Procédures modérées

320 bars juvéniles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont pêchés à l'épuisette à plusieurs reprises, soumis pour 80 d'entre eux à un test de stress par pourchasse puis confinement à forte densité, avant une prise de sang sous anesthésie suivie de la mise à mort. Le projet évalue si un extrait de micro-algue ajouté à l'aliment réduit le stress et renforce l'immunité en élevage. Le porteur situe le bénéfice, une recette d'aliment pour pisciculture, sur le long terme et affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour ce type d'approche.

Objectifs

Depuis des décennies, de nombreuses orientations scientifiques ont concouru à diminuer la part des matières premières d’origine marine dans les aliments pour l’aquaculture. En effet, les ressources de la pêche mondiale stagnent voire régressent, et ne peuvent plus être utilisées avec la même intensité pour nourrir les productions aquacoles, dont les tonnages augmentent rapidement. Les micro-algues font partie des meilleurs candidats pour assurer des substitutions devenues obligatoires, notamment pour remplacer une utilisation trop importante des huiles et farines de poissons issues de la pêche. Elles renferment des teneurs en protéines élevées, intéressantes pour les poissons, ainsi que des lipides, des vitamines et des pigments pouvant à la fois améliorer la santé des poissons en élevage, ainsi que leur qualité nutritionnelle. Dans le cas de l’algue rouge Galdieria sulphuraria, ses capacités d’adaptations importantes associées à sa composition en glucides d’intérêt dans la régulation de certains stress, ont soulevé l’intérêt des industriels afin d’étudier son effet dans l’alimentation animale, et notamment en pisciculture. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’impact d’une supplémentation algale en Galdieria sulphuraria dans l’alimentation d’un poisson d’élevage marin, le bar commun Dicentrarchus labrax, en s’intéressant notamment à divers paramètres sanguins, impliqués dans l’immunité et la gestion du stress.

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu du projet est de mettre en évidence que la micro-algue testée pourra être intégrée dans le futur à des recettes d’aliments pour poissons parce qu’elle contribue à une amélioration de certains paramètres immunitaires, susceptibles de conférer aux poissons une meilleure résistance vis-à-vis de pathogènes pouvant être rencontrés en élevage. Le deuxième bénéfice attendu porte sur la réduction de manière générale du stress du bar consommant cette micro-algue. Etant donné que la procédure d’induction du stress appliquée dans cette étude, vise à reproduire des évènements stressants ayant lieu occasionnellement en élevage, on peut espérer que les bénéfices attendus de l’incorporation de cet extrait algale dans l’aliment, confèrent une meilleure résistance des poissons à des stress de différentes natures, liés à leur élevage. Ces bénéfices pour l’alimentation piscicole seraient à long terme, puisqu’il resterait à déterminer (à minima) la dose optimale d’extrait de cette micro-algue à utiliser pour avoir un effet satisfaisant, puis à obtenir les autorisations permettant la mise sur le marché de ce produit. Du point de vue de la recherche scientifique, si des bénéfices étaient avérés, la recherche des composés impliqués dans l’amélioration de la physiologie du bar serait également réalisée sur le long terme.

Procédures

La pêche à l’épuisette, d’une durée inférieure à la minute, sera réalisée 1 fois sur 160 poissons (prise de sang), 2 fois sur 80 poissons (changement de bac, puis prise de sang), ou 3 fois sur 80 poissons (changement de bac, test de stress, puis prise de sang). La procédure expérimentale ‘test de stress’ sera réalisée une fois sur 80 poissons, et durera 6 minutes (1 min de pourchasse dans le bac + 5 min de confinement). La procédure ‘prise de sang’ sera réalisée une fois sur l’ensemble des animaux du projet, soit 320 bars. Elle consistera en une anesthésie, suivi d’une prise de sang, puis d’une mise à mort. L’anesthésie durera au moins 5 minutes pour assurer une anesthésie efficace, et le prélèvement sanguin durera normalement moins d’1 minute, et maximum 2 minutes.

Impact sur les animaux

La première nuisance attendue est le stress généré par les pêches de poissons, réalisées pour le prélèvement sanguin à l’issu de la phase d’imprégnation (10 poissons/bac, soit 160 poissons pêchés 1 fois), pour la préparation du test de stress (10 poissons/bac), sa réalisation (20 poissons/aliment), et le prélèvement sanguin final (40 poissons/aliment, soit 80 poissons pêchés 2 fois, et 80 poissons pêchés 3 fois). Les nuisances et effets indésirables attendus sont un stress généré par une réaction de fuite, puis par l’émersion et la compression dans l’épuisette qui en suivra. Cette nuisance est considérée comme légère car elle sera à chaque fois de courte durée (durée de pêche et d’exondation du poisson de l’ordre de la minute), et réalisée à l’épuisette sur de petits groupes (10 animaux). La seconde nuisance attendue est le stress généré par le changement de bac des poissons utilisés pour étudier les niveaux en cortisol, lactate et glucose sanguin des 4 régimes alimentaires. Cette nuisance est également considérée comme légère car ce transfert sera fait dans des bacs identiques à ceux d’où proviennent les poissons. Une nuisance faisant l’objet de cette demande d’autorisation est le prélèvement sanguin sur l’ensemble des poissons inclus dans cette demande, soit 320. Il s’agit de prélever du sang des bars alimentés différemment au cours de la phase d’imprégnation, afin de réaliser par la suite différents dosages. Cette nuisance est considérée comme modérée car ces prélèvements seront réalisés sur des bars préalablement anesthésiés. La nuisance provoquée par la piqûre d’aiguille ne sera donc pas ressentie par le poisson. Le prélèvement sanguin sera d’une durée inférieure à la minute, réalisé une fois par poisson, et suivi immédiatement par la mise à mort de l’animal. La seconde nuisance faisant l’objet de cette demande d’autorisation de projet est la réalisation d’un test de stress sur 80 poissons. En effet, lors de ce test, les poissons seront pourchassés à l’épuisette pendant 1 min et par groupe de 20, ce qui engendrera un stress par une réaction de fuite, avant d’être confinés pendant 5 min à une densité élevée d’environ 60 kg/m3. Cette nuisance est considérée comme modérée en raison des courtes durées d’application de ces stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour réaliser des prélèvements sanguins

Remplacement

Il n’existe pas à notre connaissance d’expérimentations déjà décrites dont le but est de montrer l’intérêt de cet extrait spécifique de micro-algue, Galdieria sulphuraria. L’objectif de ce projet étant de démontrer que ce produit amène des atouts supérieurs en terme de stress et d’immunité par rapport à d’autres micro-algues et en particulier à la spiruline, il n’est pas possible d’en faire abstraction. Pour ce type d’approche, il n’existe pas aujourd’hui de méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

Réduction

Il a été choisi en amont de ce test de réaliser 4 réplicas d’analyse par régime alimentaire. Ce nombre de répétitions est un bon compromis entre l’effort à réaliser au cours de l’étude (en termes de prélèvements, de matériel, de maintiens des animaux) et la puissance statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives. En fonction du type d’analyses, du volume de sang prélevable par poisson, et de la puissance statistique souhaitée, il a été déterminer qu’il nous fallait 10 poissons par prélèvement pour les analyses immunitaires (soit 40 poissons par régime alimentaire et 160 poissons au total), et 5 poissons par prélèvement pour les analyses liées au stress (soit 40 poissons par régime alimentaire et 160 poissons au total). Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum, en tenant compte de la densité d’élevage des poissons pour obtenir un optimum pour le bien-être des animaux, sans nuire aux besoins analytiques. Les données issues de cette étude seront analysées statistiquement.

Raffinement

La procédure expérimentale a été conçue pour minimiser les dommages causés aux animaux. Par exemple, les pêches et pourchasses de poissons seront réalisées avec des équipements adaptés (bacs et épuisettes sans parties contondantes) ne risquant pas de blesser les poissons, et la taille des lots de poissons échantillonnés sera réduite à 10 poissons maximum afin de limiter la compression au sein de l’épuisette. Les 160 poissons changés de bacs seront acclimatés pendant 96h avant la réalisation des tests de stress. Les poissons pêchés afin de subir une prise de sang seront immédiatement sédatés pour diminuer le stress et l’inconfort de l’animal. Lors des phases de confinement des tests de stress, une attention particulière sera portée sur le maintien d’une teneur en oxygène dissous supérieur à 90% dans les seaux, via un bullage faible mais continu d’oxygène. De même, la qualité de l’eau utilisée pour le confinement sera identique à celle des enceintes d’élevage. Tout cela afin que seul le volume restreint et donc la charge plus importante en poissons soit de nature à engendrer un stress.

Choix des espèces

Le bar commun est une espèce de poisson marin carnivore dont l’aquaculture est bien développée en France et en Europe (3ème espèce de poisson marin produite), mais pour laquelle des voies d’amélioration restent à trouver, notamment vis-à-vis de l’immunité et du stress. Concernant l’immunité, malgré le fait que des vaccins existent, certains phénomènes de mortalité massive (ex : vibrioses) ont toujours lieu dans les élevages dans certaines conditions, et des solutions restent à trouver, qu’il s’agisse des conditions environnementales ou du statut immunitaire du poisson. En ce qui concerne le stress, plusieurs études scientifiques ont mis en évidence que le bar y est particulièrement réceptif (en terme d’augmentation du cortisol et du lactate sanguin), ce qui en fait un bon candidat pour notre étude. D’un point de vue économique, une diminution de cette sensibilité au stress pourrait améliorer les performances de ce poisson en élevage. Il s’agit d’animaux juvéniles d’environ 15 g au moment de la réalisation des procédures. Il s’agit d’un poids standardisé pour les essais zootechniques menées au sein de notre structure. Cette taille permet de réaliser des prélèvements sanguins d’un volume suffisant pour la réalisation des analyses prévues dans cette étude.

3 750 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette prestation commerciale greffe des tumeurs humaines sous la peau ou dans la graisse mammaire, avec injections hydrodynamiques à fort volume, imagerie et parfois rayonnements ionisants, jusqu'à des pertes de poids et des nécroses tumorales. Le porteur teste des candidats médicaments pour des clients et greffe 10 % d'animaux surnuméraires pour compenser les échecs de prise. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne prédit l'efficacité in vivo et juge les modèles 3D "marginaux".

Objectifs

Dans le monde, il est constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, 19 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués avec 10 millions de décès des suites de cette maladie. Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. 1/8 hommes et 1/11 femmes en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation du processus contrôlant la prolifération, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Bien que possédant des caractéristiques communes, les differents cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente aux traitements. Une des cibles communes à tous les cancer est une approche thérapeutique qui agit sur le système immunitaire d’un patient pour lutter contre sa maladie. En effet, les cellules cancéreuses sont capables d’inactiver les défenses de l’organisme. Le microenvironnement tumoral devient alors immunosuppresseur et empêche l’arrivée sur place des défenses immunitaires. Cette approche se fonde sur l’utilisation de différents outils : vaccination, anticorps monoclonaux, immunomodulateurs, cytokines. Afin d’étudier les interactions physiologiques des cellules immunitaires avec les cellule cancéreuses il est nécessaire de disposer de modèle murins contenant des cellules immunitaires humaines. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles déjà mis en place dans notre société, et de les humaniser afin de les rendre plus prédictifs pour mieux évaluer de nouveaux médicaments. Cette évaluation permettra d’étudier ces molécules dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme avant les essais cliniques. Les animaux sont utilisés pour déterminer l’efficacité antitumorale des composés testés, déterminer leur pharmacocinétique, leur toxicité, leur concentration active, et pour les comparer avec des composés cliniques de références. A ce jour, aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux pour évaluer l’efficacité d’un composé. De plus, les animaux autorisent une grande variété de techniques d’administration, de prélèvements et de chirurgies permettant de créer des modèles dans lesquels l’évolution de la maladie et le traitement sont proches de la situation clinique.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer, spécifiquement les cancers d’origine osseuse ou à métastases osseuses. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant la greffe (

Impact sur les animaux

Trois types de greffe pourront être faites : Sous cutanée, intradermique et graisse mammaire. Il y aura une évolution du volume tumoral ce qui entrainera une distension de la peau. Pour limiter cette tension qui peut engendrer une douleur ou une gêne dans la mobilité, le volume tumoral maximal sera limité. Il est possible que des nécroses apparaissent. La tumeur n’étant pas innervée, seules les plaies en surface peuvent engendrer une douleur. Par conséquent, la taille de la nécrose en surface sera limitée et des soins seront apportés. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. Dans ce dernier cas, dès la greffe tumorale, de la nourriture enrichie sera apportée afin de limiter la perte de poids. Il est possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de différents composés par voie IM, ID, SC, IP, IV et/ou seront exposés à des rayonnements ionisants. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. En fonction du comportement des animaux ou bien des besoins de l’étude, il sera possible d’isoler des animaux.. Il est possible que l’injection hydrodynamique engendre une douleur et une perte de poids transitoire. L’injection hydrodynamique sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane) et les souris seront placées sur un tapis thermochauffant pendant 15 min à 37°C et traitées par un antalgique avant et après l’injection (buprénorphine). Les souris seront observées pendant une heure suivant l’injection hydrodynamique. Le poids des animaux sera enregistré 4 fois par semaine incluant le jour de l’injection la semaine qui suit cette injection. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Ces mesures seront faites dans les salles de stabulation. Les autres manipulations seront faites en laboratoire afin de ne pas stresser les autres animaux.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et niveau d’humanisation). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité, et un groupe avec tumeur, traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés seront testés au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 15 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Moins de 5 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des commandes des clients. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle) à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisées dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude et donc éviter de multiplier les groupes nécessaires. Pour compenser le taux de prise variable de certaines tumeurs, et la variabilité intrinsèques de certains modèles, il sera nécessaire d’inclure des animaux surnuméraires. Ce nombre d’animaux surnuméraire est réduit à un maximum de 10% (pour 100 animaux, 110 seront greffés). Ces animaux exclus seront valorisés soit pour remplacer des animaux des groupes traités constitués, soit pour servir de contrôle ou de calbration lors des analyses (par exemple en cytométrie de flux pour les calibrations.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et 4 fois par semaine la semaine qui suit l’injection hydrodynamique: • 5% sera observée sur certains animaux. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. Le statut immunodéprimé de l’animal choisi est également important pour évaluer l’immunothérapie du cancer, car l’espèce choisie doit simultanément tolérer la transplantation de tumeurs humaines et de cellules immunitaires humaines. Pour finir, les souris et les rats autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines d’âge minimum pour leur réception et 8 semaines pour la manipulation).

920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections intrapéritonéales répétées tous les quatre à sept jours pendant deux à sept mois, un séjour de 48 heures en cage métabolique, un prélèvement rétro-orbital, puis une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever les organes. Le projet teste des doses croissantes d'une molécule contre la néphronophtise, une maladie rénale génétique. Le porteur indique avoir mené les premières recherches sur cellules mais affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'étudier un rein, et renvoie le bénéfice, éviter la greffe rénale, au long terme.

Objectifs

Récemment, une molecule a montré un potentiel thérapeutique après 2 mois de traitement dans un modèle murin qui reproduit en partie la néphronophtise humaine, avec l’observation de lesions rénales à partir de 3 mois. L’objectif de ce travail est d’évaluer dans ce modèle murin l’efficacité thérapeutique de doses croissantes de la molécule, administrée pendant une durée plus longue (de 1 à 5 mois de vie) pour prévenir l’apparition de lésions rénales, ou administrée à un stade plus tardif de la maladie (5 mois de vie) pour évaluer l’efficacité à guérir les lésions rénales apparues.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’administration intrapéritonéale d’un composé thérapeutique, participant ainsi au développement d’un médicament qui permettra à terme d’éviter la greffe rénale aux patients souffrant de néphronophtise.

Procédures

Les 920 animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales uniques (durée : 5-10 secondes/injection), ou répétées tous les 4 ou 7 jours pendant 2, 4 ou 7 mois à l’aide de seringues très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce à la forme biseautée de l’aiguille. Les 920 animaux seront également soumis à une mise en cage métabolique, dans le calme dans une pièce dédiée, pendant 48 h : 24h d’adaptation et 24h de recueil des urines. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Enfin, chacun des 920 animaux sera soumis à un prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale (durée : 30 secondes/prélèvement), une seule fois le jour de la mise à mort à l’aide de micro-capillaires héparinés. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale (durée : 2 secondes/dislocation).

Impact sur les animaux

L’administration répétée par injection intrapéritonéale comporte un risque d’irritation au point d’injection. Si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement.

Devenir

A la fin de ce projet, les 920 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Les recherches préliminaires ayant permis l’identification de la molécule thérapeutique qui fait l’objet de cette étude ont été menées sur des lignées de cellules afin de limiter le recours à l’expérimentation animale. Néanmoins, compte tenu de l’absence de modèle cellulaire permettant l’étude d’un rein, il n’a pas été possible du substituer des approches cellulaires aux modèles murins impliqués dans ce projet à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum (entre 5 et 20 animaux par groupe de traitement) permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Pour l’étude statistique, nous utiliserons un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et deux fois par semaine par le responsable du projet afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Afin de limiter la possibilité d’une souffrance due aux injections i.p. répétées, les injections seront réalisées avec des seringues Insuline très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce au biseau à trois facettes. Si la zone d’injection présente une irritation, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée (Douxo Calm). Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement. Afin de limiter ce stress, une période d’adaptation de 24h est réalisée. La mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Avant la mise à mort, lors de la phase terminale, les animaux seront anesthésiés via une injection intrapéritonéale d’un mélange de Kétamine/Xylazine (0,1mL/10g souris) à la dose de 160mg/kg pour la Kétamine et 8mg/kg pour la Xylazine. Des points limites spécifiques ont été définis sur une grille de score de sévérité allant de 0 à 3. Les souris sans perte de poids ayant un score compris entre 2 et 3 recevront un analgésique (Ketoprofen 5mg/kg) et seront observées quotidiennement. Les souris avec un score ≥3 ou ayant une perte de poids de plus de 20% par rapport à leur poids initial, seront mises à mort par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Les souris ayant une perte de poids comprise entre 10 et 20% par rapport à leur poids initial seront observées tous les jours et auront accès à un complément nutritionnel hydraté (DietGel). En cas d’échec de la complémentation ou du traitement par analgésique, les animaux seront mis à mort par inhalation progressive de CO2 dans un appareil dédié.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons fixés après la fin de la néphrogénèse contrairement aux poissons et aux batraciens. C’est également un modèle indispensable pour les essais pré-cliniques. Pour étudier l’efficacité du traitement à prévenir l’apparition de lésions rénales, le traitement sera initié à 1 mois de vie (avant le début de la maladie) et sera poursuivi jusqu’à 5 semaines de vie pour analyser un marqueur de réponse rapidement après le traitement ou jusqu’à 5 mois de vie, pour évaluer l’état des lésions rénales à l’âge de la phase exponentielle de la maladie. Pour évaluer l’efficacité du traitement à guérir les lésions rénales, le traitement sera initié à 5 mois de vie, après apparition des lésions rénales, et l’efficacité du traitement à guérir ces lésions sera évaluée entre 7 et 12 mois de vie.

64 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur dans le cerveau sous anesthésie, puis jusqu'à quatre injections intraveineuses et huit injections intrapéritonéales d'un anticorps sur trois à six mois, avant d'être tuées pour prélever sang et cerveau. Le porteur décrit des épendymomes pédiatriques sans traitement efficace et affirme qu'en l'absence de modèle cellulaire in vitro, le modèle animal est "indispensable". Il annonce espérer améliorer la survie des enfants atteints "à court terme".

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les épendymomes sont des tumeurs intracrâniennes retrouvées très fréquemment chez l’enfant. Ces tumeurs sont chimiorésistantes et responsables de nombreuses rechutes malgré les exérèses chirurgicales. Au cours des dernières décennies, leur traitement n’a connu aucun progrès. A l’heure actuelle, il n’existe pas de modèles cellulaires in vitro de ces tumeurs. Il nous est donc impossible de prédire la réponse d’un médicament sans passer par un modèle animal. Nous avons développé plusieurs modèles de cette maladie à partir de tumeurs de patients que nous avons pu modifier en ajoutant un gène, qui permet un suivi de ces modèles par imagerie. Ces modèles sont très rares et sont un outil indispensable pour l'exploration de thérapies prometteuses. L'objectif de ce projet est d'étudier l'efficacité d'un anticorps monoclonal ainsi que ces propriétés de répartition dans les tissus atteints. Dans le cas où ses objectifs seraient atteints, les molécules pourront être directement transférées en clinique chez des patients pédiatriques en phase I.

Bénéfices attendus

Les épendymomes sont des tumeurs pédiatriques chimiorésistantes et responsables de nombreuses rechutes et aucun traitement à ce jour ne permet d’améliorer de façon importante la survie des patients. Le traitement par l'anticoprs monoclonal objet de ce projet est un nouvel espoir thérapeutique pour traiter ses tumeurs. Nous espérons pouvoir améliorer la survie des enfants atteints à court terme.

Procédures

Les animaux seront greffés avec des tumeurs dans le cerveau sous anesthésie générale (durée 30 minutes). Les animaux recevront au maximum 4 injections de produits en intraveineuse et 8 injections en intrapéritonéales, toutes injections seront réalisées sous anesthésie locale (lidocaïne) réparties entre 3 et 6 mois (durée pour chaque 1 minute).

Impact sur les animaux

En fin de procédure, les animaux pourront présenter des symptômes neurologiques (principalement apathie). Les doses d'anticorps monoclonal utilisée pour traiter les souris sont bien inférieures au doses maximales tolérées: aucune toxicité n'est donc à attendre du traitement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récupérer le sang et le cerveau et de pouvoir réaliser des analyses complémentaires ex vivo.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas de modèles cellulaires de ces tumeurs. Il nous est donc impossible de prédire la réponse d’un médicament sans passer par le modèle animal. Cependant, nous avons pu montrer que les épendymomes de patients présentent une très forte expression de certains récepteurs, constituant une cible thérapeutique très prometteuse. De plus, il est reconnu que la barrière hémato-enchéphalique est un réel frein quant aux passage de molécules dans les tumeurs cérébrales. Il est donc indispensable d’évaluer l'efficacité du traitement par l'anticorps monoclonal pressenti dans un modèle animal pertinent.

Réduction

Nos greffes sont suivies par imagerie. Ce suivi permet d'estimer le volume tumoral. Cela permet donc de diminuer le nombre des animaux par procédure et également d'assurer un suivi clinique précis et pertinent de l'évolution des tumeurs cérébrales. De plus, les animaux développent des tumeurs de façon homogène et reproductible. Le nombre de souris a été déterminé de façon optimale par calcul de puissance les croissances tumorales des animaux traités ou non. Des tests statistiques non paramétriques seront utilisés,en analyse de variance ou pour les comparaisons de groupes deux à deux.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un antalgique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Les procédures dureront entre 3 et 6 mois suivant la croissance tumorale du modèle et la réponse au traitement. La dose du médicament évalué est inférieure à la dose maximale tolérée et des études d’efficacité chez la souris dans d’autres types tumoraux n’ont montré aucun effet toxique à la dose quenous utiliserons. Nous n’attendons donc pas à avoir de la toxicité du médicament. Des points limite précoces spécifiques ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées permet la greffe de tumeurs humaines. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines (population cible pédiatrique).

50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une pastille immunosuppressive implantée sous la peau sous anesthésie, puis une injection intraveineuse de thérapie génique et plusieurs prélèvements sanguins, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir si la toxicité cardiaque observée à forte dose de vecteur est liée à une réponse immunitaire contre le transgène. Le porteur passe en revue les méthodes in silico et in vitro puis affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier les liens entre système immunitaire et système cardiaque.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont un ensemble de pathologies invalidantes sans traitements présentant des signes histologiques et fonctionnels avec une réduction de la force musculaire, et parfois une atteinte cardiaque, respiratoire et cérébral. La thérapie génique est une stratégie envisagée dans ces pathologies d’origine génétique et des approches utilisant des vecteurs dérivés du virus associé à l’adénovirus sont déjà à l’étape clinique. Lors des injections des produits de thérapie génique chez l’homme, Il a été observé des réactions immunitaires contre le vecteur et contre le transgène (produit protéique exprimé à partir du gène apporté par le vecteur), ainsi qu’un certain nombre de réactions adverses. Dans ces cas, des traitements à base de produits immunosuppresseurs sont donnés aux patients et permettent une résolution des problèmes la plupart du temps. Dans nos études précliniques de transfert de gène dans un groupe de pathologies musculaires, les sarcoglycanopathies, nous avons également observé une toxicité cardiaque à des doses élevées de vecteur chez le rat. Nous avons observé de façon concomitante une réponse immune contre le transgène-médicament, sans qu’il soit possible de déterminer si cette réaction immune était en parallèle ou à l’origine de la cardiotoxicité. L’objectif de ce projet est de répondre à cette question en utilisant un régime immunosuppresseur qui va prévenir la réponse contre le transgène et de quantifier une potentielle diminution de la cardiotoxicité.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous définirons si la cardiotoxicité observée à de forte doses de vecteurs est liée ou non à une réponse anti-transgène. La réponse à cette question nous orientera vers la génération de vecteur ayant un profil de sécurité plus élevé car nous saurons si nous devons privilégier des vecteurs ne conduisant pas à une réponse anti-transgène ou au contraire rechercher l’origine de la cardiotoxicité pour définir comment générer des vecteurs.

Procédures

Le traitement immunosuppresseur se fait par injection sous-cutanée de pastilles à l’aide d’une canule une seule fois au cours du protocole sur des animaux sous anesthésie gazeuse. Le transfert de gène se fait par injection intraveineuse en une seule fois sur animaux vigiles avec injection dans la veine caudale. Les prélèvements de sang se feront un jour avant l’injection de la thérapie génique, à 14 jours post-injection et à la fin (J21) du protocole. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées à la nature des actes réalisés : - Douleur de piqûres pour injection du traitement par transfert de gène. Certains actes qui sont susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie gazeuse, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. Effets immunosuppresseurs des drogues et l’effet toxique des doses élevées des injections de thérapie génique peuvent également entrainer des nuisances, comme une atteinte cardiaque et un dérèglement du système immunitaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.

Remplacement

Aucun modèle alternatif à des modèles animaux ne nous permet d’étudier les relations entre la réponse immunitaire et la toxicité cardiaque pour répondre aux questions posées. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, il n’existe à ce jour aucun modèle permettant d’étudier les relations entre le système immunitaire et les système cardiaque..

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le découpage en 2 lots va permettre de définir le meilleure traitement immunosuppresseur dans le premier lot et de ne faire que le meilleur dans le deuxième lot. Le groupe contrôle injecté avec placebo sera mutualisé entre les 2 lots. Nos données suggérant que les observations de toxicité et de réponse immune sont globalement les mêmes entre les deux sexes, nous n’évaluerons la question que sur un seul sexe, ce qui nous permet une réduction d’animaux.

Raffinement

Nous avons choisi d’administrer les molécules à l’aide de pastilles sous-cutanées qui permettent la délivrance de la molécule pendant une période de 21 jours. Cette méthode permet un contrôle de la quantité de produit administré en assurant une distribution continue et une stabilité du produit et donc une meilleure reproductibilité. Cette méthode permet de limiter la manipulation des animaux avec une seule manipulation au lieu de manipulations quotidiennes, évitant par la même du stress aux animaux. L’administration systémique des vecteurs se fera 2 à 3 jours après de l’implantation de la pastille évitant un stress supplémentaire l’animal. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Les prélèvements de sang sont effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telle que l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce rat car c’est sur cette espèce que nous avons observé la plus grande sensibilité à la toxicité cardiaque induite par l’injection des AAV à forte doses. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte à un âge permettant le montage d’une réponse immune.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de BrdU, puis sont tuées 24 heures plus tard pour prélever la moelle osseuse de leurs fémurs et tibias, afin d'étudier le rôle de la protéine HSF1 dans la formation des globules rouges. Le porteur indique avoir d'abord travaillé sur le poisson zèbre et des cellules humaines de sang de cordon, mais affirme que ces modèles ne permettent pas de tester son hypothèse au niveau de la moelle osseuse. La retombée annoncée reste fondamentale, définir HSF1 comme molécule clé de l'érythropoïèse.

Objectifs

L’érythropoïèse est le processus de formation de globules rouges. C’est un phénomène permanent et débute lorsqu'une cellule souche pluripotente (donnant naissance à n'importe quelle cellule sanguine) s’engage en progéniteurs érythroïde qui, par des phénomènes de prolifération et de maturation, donnera naissance à des érythrocytes. La proportion de progéniteurs érythroïdes dans la moelle osseuse est faible (-d’1 % des cellules). On estime la production moyenne de globules rouges à 10 milliards de cellules par heure. Il existe une remarquable expansion du compartiment érythroïde ainsi qu’une fine régulation de l’érythropoïèse au niveau cellulaire et moléculaire. Notre équipe a montré que les protéines de choc thermiques (HSP) sont impliquées dans l’érythropoïèse. Nos résultats préliminaires chez le poisson-zèbre montrent que la protéine HSF1 (Heat Shock Factor 1), contrôlant l’expression des HSPs, est également nécessaire à l’érythropoïèse, et de façon partiellement indépendante des HSPs. Nous avons observé une forte diminution du nombre de globules rouges dans les poissons dans lesquels l’expression d’HSF1 est inhibée. Ce phénomène s’accompagne d’une diminution de la maturation des précurseurs érythrocytaires, suggérant un blocage de l’érythropoïèse. Des travaux récents ont montré que de nombreux gènes n’appartenant pas à la famille des HSP sont régulés par HSF1 et jouent un rôle fondamental dans le cycle et la différenciation cellulaire. Notre hypothèse est que des gènes essentiels à l’érythropoïèse seraient également régulés par HSF1. Pour vérifier notre hypothèse, nous avons besoin, dans des souris déficientes en HSF1 (Hsf1-/-), de mesurer les quantités d’érythrocytes dans le sang d’une part, et d’autre part de tester la capacité des précurseurs érythrocytaires de la moelle à former des globules rouges. La formulation sanguine de nos animaux de phénotypes sauvages (WT) et déficients pour HSF1 (Hsf1-/-), sera analysée grâce à un prélèvement sanguin (veine caudale). Après anesthésie, la mise à mort permettra de récupérer leurs fémurs et tibias afin d’en extraire la moelle osseuse dans le but de déterminer : Sa capacité à réaliser l’érythropoïèse via un phénotypage par cytométrie en flux afin d’analyser la composition cellulaire relative à la voie de différenciation érythrocytaire (progéniteurs et précurseurs). Le niveau d’expression d’HSF1. L'état du cycle cellulaire des cellules en cours de différenciation érythroïde via injection intrapéritonéale de BrdU

Bénéfices attendus

Nos résultats chez le poisson-zèbre montrent une forte diminution du nombre de globules rouges dans les poissons délétés en HSF1. Ce phénomène s’accompagne d’une diminution de la maturation des précurseurs érythrocytaires, suggérant un blocage de l’érythropoïèse. La confirmation de ces résultats dans un modèle murin in vivo permettrait de définir HSF1 comme une molécule clé de la régulation de l’érythropoïèse.

Procédures

Les animaux vigiles recevront une injection par voie intrapéritonéale de BrdU (bromodésoxyuridine) (injection unique ; 3-4 secondes). 24h après injection, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés, la moelle osseuse sera extraite des fémurs et des tibias prélevés et l’analyse du cycle cellulaire réalisée par cytométrie en flux sur la base du phénotypage érythroïde précédemment mis au point.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles relatifs à l’utilisation de BrdU sur modèle murin sont les suivants : o Diarrhée o Léthargie o Agression o Perte de poids o Lésions inflammatoire cutanées o Réduction de la croissance du pelage o Atteinte hématologique (anémie, leucopénie, thrombopénie) Ces effets peuvent être observés dans le cas d’une exposition longue à la molécule (6 semaines pour une administration via l’eau de boisson ou 1 semaine par injection intrapéritonéale quotidienne). Dans notre cas de figure, nous n’excèderons pas 24h post injection ce qui, selon nous, limitera l’apparition de tels effets. Sachant cela, nous porterons toutefois une attention particulière à ces paramètres durant les 12 à 24h suivant l’injection de BrdU afin de garantir au maximum un qualité de vie optimale de nos animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure expérimentale, nous projetons de prélever et d’utiliser les moelles osseuses issues des tibias et fémurs des animaux de type sauvages (Wild Type ; WT) et déficients pour le facteur HSF1 (Hsf1-/-). Ce mode d’analyse sera réalisé ex-vivo par cytométrie en flux afin d’analyser la composition cellulaire relative à la voie de différenciation érythrocytaire de nos souris.

Remplacement

Nos résultats préliminaires obtenus dans le modèle de poisson zèbre nous a permis à la fois de remplacer l’utilisation de petits mammifères tels que les souris (Mus musculus ; A1) et d’en réduire le nombre au regard des différents axes restant à être investigués. Toutefois, ce model ne nous permet pas de tester notre hypothèse de régulation de gènes essentiels à l’érythropoïèse par HSF1 car 1) il nous permet seulement de travailler sur l’érythropoïèse embryonnaire et 2) l’étude des gènes régulés ne peut se faire qu’au niveau du poisson entier, et non pas au niveau de la moelle osseuse (site de l’érythropoïèse).

Réduction

En plus du modèle poisson zèbre, nous avons obtenu un ensemble de données grâce à l’utilisation de cellules souches et cellules progénitrices érythroïdes humaines à partir de sang de cordon ombilical. La réalisation de telles expériences sur ce matériel cellulaire nous a permis d’affiner nos axes de recherche, d’affiner notre investigation relative aux voies de signalisation intracellulaire d’intérêts ainsi que nos cibles géniques. Ceci ayant pour répercution la réduction, in fine, du nombre d’expérience à réaliser sur le modèle murin (Mus musculus) et par extension la réduction du nombre d’animaux à utiliser afin de confirmer nos résultats. Nous estimons à 60 le nombre total d’animaux qui seront utilisés dans le cadre de la phase expérimentale (30 Wild Type ; WT (phénotype sauvage) / 30 Hsf1-/- (déficientes pour le facteur HSF1) toutes expérimentations comprises). Ce nombre d’animaux correspond au nombre minimal permettant d’obtenir des résultats significatifs avec le test statistique utilisé ainsi que les mises au point (principalement sur des souris de phénotype sauvage).

Raffinement

Dans le but de réduire, supprimer/soulager la douleur/détresse de nos animaux dans le cadre de nos expériences nécessitant une intervention (injection intrapéritonéale) sur animaux vigiles, nous avons basé notre méthodologie sur des travaux optimisés, revus et publiés dans la littérature scientifique. Pour l’ensemble de nos animaux (injectés ou non), ces derniers seront minutieusement observés lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Des mesures seront prises pour améliorer le bien-être des animaux. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu sera également mis en place. Un contenant sera placé dans chaque cage permettant aux souris de se cacher et de développer leur répertoire comportemental (exploration, enfouissement…).

Choix des espèces

L’érythropoïèse murine est bien caractérisée et est proche de celle de l’homme. Les souris déficientes en HSF1 sont disponibles et viables. Nous utiliserons des souris de 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal.

405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de trypanosomes africains fluorescents, puis un prélèvement sanguin tous les trois jours pendant quatre semaines et des séances d'imagerie sous anesthésie, avant une ponction intracardiaque terminale. Le porteur affirme qu'aucun dommage évident n'est attendu car la procédure s'arrête avant l'installation des symptômes, tout en déclarant la gravité modérée. Sur le remplacement, il décrit un modèle de peau en micropuce en développement mais conclut que le recours à l'animal reste "indispensable" pour l'"organisme entier".

Objectifs

Le comportement des trypanosomes extravasculaires en termes de prolifération, différentiation, migration, métabolisme et perception sensorielle est certainement déterminant pour le développement de l’infection. Nous suivrons donc la progression de l’infection chez la souris par des parasites Trypanosoma brucei brucei fluorescents et bioluminescents, par une combinaison de méthodes d’imagerie intravitale et de cytométrie. Ceci nous permettra de localiser et de quantifier les trypanosomes dans le temps et dans l’espace en distinguant les parasites intra- et extravasculaires. Le tropisme et le comportement extravasculaires de différents trypanosomes mutants seront successivement comparés à des infections par une souche sauvage afin de : 1- Déterminer la capacité des parasites extravasculaires à se différencier en formes transmissible au vecteur : 1 souche ZCH20 KO (incapable de se différencier) et 1 contrôle Add-Back, 1 souche contrôle rapporteur NLS-EGFP PAD1-UTR (noyau vert fluo si différenciée). Ces 3 souches seront injectées par voie intrapéritonéale. 2- Déterminer l’importance de la mobilité active des parasites pour leur tropisme extravasculaire : 1 souche DNAI1RNAi inductible (nage lente et en arrière seulement). Cette souche sera injectée par voies intravasculaire Vs. intradermique pour comparaison. 3- Déterminer l’importance des fonctions sensorielles pour le tropisme et la maintenance extravasculaire du parasite : 3 souches AQP123 KO (dépourvues de canaux membranaires aquaglycéroporines) et leur 3 contrôles Add-Back. Ces souches seront injectées par voies intravasculaire Vs. intradermique pour comparaison. Un traitement suboptimal à la suramine après 2 semaines d’infections nous permettra de confirmer ces observations en ciblant spécifiquement les parasites sanguins afin de n’observer que les parasites extravasculaires possiblement présents. 4- Déterminer l’importance de la glycolyse et de la néoglucogenèse chez les formes extravasculaires. L’importance du glycérol comme source de carbone sera en particulier étudiée : 1 souche GK KO (sans glycérol kinase) et son contrôle Add-back. Ces souches seront injectées par voies intravasculaire Vs. intradermique pour comparaison. Un traitement suboptimal à la suramine après 2 semaines d’infections sera également réalisé.

Bénéfices attendus

La biologie des formes extravasculaires de trypanosomes reste mal connue. Le comportement des parasites extravasculaires (prolifération, différentiation, migration, métabolisme, perception sensorielle…) est certainement déterminant pour le développement de l’infection. Une meilleure connaissance de ces mécanismes permettrait donc d’envisager de nouvelles cibles diagnostiques et / ou thérapeutiques, et d’optimiser la surveillance des cas et des réservoirs asymptomatiques dans le contexte de l’élimination de la maladie.

Procédures

Une injection intrapéritonéale, intraveineuse ou intradermique (quelques secondes) au début de la procédure. Une prise de sang (10ul en quelques secondes) par animal tous les 3 jours pendant 4 semaines. Une observation par imagerie intravitale sur organisme entier (

Impact sur les animaux

D’après la littérature et notre expérience avec ce modèle d’infection chronique : les symptômes de la maladie ne s’installent chez la souris qu’après plus de 4 semaines et la mort ne survient qu’à partir de 6 à 8 semaines. Dans nos conditions d’observation d’une durée maximum de 4 semaines, aucun dommage évident n’est donc attendu. De plus, l’approche d’imagerie intravitale envisagée permet une réduction significative du nombre d’animaux et minimise grandement le nombre et la gravité des gestes techniques réalisés sur ces animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés (les animaux étant infectés).

Remplacement

Nous développons actuellement un modèle organoïde de peau en micropuce qui permettra de répondre à certaines questions à l’échelle tissulaire, et ainsi de réduire de façon substantielle les infections expérimentales de rongeurs. Toutefois, pour comprendre certains mécanismes à l’échelle de l’organisme entier, le recours à l’animal reste indispensable.

Réduction

L’approche d’imagerie intravitale envisagée permet un suivi des individus dans le temps, ce qui limite le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, selon la question biologique étudiée, entre 4 et 8 groupes seront nécessaires, contrôles inclus, et plusieurs mesures seront réalisées au cours du temps sur chaque animal. Dans ces conditions, les effectifs permettront de mettre en évidence avec suffisamment de puissance des effets moyens à larges (d entre 0.7 et 0.9). Avec 3 répétitions pour chaque expérience et plusieurs cages par groupe, les effets techniques pourront également être quantifiés et pris en compte dans l'analyse à l'aide de modèles à effets mixtes.

Raffinement

L’approche d’imagerie intravitale envisagée minimise le nombre et la gravité des gestes techniques réalisés sur les animaux. La fréquence des observations est limitée à 3 fois par semaine et sous anesthésie gazeuse peu profonde pendant environ 10 minutes. Les prélèvements sanguins caudaux sont réalisés après application topique de lidocaïne. Les souris sont hébergées dans des conditions optimales en portoirs ventilés en animalerie A3 sous la surveillance de zootechniciens spécialisés. Elles sont suivies quotidiennement durant toute la durée de la procédure par un des 2 expérimentateurs formés impliqués dans l’étude. Leur poids est mesuré et leur état de bien-être est contrôlé avec la grille de suivi utilisée pour évaluer leur douleur, leur stress, leur inconfort, mise au point par la SBEA et disponible sur le site internet de l’animalerie centrale. Elles disposent en permanence de nourriture, d’eau et de coton (enrichissement). Une attention particulière sera prêtée aux points limites suivants : prostration ou asthénie, aspect général altéré (pelage ébouriffé, palissement des oreilles, yeux vitreux, vivacité) et perte de poids > 20% du poids initial. La durée maximum de la procédure dans le contexte d’une infection chronique est trop courte pour que des symptômes apparaissent nettement. Dans tous les cas, les phénotypes de virulence attendus pour les souches de parasites mutées sont des diminutions voire des pertes totales de virulence par rapport aux souches contrôles.

Choix des espèces

La souris est le plus petit modèle Mammifère validé disponible et suffisamment proche de l’homme pour permettre un accès à toutes les informations recherchées et une interprétation / extrapolation par analogie, et à la fois le moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Adultes de 7 semaines. Il s’agit du modèle le plus fréquemment utilisé dans la littérature, ce qui nous permettra des comparaisons.

2 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie cérébrale d'une heure à une heure trente, d'autres reçoivent des injections répétées de cocaïne dans un test de préférence de place ou des injections intracérébrales par canule, avant le prélèvement de leur cerveau. Le projet étudie les synapses à dopamine impliquées dans la maladie de Parkinson, la dépendance et la schizophrénie. Le porteur affirme que ces dimensions ne sont pas modélisables in vitro ou in silico, tout en prévoyant de remplacer certaines validations par de la culture cellulaire.

Objectifs

Les neurones du cerveau communiquent entre eux grâce à des neurotransmetteurs au niveau de structures très petites appelées « les synapses ». Un de ces neurotransmetteurs est la dopamine. Les synapses qui libèrent de la dopamine sont impliquées dans le contrôle de nos mouvements et la sensation de « bien-être ». Elles sont affectées dans la maladie de Parkinson ainsi que dans les troubles psychiatriques comme la dépendance aux drogues et la schizophrénie. Il est donc très important de connaître cette synapse précisément afin de permettre le progrès des approches médicales à ces maladies graves. Le but de ce projet est donc d’étudier ces synapses au sein du système cérébral de la locomotion, de la récompense, et de la prise de décision (système nigrostrié et mésocorticolimbique). Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique, et/ou une approche de marquage viral. Nous utiliserons aussi une approche de manipulation pharmacologique par la cocaïne, ou une déficience en acides gras polyinsaturés de type n-3. Ces approches seront suivies de tri par fluorescence des synaptosomes, d’analyses par immuno-blot, immuno-fluorescence et spectrométrie de masse. Ces différentes approches permettront d’analyser l’impact de ces manipulations sur la structure moléculaire et la fonction de la synapse dopaminergique. Nous testerons également les processus de récompense en utilisant des tâches comportementales de conditionnement à la préférence de place. Lors de ce test la préférence de compartiment dans lesquelles des souris reçoivent une dose de cocaine ou une solution saline est analysé.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre le rôle de SynCAM 2 (molécule d’adhésion cellulaire synaptique 2) dans la formation et la maintenance des synapses dopaminergique, de comprendre quelles sont les altérations synaptiques induites par l’apprentissage conditionné par la cocaïne, et comment le statut cérébral en acides gras polyinsaturés influence la synapse dopaminergique. Ces données seront fondamentales d’un point de vue physiopathologique étant donné que : la dégénérescence des voies dopaminergiques est centrale dans la maladie de Parkinson, la plasticité des synapse striatales doit être comprise pour mieux appréhender les altérations induites par l’abus de drogues chez les patients dépendants, l’équilibre central en acides gras polyinsaturés n-3 est affecté dans les troubles psycho-affectifs. Nos données constitueront un socle de connaissances pour l’ensemble des laboratoires impliqués dans l’étude cellulaire et moléculaire de la physiopathologie du système dopaminergique central.

Procédures

Une partie des animaux subira des procédures chirurgicales (1 fois, durée de 1h à 1h30) afin d'exciser la protéine SynCAM 2, d’exprimer des protéines fluorescentes et ou de re-exprimer la protéine SynCAM 2. Une partie des animaux recevra une injection de solution saline intrapéritonéale par jour pendant 4 jours. Une partie des animaux subira quatre injections intrapéritonéales de cocaïne et/ou de solution saline. Deux injections par jour, une le matin et une le soir et sont placées à chaque fois dans une boite d’analyse de la préférence de place pendant 20 minutes. Une partie des animaux subira 2 injections intra-canules d'agents pharmacologiques. Une injection 30 minute avant chaque injection de cocaine du protocole CPP. Les injections intra-canules durent 10 minutes, 5 minutes d'injection et 5 minutes d'attente après injection pendant lesquelles l'injecteur est laissé en place pour permettre la diffusion des agents pharmacologiques. Les injections intra-péritonéales durent 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale peut causer une perte de poids ou une infection cutanée. Le régime alimentaire peut aussi impacter le poids de l’animal. Tous ces effets indésirables seront évités par le protocole de suivi mis en place et l’expertise de l’expérimentateur habitué à ces pratiques. Enfin une accoutumance et les effets de manque qui peuvent se produire suite aux injections de cocaïne seront évités par le sacrifice des animaux 24h après la dernière injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet, soit par dislocation après induction par isoflurane, soit par l'injection d’un euthanasiant (exagon) avec sédation préalable par méloxicam suivi d'une perfusion intracardiaque afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses protéomiques, biochimiques et histologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions non modélisables sur des modèles in-vitro ou in-silico. Nous remplacerons certaines validations par la mise en place culture cellulaire de neurones dopaminergiques.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum pour obtenir assez de matériel biologique ainsi que le nombre de répétitions indépendantes pour éliminer les biais expérimentaux a été déterminé par nos expériences précédentes ainsi que celles de nos collaborateurs. Basé sur nos précédentes études ce nombre est aussi suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes.Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de la plupart des animaux de la descendance et utiliseront les mâles et les femelles. Les animaux restants dont le génotype n’est pas directement utilisable seront utilisés en contrôle de fluorescence lors du tri de synaptosomes. Du fait de cette stratégie, la grande majorité des animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. D’autre part nous réduiront le nombre de souris qui passeront en chirurgie stéréotaxique par l’emploi de souris génétiquement modifiées exprimant déjà une fluorescence (VGLUT1venus). Enfin la mise en place de protocoles aseptiques de chirurgie nous a permis de réduire d’un facteur deux le nombre d’animaux utilisés lors de notre précédente étude.

Raffinement

Afin de minimiser la souffrance des animaux, les procédures suivantes sont mise en place: les animaux sont logés dans des cages communes (3 à 5 par cage de 612,5 cm2), pourvues de litière pour leur permettre de reproduire un comportement naturel de recherche de nourriture et d'un enrichissement composé d'un nid de plantes et de tube en carton pour leur permettre de ronger. Ces cages leur donnent beaucoup d'espace pour se tenir debout. Concernant la chirurgie stéréotaxique : L’ensemble de la chirurgie sera réalisée à deux opérateurs pour maintenir l’asepsie. Prévention de l'hypothermie : l'animal sera placé sur un tapis chauffant permettant d'ajuster la température du tapis en fonction de la température corporelle de l'animal (maintien à 37°C). Prévention de la déshydratation : administration d'une solution saline chaude et stérile à la fin de l'opération. Suivi, soins et hébergement, phase d'éveil: l'animal sera placé sur un tapis chaud dans une cage de récupération (~15min), avec accès à de l'eau et à de la nourriture humide, sous observation étroite pendant au moins 1h. Suivi postopératoire: l'état de santé des animaux sera évalué quotidiennement pendant au moins 2 jours (pesée, observations, évaluation des points limites) sur un formulaire de suivi individuel. Si des signes d'infection ou de saignement apparaissent au niveau du site chirurgical, la plaie sera nettoyée et un antiseptique local sera appliqué. L'administration d'un anti-inflammatoire non stéroïdien sera également systématiquement effectuée toutes les 24h après la chirurgie afin de garantir 48h de soins pour chaque souris après la chirurgie. Si nécessaire, la douleur sera soulagée par l'administration d'une injection de de ce même anti-inflammatoire 72h après la chirurgie. Pour limiter le stress des animaux lors de la procédure de perfusion les souris recevront une sédation par un anti-inflammatoire suivie 10 minutes plus tard de l'injection d'un euthanasiant. Après vérification de l'anestésie par pincement de la patte, les animaux seront perfusés en intracardiaque. Cette procédure sera effectuée par un personnel formé et compétent, ce qui garantira la précision et limitera le stress de l'animal avant la perte de conscience.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles génétiquement modifiés disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations sur le cerveau mature