en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : Le développement tumoral induira une perte de poids et des difficultés locomotrices.

Devenir

Les animaux étant porteur de tumeur ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Raffinement

Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. L’induction tumorale se fera sous anesthésie. avec traitement antalgoique adaptée. L’induction tumrale fera l’objet d’une surveillance et de soins post induction seront pratiqués si nécessaires. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse, les animaux en plus d’être anesthésiés recevront une antalgie adaptée. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations du comité éthique en termes de volume, d’anesthésie, de fréquence et d’antalgie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux Dans toutes les cages, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.

221 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un produit allergène et irritant sur le ventre rasé puis sur les oreilles, ainsi que des injections, pour étudier les cellules mémoires de la peau dans un modèle d'eczéma. Le porteur affirme que l'eczéma "ne génère pas de signe de douleur apparente" chez la souris. Les organes sont prélevés après la mise à mort, et il conclut que le recours à des souris transgéniques est "indispensable".

Objectifs

Ce projet de recherche vise à étudier l'effet de la persistance de l’allergène sur la maintenance dans la peau d'une population de cellules immunitaire particulière, ayant une fonction de mémoire à long terme et résidant dans la peau. Les eczémas se développent suite à des contacts répétés avec un allergène de l’environnement, induisant, chez certains individus, la production de cellules spécifiques de cet allergène. Lorsque ces cellules pénètrent dans la peau , elles induisent une poussée d’eczéma et certaines d’entre elles acquièrent alors des propriétés mémoires, c’est à dire une capacité à répondre très rapidement et plus efficacement à des expositions ultérieures au même allergène. Ces cellules mémoires, récemment décrits dans la littérature, ont la capacité de persister pendant de longs mois dans la peau, sans recirculer dans les organes lymphoïdes ou le sang. Pour survivre dans le tissu, ces cellules ont besoin de capter un certain nombre de signaux présents dans leur environnement tissulaire. Toutefois, la nature de ces signaux et leur importance relative reste encore mal caractérisée à ce jour. S'appuyant sur la récente mise en évidence de la capacité des allergènes de nature chimique à persister jusqu’à 1 mois dans la peau, cette étude vise à caractériser l’impact de la persistance de l’allergène sur la biologie des cellules mémoire résidant dans la peau. Ce projet permettra une meilleure connaissance du cycle de vie de ces cellules dans la peau et s’inscrit dans un projet plus global de développement d’une nouvelle solution thérapeutique permettant d’éliminer les cellules responsables de l'eczéma et donc de traiter cette pathologie à sa source.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’eczéma et une meilleure compréhension de la biologie des cellules mémoires résidant dans la peau.

Procédures

Les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles, afin d'induire une réaction allergique (inflammation). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 30 à 45 minutes. Les animaux pourront également être injectés (5 injections au total) avec un produit permettant d'induire sélectivement la délétion de gènes cibles. Ce traitement sera réalisé sur animal vigile par injection du produit (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Enfin, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 2 semaines, afin de suivre de manière quantitative l'inflammation (l'augmentation de l'épaisseur des oreilles étant un des signes de l'inflammation). Ces mesures seront effectuées sur animaux anesthésiés (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes) afin d'éviter de générer un stress trop important chez les souris et pour réaliser les mesures les plus fiables et reproductibles possible.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Il est connu que l'induction d'un eczéma chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. L'induction de l'eczéma peut conduire les souris à se gratter mais aucun signe excessif de grattage n'a jamais été observé. Les souris seront raser sur le ventre en vigile et recevront plusieurs injections au cours de la procèdure ce qui pourra engendrer un leger stress ponctuel.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort et certains organes sont utilisés pour analyse de la reponse immunitaire

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet de récapituler de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. D'une part, les cellules étudiées dans ce projet sont des cellules initialement circulantes, qui pénètrent dans le tissu suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal. Malheureusement, les techniques actuelles d'étude in vitro ne permettent pas de mimer cette étape de pénétration dans le tissu. D'autre part, l'utilisation de modèles de peau reconstruite à partir de cellules murines n'est pas envisageable. En effet, ces modèles sont loin d'être fonctionnels puisqu'il n'existe à ce jour aucune lignée de cellules de peau immortalisés. Cela nécessite donc l'utilisation de cellules primaires (récupérées post-mortem sur des souris) qui ne peuvent pas être congelées et qui résistent mal ex vivo. Enfin, les modèles de peau reconstruites à partir de tissu humain en sont à un stade de développement plus avancé que chez la souris mais ils restent malgré tout inutilisables après 2 semaines de culture. Etant donnée que les expériences de ce projet durent toutes 3 semaines ou plus, l'utilisation de ces modèles de peau reconstruites ne peut être envisagée dans ce projet. Par ailleurs, la question biologique adressée dans ce projet nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques qui existent seulement chez la souris. Dès lors, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable à la réalisation de notre étude.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de l'expérience de l'équipe ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que pour la procédure 1, 3 souris par groupe seront suffisantes pour determiner la bonne dose de tamoxifène à injecter, et qu'afin de minimiser le nombre d'animaux, les doses les plus fortes seront utilisées uniquement si les doses les plus faibles, testées en 1er, n'ont pas été suffisantes pour obtenir l'effet attendu. Les expérimentations décrites ici indiquent donc le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet.

Raffinement

Afin d'optimiser le bien-être des souris, une observation clinique des animaux 5 fois par semaine (durant les 2 premières semaines de chacune des procédures) puis de manière hebdomadaire jusqu'à la mise à mort des animaux sera réalisée. Une grande importance sera donnée à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans cette étude.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les pathologies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. De plus, de nombreux produits, spécifiques à l'immunologie (ex: anticorps, kits de dosage de cytokines), ne sont disponibles que chez la souris. Par ailleurs, la question biologique adressée dans ce projet nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques qui existent seulement chez la souris. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou l’induction de différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, les travaux de recherche sur les cellules mémoires résidant dans la peau sont également réalisés chez la souris. Dès lors, dans l’optique de pouvoir confronter les résultats de cette étude à ceux obtenus par d’autres, l’utilisation du modèle murin est indispensable. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées, au minimum 2 semaines, au sein de l'animalerie avant d'entrer dans les protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 8-12 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies cérébrales, la pose d'une pompe pour des perfusions dans le cerveau et des tests de tolérance au glucose, une partie soumise à un régime gras, pour étudier une voie moléculaire liée au diabète de type 2. Elles sont hébergées seules et tuées par dislocation cervicale pour prélèvement des tissus. Le porteur qualifie de "besoin crucial" la recherche de nouvelles cibles et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les échanges entre organes.

Objectifs

L’obésité participe au développement de pathologies chroniques tel que le diabète de type 2 (DT2). Le DT2 se caractérise par une hyperglycémie chronique résultant d’un défaut de sécrétion et d’action de l’insuline. Au cours de l’obésité, une saturation de la capacité de stockage du tissu adipeux (TA) favorise une hyperlipidémie qui conduit à l’accumulation des acides gras en excès dans les tissus périphériques insulino-sensibles favorisant l’altération de leur fonctionnement. Cette lipotoxicité peut notamment être induite via la synthèse de dérivés lipidiques tels que les céramides : des médiateurs clés de l’insulino-résistance (IR) qui constitue le principal facteur de risque du DT2. Le traitement du DT2 est une priorité de santé publique mondiale, un certain nombre de médicaments antidiabétiques sont arrivés sur le marché mais ont échoués en raison de problèmes de toxicité. Nous avons un besoin crucial de nouveaux paradigmes pour développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Aussi, il est actuellement reconnu que l’hypothalamus joue un rôle crucial dans la régulation de la prise alimentaire et le contrôle de l’homéostasie glucidique via l’intégration de signaux métaboliques périphériques tels que la leptine et l’insuline. L'homéostasie glucidique est principalement contrôlée par la sécrétion d'insuline qui maintien la glycémie en favorisant le stockage du glucose en excès dans la circulation sanguine dans les tissus cibles insulino-sensibles. Il est également reconnu que l’expansion du TA au cours de l’obésité s’accompagne d’une altération de la sécrétion d’adipokines (molécules produites par le TA) notamment la résistine, une hormone connue pour son rôle causal dans le développement de l’IR et du DT2. La résistine agit au niveau de l’hypothalamus en promouvant l’IR et de la neuro-inflammation participant ainsi à la dérégulation de l’homéostasie glucidique. Compte tenu de l’implication de l’hypothalamus dans la pathogénèse du DT2, il est primordial de comprendre quels sont les mécanismes sous tendant des dysfonctionnements hypothalamiques induits par l’action de la résistine et comment ils précèdent et provoquent la survenue de l’IR et du DT2. Nous évaluerons l’implication potentielle de la synthèse de novo des céramides dans la médiation des effets insulino-résistants et inflammatoires de la résistine au niveau hypothalamique et leurs conséquences sur le contrôle de l’homéostasie glucidique.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l’implication de la synthèse de novo des céramides hypothalamiques dans l’inflammation hypothalamique et la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par la résistine. Cette étude vise à mettre en évidence la synthèse de novo des céramides comme nouvelle voie de signalisation participant à la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par l’action hypothalamique de la résistine en situation d'obésité. Cette voie de signalisation contribuerait ainsi à la dérégulation du contrôle hypothalamique de l’homéostasie glucidique induite par la résistine. Le rôle de la synthèse de novo des céramides a été clairement établit dans la lipotoxicité touchant les tissus périphériques. Des recherches préliminaires déjà effectuées au laboratoire laissent apparaitre un nouveau concept dans les dysfonctionnements moléculaires hypothalamiques qui impliquent une interaction entre une adipokine, la résistine, et la synthèse de novo des céramides. Ainsi, cibler la synthèse de novo des céramides au niveau central permettrait de prévenir l’insulino-résistance et l’inflammation hypothalamique et d’en éviter les répercussions néfastes sur l’homéostasie glucidique. Il apparait alors que comprendre plus en profondeur le rôle du métabolisme des céramides hypothalamique permettrait de générer de nouveaux inhibiteurs moléculaires ciblant la synthèse de novo des céramides ou ses dérivés pour prévenir les effets de l’obésité au niveau hypothalamique et ainsi éviter le développement du DT2.

Procédures

Les souris de toutes les procédures (P) subiront 2 chirurgies stéréotaxiques, sauf la moitié des souris de la P1 qui, après les 10j suivant l'injection de l'adénovirus, seront soumises à un régime riche en graisse : - Une 1ère chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) afin d'injecter les adénovirus dans le troisième ventricule. - Une 2ème chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) 10j plus tard pour poser le système de pompe et de canule ALZET pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires (15j). Les souris de la P1 subiront, à la fin des 15j de perfusion ou de régime riche en graisse, un test de tolérance au glucose (GTT) (120 min). Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvement à la queue de sang afin de mesurer l’insulinémie. Les souris de la P2 subiront, à la fin des 15j de perfusion, un test de sensibilité à l’insuline (ITT) (120 min) ainsi qu’un GTT 2 jours après l’ITT. Pendant l’ITT, aux temps 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Pendant le GTT, aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvement à la queue de sang afin de mesurer l’insulinémie. Les souris de la P3 subiront, à la fin des 15j de perfusion, un test de tolérance au pyruvate (PyTT) (120 min) ainsi qu’un test de tolérance au glycérol (GyTT) (120 min) 2 jours après le PyTT. Pendant le PyTT et le GyTT, aux temps 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie (7x5µl de sang = 35µl). Les souris de la P4 subiront, en parallèle de la pose des pompes, l’implantation d’un cathéter intraveineux dans la jugulaire de chaque souris de la procédure dans le but de réaliser un clamp euglycémique hyperinsulinémique (2h) : prélèvement de sang toutes les 20min pendant 2h pour suivre la glycémie. Les souris de la P5 subiront, à la fin des 15 jours de perfusion, une mesure de l’activité nerveuse autonome au niveau de la branche thoracique du nerf vague et du tronc sympathique le long de l’artère carotide (20 min) grâce à une incision de la peau et de la couche musculaire.

Impact sur les animaux

Les procédures font intervenir des injections et perfusions stéréotaxiques, chirurgies qui peuvent entraîner des effets indésirables sur les animaux tels qu’une perte de poids, des troubles alimentaire, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crâne.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de collecter les tissus pour de réaliser des RTqPCR sur l'hypothalamus et le foie, des immunohistochimies sur coupes de cerveau, une analyse lipidomique de l'hypothalamus et estimer l'incorporation du glucose par les tissus insulino-sensibles.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscle, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l’organisme des besoins énergétiques. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions, c’est pour cela que l’utilisation de modèles animaux est encore nécessaire. Cependant, des données préliminaires ont été obtenues sur une culture cellulaire in vitro sur une lignée cellulaire neuronale hypothalamique murine adulte (mHypoA) afin de mettre en évidence l’implication du métabolisme des céramides dans l’inflammation et l’altération de la sensibilité à l’insuline chez ces modèles cellulaires, il nous reste à démontrer que cela est bien le cas in vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux nous avons effectué un travail préliminaire qui nous a permis d’identifier l’enzyme SPT, première enzyme de la synthèse de novo des céramides comme étant impliqué dans la médiation des effets pro-inflammatoire et insulinorésistant de la résistine dans la lignée cellulaire neuronale hypothalamique murine adulte (mHypoA). Le nombre d’animaux a été calculé pour que le test statistique de Kruskal-Walllis puisse être fiable et robuste, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d’animaux le plus faible possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en cage individuelle puisqu’il est primordial pour notre étude de contrôler quotidiennement et individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (maison, nid, bâtons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Il est indispensable d'avoir un suivi personnalisé du poids corporel et de la prise alimentaire, en effet, si nous n'obtenons pas de résultats homogènes au sein d'un groupe expérimental lors de l'analyse d'un GTT ou d'une RTqPCR par exemple, nous remonterons l'historique de l'animal en comparant sa prise alimentaire et son poids corporel notamment afin de vérifier s'il a plus ou moins mangé/pris de poids qu'un autre individu du même groupe expérimental, ce qui permettra d'expliquer certaines différences. Bien que les procédures chirurgicales soient lourdes et douloureuses, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. En effet, les chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous Isoflurane accompagnée d'une injection de Lidocaïne au niveau de site de l'incision avant en tant qu'anesthésique local. Durant toute la procédure chirurgicale, les animaux reposent sur un tapis chauffant et reçoivent une injection de solution saline (NaCl 0,9%, 10ml/kg/h) en sous-cutanée pour prévenir leur déshydratation. Aussi, lors de la phase de réveil, les animaux, toujours sur un tapis chauffant, reçoive une injection intrapéritonéale de glucose 5% (2g/kg). De plus, en période post-opératoire, pour suivre l'antalgie, dès la fin des sutures, du Ketoprofene (2mg/kg) est injecté en sous-cutané, ainsi que le jour suivant l'opération. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux. Elle se compose de score et d'actions à réaliser selon le score. La grille de contrôle du poids est la suivante : normal : score = 0 ; perte de 5 à 10 % : score = 1 ; perte > 15 % : score =2. La grille de contrôle du comportement est la suivante : normal : score = 0 ; prostration, manque de toilettage : score = 1 ; hyperactivité lors de la manipulation, vocalisations sonores répétées : score = 2. Un score égal à 1 dans les deux grilles déclenche la sortie de l'animal de la procédure. Un score égal à 2 dans les deux grilles entraine la sortie de l'animal de la procédure et l'euthanasie si absence d'amélioration des scores.

Choix des espèces

Le modèle de souris est un outil complémentaire essentiel, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.

80 furets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le virus de la grippe par voie nasale, puis subissent des lavages nasaux jusqu'à trois fois par semaine et des prélèvements sanguins sous anesthésie, pour tester des produits antiviraux. L'infection provoque fièvre, écoulement nasal et apathie, et les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur annonce comme bénéfice la "mise sur le marché de nouveaux produits antiviraux" et affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise l'efficacité dans un "organisme entier".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de développer et caractériser des modèles d’infection par le virus de la grippe (virus Influenza) et d’évaluer l’efficacité de différents produits antiviraux. Plusieurs études pourront être réalisées pour répondre à ces objectifs. Lors de celles-ci, des furets (mustela putorius furo) seront infectés avec une suspension virale du virus de la grippe et traités avec les produits à tester.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à la mise sur le marché de nouveaux produits antiviraux.

Procédures

Les animaux seront infectés par une dose unique de virus et recevront une ou plusieurs fois l'administration des produits antiviraux. Des lavages nasaux seront réalisés (jusqu’à 3 fois par semaine à 2 jours d’intervalle) ainsi que des prélèvements sanguins (au maximum 2 fois en 1 semaine + avant euthanasie) sur animaux anesthésiés.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être infectés avec le virus de la Grippe, à une dose d’environ 10^5 PFU/mL, entrainant l’apparition de signes cliniques des animaux reflétant la réalité clinique (principalement fièvre, éternuement, écoulement nasal et apathie). Les animaux seront également manipulés régulièrement pour différents actes (administration des vaccins, pesées, scoring clinique, prélèvements, etc.). Ces actes peuvent stresser les animaux, aussi, pour palier à cela, des mesures de raffinement ont été prévues notamment des anesthésies systmétique pour tous actes nécessitant une contention importante des animaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la phase expérimentale afin de prélever les organes pertinents à la mesure d’efficacité des produits antiviraux en vues d’analyses des charges virales.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable l’efficacité de produits antiviraux dans un organisme entier vivant. Le furet a été choisi car il s’agit d’un modèle classiquement utilisé dans les études sur la grippe.

Réduction

Cette étude a fait l’objet d’une réflexion afin que les effectifs de chaque groupe soient déterminés de façon à pouvoir analyser les résultats avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en groupe tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leur besoin (balles et autres jouets avec une alternance des jouets tous les 15 jours, paniers de repos…). L’infection des animaux par administration intranasale sera réalisée sous anesthésie, ainsi que tous les actes techniques nécessitant une contention importante afin d’éviter tout stress aux animaux. Tout au long de l’étude, un suivi clinique quotidien sera réalisé. Le poids des animaux et la température seront mesurés régulièrement et un suivi clinique avec grille de scoring sera réalisé (a minima quotidiennement après l’infection). Tout score total supérieur ou égal à 12, témoignant d’un état de santé considérablement dégradé de l’animal et sans possible rétablissement conduira à une euthanasie étique des animaux concernés. De façon similaire, toute perte de poids supérieure ou égale à 10% du poids initial de l’animal au cours de l’étude ou durant les 15 derniers jours conduira à une euthanasie éthique.

Choix des espèces

Le furet est un modèle animal dont l’infection grippale mime le mieux la physio-pathogénie humaine (signes cliniques et transmission entre animaux) permettant de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine. Les animaux sélectionnés pour ce projet seront âgés de 3 à 4 mois (stade de jeune adulte) au moment de l’infection. Ce stage de développement est celui habituellement utilisé pour ce type d’étude (pas de contrainte spécifique lié à l’age).

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique pour l'implantation d'un organoïde cérébral humain, puis sont tuées deux à quatre semaines plus tard pour prélèvement du cerveau, non pour produire des connaissances mais pour former des étudiants, à raison d'un animal par étudiant et par instructeur. Le porteur décrit longuement les mini-cerveaux humains cultivés in vitro, tout en affirmant qu'ils cessent de croître après cinq semaines faute d'irrigation. Il justifie l'implantation chez la souris par la nécessité de leur fournir sang et nutriments.

Objectifs

Nous proposons de former de nouveaux chercheurs sur les méthodes modernes utilisées dans le domaine de la neuroscience. Pendant cette formation, nous travaillerons sur les organoïdes cérébraux, une masse de cellules mimant la structure et les fonctions principales du cerveau. Les organoïdes sont cultivés en laboratoire et Ils sont composés de tissus hétérogènes complexes, similaires au cortex cérébral immature. Pour faciliter leur maturité, ils sont transplantés dans le cerveau des rongeurs ce qui les permettre de développer leur système vasculaire. Cette technique permet de modéliser les affections cérébrales congénitales et les troubles neuropsychiatriques. La technique a aussi favorisé l'étude du développement du cerveau. Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront appris et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie leur permettra de réduire le nombre d’animaux lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront appris et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilises lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

Les animaux suivront une chirurgie stereotaxique pour implanter une organoïde cérébral. Entre deux - quatre semaines plus tard, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques. Tous les animaux suivront donc 2 procédures: Chirurgie stereotaxique (Durée prevue: 1 heure) + euthanasie.

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur post-opératoire, risque mineur d’infection de la cicatrice, perte de poids. Dans des cas très rares, le couvercle en verre peut se décoller.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques.

Remplacement

Les mini-cerveaux humains sont produits à partir de cellules souches humaines qui vont se différencier en cellules cérébrales et se développer en une structure mesurant quelques millimètres et imitant la structure physique et cellulaire d’une version complète du cerveau humain. Avec la culture in-vitro, les structures cessent de croître au bout de cinq semaines, car l’oxygène et les nutriments nécessaires n’arrivent pas à atteindre les cellules les plus internes. L’implantation d’organites du cerveau humain dans un cerveau de souris leur donne en revanche tout ce dont ils ont besoin pour grandir et se développer. Le cerveau hôte fournit effectivement suffisamment de sang et de nutriments aux mini-cerveaux pour les maintenir en vie et leur permettre de se développer pendant des mois. En l’espace de deux à 12 semaines, les organoïdes faisaient germer des neurones supplémentaires, y compris ceux trouvés dans des régions très spécifiques du cortex humain : des cellules gliales (y compris les astrocytes) et des cellules souches neurales. Au bout de 14 jours, presque tous les organites développent un riche réseau de vaisseaux sanguins transportant des nutriments et de l’oxygène, leur permettant de survivre jusqu’à 233 jours. Leur structure et leur maturation cellulaire étaient celles d’un nouveau-né.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs. Nous utiliserons un animal par étudiant et par instructeur soit 30 souris/an.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Si l'animal présente un score entre 6 - 16, une injection de carprofène s.c. (dose 5 mg/kg pour souris) sera effectuée et reconduite toutes les 24h si les signes persistent lors des observations suivantes. Si l’animal n’a pas repris de poids au bout de 4 jours, ou si des signes de souffrance sont observés, le traitement sera étendu de 2 jours supplémentaires. Si la récupération ne s’effectue pas bien et si le score des critères de la grille d’évaluation est supérieur à 11 durant 2 jours consécutifs l’animal sera euthanasié par l'expérimentateur par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Avec la culture in-vitro, les organoides cessent de croître au bout de cinq semaines. L’implantation dans un cerveau de souris leur donne tout ce dont ils ont besoin pour grandir et se développer. Le cerveau hôte fournit suffisamment de sang et de nutriments aux mini-cerveaux pour les maintenir en vie et leur permettre de se développer pendant des mois. En l’espace de deux à 12 semaines, les organoïdes faisaient germer des neurones supplémentaires, y compris ceux trouvés dans des régions très spécifiques du cortex humain. Au bout de 14 jours, presque tous les organites développent un riche réseau de vaisseaux sanguins transportant des nutriments et de l’oxygène, leur permettant de survivre jusqu’à 233 jours. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.

40 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de moelle osseuse, puis une blessure musculaire provoquée par injection d'un agent chimique dans les deux pattes, pour étudier le rôle d'une protéine dans la régénération du muscle vieillissant. L'irradiation provoque une immunodépression et une fatigue de plusieurs jours. Le tissu musculaire est prélevé après la mise à mort, et le porteur indique avoir mené en amont des essais sur cultures cellulaires.

Objectifs

Le muscle adulte a la capacité de régénérer complètement après une lésion. Certaines cellules de l'immunité jouent un rôle important dans ce processus, comme les macrophages. Cependant, au cours du vieillissement, le processus de réparation musculaire se fait mal, en partie car les macrophages fonctionnement moins bien. Une protéine X a été montrée comme régulant l'activité des macrophages dans des modèles mimant la réparation musculaire in vitro. La validation du rôle de cette protéine dans les macrophages au cours de la régénération musculaire in vivo chez la souris âgée nécessite l’utilisation d’un modèle de souris présentant une inactivation du gène à l’origine de cette molécule. Une approche réductrice en nombre d'animaux consiste à transplanter les cellules de la moelle osseuse d’un animal déficient pour la molécule dans des souris receveuses âgées saines. De cette manière, seuls les macrophages sont inactivés pour la molécule dans les animaux transplantés. Ensuite, une blessure musculaire avec un agent chimique est réalisée afin de pouvoir analyser la régénération musculaire de ces souris. L’objectif de cette étude est de valider le rôle de cette molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire dans la souris âgée.

Bénéfices attendus

Le processus de régénération musculaire, bien qu'habituellement très efficace est altéré au cours du vieillissement. La connaissance des mécanismes moléculaires du processus de régénération pourrait ouvrir des voies thérapeutiques afin d'aider ce processus. L'étude permettra d'identifier si la molécule est nécessaire dans les macrophages pour la régénération musculaire dans le sujet âgé.

Procédures

Les souris subiront les interventions suivantes : - irradiation (1 fois 10 minute) - injection intraveineuse de moelle osseuse (1 fois 10 minutes sous anesthésie) - prélèvement sanguin (1 fois 10 minutes sous anesthésie) (pour un seul groupe de souris, 1/3) -traitement antalgique par injection sous cutanée - induction de blessure musculaire : injection dans les deux pattes d’un agent chimique dans le muscle situé le long du tibia (1 fois 10 minutes sous anesthésie et analgésie).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (irradiation, injections, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur. L'irradiation puis la transplantation provoquent une immunodépression transitoire. Ceci induit une fatigue générale chez les animaux et une perte de mobilité pendant environ 4 jours, et peut entraîner chez certains individus à une perte de poids de corps jusqu'à 5 jours après l'irradiation, et qui est récupérée ensuite. L'induction de la blessure musculaire engendre un inconfort passager (la douleur étant traitée par analgésique).

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires.

Remplacement

Les alternatives non animales ont déjà été utilisées en amont de ce projet. Il s'agit d’expériences de culture cellulaire in vitro, qui montrent un rôle de la molécule dans la fonction des macrophages dans des modèles qui miment la régénération musculaire in vitro. L'étude analysant les effets du vieillissement, des souris agées (24 mois) sont utilisées.

Réduction

Le modèle mis en œuvre dans ce projet a été choisi car il permet de répondre à la question et car c’est celui qui permet de réduire le plus possible le nombre d’animaux. Les études précédentes ont montré qu’un nombre de 5 individus par point d’analyse est suffisant pour réaliser des statistiques. De plus, l'établissement d'une lésion aux deux pattes de chaque souris permet de réduire par deux le nombre d'animaux, sans impact sur la mobilité des animaux.

Raffinement

Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Le raffinement inclut l'anesthésie et l'analgésie lors de l'injection de la moelle osseuse, du prélèvement sanguin et de l'induction de la blessure musculaire et lors de la mise à mort des animaux. Le raffinement inclut le maintien des animaux dans des conditions prophylactiques strictes et une surveillance quotidienne des animaux après l'irradiation comprenant le dépôt de nourriture hydratée et de gel nourrissant directement dans la cage, une pesée trihebdomadaire, la surveillance de l'état général des individus. Ces mesures de raffinement sont issues de recommandations publiées issues de travaux de la communauté scientifique. Des points limites ont été établis sur l'observation du comportement des animaux et leurs poids.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'Homme dans sa structure et son fonctionnement. Les mêmes séquences de l'inflammation chez la souris et chez l'homme sont observées au cours de la régénération musculaire. Le modèle murin permet des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles (évaluation de la fonction contractile du muscle). L'existence de lignées murines génétiquement modifiées et permettant le traçage des populations de macrophages est un argument supplémentaire pour l'utilisation de cette espèce. Les souris sont utilisées à l'âge de 22 mois car le projet concerne la régénération musculaire chez l'individu âgé.

785 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une implantation sous-cutanée de cellules de glioblastome issues de patients, puis jusqu'à cinq types d'interventions, imagerie de fluorescence, injections répétées sur cinq semaines, gavages sur cinq cycles et perfusion cardiaque. Le sang et les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que le passage par un modèle animal est "indispensable" avant de tester ces molécules sur des patients.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde. Le traitement standard actuel (extraction chirurgicale, radiothérapie et chimiothérapie) n’est malheureusement pas curatif et la survie médiane des patients est de 14 mois. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles thérapies contre ce cancer. Le projet compte évaluer des molécules capables de cibler et d’éliminer les cellules de GBM, seules ou en combinaison avec des nanotechnologies. Le développement pharmaceutique de ces formulations a permis de formuler ces médicaments pour une utilisation clinique (formulations validées sur des lignées cellulaires de GBM humain). Il est maintenant important d’évaluer l’intérêt thérapeutique de ces nouvelles molécules sur différents modèles animaux, avant d’envisager un essai clinique chez l’Homme. Le projet consiste à développer des modèles murins de GBM sous-cutanés à partir de cellules dérivées de patients, dans le but d’évaluer l’intérêt thérapeutique de plusieurs candidats médicaments après administrations répétées (intraveineuses ou sous-cutanées).

Bénéfices attendus

Le but de ces travaux consiste à développer des modèles murins de GBM sous-cutanés à partir de cellules dérivées de patients (PDX), dans le but d’évaluer l’intérêt thérapeutique de plusieurs candidats-médicament après administrations répétées (intraveineuses ou sous-cutanées). Si l’intérêt thérapeutique est attesté et les doses maximales tolérées et efficaces déterminées, ces travaux pourront servir pour réduire le nombre de souris utilisées lors d’une future étude sur des modèles PDX où les cellules tumorales seront injectées au niveau du cerveau (= modèle orthotopique), modèle plus proche de l’Homme. La combinaison des résultats sur ces modèles sous-cutanés et orthotopiques de PDX serviront de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques.

Procédures

Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 2 types d'intervention : l’implantation tumorale sous-cutanée et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation sous-cutanée tumorale et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes, un suivi de la biodistribution des molécules par imagerie de fluorescence (3 sessions au maximum sur une semaine qui durent plusieurs dizaines de minutes chacune), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) et une perfusion cardiaque. Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront jusqu’à 4 types d’intervention : l’implantation sous-cutanée tumorale et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes, des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Certains candidats médicaments pouvant être composés d’un anticancéreux, des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.

Remplacement

L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études de biodistribution et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur intérêt thérapeutique avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Ces traitements visent les femmes et les hommes, c’est pourquoi il est important de démontrer leur efficacité chez les deux sexes. Des travaux in vitro sur cultures cellulaires vont être menés sur les cellules tumorales utilisées dans ce projet préalablement à son démarrage pour valider les formulations testées. Il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ces types de modèle dans ce projet ne peut pas être remplacés par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du GBM, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Réduction

L'étude de toxicité que nous allons effectuer dans un autre projet (n° APAFIS 38113) va nous permettre de raffiner la dose administrée. Le nombre d’animaux d'un sexe sera également réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez l'autre sexe. Un seul modèle tumoral sera testé chez le deuxième sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il est préférable de ne pas utiliser moins d’animaux, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe.

Raffinement

La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffinée la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administré jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet.

Choix des espèces

Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisées ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle sous-cutané de GBM chez la souris.