Procédures modérées

568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéficientes, elles sont irradiées, reçoivent des greffes de cellules souches et de cellules leucémiques humaines, puis des injections, des prélèvements sanguins et un prélèvement de moelle osseuse, l'envahissement leucémique pouvant provoquer un amaigrissement. Le projet, mené avec une entreprise de biotechnologies, teste une thérapie cellulaire dérivée des CAR-T contre les leucémies. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne produit des lymphocytes T humains matures et que seule la xénotransplantation le permet.

Objectifs

Les cellules CAR-T sont des lymphocytes T modifiés génétiquement dans le but de reconnaître puis éliminer les cellules cancéreuses. Elles sont la base d’une toute nouvelle approche de traitement contre le cancer, consistant à prélever des cellules immunitaires d’un patient ou d’un donneur sain (ici, les lymphocytes T), pour les modifier génétiquement et les réinjecter chez le patient. Cette nouvelle approche est un espoir dans le traitement des cancers. Des obstacles d'efficacité, de longévité et de spécificité des lymphocytes T génétiquement modifiés restent à résoudre dans cette thérapie et malgré un taux important de réponse complète aux traitements après thérapie, la rechute de la maladie reste un défi. La perte précoce des cellules liée à leur demi-vie courte et une inefficacité est une des raisons qui expliquent les échecs de cette thérapie. Notre stratégie est une approche cellulaire par l'utilisation de cellules progénitrices de lymphocytes T exprimant un récepteur CAR, génétiquement modifiées appelées ci-après (CAR-ProTcells) qui pourrait contourner certains des obstacles rencontrés. L'utilisation de la thérapie CAR-ProTcells permettrait d’accélérer la reconstitution du thymus, lieu de production des lymphocytes T, du patient, et améliorerait l'efficacité et la durabilité du traitement. Le projet sera mené en collaboration avec une entreprise de biotechnologies qui a mis en place un procédé de production de progéniteurs T et montré son efficacité à produire un compartiment de lymphocytes T matures, importantes. Des études préliminaires ont également mis en lumière une nouvelle génération de produits d’immuno-oncologie cellulaire pour lutter efficacement contre les cancers. Ces produits cellulaires pourraient limiter les effets néfastes secondaires récurrents, par exemple la production massive de cytokines inflammatoire, de la stratégie des lymphocyte T génétiquement modifiés. Notre projet propose de mener des études précliniques dans un modèle rongeur, afin de démontrer le potentiel et l’efficacité de la stratégie CAR-ProTcells comme thérapie pour l’éradication de leucémies.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant des progéniteurs de lymphocytes T génétiquement modifiés, et donc d'une plateforme de développement de ces cellules à visée d'utilisation clinique chez l'humain. L’acquisition de nos données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. La stratégie de CAR-ProT cells pourrait offrir des réponses antitumorales durables et efficaces en contournant les obstacles majeurs d'efficacité, de longévité et de spécificité des CART reportés à ce jour dans le domaine des immunothérapies pour le cancer.

Procédures

Irradiation : Les animaux receveurs des greffes de CSH et cellules Pro-CAR T cells. La procédure d’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles.) Injection intraveineuse rétro-orbitale des cellules 1 fois, sous anesthésie. L’injection durera 1 minute / animal après anesthésie. Injection sous cutanée, 1fois par semaine, animaux vigiles. durée 1 minute/ animal. Injection intraveineuse (queue) des cellules tumorales 1fois. L’injection durera 1 minute par animal vigile. Les souris subiront des prélèvements sanguins (au maximum 3 sur une période de 2 à 3 mois) en cours d'expérience sous anesthésie. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes par animal. Imagerie Bioluminescence sur animaux anesthésiés maximum 1 foi par semaine (dure 10 min/souris) Un prélèvement de moelle osseuse, sous anesthésie générale, avec un traitement anti-douleur avant et après l'intervention (dure environs 3 minutes)

Impact sur les animaux

L’introduction des cellules leucémiques humaines peut occasionner chez l'animal des troubles de type amaigrissement du fait de l'envahissement leucémique prononcé qui joue sur l'appétit des animaux. La durée de nos expériences ne dépassera pas 6 mois pour éviter ces effets indésirables. Nos expériences préparatoires vont anticiper ces possibles troubles en définissant la période précédant leur apparition, qui sera celle choisie pour injecter les CAR-T ou CAR-ProT cells qui devraient agir comme une thérapie. Un prélèvement de moelle osseuse sera réalisé (uniquement sur les groupes ayant reçu les cellules leucémiques du patient) qui pourrait provoquer également de la douleur.

Devenir

L'obtention des résultats requiert que tous les animaux soient euthanasiés en fin d'expériences afin de pouvoir analyser le contenu cellulaire normal et leucémique des organes des souris et donc de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

Les expériences chez l’animal interviennent au terme d’un long processus expérimental de mises au point et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique des CAR-ProT cells avant un développement clinique chez l'humain. Des études in vitro ont été réalisées avec des cellules humaines afin d’optimiser les conditions de préparation et améliorer le produit de thérapie cellulaire. Néanmoins ces tests sont trop limitants et il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir des cellules T humaines matures et fonctionnelles. Pour l’instant, seule la xénotransplantation de cellules hématopoïétiques humaines à des souris immunodéficientes permet la maturation et la différenciation complète de progéniteurs de lymphocytes humains dans le thymus de ces souris. Nous sommes donc arrivés à un point où nous ne pouvons pas aller plus loin dans le remplacement de l'utilisation d'animaux par un modèle in vitro.

Réduction

Chaque expérience sera répétée 2 fois, afin d’accumuler les datas dans 10 à 12 animaux au total. Nous avons auparavant et au sein d’autres projets acquis des connaissances sur le modèle tumoral de cellules hématopoïétiques. Ce modèle est reproductible et la tumeur peut être éliminée par un traitement classique CAR-T. Selon nos expériences précédentes et les données de la littérature utilisant ce type de modèle, nous avons postulé que si nous accumulons des données sur 10 à 12 souris au total nous devons pouvoir observer une différence significative entre les groupes non-traités et traités par l’approche CAR-ProTcell (diminution de tumeur dans le groupe traité versus groupe non traité). Pour obtenir ces résultats sur le nombre d’animaux déposés, nous allons effectuer 2 expériences indépendantes contenant 5 à 6 souris par groupe.

Raffinement

Les animaux seront suivis très régulièrement pour mesurer l'impact des manipulations sur leur état de santé. L’état de santé sera évalué à l’aide d’une grille de score définie par la structure chargée du bien-être animal au sein de l’organisme. Cette grille permet de réagir rapidement, pour décider de la mise en place de traitements palliatifs ou d’une euthanasie Pour limiter les effets de stress et de douleur des animaux, les interventions telles que les prélèvements sanguins ou les injections de cellules seront réalisées sous anesthésie et analgésie

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes. Ces souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Le déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, normales ou pathologiques, et offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules humaines in vivo. Ce modèle est couramment utilisé pour tester l’efficacité des cellules CAR-T. Le thymus des souris immunodéficientes adultes, qui joue un rôle majeur dans la maturation des lymphocytes T, ressemble à celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une transplantation de moelle osseuse. De nombreuses données sur l’étude de la différenciation des lymphocytes T humains chez ces souris sont disponibles, ce qui nous permettra d’évaluer l’efficacité des progéniteurs lymphoïdes produits par nos équipes dans un environnement similaire à celui des patients.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration unique d'un composé par voie orale ou intraveineuse, puis jusqu'à trois prélèvements sanguins, pour étudier le devenir de molécules dans l'organisme. Le projet relève de l'évaluation préclinique d'inhibiteurs de kinases, la sélection des meilleures molécules étant située à "plus long terme". Le porteur affirme que les tests in vitro "ne constituent pas des méthodes alternatives" et que le recours au modèle animal est "indispensable".

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine: maladies inflammatoires, pathologies affectant le système nerveux périphérique et central, et cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à assembler des petites molécules, ou molécules fragments, dirigées contre une cible thérapeutique choisie, dans le cadre d’une pathologie particulière. Chacun des fragments va contribuer à la spécificité de la molécule complète pour sa cible biologique. Ce projet se situera dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de protéines recombinantes, de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Les études sur les modèles de cellules en culture des composés à tester auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations d’ordre pharmacocinétique. L’étude de la pharmacocinétique in vivo d’un nouveau composé permet d’affiner la compréhension et l’analyse du devenir du composé dans l’organisme afin de mieux caractériser son mode d’action et appréhender de potentiels effets indésirables. L'objectif du projet est d'étudier l'effet du système biologique d'un organisme entier sur le devenir d'un composé test au cours du temps suivant son administration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les propriétés pharmacocinétiques de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées dans le but de déterminer leur capacité à atteindre leur cible in vivo. Cela permettra d’optimiser leur posologie (dose et fréquence d’administration) pour l’évaluation de leur toxicité d’une part et de leur activité biologique sur des modèles murins de pathologies humaines d’autre part. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dus au traitement, pour le traitement de maladies à forts besoins médicaux non satisfaits (maladies neurodégénératives, inflammatoires et cancer) et ainsi améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux se verront administrer un composé test une fois par voie orale (quelques secondes) ou intraveineuse (inférieur à 1 minute). Des prélèvements de sang seront réalisés à différents temps après le traitement n’excédant pas 3 prélèvements par animal (durée du prélèvement inférieure à 1 minute).

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu suite à l'administration d'une nouvelle molécule et suite aux prélèvements sanguins répétés est une perte de poids. Les animaux se verront administrer le composé test une fois : par voie intraveineuse pour la moitié d’entre eux, et par voie orale pour l’autre moitié. Des prélèvements de faibles volumes de sang (microsampling) seront faits au niveau de la veine caudale ou de la veine mandibulaire, 3 fois maximum par animal, répartis sur une durée maximale de 48h.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Ces tests permettent de sélectionner les meilleures molécules candidates d'une part, et d'autre part d'avoir une première approche de la pharmacocinétique des composés (absorption, métabolisme), mais ils ne peuvent fournir l'ensemble des éléments caractérisant le devenir du composé dans un organisme vivant. Ils ne constituent donc pas des méthodes alternatives ou substitutives à la complexité d’un organisme vivant. L'effet de l’administration du composé test in vivo résulte de l'interaction entre de nombreux mécanismes physiologiques qui ne peuvent être reproduits in vitro. Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, il est nécessaire d'avoir au minimum 3 prélèvements par temps pour obtenir des paramètres pharmacocinétiques fiables en tenant compte de la variabilité biologique. Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés nous utiliserons la technique du microsampling : des micro-prélèvements de sang seront réalisés sur un même animal à différents temps de prélèvements réduisant ainsi la variabilité des résultats et le nombre d'animaux nécessaires. Il n'est pas prévu de faire une étude statistique sur ce projet. Les effectifs seront limités à 9 animaux par groupe pour tenir compte de la variabilité biologique (3 animaux par temps de prélèvement) et du nombre de prélèvements répétés possibles (chaque animal sera utilisé pour 3 prélèvements maximum).

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux lors du projet et donc d'augmenter la fiabilité des résultats, une période d'acclimatation de 7 jours sera respectée avant le début de la procédure expérimentale. Durant cette période les animaux seront manipulés et habitués à la boite de contention qui sera utilisée pour réaliser les injections intraveineuses. Au cours de la phase expérimentale les animaux seront observés quotidiennement. Dans le cas de l’atteinte de l’un des points limites définis dans le projet l’animal sera euthanasié. Pour les prélèvements de sang, la technique de microsampling (rapide et entrainant une douleur légère liée à la piqure) sera utilisée.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques : oncologie, maladies inflammatoires et pathologie du système nerveux. La majorité des modèles animaux développés pour ces pathologies sont des modèles de souris génétiquement modifiées, souris transgéniques pour les pathologies inflammatoires et système nerveux, souris immunodéficientes pour les modèles en oncologie. Afin de tester l'activité biologique in vivo des molécules développées il est donc nécessaire d'avoir recours à ces modèles murins. Dans ce projet il n'y aura pas d'induction de pathologie, cependant les résultats obtenus serviront pour la suite de l’évaluation préclinique du médicament (dose maximale tolérée et efficacité). Il est donc prévu d’utiliser des souris de même fond génétique que les souches nécessaires et choisies pour la cible thérapeutique considérée. De plus, la souris est un modèle tout à fait pertinent pour les études de pharmacocinétiques en raison de ses similitudes avec les humains dans les processus d'absorption, de métabolisme et d'élimination. Les animaux seront adultes, soit 8 à 10 semaines lors du début de l’étude, afin d’avoir un système immunitaire, hormonal et métabolique mature dans le but d’obtenir la réponse recherchée sans biais.

350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbital de l'œil sous anesthésie, puis des prélèvements sanguins au même endroit, avant une mise à mort permettant de prélever leurs organes. Le projet vise à documenter un effet inattendu observé lors d'une étude précédente d'un candidat d'immunothérapie, en vue d'un dossier réglementaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne mime le système immunitaire complet et qu'il est "obligé" de recourir à la souris.

Objectifs

L’équipe s’intéresse au développement de petites molécules exprimées par des vecteurs viraux notamment pour restaurer le système immunitaire dans certaines pathologies. Plusieurs de ces molécules sont déjà en développement clinique mais il est possible que l’expression d’une ou plusieurs de ces molécules via un vecteur pourrait permettre une expression prolongée et/ou une distribution différente dans l’organisme de ces protéines, voire engendrer une activité biologique différente de celle de la forme non vectorisée et ainsi avoir une efficacité accrue. Des études précédentes (dans des modèles murins) ont permis d’obtenir une preuve de concept pour un candidat, administré par voie intraveineuse, basé sur vecteur virale modifié codant pour une protéine agissant sur le système immunitaire majoritairement décrite pour agir sur un certain type de lymphocyte. Lors de ces études, il a été observé un effet non négligeable et inattendu de ce candidat sur un autre type de cellule. Malheureusement, nous n'avons pas pu investiguer en détails les effets du candidat sur ces cellules, ces dernières n'étant pas la cible privilégiée dans notre étude précédente. Par conséquent, nous souhaitons réaliser une nouvelle étude préclinique ayant pour objectif l'étude de l'impact de ce candidat sur ce type cellulaire dans des souris naïves. Ces résultats permettront de mieux appréhender le(s) mécanisme(s) d’action de notre candidat, dans le but d’étoffer les dossiers règlementaires nécessaires pour initier un développement clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements pour traiter l’immunosuppression en restaurant le système immunitaire des patients et ainsi prévenir les infections secondaires pouvant leur être fatales. Précédemment, nous avons montré la pertinence de vectoriser une protéine particulière sur sa capacité à booster le système immunitaire de souris saines. Néanmoins, lors de cette évaluation, nous avons observé un effet inattendu sur un type particulier de cellule, qui n’a pas pu être pleinement étudié, les tests d’analyse étant focalisé sur la réponse cellulaire T. L’objectif à court terme de ce projet de recherche est donc de confirmer et de documenter plus en profondeur l’effet biologique observé sur ces cellules cibles. Ces résultats permettront de mieux appréhender le mécanisme d’action du produit ce qui peut être critique pour la suite du développement du produit en phase clinique. En effet, mieux connaître le mécanisme d’action d’un produit d’immunothérapie permettrait de mieux cibler les patients pour lesquels le produit pourrait être testé.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Injections des produits en intraveineuse au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie locale suivie d’une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sur tous les animaux : (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) - Prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbital sur animaux vigiles après anesthésie locale (1 fois/ souris et 1 à 2 min/souris)

Impact sur les animaux

Aucune toxicité du produit n’est attendue puisque celui-ci a déjà été évalué chez la souris. Néanmoins, les animaux peuvent ressentir un désagrément voire une douleur modérée au moment de l’injection des candidats (injection intra veineuse au niveau du sinus rétro-orbital) qui est minorée par l’utilisation d’une anesthésie locale suivie d’une anesthésie générale mais également lors des prélèvements sanguins à l’œil. La douleur est sont atténuée par l’utilisation d’une anesthésie locale.

Devenir

Le but du projet étant d’évaluer l’activité biologique de notre candidat sur différents types cellulaires provenant de différents organes au cours du temps, il est donc nécessaire de mettre à mort tous les animaux inclus dans la procédure.

Remplacement

Les objectifs de ce projet étant d‘évaluer un candidat d’immunothérapie, susceptible de suivre un développement clinique chez l’homme, nous sommes donc contraints de respecter les obligations réglementaires à savoir qu’un produit ne peut pas passer en clinique en se basant uniquement sur des résultats générés in vitro. La caractérisation in vitro de ce candidat a déjà été réalisée. Désormais, nous voulons évaluer au cours du temps les effets de notre candidat sur une population lymphocytaire et ses sous-types dans différents organes dont le pic de la réponse peut différer, ce qui nécessite l’utilisation d’un organisme vivant entier. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro mimant le système immunitaire complet murin et susceptible d’apporter le même niveau d’information pour répondre à ces objectifs. L’utilisation des invertébrés ne semble pas judicieuse en raison d’un système immunitaire très différent de celui d’un vertébré. Nous sommes donc obligés de faire appel à un vertébré, la souris.

Réduction

Tout au long du projet, nous avons essayé de réduire le nombre de souris sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Ce type d’expérience ayant déjà été réalisé au cours du projet global, nous avons donc pu calculer la taille de l’effet de notre produit sur cette population at ainsi déterminer le nombre de souris nécessaire par groupe pour avoir une puissance statistique adéquat. Vingt souris par groupe seront donc nécessaires pour comparer deux à deux les moyennes des groupes et pour montrer une différence statistique entre les groupes d’intérêt, moins de souris (10 souris/temps) pour le groupe injecté par le tampon de dilution du MVA car les effets biologiques ne varient pas au cours du temps. Dans ce projet, nous prélèverons post mortem la plupart des organes cibles de notre candidat afin de répondre à un maximum de question dans un seul protocole.

Raffinement

Mise en place du raffinement dans la procédure : L’injection intraveineuse au niveau du sinus rétro orbital de notre candidat est réalisée sur animaux anesthésiés, une anesthésie locale par de la tétracaine suivie d'une anesthésie générale gazeuse. Les prélèvements sanguins à l’œil se font sur animaux vigiles après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. Les points limites ont été définis de manière suffisamment prédictive et précoce pour éviter toute souffrance de l'animal de la naissance à la mort. Tout au long de la procédure nos animaux sont surveillés au moins 5 fois par semaine avec une observation accrue quelques heures après l’injection des produits (entre 4h et 6h post injection) même s’il n’est pas attendu d’effet délétère de ces derniers sur l’état général des animaux. Néanmoins, en cas d’apparition de signes cliniques (pelage ébouriffé, terne), une surveillance accrue avec suivi de la température sera effectuée. En cas de fièvre (température > 39°C), du doliprane sera donné dans l’eau de boisson (0.6mL/mL). Si persistance de la fièvre (> 2 jours) ou de tout autre signe clinique (immobilité, prostration, apathie) pouvant traduire une douleur/détérioration de l’état général, ce sera un critère de point limite et il y aura mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle murin est un bon modèle animal pour étudier la réponse cellulaire car le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. D’autre part, ayant déjà validé l’efficacité de ce candidat chez la souris, il nous semble pertinent de confirmer et d’approfondir les résultats inattendus précédemment observés dans le même modèle. Nous utiliserons des souris avec un système immunitaire mature, c'est à dire des animaux d'au moins sept semaines pour ces études précliniques

20 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale d'environ une heure pour l'implantation de deux prothèses, gardées en place deux, quatre ou treize semaines, avant une mise à mort permettant de prélever les implants et des organes. Le projet évalue un dispositif médical de réparation des hernies, en testant la résorption et la résistance mécanique des prothèses. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" car ces prélèvements ne sont pas réalisables chez l'humain.

Objectifs

Les hernies abdominales et les éventrations restent compliquées à réparer actuellement même pour les chirurgiens les plus expérimentés. La mise au point d’implants abdominaux destinés à améliorer la prise en charge et la réparation de ces plaies est ainsi primordial. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo plusieurs paramètres suite à l’implantation d’un dispositif, dont le taux de résorption du dispositif et la résistance mécanique. L'objectif du projet est l’obtention des dispositifs médicaux d'essai après une durée d’implantation in vivo (2, 4 et 13 semaines respectivement). Ces échantillons sont nécessaires pour permettre, par des analyses ex-vivo ultérieures, une étude du taux de résorption du dispositif et une analyse de la résistance mécanique. Le critère de jugement principal est l’obtention des dispositifs (avec débors) après une période d’implantation de 2, 4 et 13 semaines chez le porc. Les autres objectifs seront : - D’évaluer les effets locaux induits par l'implantation du dispositif médical pendant 2 semaines, 4 semaines et 13 semaines, - La colonisation des tissus du dispositif médical à l’issue de 2 semaines, 4 semaines et 13 semaines d’implantation (examen visuel)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’évaluation in vivo de la colonisation de la prothèse en fonction du temps. De plus, grâce aux échantillons prélevés à l’issue de l’étude, une analyse de la résistance de la prothèse en situation in vivo et l’évaluation microscopique de l’adhésion de la prothèse par examen histologique pourront être réalisés.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie abdominale pour l’implantation des deux prothèses d’essai d’une durée d’1 h environ, sous anesthésie générale. D’éventuels prélèvements sanguins pourront être effectués en cas de besoin pour compléter l’examen clinique vétérinaire, afin de vérifier les paramètres biologiques qui seront le témoin d’une éventuelle inflammation ou infection de prothèse par exemple. Un traitement analgésique pourra être administré en cas de besoin en fonction des suites opératoires et de l’examen clinique. La durée des actes de prélèvement et d’injection est limitée à quelques minutes.

Impact sur les animaux

Des nuisances au niveau de la cicatrice sont attendus avec des risques d’infection, d’ouverture de la cicatrice, gêne à la marche etc qui seront particulièrement surveillés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour le prélèvement des deux prothèses de test et d’éventuels autres prélèvement d’organes, qui ne seraient pas compatibles avec leur réveil.

Remplacement

Toutes les analyses qui ont pu être réalisées in vitro ont été faites. Des données complémentaires sur la résistance nécessitent l’obtention de prélèvements de l’implant intégré et des prélèvements biologiques éventuels, ce qui n’est pas réalisable chez l’Homme. Le modèle animal est donc ici indispensable pour pouvoir effectuer ces tests dans des conditions les plus proches de chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux dans cette étude est limité au minimum nécessaire pour obtenir un nombre suffisant d’échantillons permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, et ce, sur 3 temps d’étude optimaux pour les résultats escomptés. Deux prothèses seront implantées par animal, ce qui limite d’autant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans une structure agréée pour l’expérimentation animale, dans des conditions maîtrisées (température, ventilation, éclairage). Ils sont suivis quotidiennement et biquotidiennement dans les premiers jours post-opération. Leur environnement est enrichi par la présence de ballons et d’autres objets permettant de maintenir des comportements normaux. Au cours des procédures, les animaux sont anesthésiés et l’anesthésie est suivie et ajustée par un personnel qualifié. Une analgésie post-opératoire sera mise en place au besoin. En post-opératoire et pour la suite de la manipulation, une grille de cotation évaluera différents paramètres pour identifier des signes de mal-être ou de souffrance de l’animal. L’examen clinique comprendra par ailleurs une surveillance de la tension abdominale, de l’état de la plaie (infection, tenue des sutures) et de la température de l’animal. Si ces signes venaient à apparaître, une analgésie post-opératoire serait mise en place avec un suivi renforcé, conformément à la grille de score et suite à l’examen clinique vétérinaire. Si cette gestion venait à être insuffisante ou inefficace, ou si une complication ne pouvait être gérée, la manipulation sera arrêtée, et l’animal serait mis à mort pour éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

Le modèle porc est le modèle utilisé car il est particulièrement adapté à l’implantation sur des durées longues. De par son anatomie proche de l’homme, le modèle porc se prête à l’implantation preperitonéale (rétromusculaire ou intrapéritonéale) de dispositifs de tailles suffisantes afin de permettre des observations histologiques et mécaniques. Enfin, le modèle porc est un modèle usuellement choisi sur ce type de dispositifs de renforts de paroi de sorte que les résultats obtenus permettront une comparaison des résultats. Les animaux utilisés sont des jeunes de 2 à 4 mois (25-30 kg) car la taille des animaux est compatible avec celle des prothèses implantées.

310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines au flanc, puis un traitement quotidien cinq jours par semaine pendant trois à quatre semaines, avec un suivi total de quatre à six mois avant le prélèvement des tumeurs. Le projet teste une molécule censée sensibiliser les cellules souches cancéreuses aux chimiothérapies, avec un bénéfice pour les patients situé "à plus long terme". Le porteur affirme que la validation in vivo est "nécessaire" pour prendre en compte le métabolisme et le microenvironnement.

Objectifs

Dans le cadre de ce projet de recherche, nous voulons évaluer l'efficacité in vivo d'une nouvelle molécule ciblant un facteur de transcription impliqué dans la survie des cellules souches cancéreuses des cancers colorectaux.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet devrait permettre dans une premier temps de tester et d'obtimiser l'efficacité in vivo de nouvelles molécules ciblant une protéine impliquée dans la résistance aux chimiothérapies dans un modèle préclinique murin. A plus long terme, si ces résultats sont concluants, ils pourront potentiellement bénéficier aux patients comme stratégies adjuvantes afin d'améliorer l'efficacité des traitement actuels

Procédures

À l’âge de 7 semaines, les souris dépourvues de système immunitaire (immunodéprimées) seront dans un premier temps greffées avec des cellules tumorales humaines (injection sous-cutanée, durée de contention

Impact sur les animaux

Nous anticipons de légères douleurs provoquées par la piqure avec une aiguille (injection de cellules en sous-cutanée ou de molécules en intrapéritonéales), une possible perte de poids durant les traitements par chimiothérapie. En outre, le développement d'une masse tumorale sur le flanc droit pourrait entrainer une altération de la locomotion de l'animal.

Devenir

A l'issue des procédures expérimentales, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélevéer et d'analyser les tumeurs résiduelles: analyse moléculaires et histologiques.

Remplacement

In vitro, le PXR PROTAC diminue la population de cellules souches cancéreuses ainsi que l’expression de PXR. La validation in vivo de ces données s’avère nécessaire afin de prendre en compte le rôle du métabolisme et du microenvironnement dans le processus de chimiorésistance et de récidive.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux requis pour ces expériences originales qui ne peuvent pas être réalisées autrement que sur la souris immunodéprimée, sans que cela se traduise par l’obtention de résultats moins fiables. Le nombres d’animaux a été déterminé au minimum après calcul de l’échantillonnage nécessaire afin d’obtenir une puissance statistique satisfaisante compte-tenu de nos études antérieures (Planque 2016 et Bansard 2022)

Raffinement

Les souris étant des animaux sociaux et nerveux, nous avons prévu de les maintenir en groupes de 5/cage avec un environnement enrichi (maison carton, copeaux, cotons) afin qu'elles puissent se fabriquer des nids. Les injections intraveineuses seront réalisées sous anesthésie rapide afin de limiter la souffrance des animaux. Compte tenu de la répétition des traitements, nous allons évaluer au moins deux fois par semaine leur état de santé (poids, taille des tumeurs, locomotion, posture) afin de déceler toute douleur subie. Nous avons ainsi identifié des points limites justifiant l’euthanasie des animaux si nécessaire.

Choix des espèces

Les souris dépourvues de système immunitaire sont les modèles utilisés internationalement pour étudier la sensibilité des cellules tumorales humaines aux chimiothérapies et leur capacité à former des tumeurs. Ne possédant de lymphocytes (cellules immunitaires), elles acceptent la greffe de tissus, de tumeurs ou de cellules humaines sans présenter de phénomène de rejet. Age 6 semaines, âge où l’on observe une bonne prise de greffe, et suffisamment âgées pour permettre une récupération dans les meilleures conditions après l'injection de cellules tumorales.

126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, six injections d'un anticorps et sept prélèvements sanguins, la mise à mort intervenant quand la tumeur atteint 2 000 mm³ ou en cas de nécrose. Le projet compare un anticorps humanisé à sa version murine déjà testée, pour un bénéfice que le porteur situe "à long terme". Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de tester ces anticorps sur un "système mammifère vivant entier" et écrit devoir "malheureusement" utiliser à nouveau des souris.

Objectifs

Le système TRAIL (récepteur membranaire) est très prometteur en oncologie car il induit préférentiellement la mort des cellules cancéreuses, épargnant les cellules saines. De nombreux efforts ont été mis en place pour développer des molécules capables d’activer cette voie. Dans une précédente publication nous avons validé l’efficacité antitumoral d’un anticorps monoclonal murin ciblant le récepteur DR4 (récepteur membranaire). Ce dernier a été humanisé et doit être comparé à l’anticorps murin, avec un effet dose, pour validation préclinique. Nous utiliserons donc la lignée de référence publiée en 2019 (BL2)

Bénéfices attendus

Le bénéfice à long terme est la mise au point d’un nouveau traitement immunothérapie pour les cancers chez l’Homme.

Procédures

- Une injection en sous-cutané (environ 4-5 secondes) sous anesthésie à l’isoflurane - Injections en intra-péritonéal (environ 2 secondes), tous les quatre jours, six injections - Prélèvements sanguins sous anesthésie, 100µl de sang par prélèvement maximum, toutes les semaines, sept prélèvements. - Mesure des volumes tumoraux

Impact sur les animaux

Nous attendons une très légère gêne de la motricité à cause de la croissance tumoral, afin de limiter cela, les souris seront mises à mort lorsque les tumeurs auront atteint la taille de 2000 mm3. Nous ne nous attendons pas à des atteintes pulmonaires, mais nous serons vigilants aux éventuelles détresses respiratoires, qui donneront lieu à une mise à mort. Les prélèvements sanguins et les injections de cellules seront effectués sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane afin de réduire le stress et de permettre la contention des animaux. Des nécroses pourraient apparaitre sur les tumeurs (cela est peu probable), si une nécrose dépasse les 2 mm de diamètre la souris sera mise à mort.

Devenir

La croissance tumorale, ainsi que le prélèvement de sang final justifient la mise à mort des animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’est disponible pour tester l’effet des anticorps thérapeutiques sur un système mammifère vivant entier. L’utilisation de souris est donc nécessaire afin d’évaluer la pertinence pré-clinique des traitements antitumoraux. C’est cette approche que nous avions utilisée pour tester notre anticorps murin. Nous devrons malheureusement l’utiliser à nouveau pour tester la version humanisée

Réduction

Nous avons choisi le nombre d’animaux par groupe après étude de la variabilité de la croissance tumorale et de l’effet du traitement obtenue lors de nos précédentes études. Un test statistique sera utilisé afin d’évaluer la significativité des résultats obtenus. Comme indiqué précédemment, si les effets mesurés sont fiables d’un point de vue statistique au deuxième essai, nous n’en feront pas un troisième, ce qui permettra de limiter d’au moins 30% le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

La croissance tumorale sera mesurée trois fois par semaine pour éviter l’apparition de tumeurs de taille excessives. Les animaux seront anesthésiés lors des prélèvements de sang et lors de l’injection des cellules tumorales. Les animaux auront un enrichissement dans les cages sous forme de tunnels.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris NUDE. Cette lignée présente une mutation génétique causant un thymus absent ou détérioré, ce qui résulte en un système immunitaire déficient dû au nombre grandement réduit de lymphocytes T mais conserve les autres cellules du système immunitaires comme les macrophages et cellules dendritiques. Ce modèle permet la greffe de cellules tumorales humaines et garde la capacité des macrophages et des cellules dendritiques à entrainer une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). L’évolution de ces xénogreffes sont ensuite évaluées en fonction des différents traitements testés. Les modèles syngéniques ne peuvent être utilisés car l’anticorps reconnait la forme humaine du récepteur TRAIL. Souris de 6-8 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature

Avant leur septième jour de vie, les souriceaux de trois lignées mutantes subissent un prélèvement à l'oreille pour être génotypés. Devenues adultes, 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour désigner laquelle des trois mutations du syndrome de Bosch-Boonstra-Schaaf se rapproche le plus de la maladie humaine. Elles passent un open field, un grip test, un test de préhension, une boîte clair-obscur, un labyrinthe en croix surélevé, un enfouissement de billes, une construction de nid de 14 heures, un test du tube pour la dominance sociale, des tests d'interaction sociale et une reconnaissance d'objets. Le porteur affirme pourtant qu'elles ne subiront aucun "prélèvement quelconque de leur vivant". Toutes sont tuées à l'issue, et leur encéphale est prélevé pour des études in vitro.

Objectifs

Le syndrome de Bosch-Boonstra-Schaaf est une maladie génétique humaine identifiée à ce jour sur une centaine de personnes à travers le monde, souvent chez de jeunes enfants. Ces malades souffrent généralement d'une déficience intellectuelle, d'un retard développemental, de syndromes autistiques ainsi que de modifications comportementales plus ou moins sévères. De plus,cette pathologie est souvent associée à des troubles de la vision. Chez la souris, trois lignées mutantes ont été générées afin d'être au plus près des mutations rencontrées chez l'Homme. L'objectif principale est d'étudier le comportement (activité générale, apprentissage, mémoire, anxiété, sociabilité) de ces animaux afin de déterminer quel est le modèle (la mutation) le plus proche de l'Homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont importants car cela permettra de valider le modèle animal et de choisir la mutation génétique la plus proche de l'Homme afin de mieux étudier ensuite le neurodéveloppement dans ce modèle et éventuellement de proposer des thérapies comportementales afin de permettre une évolution favorable de ce syndrôme.

Procédures

Ces animaux ne seront pas soumis à de procédures chirugicales ni à prélèvement quelconque de leur vivant. Les 360 animaux seront testés dans des tests comportementaux permettant d'évaluer la motricité, l'anxiété, l'apprentissage, la mémoire ainsi que la sociabilité. L’activité locomotrice de la souris sera évaluée dans un test dit d’open field (deux fois 15 min avec 24h d’intervalle). Un grip test sera effectué : 3 x 60 secondes max avec un intervalle de 10 minutes. Un test d'habilité (préhension) motrice sera aussi effectué pour mettre en évidence une éventuelle déficience de la motricité fine des pattes antérieures: phase d'apprentissage (durée max 30 min), phase test : 2x10 min max avec un intervalle de 24h. L’anxiété sera testée en Dark-light box (durée 10 min) et dans le test de labyrinthe en croix surélevée (durée 10 min). Le caractère impulsif sera mesuré dans le test d'enfouissement de billes: habituation pendant 20 min puis session test (durée 20 min) ainsi que dans le test de fabrication du nid (durée 14h). La dominance sociale sera testée dans le test dit du tube (durée 3x5 minutes max pendant 5 jours). Le test d’interaction sociale permettra de mesurer une préférence sociale chez la souris: habituation deux cages vides durée 5 minutes puis phase de test avec une cage avec un individu (durée 10 min). Un test d'interaction sera aussi effectué: durée 10 minutes. La mémoire de type déclarative sera testée par le test de reconnaissance d'objets: phase d’apprentissage (10 min) suivie d’une session test (durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les troubles liés à l'anxiété et la dépression sont modélisables à l’aide d'une batterie des tests comportementaux classiques décrits dans ce document. Aucune injection ou chirurgie ne sera faite sur l'animal. Le seul effet indésirable potentiel sera le stress de nouveauté dans une nouvelle enceinte ou du vide dans le labyrinthe surélévé ou une aggrisivité particulière vis à vis d'un autre congénère dans un test social. Des critères de suivi (aspect pelage, hydratation, locomotion, morsures...) et des points limites adaptés permettront de mettre fin à une expérimentation si la santé générale de l'animal n'est pas optimale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et l'encéphale sera prélevé pour des études in vitro à postériori

Remplacement

Les conséquences de certaines mutations sur le comportement ne peuvent pas être testées in vitro. Les interactions sociales, motivationnelles, les capacités motrices et mnésiques ne peuvent être étudiées que sur l'animal vigile. Afin de s'assurer que les résultats soient transférables à l'humain, les expériences seront menées sur la souris qui est un excellent modèle génétique.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé selon un testde puissance (logiciel GPower, avec une puissance de 75%) et d'après notre propre expérience afin d'obtenir des résultats robustes. Cela nous permet d'utiliser le strict minimun d'animaux, cad 20 animaux par groupe. Nous utiliserons les mâles et les femelles car il n'a pas été rapporté de différences comportementales entre sexe dans de précédentes études de ce gène. Lors des croisements, sitôt le nombre d'animaux hétérozygotes atteints, ceux-ci seront stoppés afin de ne pas générer d'animaux supplémentaires. Les data sont analysées via des tests non paramétriques

Raffinement

L'hébergement sera effectué dans l'animalerie où les conditions d'élévage sont parfaitement définies pour un bienêtre animal. Les tests comportementaux seront effectués entre 9:00 et 17:00, avec un seul test par jour pour limiter le stress. Un suivi quotidien des animaux ( week-end et jours fériés inclus) est effectué soit par les animaliers, soit par l'expérimentateur. Les animaux seront amenés en salle d'expérimentation 30 minutes minimum avant le début du test pour s'habituer à la pièce et diminuer le stress. Les expérimenteurs pourront venir éventuellement le weekend afin de travailler dans des conditions optimales. Les animaux ne seront pas soumis à plus de deux tests par semaines. Si besoin, suite à une évolution du score de la grille d'évaluation, et en accord avec le vétérinaire de l'institut, des mesures seront prises pour traiter l'animal. L'analyse comportementale sera faite par un système d'analyse vidéo automatique afin d'avoir un bon niveau de raffinement des résultats et de permettre d'utiliser un nombre minimal d'animaux. Une application stricte des points limites durant toute la vie de l'animal sera mise en place pour ce projet.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. La souris est un excellent modèle génétique afin d'étudier le comportement suite à la mutation des gènes connus chez l'Homme comme impliqués dans le syndrome BBSOAS. Ces mutations sont maintenant bien identifiées et les animaux sont en élévage chez les prestataires d'élévage. Le génotype sera effectué avant P7 (par prélèvement à l'oreille) avec un sevrage à P21. Les tests comportementaux seront effectués sur des animaux adultes permettant ainsi d'avoir une maturité corticale suffisante.

Une perte de poids de plus de 5 % ou une posture anormale pourrait signaler une souffrance chez les rats des sables, surveillés aussi pour toute inflammation, infection, rougeur ou opacité de l'œil dans les jours qui suivent chaque analyse. 496 rats des sables (Psammomys obesus), des rongeurs, vont être utilisés dès l'âge de quinze jours dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse de leur rétine. Chacun reçoit sous anesthésie une injection sous la rétine des deux yeux, l'un avec un ADN témoin, l'autre avec une forme mutée du gène abca4, puis sa vision est mesurée à partir de trois mois, sous anesthésie, par électrorétinogramme et tomographie d'une heure au plus chacun, à plusieurs reprises. Le but est de mettre au point une méthode d'induction de la maladie de Stargardt chez ce rongeur diurne, dont la rétine compte selon le porteur 40 % de cônes contre 1 % chez la souris, et les résultats "pourraient donner des pistes" thérapeutiques.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil. Elle fait notamment partie de la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Le gène impliqué dans cette maladie héréditaire est le gène abca4. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène abca4 (alias « knockout »). Néanmoins, ces souris knockout ne présentent pas les déficits observés chez les patients atteints de la maladie de Stargardt. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa macula, contrairement à ce qui est obnservé chez la souris animal nocturne, est riche en cônes et ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène abca4 sera invalidé par l’injection dans l’œil de la forme mutée du gène abca4. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de mesurer finement la vision et la fonction de la rétine interne, ainsi que d’obtenir des images de l’œil en coupe. Des analyses cellulaires et moléculaires post-mortem viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle mènera à une meilleure compréhension du rôle du gène abca4 et de sa protéine dans la régulation de la prolifération des cônes au cours du développement de la rétine. Par conséquent, il permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt associée aux mutations du gène abca4.

Bénéfices attendus

La suppression du gène abca4 dans l’oeil de Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les effets, spécifiquement in vivo, de l’altération de abca4 dans les processus du développement de la rétine, et surtout de déterminer l’importance du gène abca4 dans la survie des photorécepteurs. Les résultats pourraient donner des pistes pour de nouvelles stratégies thérapeutiques de la maladie de Stargardt où les cônes dégénèrent.

Procédures

496 nouveau nés de Psammomys obesus sont inclus dans une procédure comprenant une injection sous-rétinienne, et une analyse fonctionnelle de la vision à l'aide de deux méthodes, nommément électrorétinogramme (ERG) et tomographie à cohérence oculaire (OCT). L'injection sous-rétinienne s’effectue sous anesthésie gazeuse suivie d’une anesthésie locale et de l’application d’un gel limitant le dessèchement de l’oeil (ocrygel), environ 10minutes pour chaque animal. L'étude fonctionnelle de la vision par ERG et OCT sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière. Ces deux méthodes d'une durée de 60 minutes maximum chacune sont réalisées sous anesthésie. Les yeux sont traités avec une application de gel hydratant avant et après la réalisation des mesures. Seulement un des yeux injectés développera la maladie étudiée.

Impact sur les animaux

Les animaux sont systématiquement surveillés dans les jours suivant les analyses pour détecter toute anomalie oculaire (inflammation, infection, rougeur, opacité...). L’injection sous-rétinienne chez les nouveau nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté lors de son développement ou d’une douleur transitoire. L’ERG et l’OCT sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’œil n’est pas à exclure. Une perte de poids (sup à 5%)- ou une anomalie posturale pourrait indiquer un mal-être et une souffrance chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.

Remplacement

A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégrité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (en ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique permettant d'introduire la forme mutée du gène abca4 dans les cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) a été validé par analyse de l'ADN et sera également validée sur des cellules de peau en culture.

Réduction

Chaque animal est son propre contrôle. A savoir un oeil est injecté avec un ADN contrôle et l’autre avec la forme mutée du gène abca4 .Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection d'ADN (maximum 10%), ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’oeil contrôle et l’œil qui n'exprime plus la protéine ABCA4 d’un même animal. Il s'agit également d'une étude ou le même animal est suivi à plusiuers temps après injection ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux âgés de 15 jours sont hébergés avec leur mère et leur fratrie, afin de respecter les interactions sociales; et dans un environnement enrichi (matériel de nidification et bâton à ronger), afin de stimuler leur activité motrice. Après le sevrage, les animaux sont hébergés en groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe, afin de respecter les interactions sociales et dans un environnement enrichi (bâton à ronger, tunnel), afin de stimuler leur activité motrice. Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux âgés de 15 jours sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale , à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’oeil. Après l’intervention, le dessèchement de l’oeil est limité par l’application d’un gel hydratant (ocrygel). Lors des analyses non invasives de la fonction visuelle, les animaux alors âgés d’au moins 3 mois sont placés sous anesthésie générale et analgésie. De plus, le dessèchement de l’oeil est limité par l’application d’un gel hydratant. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour de l’intervention, puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 1%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux au stade postnatal P15 (15 jours après la mise bas), car c’est à ce stade que la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans) et que la protéine Abca4 est déjà bien exprimée dans les photorécepteurs.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie sous anesthésie pour injecter un produit dégradant un réseau de molécules cérébrales, un isolement individuel pendant toute l'étude, une contention en tube pour mesurer la composition corporelle et un test de glycémie, avant le prélèvement de leur cerveau. Le projet vise à comprendre le rôle de ce réseau dans l'obésité et le diabète, dans une perspective thérapeutique que le porteur renvoie au "plus long terme". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal pour ces interactions complexes.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 sont des problèmes majeurs de santé publique. Le poids corporel d’un individu est fortement influencé par l’activité de différents neurones, qui agissent sur la prise alimentaire, le stockage de graisse, la dépense d’énergie et participent à la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang). Certains de ces neurones sont entourés d’un réseau de molécules qui forment comme un filet autour d’eux. Ce filet est appelé filet périneuronal (FPN), et participe à la fonction et la maturation des neurones qu’il enveloppe. Dans le contexte de l’obésité, le rôle de ce FPN est encore mal connu. Notre objectif dans cette étude est de dégrader le FPN dans une région cérébrale impliquée dans le contrôle du poids, de la prise alimentaire et de la régulation de la glycémie, afin d’en étudier les conséquences, en particulier en situation d’alimentation hypercalorique. Nous souhaitons notamment connaître le rôle joué par le FPN dans la susceptibilité à développer une obésité et à dérégler le contrôle glycémique. Pour ce faire, nous utiliserons au total 80 souris mâles et femelles, chez lesquelles nous injecterons un produit qui dégrade le FPN par neuro-chirurgie. Certaines de ces souris seront nourries avec une alimentation hypercalorique pour rongeur et comparées à celles qui resteront sous une alimentation standard. Nous mesurerons l’évolution du poids, de la prise alimentaire, de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre), ainsi que le contrôle glycémique. À la fin de l’étude, nous récupèrerons les cerveaux de ces souris pour des analyses in vitro complémentaires.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle du filet périneuronal dans le développement de l'obésité et du diabète de type II, en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements moléculaires associés au niveau cérébral. De plus, le FPN est présent aussi bien chez la souris que chez l’Homme, ce qui renforce la portée translationnelle de ces résultats. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de restauration du FPN, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. Tous les animaux de cette étude (80) sont concernés par l’ensemble des gestes suivants : 1) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 2 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées de 3 semaines. 2) Neuro-chirurgie : cette technique est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 1 heure. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée durant toute l’étude. 3) Test de régulation de la glycémie : ce test nécessite de réaliser sur les souris une injection après un jeûne de 5 heures, puis de mesurer leur glycémie à 7 temps différents temps post-injection, par pélèvement d'une goutte de sang. Ce test est réalisé sur souris vigiles, avec un intervalle de temps d’au moins 15 minutes entre chaque mesure. Un seul test sera réalisé durant toute l’étude. 4) Hébergement : les souris de cette étude seront hébergées de manière individuelle, pour nous permettre de mesurer la prise alimentaire de chaque animal. L’isolement débutera dès l’arrivée des souris et jusqu’à la fin du projet.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte. Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal. Afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Pour réduire au maximum le stress ressenti par les animaux, nous avons prévu une période d’habituation d’une semaine à l’expérimentateur. De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement ou de façon hebdomadaire, nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale. Au-delà de du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. Notre protocole d’analgésie le jour de la chirurgie et les jours suivants permet cependant une prise en charge efficace des douleurs post-opératoires liées à l’incision de la peau du crâne. Les animaux seront suivis quotidiennement la semaine suivant la chirurgie et toute aggravation de leur état fera l’objet d’une évaluation, avec des points limites précoces qui déclencheront une prise en charge analgésique supplémentaire et des points limites terminaux qui entraîneront la mise à mort immédiate de l’animal pour éviter toute souffrance inutile.

Devenir

À l’issue de l’unique procédure de cette étude, tous les animaux (80) seront mis à mort par une injection d’euthanasiant. Nous récupérerons par la suite leur cerveau, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les changements neuro-moléculaires associés à la dégradation du filet périneuronal.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre l’effet de la dégradation du filet périneuronal sur un ensemble de phénomènes, tels que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre tous ces acteurs. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différentes expériences sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique, qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une neuro-chirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 3 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de mofication de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le contrôle de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, le filet périneuronal est présent à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront à l’âge de 7 semaines dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.

3 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau sous anesthésie, puis l'administration de composés pendant 56 jours maximum, une à deux fois par jour, avec des prélèvements sanguins répétés et une ponction intracardiaque terminale. Le projet vise à confirmer l'activité antitumorale d'inhibiteurs de kinases avant un éventuel passage en clinique, les bénéfices pour les patients étant renvoyés au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable" pour obtenir des résultats transposables à l'humain.

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine, notamment les cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à assembler des petites molécules, ou molécules fragments, dirigées contre une cible thérapeutique choisie dans le cadre d’une pathologie particulière. Chacun des fragments va contribuer à la spécificité de la molécule complète pour sa cible biologique. Ce projet se situe dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de protéines recombinantes, de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Pour chaque composé test les études sur les modèles de cellules en culture, la pharmacocinétique et l’évaluation de la dose maximale tolérée in vivo auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations d’ordre pharmacologique in vivo. Les composés testés dans ce projet auront été préalablement sélectionnés pour leurs propriétés anti-tumorales vis-à-vis de certains types de tumeurs dans des tests cellulaires adaptés et pertinents. L’objectif du projet est donc de confirmer l’efficacité anti-tumorale attendue in vivo sur des modèles murins porteurs de tumeurs pertinents.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer l’activité anti-tumorale de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées sur des modèles vivo bien caractérisés et pertinents. Ces données, en association avec celles obtenues in vitro et in vivo au préalable permettront de poursuivre (ou stopper) le développement du médicament vers les phases d’essais cliniques. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dus au traitement, pour améliorer la prise en charge des patients dans le traitement de différents cancers.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale, puis une incision sur le dos sera réalisée suivie d’une injection de cellules dans le tissus sous cutané. L’évolution pondérale des animaux et le suivi de la croissance tumorale seront faits au minimum 1 fois par semaine en même temps, et jusqu’à 3 fois par semaine pour les tumeurs à croissance rapide. Les animaux se verront administrer des composés pendant 56 jours maximum, 1 à 2 fois par jour maximum. Les administrations seront faites par injection du produit par voie orale ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou sous-cutanée. Des prélèvements de faibles volumes de sang (microsampling) seront réalisés au niveau de la veine caudale ou de la veine mandibulaire dans le respect des volumes maximaux réglementaires. A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale et une ponction intracardiaque sera réalisée.

Impact sur les animaux

L’implantation de cellules tumorales aux animaux peut générer une perte de poids transitoire. De même l'effet indésirable attendu suite à l'administration des molécules et suite aux prélèvements sanguins répétés est une perte de poids. L’implantation sous cutanée de cellules tumorales peut entrainer un inconfort transitoire au niveau du site d’incision cutané et du site d’injection. Enfin, l'injection d'un composé test ou d'un anesthésique ou la piqure d'une aiguille pour un prélèvement peuvent générer un inconfort transitoire au niveau du site d'injection/piqure.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Ces tests permettent de ne retenir que les meilleures molécules candidates et d'avoir une première estimation de leur efficacité in vitro sur un panel de lignées cellulaires tumorales humaines, mais ils ne permettent pas de prédire leur efficacité face à la complexité des mécanismes mis en jeu dans un organisme vivant. Les modèles précliniques se doivent de mimer la réponse thérapeutique chez l’homme, et idéalement les mécanismes prédictifs de résistance. Il convient donc d’utiliser des modèles qui reproduiront la physiopathologie des cancers chez l’homme le plus fidèlement possible. Les souris constituent des organismes-modèles présentant de multiples avantages, notamment liés à leur physiologie proche de l’homme. Le recours à l’utilisation de ce type de modèle animal est donc indispensable afin d’obtenir des résultats transposables chez l’homme.

Réduction

Des études préliminaires in vitro et in vivo ont été réalisées afin de déterminer les propriétés toxicologiques et pharmacologiques des composés testés dans ce projet, ceci permettant de ne tester que les meilleures molécules candidates et d’affiner la dose et la fréquence d’injection aux animaux. Dans le cadre de la thérapie ciblée, les modèles de lignées cellulaires utilisés dans ce projet sont préalablement caractérisés au niveau moléculaire (présence de la cible) afin de s’assurer qu’ils soient pertinents et donc susceptibles de répondre aux thérapies envisagées. En effet la maitrise des modèles permet de cibler uniquement les plus pertinents, de gérer la variabilité attendue, notamment le taux de prise de greffe, et donc de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux greffés pour réaliser une étude d’efficacité pertinente. Le nombre d'animaux par groupe a été determiné de manière statistique afin d'obtenir des résultats analysables avec un test statistique. La réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet passe également par l'optimisation de l'utilisation des groupes contrôles : dans la mesure du possible des études pourront être définies pour tester plusieurs molécules en parallèles afin de limiter l’utilisation d’animaux dans les groupes contrôles.

Raffinement

Afin d’éviter un stress des animaux lors du projet et donc d'augmenter la fiabilité des résultats, les animaux seront manipulés et habitués aux conditions expérimentales au cours de la période d’acclimatation. Au cours de la phase expérimentale les animaux seront observés quotidiennement. Leur évolution pondérale et le suivi de la croissance tumorale seront faits au minimum 1 fois par semaine, et jusqu’à 3 fois par semaine pour les tumeurs à croissance rapide. Des limites ont été définies dans le projet pour renforcer le suivi des animaux lorsqu’ils se rapprochent d’un point limite nécessitant une euthanasie, notamment au niveau des pertes de poids. Si un animal devait atteindre l’un de ces points limites il sera euthanasié. Lors de la greffe de tumeurs les animaux recevront un anesthésique et un tranquillisant afin d'éviter un stress ou une douleur. Il en sera de même pour les prélèvements de sang terminaux en fin de phase expérimentale. Pour des prélèvements de sang de faible volume au cours de la phase expérimentale, la technique de microsampling (rapide et entrainant une douleur légère liée à la piqure) sera privilégiée car elle offre la possibilité de réaliser des prélèvements répétés sur le même animal en s’affranchissant des biais interindividuels et en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques, notamment en oncologie qui constitue le sujet de ce projet. Les modèles implantables ou de greffe dans lesquels des cellules humaines (xénogreffes) ou murines (allogreffes), préalablement cultivées in vitro, sont greffés sur des souris immunodéficientes ou immunocompétentes, sont des modèles animaux indispensables et systématiquement utilisés pour la découverte, la caractérisation et le développement de candidats médicaments en oncologie. Il est donc nécessaire d'y avoir recours pour tester l'activité anti-tumorale in vivo des molécules testées dans ce projet. Nous cherchons à nous rapprocher de la physiopathologie cible du composé développé afin de pouvoir transposer nos résultats à l’homme, les animaux doivent donc être adultes au début de la phase de traitement. De plus, nous devons prendre en compte la période de latence nécessaire avant traitement pour avoir des tumeurs bien implantées, et le fait que le taux de prise de greffe diminue avec l’âge chez certaines souris immunodéficientes. Les animaux seront donc implantés au stade de jeunes adultes, soit un âge de 6 à 9 semaines environ.