Procédures modérées

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une substance induisant une fibrose pulmonaire est instillée dans la trachée au cours d'un acte chirurgical de dix minutes sous anesthésie, avec incision et suture, puis les souris sont mises à mort pour prélever les poumons. Le porteur décrit une possible perte de poids, une baisse de mobilité, un essoufflement voire une détresse respiratoire. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise la réponse d'un "organe entier" et retient la souris pour sa proximité respiratoire avec l'humain et ses lignées transgéniques.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique, dévastatrice et mortelle. La FPI est une maladie très rare, moins d’une personne sur 2000 en France. Il s’agit d’une modification de la structure du poumon qui devient un tissu fibreux et ne remplit plus sa fonction essentielle qui est d’assurer les échanges gazeux. Le mécanisme exact n’est pas connu, et impliquerait l’exposition à des facteurs endommageant les poumons (tabac, infections virales, pollution), probablement en association avec un dérèglement des cellules immunitaires (globules blancs ou leucocytes chargés de la défense de l’organisme contre les micro-organismes pathogènes) qui favoriserait ce processus de cicatrisation excessive. Parmi ces cellules immunitaires, nous nous intéressons à une population de cellules qui participent en temps normal à la protection contre les infections. Cependant, ces cellules peuvent dans certaines circonstances avoir un rôle délétère et favoriser l’apparition de maladies comme la fibrose hépatique (cicatrisation excessive avec perte des fonctions vitales du foie). Notre hypothèse est que les MAIT pourraient être recrutés et activés dans les poumons chez les patients présentant une forme sévère de FPI. Des résulats préliminaires obtenus chez la souris ont montré que le degré de fibrose pulmonaire est moins important chez des souris qui possèdent beaucoup de ces cellules, et qu’inversement les souris dépourvues de ces cellules ont une maladie plus sévère. L’objectif de ce projet est de confirmer les résultats obtenus précédemment suggérant que ces cellules immunitaires auraient un rôle protecteur. Pour cela, nous utiliserons le même modèle établi de fibrose pulmonaire dans différents types de souris caractérisées soit par une absence de ces cellules, soit au contraire en ayant beaucoup (comme chez l’homme). L’objectif futur sera d’utiliser ces cellules immunitaires comme cible thérapeutique pour freiner la progression de la fibrose pulmonaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment se développe la fibrose et plus précisément si certaines cellules immunitaires influencent la gravité de la fibrose. A plus long terme, il permettra d’explorer une nouvelle piste thérapeutique, basée sur l’utilisation de molécules capables de moduler l’activité de ces cellules

Procédures

Introduction unique dans la trachée d’une substance induisant une fibrose du poumon, sous anesthésie générale et analgésie pré-opératoire. Il s'agit d'un acte chirurgical de 10 minutes au cours duquel une incision de la peau est réalisée afin d’instiller la substance dans la trachée à l’aide d’une seringue. Une suture de la trachée et de la peau est ensuite réalisée. Cette intervention sera réalisée une seule fois. Aucun prélèvement sur animaux vivants ne sera effectué durant le protocole. Les prélèvements de poumons et les lavages broncho-alvéolaires se feront uniquement après euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

L'incision de la peau peut entrainer une gène, une irritation. Les complications possibles de l'administration de la substance sont : une perte de poids, un comportement anormal comme une baisse de la mobilité, un essoufflement ou une détresse respiratoire.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour le recueil des lavages broncho alvéolaires et des poumons pour l’étude de la fibrose.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. Les expériences sur cellules isolées sont complémentaires et seront réalisées dans la suite du projet, mais ne peuvent pas se substituer à l’expérience sur l’animal en sa globalité, pour plusieurs raisons : - Les expériences in vitro ne permettent pas de contrôler / recréer tous les paramètres intervenant dans le développement de la fibrose du poumon - L’accès au tissu pulmonaire humain est très limité (biopsie à visée diagnostique, greffe de poumons)

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre hypothèse de travail. Après analyse statistique le nombre de souris nécessaires pour mener à bien cette expérience est de 48 animaux (16 animaux dans chacun des trois groupes : 8 recevant la substance induisant la fibrose et 8 recevant une solution saline contrôle).

Raffinement

Le personnel responsable du protocole ou en charge d’effectuer les expérimentations sera composé de personnes formées. Afin de diminuer angoisse et douleur, une source de chaleur (tapis chauffant, lampe) sera mise en place pour éviter l’hypothermie en post-opératoire. Les animaux seront surveillés quotidiennement et un suivi clinique sera réalisé tous les deux jours pour déterminer une éventuelle souffrance avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de scores. Si une douleur/souffrance est constatée, un antalgique sera administré, de l’eau gélifiée et de la nourriture hydratée seront placées dans la cage et le suivi clinique sera quotidien. Si des animaux atteignent les points critiques définis ou ne présentent pas d'amélioration après 24 heures, ils seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle souris est pertinent du fait de son temps de gestation court et de par son système respiratoire qui est très similaire à celui de l’Homme. De plus, les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule ou d’une population cellulaire en particulier dans le poumon. Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont très largement décrits dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. La fibrose pulmonaire est une pathologie humaine du sujet adulte.

350 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort prévue, une partie devant être réutilisée dans d'autres projets et une trentaine proposée à l'adoption vers six à huit ans. On leur provoque une otite externe, infectieuse ou non, puis on les soumet à des prélèvements sanguins à la jugulaire et à des écouvillonnages du conduit auditif pour tester des produits destinés au marché vétérinaire. Le porteur décrit les symptômes attendus, exsudat, rougeurs, démangeaisons et douleur de l'oreille, et une contention légère. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'otite du chien et justifie l'espèce par l'obligation de tester les produits dans l'"espèce de destination".

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place un modèle d’otite externe infectieuse ou non chez le chien et d’utiliser ce modèle pour la sélection de solutions thérapeutiques et/ou préventives pour la prise en charge de l’otite chez le chien. La maîtrise des ces modèles permettra d’évaluer la tolérance et/ou l’efficacité de produits thérapeutiques destinés à une mise sur le marché.

Bénéfices attendus

Ce projet de modèle d’otite expérimentale présente plusieurs avantages par rapport aux modèles d’otites terrain. Les oreilles du chien sont extrêmement sensibles et sont par conséquent prédisposées à des troubles tels que l’otite. Une otite est une inflammation du pavillon ou du conduit auditif en réponse à un traumatisme infectieux ou physique. Il existe plusieurs origines aux otites chez le chien, les otites infectieuses dues à des bactéries ou des champignons, les otites parasitaires et les otites allergiques. Lors d’une infection expérimentale de l’oreille, la dose inoculée (nombre de bactéries / champignons / parasites ou agent allergène ou irritant) est connue et maitrisée et les caractéristiques de l’infection/inflammation sont suivies et maitrisées dès la phase précoce de la maladie. La mise en place et la maîtrise de modèles d’otite induisant des signes cliniques significatifs permettent d’évaluer la tolérance et l’efficacité d’un traitement de l’otite dans des conditions réelles, d’améliorer les phases de screening de molécules/produits et de sélectionner rapidement et de façon plus sure, des molécules/produits présentant une probabilité importante de succès de guérison sur un nombre optimisé d’animaux.

Procédures

Des prélèvements sanguins et / ou microbiologiques seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention légère ne visant qu’à restreindre ses mouvements pour sa sécurité et celle des manipulateurs, selon les procédures en vigueur sur le site et selon les recommandations de la réglementation en vigueur. Avant et éventuellement après induction de l’otite, des prises de sang pourront être réalisées afin de suivre l’état de santé des chiens. Ils seront généralement réalisés à la veine jugulaire (ponctuellement un autre site : veine céphalique) et effectués en environ 3 minutes par chien, au maximum une fois par jour. Durant la phase d’induction de l’otite et au cours du suivi de la régression (efficacité) de l’infection, des prélèvements microbiologiques par écouvillonnage pourront être réalisés dans le conduit auditif externe du chien, sous le contrôle d’un vétérinaire. L'intervention prend moins de 5 minutes par chien et sera réalisée au maximum une fois par jour. La fréquence des prélèvements sera définie et justifiée dans le plan d’étude.

Impact sur les animaux

La mise au point des modèles otite et les études de tolérance / efficacité pharmacologiques, requièrent une contention légère des animaux, pendant des temps très courts, à quelques reprises, durant l’induction de la pathologie et/ou l’administration des produits ou encore lors d’éventuels prélèvements (ex. sang, microbiologiques…). Les symptômes de l’otite externe sont, présence d’exsudat, rougeurs, démangeaisons et gène / douleur à l’extérieur de l’oreille, sur le pavillon et le conduit auditif externe. Il est donc important d’établir un diagnostic rapide et apporter un traitement adapté.

Devenir

Dans le cadre de ce projet, les euthanasies ne sont pas prévues. Ils seront réintroduits dans la colonie des animaux hébergés dans l'animalerie ou adoptés lorsqu'ils atteignent l'âge de 6 à 8 ans. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire l’otite infectieuse ou non infectieuse chez le chien. Il n’existe également pas de méthode alternative pour déterminer la tolérance locale et/ou l’efficacité pharmacologique d’un produit testé dans ce type de pathologie. Ceprendant, un certain nombre d’études in vitro peuvent être déroulées avant la mise en place du modèle : - Des études de microbiologie permettront d’évaluer la pathogénicité des germes utilisés lors du modèle et de sélectionner des souches adaptées au modèle. - Des études de toxicité des molécules et produits testés permettront d’écarter les produits toxiques ou mal tolérés.

Réduction

Dans le plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié de manière à optimiser l’utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre d’animaux permette d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettent de prendre une décision sur l’induction de l’otite et/ou l’efficacité du produit ou des produits évalués. Il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Le modèle sera induit dans une oreille par chien et aucune intervention ne sera réalisée sur la 2ème oreille qui servira de témoin sain. L’unité statistique d’évaluation des résultats est selon les cas, l’animal ou l’oreille.

Raffinement

La mise au point des modèles otite et les études de tolérance et d’efficacité pharmacologiques ne requièrent qu’une contention légère des animaux pour l’induction de la pathologie et/ou l’administration des produits et pour les éventuels prélèvements (ex. sang, microbiologiques …). Les volumes sanguins prélevés et les temps de récupération des animaux seront déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être animal ne sera pas altéré. Depuis leur inclusion dans l’étude jusqu’à la dernière observation, les animaux sont observés au moins 2 fois par jour par le personnel dédié aux soins des animaux. Des observations plus fréquentes sont prévues, particulièrement après l’induction de la pathologie et/ou l’administration des produits, pour s’assurer qu’aucune réaction non attendue n’est observée. Le suivi du comportement des animaux par le personnel dédié aux soins des animaux peut être doublé le cas échéant par une surveillance vidéo en continu. Toute observation d’un état de santé ou d’un comportement anormal d’un animal fait l’objet d’un examen par un vétérinaire qui proposera les mesures adéquates pour protéger l’animal en lui administrant un traitement si nécessaire.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. Les modèles expérimentaux qui permettent d’évaluer les produits vétérinaires doivent être développés dans la même espèce pour plus de pertinence. L’espèce canine a été retenue comme correspondant à l’application clinique future des produits visant à traiter les otites externes infectieuses et non infectieuses. Selon les objectifs de l’étude, les modèles seront à mettre en place chez des chiens sains jeunes adultes de plus de 1 an.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées avant leur réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements à la queue et des injections rétro-orbitaires sous anesthésie générale, pour observer comment les mégacaryocytes de la moelle osseuse libèrent les plaquettes sanguines. Le porteur mentionne des risques d'inflammation, d'infection et d'hypothermie, et prévoit de surveiller l'automutilation au niveau de la queue. Il affirme que ce passage des cellules dans la circulation ne peut être étudié qu'in vivo, les retombées cliniques éventuelles restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle vital dans l’arrêt des saignements. Elles sont produites dans la moelle osseuse à partir des mégacaryocytes, des cellules remarquables par leurs grandes tailles et leur noyau multilobé. Chaque mégacaryocyte libère plusieurs milliers de plaquettes dans la circulation sanguine. A ce jour, la manière dont les mégacaryocytes interagissent avec les microvaisseaux médullaires, les traversent et libèrent les plaquettes dans le sang est incomprise. Dans ce projet, nous allons aborder les questions suivantes : 1) Comment les mégacaryocytes interagissent-ils physiquement avec les microvaisseaux, 2) Quelles sont les mécanismes moléculaires de ces interactions ? Pour cela nous utiliserons des modèles de souris et des traitements pharmacologies connus pour cibler les mécanismes d’intérêt qui seront analysés par une combinaison d’approches d’imageries. La réalisation de ce travail permettra de faire progresser nos connaissances sur la formation des plaquettes en vue d’améliorer la production des plaquettes in vitro à partir des cellules souches

Bénéfices attendus

Ce projet aura pour but de mieux comprendre comment se forme les plaquettes, ainsi que le rôle joué par le microenvironnement médullaire, en particulier les protéines de la matrice extracellulaires et les macrophages dans ce procédé. Il permettra d’explorer différentes approches afin de trouver un traitement pour restaurer efficacement la numération plaquettaire observée dans des souris déficientes et à plus long terme chez les patients

Procédures

Tous les gestes invasifs (prélèvements à la queue, injections) sont effectués sous anesthésie générale. La durée de l'anesthésie est au maximum de 7 minutes pendant les opérations de prélèvements - injections par animal. Les différents animaux transgéniques (81) et traités (189) seront tous soumis à deux prélèvements à la queue un au début du traitement et l'autre en fin d'expérimentation. Les souris traitées seront par ailleurs injectées en rétro orbitaire une fois ou deux selon le produit à injecter, toujours sous anésthésie générale.

Impact sur les animaux

Les différentes molécules envisagées : GM6001, le romiplostim et les liposomes, ne devraient pas engendrer de dommage ou douleur majeurs aux souris. Cependant les risques habituellement liés à l'intervention demeurent : risque d'inflammation et d'infection aux zones d'injection et de prélèvement, hypothérmie due à l'anesthésie. En particulier, nous prévoyons la surveillance d’automutilation au niveau de la queue.

Devenir

Toutes les souris sont mises à mort pour prélèvement avant leur réveil à la fin du protocole expérimental.

Remplacement

Les mécanismes conduisant au passage des MKs dans la circulation sanguine ne peuvent pas être étudiés chez l’homme. Des animaux sont nécessaires afin de pouvoir prélever les tibias et les fémurs contenant la moelle osseuse pour étudier les processus menant à la formation des plaquettes sanguines. Ces processus mettent en œuvre simultanément des interactions entre MK, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et, vue l’imprévisibilité de l’évènement et sa rareté, ne peuvent être étudiés qu’in vivo dans des conditions ou la mégacaryopoièse est stimulée. Enfin, nous disposons de lignées de souris transgéniques thrombocytémiques (Souris Yall) qui contiennent 2 fois plus de MKs dans la moelle osseuse qui nous permettrons de cibler plus facilement des évènements intérêt qui sont rares dans une souris contrôle.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum afin d’obtenir des données statistiquement fiables et robustes.

Raffinement

Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : Pendant l’hébergement, un environnement calme et non stressant est privilégié avec un minimum de manipulation. Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées, maintenues au chaud tout au long de l’expérience pour éviter une hypothermie due à l’anesthésie, les yeux protégés par du gel hydratant oculaire.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs (ex : anticorps, souris génétiquement modifiées pour augmenter la production plaquettaire). La connaissance de la souris et l’existence de modèles transgéniques adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude . Ce projet ne requière pas un stade de développement spécifique de l'animal. Les animaux sont utilisés au stade adulte, pubère âgé de 8 à 12 semaines

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la myopathie de Duchenne, elles reçoivent des injections répétées de lymphocytes T génétiquement modifiés, des prélèvements sanguins, des échocardiographies sous anesthésie et une mesure de force par stimulation du nerf sciatique, avant la mise à mort pour prélever le cœur et les muscles. Le porteur décrit un affaiblissement musculaire et une baisse modérée de la fonction cardiaque liés au modèle lui-même. Les bénéfices annoncés pour les patients sont renvoyés à une utilisation future, et le porteur revendique la souris comme une source "unique et indispensable" faute de système in vitro reproduisant la maladie.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie neuromusculaire grave. Elle est causée par des mutations du gène de la dystrophine qui assure la stabilité structurelle des muscles squelettiques et cardiaque. Chez les patients DMD, les fibres musculaires sont progressivement endommagées et remplacées par du tissu fibreux et adipeux. La présence d’une quantité importante de tissus fibreux (fibrose) dans le muscle des patients est l’une des causes communes aux échecs des thérapies géniques et cellulaires en développement. Pour cette raison, il est cliniquement pertinent de réduire la quantité de tissus fibreux comme une nouvelle piste dans la prise en charge de la DMD. L’une de ces pistes consiste à cibler et dégrader une protéine présente en grande quantité au niveau des tissus fibreux et ceci à l’aide de lymphocytes T génétiquement modifiés ou de nanoparticules lipidiques permettant de cibler spécifiquement cette protéine. Une étude de preuve de concept que ces stratégies étaient capables de limiter la fibrose cardiaque dans un modèle murin de cardiopathie a été préalablement réalisée. Cette pathologie diffère toutefois de la DMD, il est donc important d’établir si les conclusions initiales positives sont extrapolables à la DMD. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets thérapeutiques de lymphocytes T génétiquement modifiés dans des modèles murins de DMD. A l’issue de ces expériences, nous pourrons déterminer si cette thérapie est efficace pour réduire la fibrose musculaire et cardiaque induite par la DMD.

Bénéfices attendus

La mise en évidence d'une réduction de la fibrose et d'une amélioration de la fonction cardiaque et musculaire par une approche d'immunothérapie basés sur l’administration de lymphocytes-T spécifiques dans des modèles murins de la dystrophie de Duchenne constitue un préalable important pour une utilisation future et sûre chez l’homme. L’objectif de ce projet est de développer un médicament biologique susceptible d’améliorer le pronostic de la dystrophie de Duchenne à travers une réduction de la fibrose et l'amélioration des fonctions cardiaques et musculaires dont souffrent les patients. Ce projet permet également d’ouvrir la piste d'une utilisation des approches d'immunothérapie dans le contexte des maladies génétiques rares et ceci en combinaison avec une thérapie génique à visée curative.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront 1- Injection intra-péritonéale en solution saline (150 microlitres, réalisée en quelques secondes) -2 Injections intra-veineuse caudale espacées d'une semaine (solution isotonique saline contenant ou pas des lymphocytes) réalisés sous anesthésie avec un volume de 150 microlitres, avec une durée d'environ 5 minutes - 3 Prélèvements sanguins (une goutte, environ 50microlitre) espacés d'une semaine pour les deux premiers et 3 mois plus tard pour le dernier avec une durée d'une minute -Echocardiographie réalisé sous anethésie (fréquence 3, durée 20 minutes). -Test de préhension (Fréquence 5; Durée 2 minutes) qui consiste à mesurer la capacité de la souris à s'agripper sur une grille et de ce fait nécessite que l'animal soit éveillé. Cet examen n'est pas invasif et ne provoque donc aucune douleur chez l’animal. Le test de préhension n’occasionne pas de souffrance chez l’animal. -Mesure de la force musculaire suite à une stimulation du nerf sciatique réalisée sous anesthésie générale et analgésie (Fréquence 1; durée 15 minutes). A l'issue de ce test la procédure sera achevée pour procéder à l’analyse histologique des tissus afin de récolter les données. Ainsi, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures seront réalisées sous anesthésie générale et si nécessaire analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci à l’exception du test de préhension et du prélèvement sanguin. Une grille d’évaluation des points limites sera établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité. Tous les animaux qui ont atteint les points limites seront sortis de protocole précocement.

Impact sur les animaux

Ici, les souches de souris étudiées ont été choisies pour mimer la pathologie humaine. Les effets indésirables consistent en l'affaiblissement musculaire et une réduction modérée de la fonction cardiaque. La contention pour l'injection intra-péritonéale et le prélèvement sanguin pourrait générer du stress à l'animal, cependant le même expérimentateur sera chargé de l'acte et les souris seront préalablement habituées à la personne. Le prélèvement de sang (une goutte) peut occasionner un léger stress chez l'animal, ce niveau de stress est équivalent à l'effet d'une piqure. Le test de préhension n’occasionne pas de souffrance chez l’animal.

Devenir

A l'issue de cette procédure, l'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera euthanasié par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (coeur, muscles) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et receuillir ainsi les donnés indispensables pour évaluer l'efficacité de l'approche thérapeutique mise en place.

Remplacement

En amont de l’administration de cette thérapie dans le modèle murin, une évaluation de la fonctionnalité des CAR-T cells est mise en place in vitro via des tests cytotoxiques sur des modèles cellulaires musculaire et cardiaque. Ainsi, ne sont administrés aux animaux que des traitements ayant fait la preuve de leur fonctionnalité in vitro. Cependant, les modèles murins restent une source unique et indispensable pour évaluer une amélioration histologique et fonctionnelle induite par le traitement testé. De plus, ces modèles nous permettront d’obtenir des informations sur le profil de sécurité de ce traitement grâce à la détection d’un potentiel syndrome de relargage des cytokines, effet indésirable communément observé en clinique humaine.

Réduction

Nous allons dans un premier temps vérifier grâce à des coupes histologiques issues de travaux précédents la présence des protéine d’intérêt chez des animaux d’âge et sexe différents. Le but est de sélectionner le moment optimal de l’administration de CAR-T cells pour observer un effet thérapeutique. Lors du passage à la phase in vivo, les mêmes animaux sont utilisés pour les évaluations fonctionnelles, les tests de contraction musculaire ainsi que les études d’histologie et de transcriptomique à la suite de la mise à mort. Les procédures expérimentales sont donc conçues pour réduire le nombre d’animaux utilisés au maximum, sans compromettre la puissance statistique de l’étude. Les calculs d’effectifs, assurés par une statisticienne, se fondent sur les données de la littérature et l’expérience déjà acquise par l’équipe. Ce nombre devrait permettre de valider le concept et tient compte de l’exclusion du protocole de certains animaux (due à l’atteinte de points limites ou de décès prématuré). Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de souris utilisé sera de 300 souris. L’effectif de 25 souris par groupe a été établi grâce à un calcul de puissance. Suite à l'analyse des données, des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Nous réduirons au maximum la souffrance des animaux. En effet, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures, à l’exception des mesures de la force musculaire (test de préhension) l'injection intra-péritonéale et le prélèvement d'une goutte de sang, seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Nous avons opté pour l'injection intraveineuse de CAR-T cells étant donné qu’elle est simple et non invasive. L'injection sera réalisée sous anésthésie et avec l'utilisation d'une source de chaleur pour dialter la veine ce qui facilitera l'injection. Pour réduire les effets indésirable liés à des anesthésies fréquentes, les prélèvements sanguins correspondant en terme de douleur et stress à une piqure seront réalisés sans anethésie. Des antalgiques sont prévus pour la mesure de la force musculaire qui intervient en étape finale. Une grille d’évaluation des points limites est établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité . Tous les animaux qui ont atteint ces points limites seront euthanasiés précocement. Toutes ces attentions particulières portées au bien-être animal seront complétées par un hébergement adapté, c’est-à-dire avec des congénères (répartis en cages de 5) et avec des éléments d’enrichissement dans les cages (cubes de bois à ronger, abris, substrats pour la construction de nids, nourriture et eau de boisson ad libitum) afin de créer un environnement propice au confort des animaux.

Choix des espèces

Pour atteindre notre objectif, nous sommes amenés à utiliser des modèles murins car aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la DMD. Nous utiliserons ici un modèle préclinique pertinent de la Dystrophie de Duchenne. Ces modèles développent une fibrose du myocarde et des muscles squelettiques, ainsi qu'une altération fonctionnelle et récapitule ainsi la chronologie de la progression et les altérations observées chez les patients. Les contrôles seront des souris contrôle saines avec le même fond génétique. Ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application potentielle chez l’homme de ces approches thérapeutiques. La souris constituant le modèle sera étudiée entre 3 mois à 6 mois d'âge car à partir de 3 mois, les souris sont considérées comme ayant accompli leurs croissances musculaires et cardiaques. Il est aussi prouvé dans la littérature que la fibrose se met en place dans ces modèles à partir de 5 mois. Cette fourchette sera affinée en fonction de l’analyse histologique en cours de coupes issues d’études antérieures.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris génétiquement modifiées pour développer la maladie d'Alzheimer reçoivent une injection hebdomadaire de nano anticorps pendant six mois, puis des tests d'apprentissage et de mémoire à 9 et 12 mois, avant d'être tuées. Le porteur affirme que les déficits cognitifs "n'affectent pas le bien-être des souris" et n'attend aucune douleur liée au traitement. Il indique que le partenaire a validé les effets sur cultures cellulaires, mais juge le modèle animal "nécessaire" pour évaluer la mémoire.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer affecte environ un million de personnes en France, et plus de 14 millions en Europe, c'est la 1ere cause de démence. De nombreux essais thérapeutiques ce sont révélés infructueux, jusqu'à très récemment où un traitement basé sur des anticorps a été autorisé d'abord aux Etats-Unis, malgrè les controverses dues à des effets secondaires fréquents et importants chez les patients. Il a été récemment autorisé en France en septembre 2022, à titre expérimental. Le laboratoire avec qui nous collaborons a développé une nouvelle génération d'anticorps innovants, appelés nano anticorps qui sont des anticorps de petite taille présentant moins d'effets secondaires. L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces nano anticorps dans un modèle de souris génétiquement modifié représentatif de la maladie d’Alzheimer. Cette étude analysera les effets de ces nano anticorps sur trois récepteurs différents dont le fonctionnement est altéré dans la maladie d'Alzheimer.

Bénéfices attendus

A l'issue du projet, nous pensons pouvoir identifier des nano anticorps ayant un effet pharmacologique sur les marqueurs de la maladie d'Alzheimer, comme la réduction de la toxicité, de l'aggrégation des protéines dans le cerveau, et la neuroinflammation. La réduction de ces marqueurs devraient être associée à une amélioration des performances d'apprentissage et de mémoire chez les animaux. Nous pensons egalement, identifier des co-traitements pour augmenter les effets bénéfiques de ces outils.

Procédures

A partie de 6 mois d'âge, les souris seront administrées avec 1 dose de nano anticorps 1 fois/semaine par voie intra-péritonéale. Le traitement sera effectué pour une durée de 6 mois. A l'âge de 9 et 12 mois, les animaux auront deux tests comportementaux non invasifs afin d'évaluer leur capacité d'apprentissage et de mémorisation. L'objectif étant de voir si le traitemtent aux nano anticorps améliore les déficits de mémoire et d'apprentissage. Lorsque les animaux seront agés de 12 mois, ils seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Selon la littérature scientifique disponible, l'injection de nano anticorps ne provoque pas de réactions inflammatoires contrairement à l'injection d'anticorps traditionnels. L'utilisation de nano anticorps spécifiques d'un seul récepteur permet d'augmenter la spécificité de la cible et donc de limiter les effets indésirables (effets secondaires) décrits lors des études réalisées avec des composés non-sélectifs de ces récepteurs, comme des molécules chimiques. Tous ces éléments suggèrent que peu d'effets indésirables sont attendus avec les traitements par les nano anticorps. Concernant les souris génétiquement modifiées, elles vont développer des déficits d'apprentissage et de mémoire entre 9 et 12 mois d'âge. Ces déficicits cognitifs n'affectent pas le bien-être des souris. Ce modèle lent est représentatif de la maladie d'Alzheimer.

Devenir

A l'issue de la procédure de traitement des animaux par les nano anticorps, tous les animaux (432) seront euthanasiés et les tissus prélevés.

Remplacement

Notre partenaire, avec qui nous collaborons, a déjà validé sur des cultures cellulaires les effets pharmacologiques des nano anticorps sur les récepteurs d'intérêt. Ces nano anticorps sont capables d'activer, ou d'inhiber l'activité de ces récepteurs, impliqués dans la maladie d'Alzheimer. Toutefois, pour évaluer le potentiel des nano anticorps à restaurer les déficits d'apprentissage et de mémoire, critère qui n'est pas possible d'évaluer sur des modèles de cultures cellulaires, l'utilisation d'un modèle animal génétiquement modifié et représentatif de la maladie d'Alzheimer est nécessaire.

Réduction

L'étude sera réalisée sur des souris génétiquement modifiées, modèle progressif de la maladie d'Alzheimer, ainsi que des animaux contrôles non modifiés génétiquement. Les nano anticorps les plus aptes à diminuer la pathologie Alzheimer dans les cellules, seront alors testés dans le modèle de souris, soit seul ou en co-traitement pour cibler plusieurs récepteurs d'intérêts. Pour ce projet nous envisageons d'utiliser 432 souris sur la durée du projet, réparties en plusieurs groupes avec 1 seule procédure. Nous procéderons par étapes, avec des études pilotes avant de générer l'ensemble des expériences prévues. Le nombre d'animaux adéquat a été calculé grâce à un logiciel permettant d'avoir des analyses robustes. Nous avons également tenu compte de notre expertise de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant un nombre suffisant d'animaux pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées.

Raffinement

Les données préliminaires obtenues au laboratoire de notre collaborateur et présentes dans la littérature scientifique n’indiquent pas de toxicité liée à l’injection des nano anticorps. Il n’est donc pas attendu de souffrance chez les animaux qui seront traités. Les animaux utilisés seront sous surveillance régulière. Si les points limites sont atteints lors de l’expérimentation (perte de poids de plus de 20%, blessures, prostration, léthargie, décubitus latéral, ou autres signes), les souris seront euthanasiées. Pour évaluer les effets de l'injection des nano anticorps, différents paramètres seront observés: les processus neuro-inflammatoires, suivi de paramètres comportementaux généraux (prostration, léthargie, activité,...). Pour évaluer l'effet thérapeutique des nano anticorps sur l'apprentissage et la mémoire, des tests comportementaux adaptés, non invasifs et sans douleur, seront réalisés. Au vu des données disponibles dans la littérature scientifique, aucun symptôme de douleur n’est attendu pour ces modèles. Les souris seront hébergées dans un milieu enrichi (copeaux et maisonnettes), avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle choisi pour nos études, est un modèle murin génétiquement modifié, récapitulant la maladie d’Alzheimer à évolution lente, bien caractérisé au niveau des symptômes, tels que les déficits d'apprentissage et de mémoire. Ce modèle peut donc être utilisé pour évaluer une modification des marqueurs de la maladie d'Alzheimer lors des traitements avec les nano anticorps. L’utilisation de ce modèle génétiquement modifié justifie l’utilisation de souris contrôles, non modifiées génétiquement qui sont issues des mêmes portées et de même fond génétique. Les traitements seront effectués de 6 à 12 mois dans le modèle de souris génétiquement modifié, car c'est un modèle d'évolution lente de la pathologie Alzheimer, et nous souhaitons traiter les animaux à l'apparition des marqueurs de la maladie soit vers 6 mois. Les nano anticorps seront administrés à la dose de 10 mg/kg, à raison de 1 fois par semaine.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection puis deux prélèvements sanguins sous anesthésie sur une période de 6 à 72 heures, avant d'être tué pour prélever ses organes. Le projet mesure la persistance et la toxicité de dix candidats médicaments d'immunothérapie anticancéreuse. Le porteur affirme qu'aucune technique in vitro ne mesure la persistance dans un "organisme entier" et présente l'animal comme la "seule approche" possible.

Objectifs

Au cours de la dernière décennie, les approches immunothérapeutiques ont révolutionné le traitement des cancers et constituent un domaine de recherche en plein essor. Les immunothérapies visent à rendre le système immunitaire plus à même de reconnaitre les cellules tumorales et de les détruire. Cependant, la proportion de patients qui répond à ce type de médicaments est pour l’instant trop faible. Nous avons récemment développé et breveté une technologie permettant de produire un panel de protéines immunomodulatrices, c’est-à-dire capables de moduler l’activité du système immunitaire. Sur la base de cribles d’activités réalisés in vitro nous avons sélectionné deux premières protéines qui s’avèrent capables de contrôler la croissance tumorale chez la souris ce qui indique le potentiel immunothérapeutique de notre technologie. A l’aide des mêmes cribles, nous travaillons actuellement à la sélection de nouvelles protéines présentant des activités immunomodulatrices encore plus optimisées qui représenteraient de ce fait de nouveaux candidats médicaments pour le traitement de cancers. Avant d’étudier l’efficacité thérapeutique des candidats sélectionnés, nous devrons caractériser leur devenir chez l’animal de laboratoire ainsi que leur toxicité potentielle. Ces travaux permettront en effet de définir les conditions de délivrance les plus appropriées pour tenter d’obtenir un effet thérapeutique optimal avec un risque de toxicité nul ou très limité. L’objectif de notre projet est donc de caractériser chez l’animal de laboratoire le devenir dans l’organisme au cours du temps ainsi que la toxicité potentielle de dix nouveaux candidats médicaments générés par notre technologie et préalablement sélectionnés in vitro. La persistance des protéines candidates dans l’organisme sera déterminée par immunodosage. Pour ces travaux, nous utiliserons des souris qui représentent des références pour la communauté scientifique impliquée dans le domaine de l’immunothérapie des cancers.

Bénéfices attendus

Les médicaments utilisés chez l’homme ou chez l’animal doivent être capables de générer des effets thérapeutiques significatifs en absence de toxicité ou avec une toxicité minimale par rapport au bénéfice attendu. Les candidats médicaments générés par notre approche technologique doivent répondre à ces deux critères. Pour évaluer l’efficacité thérapeutique dans des conditions optimales, il faut cependant définir dans un premier temps les conditions de délivrance les plus appropriées. Les études de persistance dans l’organisme réalisées dans ce projet seront d’un apport crucial dans ce contexte. En effet, le suivi de la demi-vie des candidats médicaments dans l’organisme permettra de connaître les paramètres d’absorption et d’élimination ainsi que l’atteinte des tissus cibles. Ces données permettront de définir i) la dose à injecter, ii) le temps entre deux injections, iii) la voie d’injection, pour obtenir une persistance significative des candidats médicaments durant les études d’efficacité réalisées ultérieurement. Les études de toxicité seront quant à elles essentielles pour évaluer l’innocuité des différents candidats médicaments. Les bénéfices du projet sont donc attendus aussi bien en terme de définition des conditions optimales de délivrance des candidats médicaments que du point de vue de la caractérisation de leur innocuité.

Procédures

Les animaux subiront une seule injection et deux prélèvements de sang sur une période de 72 heures. Dans ces deux cas, pour éviter tout stress, les animaux seront anesthésiés. Les études seront réalisées sur des temps courts, compris entre 6 heures et 72 heures. La présence des candidats médicaments dans le sang sera déterminée par immunodosage.

Impact sur les animaux

Au cours de nos études nous auront pour objectif de surveiller les animaux afin d’évaluer si des effets indésirables inattendus apparaissent. Les effets indésirables peuvent être une perte de poids, une perte de mobilité, un stress, des difficultés respiratoires, une inflammation au point d’injection. Il n’est pas possible d’évaluer, à priori, la durée d’effets inattendus. Cependant, si des effets apparaissent, leur durée sera comprise entre 6h à 72h au maximum car les animaux seront euthanasiés de 6 à 72 heures après le début de l’expérience.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à la fin des expériences afin de prélever de prélever différents organes pour étudier la distribution des candidats médicaments dans les tissus.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer le devenir dans l’organisme ainsi que la toxicité potentielle de nouvelles immunothérapies. Ces travaux ne peuvent être réalisés sans se passer de l’animal car, aucune technique in vitro ne permet d’évaluer la persistance ou la localisation dans un organisme entier. L’utilisation d’animaux de laboratoire représente donc la seule approche permettant une évaluation du devenir et de la toxicité potentielle d’un candidat médicament.

Réduction

Notre technologie nous permet de produire des centaines de protéines dotées d’activité immunomodulatrice. Pour limiter le nombre d’immunothérapies à évaluer chez l’animal, les protéines produites seront dans un premier temps évaluées in vitro pour leur capacité à induire des cellules du système immunitaire. Seules celles qui présenteront la capacité immunomodulatrice la plus optimale seront sélectionnées pour être évaluées chez l’animal. Les expérimentations sont basées sur des modèles de souris chez lesquelles il existe une variabilité interindividuelle. Pour tenir compte de cette variabilité, trois animaux par temps de cinétique seront utilisés. Pour étudier le devenir des immunothérapies de façon fiable au cours du temps, il est recommandé d’effectuer des prélèvements sanguins à au moins 6 temps différents. Dix-huit animaux sont donc théoriquement requis pour l’étude d’une immunothérapie via une voie d’injection. Nous limiterons cependant le nombre d’animaux à douze en réalisant un deuxième point de cinétique au moment de l’euthanasie de neuf des animaux inclus dans l’expérience. Enfin, nous mènerons les études de biodistribution et de toxicité sur les rongeurs soumis aux études de pharmacocinétique ce qui permettra de réduire le nombre de rongeurs utilisés.

Raffinement

Les protocoles que nous utiliserons sont classiquement employés chez l’homme ou chez l’animal. Pour limiter le stress des animaux, permettre une manipulation aisée et douce, nous anesthésierons les animaux avant l’injection des immunothérapies et avant les prélèvements. Pour préserver le bien-être des animaux, ceux-ci seront hébergés au calme en respectant des cycles diurne/nocturne. De plus, ils seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué afin d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. L’application de critères d’arrêt et le suivi régulier des animaux hébergés en groupe permettront de garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Pour évaluer le devenir dans l’organisme des immunothérapies ainsi que la toxicité potentielle, nous travaillerons chez la souris. Pour ce type d’étude, elle représente en effet une référence utilisée par la plupart des chercheurs académiques ou de l’industrie pharmaceutique. Les rongeurs auront entre 8 et 12 semaines car ils présentent un système immunitaire et une physiologie pleinement mature qui s’avère cruciale pour évaluer le devenir dans l’organisme au cours du temps et l’innocuité d’immunothérapies.