Procédures modérées

40 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras pendant environ 90 jours, elles reçoivent des antibiotiques puis l'application quotidienne d'une bactérie sur la langue, avec des tests de préférence alimentaire et un prélèvement de sang intracardiaque terminal. L'objectif est d'étudier le rôle du microbiote buccal sur le goût du gras et l'obésité, en vue d'applications en alimentation vétérinaire et humaine. Le porteur affirme que les relations entre organes nécessitent l'utilisation d'animaux, malgré des tests in vitro déjà menés sur des cellules gustatives.

Objectifs

Contrairement aux nombreuses études concernant le microbiote intestinal, très peu d'études ont exploré le microbiote oral et sa relation avec la prise de poids. Les seules études disponibles démontrent chez l’homme comme chez la souris que les bactéries du microbiote buccal peuvent induire l’obésité. Nous avons observé, par Séquençage métagénomique du gène codant pour l’ARN 16S bactérien qu’il existe une dysbiose (augmentation du rapport Firmicutes/Bacteroidetes) ainsi qu’une diminution de la diversité du microbiome oral chez les souris rendues obèses avec un régime hypercalorique contenant 32% huile de palme) en comparaison aux souris sous régime standard. L’analyse du phylum et du genre a démontré qu’une espèce bactérienne (bactérie A) appartenant au genre Streptococcus est plus abondante dans le microbiome oral des souris obèses. Cette bactérie (commensale) abondamment présente dans la flore intestinale murine est non pathogène de classe 1 et ne présente aucun risque pour l’homme. Pour des raisons de confidentialité on ne divulguera pas son nom et on l’appellera bactérie A. L'obésité résulte d’une surconsommation d’aliments caloriques due à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. Chaque bourgeon du goût est constitué par un amas de cellules gustatives. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors, TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Les récepteurs CD36 et GPR120 (et aussi GPR40) sont impliqués dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Dans ce contexte, nous souhaitons mettre en évidence le rôle de la bactérie A au niveau oral sur le comportement alimentaire, la perception gustative lipidique et l’induction de l’obésité. Le but de cette étude est de : 1- Evaluer l’effet de l’application orale de la bactérie A sur le comportement alimentaire en évaluant la préférence lipidique par test double choix et test de licking chez des souris obèses et contrôles non obèses 2- Évaluer l’effet de l’application orale da la bactérie A sur l’évolution du poids corporel et la glycémie chez des souris obèses et contrôles non obèses

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence le rôle du microbiote oral, et particulièrement la bactérie A, sur le comportement alimentaire et l’induction de l’obésité. Si cette étude fonctionne, elle serait intéressante, à terme, dans un contexte d’alimentation vétérinaire mais aussi dans un contexte d’alimentation humaine.

Procédures

L’ensemble des souris subira : - Mise sous régime (obésogène ou standard) toute la durée de l’étude (environ 90 jours) - Pesée tous les 3 ou 4 jours, toute la durée de l’étude - 10 jours de traitements antibiotiques dans l’eau de boisson - Application orale de la bactérie A chez les souris vigiles. Application quotidienne sur la langue, pendant 3 semaines ; technique de non invasive chaque application dure moins de 30 secondes - Mesure de glycémie (3 mesures) au début de l’expérience (temps 0), puis avant le traitement aux antibiotiques et au point final avant la mise à mort lors du test de tolérance orale du glucose (OGTT). Prélèvement d’une goutte de sang sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Un seul test OGTT : Les souris seront soumises à un test de tolérance au glucose (OGTT) nécessitant un gavage au glucose (quelques secondes le temps de la contention) et 5 prélèvements sanguins de faible volume seront réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Quatre Tests de double choix et quatre tests de licking pour chaque souris. Ces tests nécessitent une individualisation cinq jours avant le début des tests ainsi qu’une mise à jeun hydrique 6h avant chaque test. La durée est de 12 h pour le test de double choix et 5 minutes pour le test de licking. - Un seul test OGTT : Les souris seront soumises à un test de tolérance au glucose (OGTT)nécessitant un gavage au glucose (quelques secondes le temps de la contention) et 5 prélèvements sanguins de faible volume seront réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Un prélèvement sanguin : À la fin de l’étude, un prélèvement sanguin de 0,5 ml en intra-cardiaque sera réalisé sur souris anesthésié avec l’isoflurane (3 %) - Prélèvement d’organes : Les organes seront prélevés, après mise à mort

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact sur les souris puisqu’on induit une obésité ce qui implique un certain inconfort et de potentielles complications liées à l’obésité. Aussi, on supprime le microbiote endogène de la souris par traitement antibiotique. Le traitement aux antibiotiques peut également induire des troubles digestifs et par conséquent impacter la prise alimentaire et induire des diarrhées. De même, les animaux peuvent subir un stress, dû aux manipulations répétées pour appliquer sur la langue la bactérie A, ou suite aux prélèvements sanguins (lors de mesure de la glycémie pendant l’expérimentation et lors du test d’OGTT) ou encore des suites d’individualisation (pour les tests double-choix et licking).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes..

Remplacement

Les études physiologiques et les relation inter-organes nécessitent l’utilisation d’animaux. De plus, nous avons déjà étudié, in vitro, sur une lignée de cellules gustatives murines les mécanismes moléculaires d’action de la Bactérie A immortalisée ainsi que de la paroi de la bactérie A. Les tests effectués in vitro n’ont montré aucun effet toxique.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires, in vitro, nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation la taille des groupes minimale est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans les conditions habituelles de l’animalerie et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo en cellulose et sizzle pad). Si les animaux observés quotidiennement et si un signe clinique fait apparaitre un mal-être ou une douleur chez les animaux, ils seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane (3%).

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles de 8 semaines seront mises sous régime obésogène pour maitriser l’induction de l’obésité.

3 680 animaux non-humains, 1 840 souris et 1 840 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés à tester puis subissent une chirurgie de clampage de l'artère rénale d'environ 45 minutes, avec un risque d'hémorragie et une atteinte de la fonction rénale. La mise à mort permet d'analyser les organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité du syndrome d'ischémie-reperfusion et conclut à la nécessité d'expériences in vivo.

Objectifs

La transplantation d’organe est un traitement de choix de certaines maladies chroniques arrivées à un stade ultime ; elle concerne surtout les organes vitaux abdominaux ou thoraciques et notamment les reins. Le syndrome d'ischémie reperfusion (IR) est un phénomène incontournable en transplantation rénale. L’ischémie correspond à la phase où l’organe du donneur est isolé de la circulation sanguine et subit un défaut d’apport en nutriments et en oxygène, c’est-à-dire depuis le prélèvement chez le donneur jusqu’à la reprise du flux sanguin dans l’organe chez le receveur. La reperfusion de l’organe chez le receveur se traduit par une reprise de la circulation sanguine en lien avec le retour de l’apport en nutriments et en oxygène. Cette reperfusion est brutale ce qui génère énormément d’inflammation au niveau du greffon. À court terme, les conséquences délétères du syndrome d'IR se traduisent principalement par une reprise différée de la fonction rénale mais à plus long terme, on peut observer l’apparition d’une fibrose rénale voir la mort du greffon. Chez l'homme, la prévention du syndrome d'IR fait l'objet de recherches cliniques à travers le conditionnement du donneur, les molécules additives aux solutions de conservation, les modalités de perfusion du greffon rénal ou encore les molécules administrées chez le receveur. Les progrès engendrés par les traitements immunosuppresseurs expliquent, qu’aujourd’hui, l’IR est une cible thérapeutique majeure. Les modèles précliniques, en particulier murins, ont permis de nombreuses avancées dans la compréhension physiopathologique du phénomène d'IR. L’IR provoque des nécroses tissulaires dans le rein qui activent le système immunitaire en libérant des protéines importantes qui participent au processus inflammatoire et engendrent les lésions. Ces protéines peuvent être utilisées comme cibles pour neutraliser la cascade inflammatoire et par conséquent améliorer la reprise de fonction immédiate du rein. Cette stratégie pourrait se révéler bénéfique, sur le long terme, sur la survie des greffons qui représente un enjeu majeur en transplantation. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés issus de notre recherche dans un modèle d’IR chez la souris ou le rat afin de prévenir et de traiter le syndrome d’IR chez l’homme. Ces composés ayant par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur des cellules rénales humaines de patients.

Bénéfices attendus

Les traitements existants sont des cocktails d’immunosuppresseurs avec le risque de nombreux effets secondaires. L’identification d’un ou plusieurs candidat (s) médicament (s) agissant plus spécifiquement au niveau du greffon augmentera l’efficacité du traitement et permettra de diminuer les effets secondaires.

Procédures

1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 6 jours sous un volume de 5 à 10ml/kg en fonction de la voie d’administration 2/ Injection sous-cutanée d’un analgésiant 2 fois le jour de la chirurgie 3/ Chirurgie sous anesthésie gazeuse pendant environ 45 minutes, une fois dans l’étude 4/ Anesthésie gazeuse pour prélèvement sanguin, urinaire et mise à mort, une fois dans l’étude

Impact sur les animaux

Pendant la chirurgie sous anesthésie générale, il y a un risque d’hémorragie lié aux gestes chirurgicaux lors du clampage en lésant l’artère rénale. À la suite de la chirurgie, les effets indésirables attendus sur les animaux sont : une atteinte partielle de la fonction rénale, une mobilité réduite, ainsi qu’une perte de poids n’excédant pas 10% dans les 24 à 48h post-chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement de la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans le syndrome ischémique. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments.

Réduction

Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à l’heure arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Après la chirurgie, un enrichissement plus doux (igloo en carton) sera utilisé afin d’éviter tout accroc avec la cicatrice. La litière sera également remplacée par une litière plus douce et plus absorbante en fibre de cellulose pour éviter tout irritation de la cicatrice. Afin de palier l'inconfort lié aux procédures et obligatoirement lors des gestes de chirurgie, un programme d'anesthésie sera effectué par inhalation d’isoflurane (induction 3 à 5%, maintien 1 à 3%). Pour prévenir de la douleur, de la buprénorphine à 0.1 mg/kg en sous cutanée sera administrée 30 minutes avant et 4 heures après la chirurgie suivi d’un apport dans l’eau de boisson à 0.01 mg/ml pendant 48 heures. Pendant la chirurgie les animaux seront placés sur un tapis chauffant, une sonde rectale sera placée afin de mesurer leur température corporelle, le tapis régulera alors sa température pour maintenir le corps à 37°C. Pendant la phase de réveil, les animaux seront placés sur un tapis chauffant (37°C). Afin de faciliter la prise de nourriture, quelques croquettes humidifiées seront placées directement dans la cage. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques à ce modèle ont été établi conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal. Lors de la mise a mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane (induction et maintien de 3-5%).

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Le modèle utilisé sera mis au point, sur la base de la littérature existante. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de lipopolysaccharides provoquant un choc septique, avec fièvre, confusion et apathie, avant un prélèvement de sang intracardiaque terminal. Le porteur indique qu'aucune couverture analgésique n'est mise en place, car elle modifierait le taux de cytokines mesuré. L'objectif est de mettre au point un modèle d'inflammation pour tester des candidats médicaments anti-inflammatoires.

Objectifs

Le but de ce projet est de mettre au point un modèle de choc septique au LPS (lipopolysaccharides) afin de mettre en évidence une activité anti-inflammatoire de molécules testés au moyen d’analyses de différentes cytokines (TNFalpha, IL-10).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettrait de mettre au point un modèle d’inflammation au LPS chez le rat avec pour but de déterminer le potentiel anti-inflammatoire d’une molécule spécifique par le biais de dosages de cytokines anti-inflammatoires.

Procédures

Les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p., aiguille 26G ou 25G; 10mL.kg, 5 secondes) de LPS. Puis ils seront anesthésiés (3 minutes) pour le prélèvement de sang (1 minute) puis euthanasiés. Dans les cas où nous testerons la référence anti-inflammatoire, les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p., aiguille 26G ou 25G; 10mL.kg, 5 secondes) en plus de l’injection de LPS.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p.; 10mL.kg, 5 secondes) de LPS. Lors du choc septique, les animaux seront fébriles (augmentation de la température corporelle), ils peuvent montrer des signes de confusions et d’apathie. Les animaux seront suivis (observation de 30 secondes) toutes les heures afin de surveiller leur état jusqu’au prélèvement. Puis ils seront anesthésiés (3 minutes) pour le prélèvement de sang (1 minute) puis euthanasiés. Dans les cas où nous testerons des références anti-inflammatoires, les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale (i.p.; 10mL.kg, 5 secondes) en plus de l’injection de LPS.

Devenir

Une grande quantité de sang doit être prélevée sur les animaux, il est donc indispensable qu’ils soient mis à mort après le prélèvement intracardiaque.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments anti-inflammatoires. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur l’inflammation, mais sans observation des potentiels effets secondaires. L’étude de potentiels traitements anti-inflammatoires doit donc être conduite dans un modèle restituant à la fois la composante comportementale et physiologique. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est basé sur les données publiées dans des articles réalisant le même modèle et les mêmes analyses. Cette estimation théorique sera confirmée lors des stades initiaux de développement du modèle (dès que l’approbation du projet permettra le début des expérimentations et la génération de données) par la réalisation d’une analyse statistique par la méthode des tirages aléatoires et d’un calcul de puissance via BiostaTGV. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat).

Raffinement

Dans le domaine de la pharmacologie préclinique, l’induction des modèles entraîne potentiellement l’apparition de symptômes douloureux et l’objectif des études réalisées ne permet pas la mise en place de dispositions spécifiques (e.g. couverture analgésique) aux risques d’impacter le niveau de cytokines. Le choix d’un modèle aigue (environ 4h) constitue un raffinement par rapport aux modèles chroniques qui augmentent la durée pendant laquelle les animaux sont exposés à des nuisances.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein d’ANS Biotech. Le rat a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) large caractérisation de ce modèle dans la littérature ; b) existence de cytokines identiques et mécanismes biologiques communs. Le jour de l’induction, les rats seront âgés de 6 semaines (Adolescent, jeune adulte) et pèseront entre 200 et 300 g. Ce stade est défini en suivant les caractéristiques décrites dans la littérature.

1 710 primates, 1 625 macaques à longue queue et 85 macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée pour analyse histopathologique et une soixantaine réutilisée dans d'autres projets. Ils reçoivent un candidat médicament par voie orale ou injectable, de façon quotidienne ou hebdomadaire, avec des prélèvements sanguins et urinaires répétés. L'objectif est l'évaluation réglementaire de la toxicité avant les essais chez l'humain. Le porteur affirme que cette évaluation ne peut pas se faire in vitro et décrit le primate comme "parfois l'unique espèce pertinente", "indispensable" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Le projet réalisé dans un cadre réglementaire a comme objectif de permettre l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament dans le cadre de son développement préclinique. Les lignes directrices ICH guideline M3(R2), ICH-S6, ICH-S9 et EMA/CPMP/ICH/286/1995 ; December 2009, rendent indispensable ce projet chez un non-rongeur pour chaque nouveau médicament avant tout essai clinique et mise sur le marché. Selon la guideline ICH Topic S6(R1), EMA/CHMP/ICH/731268/1998 - June 2011, l'espèce primate est parfois l’unique espèce pertinente pour le développement préclinique de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins anti-cancer). Ces études sont validées par la direction scientifique de notre laboratoire et celle du sponsor, basées sur des informations complémentaires aux études réglementaires requises pour une phase clinique ou la soumission d'un dossier.

Bénéfices attendus

Le projet, réalisé dans un cadre réglementaire, a comme objectif de permettre l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament pendant son développement pré-clinique. Conformément aux lignes directrices ICH guideline M3(R2), ICH-S6, ICH(S9 et EMA/CPMP/ICH/286/1995; December 2009, l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament chez un non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de pouvoir démarrer les essais cliniques chez l'homme, et avant toute autorisation de mise sur le marché. Selon la guideline ICH Topic S6(R1), Step 4 Note for Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Products (EMA/CHMP/ICH/731268/1998 - adopted June 2011), l'espèce primate peut même être la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques des composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins thérapeutiques anti-cancer...). Ces études permettent d’évaluer le schéma thérapeutique envisagé et de réduire le risque potentiel encouru par le volontaire sain à la suite de l’administration du candidat médicament au cours des premiers essais cliniques.

Procédures

Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire (ex : composés biologiques), avec un produit, pour évaluer le potentiel effet toxique de ce produit. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets pharmacologiques du produit administré (exemple : action au niveau du système nerveux central, à l’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et à des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.

Devenir

Les études de toxicologie incluent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. Seule la procédure 1 (études préliminaires) où les animaux participant à des études où une analyse anatomopathologique n'est pas nécessaire pour atteindre les objectifs, et ayant reçu un traitement n'entraînant pas d'effets secondaires ou des effets légers et réversibles, i.e. classe de sévérité réelle =1 (légère) ou 2 (modére) après analyse rétrospective, peut amener à garder les animaux en vie, et possiblement à être réutilisé dans un autre projet après une période de récupération et un aval du vétérinaire. Une estimation est faite en considérant que la moitié des animaux de la procédure 1 seront gardés en vie.

Remplacement

L'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet (ex : sonde de gavage). Des enrichissements variés (graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteur, …) sont fournis aux animaux leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex. recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement, …). L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. En cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire, un antibiotique. Les mesures sont prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation.

Choix des espèces

Le choix du primate est justifié par : - les homologies avec l'homme (anatomiques, physiologiques, métaboliques...) et souvent l'impossibilité d'utiliser d'autres espèces telles que le chien ou le porc en raison de l'absence d'homologies - la disponibilité d'études préliminaires dans cette espèce, - les données de pharmacocinétique, pharmacodynamie… Certains composés biologiques, ayant des effets sur le système immunitaire, en particulier les anticorps monoclonaux, protéines thérapeutiques et vaccins thérapeutiques (anti-cancer, anti-Alzheimer…) doivent être testés dans des espèces pertinentes. Le singe est généralement l’espèce non-rongeur de choix car son système immunitaire est le plus proche de celui de l’homme s'il n'existe pas de modèle rongeur humanisé (souris transgéniques). Animaux d’au-moins 24 mois en début d'étude. Age moyen généralement requis dans les études de toxicité. Des animaux un peu plus âgés (jusqu'à 35-40 mois) peuvent être utilisés dans les études standards. Pour certains composés, des animaux mâtures (d'un point de vue maturité sexuelle ou maturité du système immunitaire) doivent être utilisés (par exemple nouveau produit contraceptif, des anticancéreux, des immunomodulateurs). Dans ce cas les femelles ont en général au-moins 4 ans, et les mâles au minimum 4 à 5 ans. Pour certaines indications, il sera indispensable de tester le candidat chez un animal plus jeune que 24 mois (études de toxicité juvénile).

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sous la peau puis des injections intraveineuses de molécules-vecteurs, la mise à mort se faisant par dislocation cervicale pour collecter sang et organes. Le porteur cite comme effets possibles des chocs anaphylactiques et des détresses cardio-respiratoires. Il affirme qu'aucune alternative ne donne accès aux fonctions physiologiques des mammifères et conclut que le développement de ces vecteurs ne peut se faire qu'in vivo.

Objectifs

Le cancer est encore aujourd’hui une des causes majeures de mortalité dans le monde et pour lequel les besoins médicaux actuels restent très insatisfaits, avec certains cancers nécessitant de nouvelles approches thérapeutiques. Ainsi, les cancers du pancréas, les cancers des poumons et de la prostate (ainsi que leurs métastastases) sont des exemples d’enjeux de santé publique. Ces dernières années, les recherches privées et publiques ont augmenté leurs efforts, suscitant de grands espoirs pour les patients malades et leurs familles. Cette demande de projet s’inscrit dans cette dynamique, avec pour objectif d’améliorer les perspectives thérapeutiques. Ce projet innovant a pour objectif d’évaluer si des molécules conjugués à des vecteurs (V-molécule) ciblants les récepteurs aux lipoprotéines LDL (LDLR) ou à la Transferine (TfR) permettent d’observer un effet clinique (thérapeutique, de distribution, d'extinction de gènes...) sur des modèles de tumeurs humaines implantées sur le modèle de souris. L’objectif principal de ce projet sera donc de développer, tester et optimiser nos molécules-vecteurs (V-molécule) pour améliorer la délivrance d’agents thérapeutiques au niveau des tumeurs. Par ces approches systémiques nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments. Les statines sont le traitement de référence pour soigner l’excès de cholestérol, ou plus exactement le LDL-cholestérol (lipoprotéine de faible densité), il s’agit d’un des médicaments les plus couramment utilisés dans le monde. Cette inhibition stimule secondairement l’expression des récepteurs aux LDL, permettant leur entrée dans la cellule cible. Il est fort probable que certains patients traités pour des cancers prennent des traitements à base de statine. Il est donc très important d’étudier l’effet de la prise de statine dans nos modèles tumoraux afin de voir leur effet sur l’expression du récepteur au LDL dans les tumeurs et autres tissus.

Bénéfices attendus

En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos V-molécules et les faibles quantités administrées, ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules Vecteurs (V-molécules) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les implantations des cellules tumorales se font en sous-cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié (anesthésie gazeuse isoflurane). Cet acte chirurgical sera effectué une seule fois par souris et cela prend environ 1 minute. Les injections des "V-molécules" : les souris recevront une injection IV (veine caudale) de V-molécule et de molécule controle. Les animaux sont endormis pour injecter les molécules en solution isotonique stérile. Il y a l'injection d'une molécule par animal et cela prend environ 2 min.

Impact sur les animaux

Dans ce projet nous proposons d’étudier la biodistribution de nos V-molécules sur des temps d’incubation relativement courts. Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous cutanées, les injections en IV des composés V-molécules, ainsi que le développement de la tumeur chez l’animal en tant que pathologie. Les composés pharmacologiques peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des modifications et des troubles comportementaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de collecter le sang et les organes qui seront utilisés pour faire des analyses complémentaires.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos V-molécules ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des conjugués développés. L'utilisation de rongeurs impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations et cahier des charges.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur des groupes de n=15 (V-molecule et molecule controle), à raison de 120 souris par an, réparties sur 4 études de 30 individus, sera suffisant pour appréhender un effet de nos molécules sur la croissance tumorale. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Ce nombre d'animaux pour ces procédure nécessaire à l'obtention d'une significativité statistique (réduction, règle des 3Rs) a été défini en déterminant: -le test statistique : T-test (2 groupes), -l'effet biologique et la dispersion escomptées, cette estimation a été faite d'après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société, -le risque alpha.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien et vétérinaire pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont déplacées dans une pièce cyclée, insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale + chirurgie) réalisera les implantations sous-cutanées de cellules tumorales. Une observation quotidienne des animaux (poids, douleurs, souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs et des antalgiques sont prévus en cas de nécessité. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie (anesthésie gazeuse isoflurane) ou au cours du developpement tumoral constituera le point limite de l'expérience. Un enrichissement materiel (twists, cocon ou nid) de l'environnement des animaux est mis en place dans toutes les cages afin qu'ils expriment un répertoire diversifié de comportements normaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs d'un seul fournisseur extérieur.

Choix des espèces

- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique (NU(NCr)-Foxn1nu ) comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides en sous-cutanée (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection de la V-molécule) en fonction de la taille des tumeurs.

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un abcès sous-cutané leur est provoqué puis suivi par imagerie TEP au FDG, avec un risque de nécrose des tissus voisins ou de septicémie surveillé par des points limites. L'objectif est de décrire l'évolution d'une infection et le rôle des cellules immunitaires. Le porteur affirme que l'évaluation d'une lésion infectieuse par imagerie ne peut se faire que sur un modèle animal reproduisant le mécanisme physiologique global.

Objectifs

Evaluer l'intérêt du [18]F-FDG (faux sucre radioactif utilisé en routine clinique chez les patients) dans le diagnostic, et l’analyse du processus de formation et de développement de l'infection et de l'inflammation dans un modèle expérimental d’abcès sous-cutané chez le rat.

Bénéfices attendus

Faire un schéma de l’évolution de l’inflammation aigue, subaiguë à chronique afin de déterminer l’intervention des cellules immunitaires dans l’évolution de l’abcès.

Procédures

Induction d'abcès sous-cutané (20 rats, 30 min maximum), mesure de la glycémie des animaux (20 rats, 15 à 30 sec, avant d'injecter le produit radioactif, examen d'imagerie (20 rats, 30min,1h après injection du produit radioactif).

Impact sur les animaux

Risque d’évolution de l’abcès vers une nécrose profonde des tissus adjacents, ou risque de souffrance liée à une septicémie. Ces 2 risques seront particulièrement surveillés tout au long de l’étude pour chaque rat, et des points limite précoces seront définis

Devenir

les animaux seront mis à mort pour faire des analyses en autohistoradiographie et immunohistologie

Remplacement

l'évaluation objective d’une lésion infectieuse avec un examen d’imagerie ne peut être réalisée que sur un modèle animal permettant par la suite d’analyser le mécanisme physiologique global, à l’image des examens chez l’Homme ce qui permettra de mieux coller à la réalité lors d’administration de traitements thérapeutique.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux a été réalisé en amont en prenant en compte un paramètre essentiel de réponse à l’induction de l’abcès. En effet, l’abcès fistule très précocement à J3 (5%), à J4 (20%), ou tardivement à J10 (5%), et ce malgré une reproductibilité du geste expérimental par le même opérateur.

Raffinement

Les animaux seront transportés dans des cages de transport dédiées, avec une litière enrichie avec du papier absorbant autoclavé et avec des bouillotes chauffantes pour éviter l’hypothermie si besoin. Les abcès, les examens de tomographie par émission de Positrons (TEP) et les mises à mort seront induits sous anesthésie générale pour éviter un stress inutile à l’animal. Pour éviter toute souffrance de l'animal la taille maximale des abcès ne dépassera pas 800 mm^3 à J2, bien inférieure aux tailles limites de tumeurs chez le rat qui sont de 1000 mm^3. Après induction de l’abcès, les animaux seront examinés de façon très soutenue durant les 48h en surveillant leur état général, en mesurant (i) leur poids, (ii) leur température, (iii) l’état du gonflement de l’abcès, les animaux recevront également un antalgique (buprénorphine), tous les 6, 8h ou 12h (si nécessaire) durant 48h. De plus, cette surveillance se poursuivra quotidiennement durant toute la période du l’étude pour chaque animal.

Choix des espèces

Les modèles animaux les plus utilisés dans le cadre de pathologies inflammatoires sont des modèles murins (souris et rats). Pour nos expérimentations, nous utilisons comme modèle le rat « WISTAR ». Cette souche est très largement décrite dans la littérature et son utilisation reste la plus appropriée à ce type de recherche (modèle de référence). En outre, cette souche de rat a été largement utilisée au sein de notre plateforme et permet de confronter nos résultats à des analyses antérieures effectuées sur rats sains. Les rats seront âgés de 9 semaines lors de l’initiation du protocole. Ce stade correspond à un état adulte pour lequel le système immunitaire est bien établi. En outre, le poids intermédiaire des animaux permettra d’imager des organes intéressants comme la rate ou le rachis qui interviennent dans la réponse immunitaire.

20 rats, 10 mâles et 10 femelles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit sous anesthésie un prélèvement de peau sur toute l'épaisseur du dos puis une greffe de substitut cutané, avec des changements de pansement deux fois par semaine et un hébergement en cage individuelle. L'objectif est de transposer chez le rat un modèle déjà mené chez la souris, pour préparer des études destinées à des substituts cutanés pour grands brûlés et ulcères diabétiques. Le porteur affirme que le remplacement par des modèles in vitro ou ex vivo n'est pas envisageable pour caractériser la greffe sur un temps prolongé.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de transposer un modèle de greffe classiquement utilisé chez la souris chez le rat et d’évaluer la fonctionnalité d’un substitut cutané précédemment évalué chez la souris , afin d’envisager d’utiliser par la suite ce modèle de rat greffé pour la réalisation d’études de biodistribution et de tumorigénicité. Ces études sont requises selon les exigences techniques relatives aux produits pharmaceutiques à usage humain et les lignes directrices de l’Agence Européenne du Médicament pour les médicaments à base de cellules souches. Le substitut cutané sera greffé après induction d’une plaie cutanée chez le rat. Cela nous permettra de comparer les résultats obtenus chez des rats mâles et femelles et également de comparer ces résultats avec ceux obtenus lors des études effectuées chez la souris avec un substitut cutané identique. Des analyses identiques à celles effectuées au cours des études menées chez la souris permettront de caractériser la fonctionnalité du substitut cutané évalué et de valider ou non le modèle de greffe chez le rat . Cette étude de faisabilité permettra également la réalisation du prélèvement d’organes et de leur analyse en vue de la préparation des études de biodistribution qui devront être menées à la suite. L’ensemble des résultats obtenus lors de cette étude chez le rat et de ceux obtenus lors des études menées chez la souris permettront de sécuriser la production des unités thérapeutiques de substituts cutanés qui seront utilisées chez les patients souffrant de brûlures sur une grande partie du corps ou de plaies chroniques ne cicatrisant pas ou très difficilement comme les ulcères du pied chez les personnes diabétiques.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée et subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. Les substituts cutanés sont envisagés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique, ulcères veineux… Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies. Les données générées par cette étude chez le rat et celles obtenues par ailleurs chez la souris permettront de sécuriser la production des unités thérapeutiques qui seront utilisées chez les patients.

Procédures

Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour la réalisation de la greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau sur toute l’épaisseur de celle-ci sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates. Un traitement analgésique des rats greffés sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes cutanées seront protégées par la mise en place d’un pansement au-dessus du substitut cutané, d’un morceau de compresse stérile par-dessus, d’un pansement de couverture pour protéger la greffe et enfin de 2 bandes de sparadrap pour maintenir le tout en place. Les greffes cutanées seront observées régulièrement tout au long de l’expérimentation lors de chaque change de pansement effectué, 2 fois par sermaine. Un suivi quotidien des rats greffés sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats greffés en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les pansements et surtout le greffon cutané.

Impact sur les animaux

L'induction d'une plaie cutanée avant la réalisation de la greffe cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture analgésique pré- et post-opératoire. Les changes de pansements, effectués 2 fois par semaine, n’induiront pas de nuisance pour les rats, ceux-ci étant placés sous anesthésie gazeuse au préalable. L’hébergement en cage individuelle des rats greffés, nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les pansements et surtout le greffon cutané, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères.

Devenir

Procédure expérimentale 1 = Induction d’une plaie cutanée, greffe de substitut cutané et suivi de la greffe cutanée et des animaux : les 20 rats greffés, 10 mâles et 10 femelles, seront mis à mort à 2 temps différents après réalisation de la greffe cutanée, 2 semaines et 1 mois après, avec 5 rats par temps de prélèvement pour chacun des 2 sexes, pour réaliser un ensemble d’analyses.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes effectuées chez la souris et selon les recommandations des autorités de régulation sur les médicaments à base de cellules souches. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, lors de chaque change de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés , ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des briques de bois seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies chroniques à traiter chez l’Homme. Son utilisation est décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des rats âgés de 7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de rats décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

Anesthésiées, des souris reçoivent une seule fois des adénovirus, par inhalation par le nez ou par injection dans la trachée après intubation, puis sont tuées une à huit semaines plus tard pour le prélèvement de leurs organes. 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort à la fin de l'expérience ou plus tôt si elles atteignent un point limite. L'équipe veut comparer, dans le poumon, la reprogrammation de cellules spécialisées en cellules souches et l'apparition de cellules cancéreuses, un travail mené jusqu'ici sur des cultures de cellules de peau de souris. Comme effets néfastes, le résumé ne décrit qu'une inflammation possible de la trachée et une gêne liée au liquide injecté, sans dire si ces virus font apparaître des tumeurs, ce que les souris endurent pendant les semaines suivantes, ni quels points limites conduisent à leur mise à mort.

Objectifs

Lors du développement de l’embryon, à partir de quelques cellules dites cellules souches, des milliards de cellules vont être produites et acquérir une spécialisation (cellules de poumon, de peau, etc.) lors d’un processus appelé différenciation. Ces dernières années, des travaux montrant qu’il est possible de reprogrammer une cellule différenciée en une cellule souche, ont apporté la preuve que la différenciation est un processus réversible. Le mécanisme de reprogrammation partage des similarités avec ceux qui aboutissent à l’apparition de cellules cancéreuses (tumorigenèse). Des études réalisées à partir de cultures de cellules de peau de souris nous ont déjà permis d’identifier certaines de ces similarités. Afin de nous rapprocher de ce qui se passe chez l’Homme, nous souhaitons maintenant étendre notre étude comparative de la reprogrammation et de la tumorigenèse au poumon, chez la souris.

Bénéfices attendus

On sait aujourd’hui que le développement tumoral n’est pas seulement lié à une prolifération anarchique des cellules. Les changements d’identité cellulaire (modification de la nature et de la fonction d’une cellule) constituent un domaine émergeant et on sait maintenant qu’ils sont à l’initiation de certains cancers. L’étude de ces mécanismes est donc cruciale pour faire émerger de nouvelles thérapies mais également pour approfondir nos connaissances sur la biologie du cancer. Grâce à des modèles cellulaires en culture, nous avons identifié des mécanismes et des acteurs importants pour l’identité cellulaire. Nous souhaitons cette fois approfondir notre analyse dans un modèle murin et plus proche de la pathologie humaine en étudiant ces mécanismes dans le poumon.

Procédures

Les animaux seront tout d’abord soumis à une anesthésie puis inhalation intra-nasale de virus ou à une anesthésie / analgésie profonde puis injection intra-trachéale de virus par intubation. Dans le premier cas, la procédure totale dure environ 5 minutes (2 minutes d’endormissement, 3 minutes injection + réveil) et dans le second 20 minutes. Dans les deux cas, cette procédure n’est réalisée qu’une seule fois. Une à 8 semaines après inhalation / injection, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à l’injection intra-nasale en elle-même sont très légers puisque l’anesthésie est très courte et la méthode d’injection n’est pas invasive. Les effets indésirables liés à l’injection intra-trachéale sont ceux pouvant résulter d’un acte opératoire classique sans chirurgie (il s’agit d’une intubation). Dans ce cas, une inflammation est possible due au passage du cathéter dans la trachée et une gêne est également envisageable due à l'injection d'un faible volume de liquide qui va descendre volontairement dans les poumons.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas être réutilisés pour un autre projet, ils seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, ou en cas d’atteinte d’un point limite conduisant à l’interruption de la procédure d’élevage.

Remplacement

Jusqu’à présent, le projet a complètement été mené grâce à des expériences in vitro, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Dans un but de mener des études plus approfondies et pour se rapprocher de la biologie du cancer il nous est indispensable de passer à des modèles in vivo de manière complémentaire aux modèles in vitro que nous avons déjà.

Réduction

Les effectifs définis dans ce protocole ont été déterminés grâce au comportement connu de ces modèles expérimentaux et tiennent compte des exigences statistiques nécessaires à l’exploitation des résultats. Afin de limiter le nombre nécessaire de souris, nous avons réduit au maximum le nombre de souris utilisées (20/groupes) dans nos procédures sans en compromettre l’interprétation et la puissance statistique des analyses. D’autre part, le projet sera réalisé pas à pas ce qui permettra de ne pas inclure tous les animaux prévus s'il n'y a pas besoin.

Raffinement

Les procédures seront réalisées sous anesthésie / analgésie. Les animaux seront suivis 2 fois par jour sur les 48h suivant l’administration des adénovirus afin d’identifier toute complication liée au mode d’inoculation (gonflement de la trachée/région du cou). Les animaux seront par la suite observés 3 fois par semaine afin d’identifier tout signe potentiel de mal-être ou de souffrance. Nous avons défini une série de points limites conduisant à l’arrêt de nos protocoles et à la mise à mort immédiate des souris concernées.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études de cancérogénèse du fait de l’existence de nombreux modèles génétiquement modifiés bien caractérisés qui permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale observée chez les patients. Les souris jeune adultes seront infectées entre l’âge de 6 et 8 semaines afin de standardiser nos groupes d’études.