Procédures modérées

500 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort prévue, réintégrés ensuite à la colonie de l'établissement. On leur injecte un allergène qui déclenche des démangeaisons, grattage, léchage et mordillements, puis on teste des molécules par diverses voies, avec des prises de sang à la jugulaire et des biopsies de peau. Ce modèle sert à sélectionner de futurs médicaments vétérinaires contre la dermatose atopique féline, en vue d'une mise sur le marché. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne peut reproduire cette maladie hors de l'animal.

Objectifs

​​L’objectif du projet est de mettre en place un modèle de prurit chez le chat et d’utiliser ce modèle pour la sélection de futures molécules thérapeutique pouvant entrer dans la composition de nouveaux médicaments destinés à une mise sur le marché pour traiter la dermatose atopique féline (DAF). La maîtrise de ce modèle permettra d’évaluer primairement l’efficacité, secondairement la tolérance, le profil pharmacocinétique de molécules et également de suivre l’évolution de certains bio-marqueurs de l’inflammation (interleukines, PBMCs (peripheral blood mononuclear cell)…) dans notre modèle avec et sans traitement.

Bénéfices attendus

La DAF est la deuxième allergie la plus fréquente chez le chat après l’allergie aux puces : elle touche environ 12.5% de la population féline. C’est une dermatose inflammatoire et prurigineuse avec une influence saisonnière en fonction des allergènes incriminés. Le symptôme principal est un prurit (y compris un toilettage excessif) et certains chats présentent en symptômes secondaires une alopécie (perte de poils), des otites externes… Sa gravité réside principalement dans son impact sur la qualité de vie du propriétaire et de son chat, ceci pouvant être une cause de demande d’euthanasie.

Procédures

Traitements : Lors de cette procédure expérimentale, l’administration du produit sera réalisée par voie intraveineuse (IV), intramusculaire (IM), sous-cutanée (SC), orale, transcutanée, ou autre. Le volume maximal administré sera en accord avec les bonnes pratiques vétérinaires. Prélèvements de sang : généralement à la veine jugulaire sur animal vigile. Les volumes totaux de sang prélevés suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal, et ne dépasse jamais 20% du volume de sang circulant par kg de poids vif. Un temps de repos suffisant est déterminé entre chaque phase de prélèvement si l’étude en compte plusieurs et entre chaque étude. Ainsi, pour un volume maximum prélevé correspondant à 7.5%, 10%, 15% et 20% du volume de sang circulant par kg de poids vif sur une période de 24h, le temps de récupération est de 3, 7, 14, et 28 jours respectivement. Prélèvements de fluides biologiques/tissus/matrices : Des raclages cutanés et/ou des biopsies de peau pourraient être réalisés. Dans le premier cas, le prélèvement s’effectuera avec une lame de bistouri émoussée. Dans le second cas, l’acte sera réalisé sous anesthésie locale, sur un animal vigile avec ou sans tranquillisation et suivies les cas échéant par des points de suture. Le nombre de biopsies sera limité à 1 par jour et 8 par étude pour chaque chat. La taille et la profondeur de la biopsie seront définies et argumentées dans le plan d’étude.

Impact sur les animaux

Les chats recevant une injection d’élément allergisant et dévélopperont des signes pruritique : grattage, léchage, mordillement ou des frottements de n’importe quelle partie du corps. Les signes cliniques apparaissent généralement dans les 30 minutes après l’injection et le prurit disparait spontanément quelques heures après cette injection. Des prélèvements sanguins répétés pourront également générer un inconfort. Des biopsies de peau pourraient être collectées. Avant de conduire des études d’efficacité nous avons généralement des informations de tolérance dans le chat, des réactions d’intolerance sévère à cause des produits évalués ne sont donc pas attendues. Les phases de traitement/prélèvement sur un animal vigile peuvent occasionner un léger stress/baisse de bien-être en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/recueil d’échantillons.

Devenir

Dans le cadre de ce projet, les euthanasies ne sont pas prévues. Par conséquent une réintroduction de l’ensemble des animaux qui participeront à ce projet dans la colonie hébergée au sein de l’EU est envisagée. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire la DAF et pouvoir évaluer l’état général de l’animal et l’intensité des manifestations dermatologiques, la complexité des mécanismes biologiques en jeu ne pouvant être reproduite in vitro.

Réduction

Les comportements pruritiques présentent une variabilté entre individus. L’expérience avec ce type de modèle nous montre qu’il faut déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe permettant des résultats exploitables et répétables. Ce sont des études de preuve de concept : étapes précoces de l’évaluation d’un nouveau produit/composé actif. L’évaluation et l’intérprétation des résultats sont faites en comparant le temps où un comportement pruritique est observée durant une période définie pour chaque groupe. Les groupes de traitement sont : non-traité (contrôle négatif) et/ou le groupe traité avec un produit de référence (contrôle positif) et le (ou les) groupe(s) traité(s) avec le produit à évaluer. Il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d’étude spécifique dans le cadre de ce projet. Dans le plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié de manière à optimiser l’utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre d’animaux permette d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettent de prendre une décision sur le niveau de sensibilisation et/ou l’efficacité du produit/des produits évalués. Également en plus d’étudier le contrôle du prurit, l’utilisation d’un modèle permet une comparaison pharmacocinétique/pharmacodynamoqie et aussi une évaluation de la tolérance : donc une étude au lieu de trois.

Raffinement

Les animaux sont manipulés quotidiennement afin de les habituer à la contention et au contact des expérimentateurs. Les traitements et prélèvements sont réalisés généralement sur animaux vigiles selon les procédures en vigueur au sein de l’animalerie. Pour les chats, une contention légère est suffisante pour l’administration du traitement et les collectes d’échantillons et n’induit pas de nuisance au bien-être des animaux autre que d’être maintenus pendant des temps très courts. Les volumes prélevés et les temps de récupération des animaux sont déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être ne sera pas altéré. Dans le cas d’administrations ou de prélèvements spécifiques (biopsie de la peau), les animaux pourront être anesthésiés localement ou totalement pendant la durée de l’acte. L’anesthésie et le réveil des animaux se feront sous la surveillance d’un vétérinaire. Toute observation d’un état de santé ou d’un comportement anormal d’un animal fera l’objet d’un examen par un vétérinaire qui proposera les mesures adéquates pour protéger l’animal : si nécessaire, le sortir de la procédure expérimentale et/ou lui administrer un traitement. L’euthanasie (si nécessaire) sera effectuée sur site. Suite à l’injection d’élément allergisant, des personnes qualifiées évaluent régulièrement le comportement général, le grattage, la respiration et la peau avec une grille qui permet de définir si les réactions sont absentes, légères, modérées ou sévères. Ces critères constituent des points limites qui une fois atteints ou dépassés, entraineront l’exclusion de l’animal de l’étude et son traitement. La réaction induite et l’inconfort que l’injection d’élément allergisant peut engendrer sont vite et efficacement contrôlés avec par exemple des corticoïdes. Les chats pourront avoir leurs griffes épointées pour diminuer et limiter le risque de blessures lors du comportement pruritique. Également, par exemple, une colerette pourrait leur être posée si les points limites sont atteints le temps que le traitement agisse. La grille d’évaluation des lésions et les points limites sont validés par le comité d’éthique et pourront être révisés de manière rétrospective selon les résultats obtenus à chaque étude.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. Les modèles expérimentaux qui permettront d’évaluer les produits vétérinaires doivent être développés dans la même espèce pour plus de pertinence. L’espèce féline a été retenue comme correspondant à l’application clinique future des produits visant à traiter les signes de dermatose atopique. Les modèles seront à mettre en place chez des chats jeunes adultes sains. Ceci correspond à des animaux de plus de 3 mois avec un système immunitaire mature.

1 212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris de lignée NOD développent spontanément un diabète de type 1, avec soif excessive et perte de poids, et reçoivent par voie intraveineuse sous anesthésie des nanoparticules d'oxyde de fer censées réguler leur système immunitaire. Le porteur teste ce traitement en prévention et en curatif, et renvoie une application chez l'humain au long terme. Il qualifie le recours à la souris d''incontournable' et affirme qu'aucun modèle in vitro n'étudie les mécanismes immunitaires du diabète auto-immun.

Objectifs

L'organisation mondiale de la santé considère aujourd’hui le diabète comme une priorité sanitaire. Environ 5% des patients diabétiques souffrent du diabète auto-immun de type 1, la maladie métabolique la plus fréquente chez l'enfant dans les pays développés. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune complexe qui résulte de la destruction spécifique des cellules pancréatiques qui produisent l'insuline et de la perte de la capacité à contrôler le niveau de glucose dans le sang. Le diabète de type 1 survient suite à une réaction anormale du système immunitaire. De nos jours, il n’existe pas de traitement curatif sûr pour cette pathologie. Ce projet repose sur l'hypothèse que la régulation de la réponse immune peut avoir le potentiel d'induire la rémission du diabète de type 1 déclaré et/ou de le prévenir lorsqu'il est appliqué dans le prédiabète tardif, avant le déclanchement de la maladie. Des nanoparticules d’oxyde de fer, portant des molécules qui régulent le système immunitaire seront utilisées pour les traitements de souris non-obèses diabétiques. Ce type de nanoparticules est déjà utilisées en clinique en tant qu’agent de contraste en radiologie. Ce projet vise à valider et améliorer le protocole thérapeutique en termes de durée de traitement, de dose et de voie d’administration de souris diabétiques et à développer un protocole pour un traitement prophylactique. Il est également prévu d’examiner l'impact du traitement par nanoparticules sur le système immunitaire à court et à moyen terme pour la compréhension des mécanismes impliqués dans leur effet thérapeutique au niveau de l'organe affecté et du système immunitaire. Globalement ces travaux pourront contribuer à terme à valider une approche d'immunothérapie antigène-spécifique pour l'homme.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu pour ce projet est l’optimisation d’une nouvelle approche de thérapie du diabète de type 1 basée sur l’administration de nanoparticules capables de réguler le système immunitaire. Un deuxième bénéfice potentiel est la compréhension des mécanismes impliqués dans un effet thérapeutique du traitement au niveau de l'organe affecté et du système immunitaire. Ces connaissances pourraient contribuer, à plus long terme, à la translation de ce type de traitement à l’homme.

Procédures

Le dosage glycémique pour suivre l’évolution du diabète sera effectués par prélèvements d’une goutte de sang pour (un lecteur de glycémie capillaire) lorsque la glycosurie avec la bandelette s’avère positive sur toutes les souris (1212). Les traitements curatifs ou prophylactiques du diabète auto-immun par les nanoparticules seront administrés par voie intraveineuse sous anesthésie générale gazeuse (1038 souris). La durée des traitements sera soit de 10 jours soit de 4 semaines. L’injection des lymphocytes par voie intraveineuse sous anesthésie gazeuse se fera sur 120 souris et 54 souris seront utilisées pour les préparations cellulaires. Le temps estimé pour effectuer le dosage de glycosurie ou de glycémie est environ 10 secondes par souris. Les temps pour effectuer l’injection intraveineuse, après induction de l’anesthésie, est 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Aucun effet indésirable majeur n’est attendu à la suite des traitements avec le nanoparticules car elles sont déjà utilisées en clinique en tant qu’agent de contraste en radiologie. Le déclenchement du diabète chez les souris non-obèses diabétiques survient entre 13 et 30 semaines avec un incidence moyenne de 18 semaines. L'incidence du diabète est de 70% chez les femelles. Des diminutions de la teneur en insuline se produisent chez les femelles à environ 13 semaines d'âge. Le début du diabète est marqué par une glycosurie et puis par une glycémie modérée. La maladie peut induire chez les souris une surconsommation d’eau et tardivement une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que la réponse au traitement, et leur système immunitaire seront alors caractérisés.

Remplacement

Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques. Aucun modèle in vitro alternatif n’est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun et donc impossible d’analyser in vitro, mais qui dispose du modèle très performant, la souris NOD. Étant donné que le paramètre principal étudié dans ce projet est la survenue d’une maladie résultant d’un ensemble complexe d’acteurs cellulaires et de médiateurs solubles, l’utilisation du modèle de la souris est incontournable.

Réduction

Le nombre de souris utilisées est maintenu au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. L’incidence du diabète et les différences entre les populations lymphocytaires au cours des différents traitements seront analysées par un test statistique adapté. Le protocole expérimental prévoit l’analyse du système immunitaire de tous les animaux traités avec les nanoparticules pour limiter la répétition des expériences.

Raffinement

Les points finaux pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés dans des cages adaptées, 3-5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs. Les injections intraveineuses sont effectuées sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La NOD est considérée comme le meilleur modèle du diabète auto-immun spontané permettant d’étudier la maladie et la réponse immunitaire diabétogène. La souris NOD développe un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines d'âge. Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l'étude de cette maladie, en effet les mécanismes immunopathologiques découverts à l'aide des modèles murins sont similaires chez l'homme. Aucun modèle in vitro alternatif n'est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun. Les souris NOD adultes développent un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines. Notre étude d’incidence se concentre sur des animaux déclarant un diabète entre 13 et 22 semaines d’âge. Les souris de 12 semaines seront utilisées pour le traitement de prévention de la maladie et les études mécanistiques.

1 452 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection d'iodate de sodium détruit leur rétine pour reproduire une dégénérescence comme la DMLA, puis des molécules candidates leur sont administrées par diverses voies, avec des tests comportementaux mesurant la baisse d'acuité visuelle, avant prélèvement des yeux. Le porteur mène ce criblage pour développer des médicaments et renvoie l'usage chez l'humain à une éventualité. Il qualifie le recours à l'animal de 'stricte nécessité' et d''indispensable', affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit un 'organisme entier'.

Objectifs

Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie in vitro et/ou in vivo, de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de maladies ophtalmologiques avec la mise en place d’un modèle animal de dégénérescence de la rétine chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la baisse d’acuité visuelle et la dégénérescence rétinienne.

Bénéfices attendus

Ce projet se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de molécules thérapeutiques pouvant avoir un effet sur la dégénérescence de la rétine comme observée dans la DMLA ou la maladie de Stargardt. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de nouvelles molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.

Procédures

tous les animaux subiront une injection systémique de sodium iodate (sauf le groupe 1, sérum physiologique) pour induire la pathologie. l'injection sera unique et se fera par voie intra-péritonéale sur animal vigile. les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 1 mois après l'induction du modèle). selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale ou par voie topique, sur animal vigile. tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Des tests comportementaux pour mesurer l’acuité visuelle seront également réalisés : une fois avant le début des traitements mais après l’injection de sodium iodate afin de confirmer l’induction du modèle et/ou de procéder à l’allocation des groupes (durant la 1ère semaine), puis jusqu’à 1 fois par semaine pendant 4 semaines après l’injection de sodium iodate soit 4 fois maximum pour la durée d’une étude (voir figure en annexe). Le premier type de test dure 5 minutes maximum et chaque animal est testé jusqu’à 10 fois avec un intervalle de 5-10 minutes entre chaque test. Le deuxième type de test dure environ 5 secondes et le test est répété trois fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque répétition.

Impact sur les animaux

Du fait de l'induction du modèle, les animaux vont avoir une diminution de l'acuité visuelle (visible par les tests comportementaux mis en place) qui est liée à une dégénérescence de la rétine sans autre effet indésirable attendu aux doses administrées. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques) ni aux tests comportementaux (procédure légère pour tester l’acuité visuelle).

Devenir

euthanasie pour récupérer différents organes, dont les yeux, pour analyses histologiques ou autre

Remplacement

Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ces modèles in vivo permettent de mesurer l’acuité visuelle en reproduisant la physiologie d’un organisme entier. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 6 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (kruskal-wallis test).

Raffinement

Les animaux seront sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement: les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Si les signes persistent au bout de 24h, l’animal sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié.

Choix des espèces

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir en ophtalmologie implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers notre modèle reproduisent au mieux la pathophysiologie de la dégénérescence de la rétine humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’acuité visuelle ou l’histologie de l’oeil, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis à une restriction alimentaire pendant une évaluation comportementale de l'impulsivité de trois mois, à une neurochirurgie, puis à des injections quotidiennes d'un traitement dopaminergique pendant vingt jours qui provoque une forte impulsivité, avant leur mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur justifie la mise à mort par le 'besoin' d'obtenir les tissus cérébraux, et rattache l'impulsivité à la vulnérabilité aux addictions. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne permet d'évaluer un comportement impulsif.

Objectifs

La perte de contrôle sur les comportements motivés qui se reflètent au travers d'une forte impulsivité, est à la base de la vulnérabilité à developper des addictions, qu'elles soient liées aux drogues ou à des comportements (jeu pathologique, boulimie, ...). Il n'existe pas à ce jour de traitements réellement spécifiques et efficaces contre ces troubles, et ce notamment car les mécanismes cérébraux qui sous-tendent ces comportements pathologiques sont encore peu connus. L'objectif de ce projet est donc d'identifier certains des mécanismes neuronaux qui conduisent au développement d'une forte impulsivité.

Bénéfices attendus

Comprendre les mécanismes neuronaux qui sous-tendent les comportements impulsifs est une première étape essentielle pour pouvoir ensuire développer des stratégies thérapeutiques pertinentes et efficaces contre les troubles psychiatriques associés, comme les addictions.

Procédures

Les animaux seront soumis à quatre types d'interventions différentes : une évaluation comportementale de l'impulsivité (3 mois), une procédure de neurochirurgie (une heure maximum par animal), une procédure d'injection intrapéritonéale d'un traitement dopaminergique (une fois par jour pendant 20 jours) et mise à mort par dose létale d’anesthésique pour perfusion intracardiaque et prélèvement de tissus cérébraux afin d'étudier les mécanismes neuronaux pouvant expliquer les comportements observés (injection intrapéritonéale de pentobarbital après anesthésie à l'isoflurane, durée de la procédure : 5 minutes pour l'anesthésie profonde).

Impact sur les animaux

Nous attendons des nuisances d'ordre modérée dûes à la restriction alimentaire contrôlée, nécessaire à la réalisation de la tâche comportementale, et à la procédure chirurgicale. Le traitement pharmacologique induit une forte impulsivité, mais nous n'attendons pas de part nos connaissances du produit, à des effets physiologiques indésirables, à la dose modérée utilisée et largement documentée.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux afin de mieux comprendre les mécanismes de ces comportements et du traitement.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation d'un comportement impulsif.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une d'approche statistique.

Raffinement

Pour la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et analgésiés. Un anesthésique local sera également injecté au niveau du site opératoire en sous-cutanée, afin de prévenir le développement d'une potentielle douleur. Si nécessaire les heures ou jours suivant la chirurgie, un analgésique ou antalgique pourra être administré. En cas de signe d'alerte, l'alimentation sera supplémentée par une solution de Blédine, ainsi qu'une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l'animalerie. Des injections d'eau glucosée pourront également être réalisées. Afin de réduire les potentielles gênes induites par les injections répétées des aiguilles très fines seront utilisées. Les animaux seront habitués en amont à l'experimentateur ainsi qu'à la manipulation, et les aiguilles seront changées entre chaque injection, ainsi que le site d'injection chaque jour. Les animaux seront également stabulés selon la procédure mise en place par l'animalerie, afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Nous serons cependant obligés de les isolés par rapport à la procédure comportementale. Cependant, l'isolement sera limité par le fait que nous utilisons des cages avec grilles en portoir ouvert, proches les unes des autres. Ainsi, un certain nombre d'interactions sociales persistent, notamment par l'olfaction (essentielles) et l'audition.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des structures que nous allons étudier. De plus, le rat est couramment utilisé pour les études sur les comportements impulsifs. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes, ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs mois. Nous travaillerons également à la fois sur les mâles et les femelles pour prendre un compte un effet potentiel du sexe.

9 800 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont vaccinés sous la peau puis, cinq semaines plus tard, subissent un prélèvement de sang par ponction dans le cœur sous anesthésie, pour le contrôle qualité de lots de vaccins avant leur mise sur le marché. Le porteur signale que deux à cinq pour cent des animaux recevant les plus fortes doses développent une induration voire un ulcère au point d'injection. Il affirme que ce titrage réglementaire est 'nécessaire' à la libération des lots et qu'aucune méthode in vitro ne l'évalue, la réponse immunitaire exigeant selon lui un 'organisme entier'.

Objectifs

Ce projet est réalisé dans le cadre de contrôle qualité des vaccins avant leur libération sur le marché européen. Il permet le titrage d'activité de vaccins multivalents : activité antitétanique, antidiphtérique, anticoquelucheuse.

Bénéfices attendus

La conformité des résultats d'activité des vaccins pour les différentes valences est réglementairement nécessaire à la libération des lots de vaccins et donc à leur mise à disposition des patients.

Procédures

Des lots d'animaux sont vaccinés par voie sous cutanée avec plusieurs doses du vaccin à contrôler ou du vaccin de référence. La vaccination d'un animal dure moins de 30s. Cinq semaines plus tard, un prélèvement intracardiaque est effectué sur ces animaux préalablement anesthésiés. L'administration de l'anesthésique dure moins de 30s et environ 5 min après, le prélèvement sanguin est effectué. Il peut prendre environ 2 min par animal. Le dosage des anticops dans tous les sérums récupérés permet in fine de vérifier l'activité du vaccin à contrôler.

Impact sur les animaux

Suite à la vaccination il est possible d'observer des réactions au point d'injection de type induration voire ulcère chez 2 à 5% des animaux recevant les plus fortes doses de vaccins. Une surveillance et des soins (dermaflon ou vétédine) quotidiens et individuels ont donc été mis en place pendant la période d'apparition potentielle des symptômes. Le suivi est tracé.

Devenir

A la fin de l'essai après le prélèvement sanguin sous anesthésie, les animaux sont euthanasiés car ayant reçu une injection de vaccin ils ne peuvent pas être réutiliser dans un essai.

Remplacement

La réponse immunitaire engendrée par la vaccination nécessite l'organisme entier. A ce jour aucune méthode in vitro n'est disponible pour évaluer les activités antitétaniques, antidiphtériques et anticoquelucheuses.

Réduction

Ce projet permet de déterminer les activités antitétaniques, antidiphtériques et anticoquelucheuses des vaccins sur les mêmes lots d'animaux ce qui dimunue beaucoup le nombre d'animaux pour contrôler un lot. De plus, plusieurs stratégies permettent de limiter l'utilisation des animaux : - optimisation des essais: le test de deux lots de vaccins en même temps versus la référence est privilégié en l'absence de contrainte de délais de libération ( mutualisation des lots d'animaux vaccinés avec la référence) -limitation des retests, - à terme possible mise en place de "reducing": contrôle d'un pourcentage de la production et non de tous les lots lorsque la conformité et la stabilité des lots pourront être démontrées statistiquement.

Raffinement

La méthode sérologique a permis de diminuer fortement la douleur en supprimant les challenges (administration des toxines tétaniques et diphtériques) tranditionnellement utilisés pour le tritrage des valences tétaniques et diphtériques. Un enrichissement est mis à disposition des cobayes: foin compressé, balle en plastique.

Choix des espèces

Le cobaye adulte (250-300g) est le modèle retenu par la Pharmacopée Européenne pour le contrôle des vaccins multivalents comportant les valences tétanique, diphtérique et coqueluche pour sa bonne réponse immunitaire aux 3 types de vaccin. A ce stade, le système immunitaire des cobayes est parfaitement fonctionnel et permet donc d’obtenir une réponse anticorps satisfaisante.

2 475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris génétiquement modifiées pour reproduire des syndromes de surcroissance comme le syndrome de Protée reçoivent un gavage quotidien pendant deux mois, du tamoxifène puis des inhibiteurs, ainsi qu'une injection sous la peau, pour étudier ces maladies sans traitement connu. Le porteur décrit le gavage comme non traumatisant et surveille surtout le risque de fausse route, et prévoit d'arrêter le traitement quand une malformation atteint un demi-centimètre cube chez un animal témoin. Il affirme que les expériences in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des cultures cellulaires ou des méthodes in silico.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance en mosaïques sont causés par des mutations génétiques causant une croissance anormale des organes et/ou tissus. Nous nous intéressons ici au syndrome de Protée caractérisé par une hypercroissance asymétrique des tissus avec des anomalies vasculaires et lymphatiques mais aussi aux anomalies d’hypercroissance associées à des hypoglycémies. Pour ces 2 types de pathologies il n’existe aucun traitement. Notre objectif est de mettre en place des modèles de souris porteurs de ces mutations dans différents tissus de manière spécifique afin de comprendre les mécanismes moléculaires, cellulaires et endocrinologiques de ces pathologies. Nous explorerons également l’effet de différentes molécules permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements.

Procédures

Un traitement sera administré par gavage quotidien pour faire diminuer le volume des malformations. Le volume administré sera de 100ul. Celui-ci sera effectué par un technicien expérimenté. Le gavage sera réalisé chez des souris adultes. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Le gavage dure environ 15 secondes par animal. Les souris seront gavées pendant 2 mois. Un groupe de souris recevra une injection unique sous cutanée de 100ul. Cette injection sera effectuée par un technicien expérimenté

Impact sur les animaux

Gavage au tamoxifene pendant 5 jours pour induction de la Cre recombinase. Le tamoxifene à cette dose là ne donne pas de toxicité particulière. Gavage avec les inhibiteurs pharmacologique ou véhicule pour réduire le volume des hypertrophies. Le gavage n’entraine aucune nuisance particulière sauf une fausse route qui sera particulièrement surveillée. Les inhibiteurs pharmacologiques ne donnent pas de toxicité particulière aux doses utilisées. Le traitement sera interrompu lorsqu'une malformation chez une souris du groupe contrôle aura atteint le volume de 0.5cm3.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur les syndromes de surcroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu.

Réduction

La taille des groupes utilisés représente le minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Enfin, nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Par ailleurs, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Nous espérons ainsi identifier de nouveaux traitements médicamenteux qui pourraient améliorer les conditions de vie des patients porteurs de ces mutations génétiques et pour lesquels aucun traitement satisfaisant n'existe.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.

1 764 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une chirurgie crânienne de deux heures puis une injection d'anticorps dans le cerveau, d'autres reçoivent des injections répétées de psychotrope pour reproduire des symptômes de schizophrénie, à l'âge adulte ou dès la naissance, avant des tests comportementaux d'exploration et de réaction à des sons. Le porteur teste des anticorps issus de lamas censés cibler une protéine liée au glutamate, et renvoie les retombées pour les patients au conditionnel. Il affirme que le volet comportemental force le recours à la souris et conclut que le remplacement n'est pas possible.

Objectifs

La schizophrénie est une maladie psychiatrique hautement invalidante touchant environ 1% de la population. La recherche actuelle suggère que le glutamate, messager majeur dans le cerveau, est lié à la maladie quand il est trop concentré, mais les essais jusque là ont échoué à cause d'actions mal ciblées à l'origine d'effets secondaires. Une famille de protéines permet cependant de réduire les quantités de glutamate localement, ce qui diminue les risques d’effets secondaires. Nous avons montré que des petits anticorps provenant des lamas pouvaient réduire les symptômes de la maladie chez la souris en ciblant un type de protéine de cette famille. Dans cette étude, nous cherchons à observer les effets de nouveaux anticorps ciblant un autre type de protéines de cette famille, pour potentiellement trouver des résultats similaires par une autre voie. Pour ce faire, nous les testerons chez des souris modèles reproduisant différent symptômes puis enfin sur des souris modèles ne possédant plus la cible de nos anticorps, en contrôle.

Bénéfices attendus

L'utilisation des petites molécules thérapeutiques a historiquement été limitée à cause de leur manque de précision. Nos anticorps, eux, ciblent exclusivement leur cible, ce qui en fait des agents thérapeutiques prometteurs. De plus, cibler le système du glutamate permet de s’attaquer directement à la source de la maladie, plutôt que de se limiter au traitement supericiel de certains symptômes d’hallucinations et de délires tel que le font les traitements actuels. Adresser de manière complète le problème permettrait de réduire tous les symptômes, en particulier cognitifs et/ou de l’humeur, ce qui serait un immense pas en avant pour les patients et limiterait les interruptions de traitement.

Procédures

Dans un premier temps, l’activité de nos anticorps sera évaluée après injection dans le cerveau, ce qui nécessite d'une part une chirurgie crânienne d'une durée de deux heures par animal, et d'autre part une injection unique sur vingt minutes. Si nos anticorps parviennent à passer directement dans le cerveau depuis le sang, cette procédure pourra être remplacée par une injection simple en périphérie (moins de cinq minutes). En ce qui concerne nos modèles, ils se basent sur l’injection régulière (moins de cinq minutes) de psychotrope soit sur deux semaines (une fois par jour) à l’âge adulte soit sur une semaine (un jour sur deux) chez le nouveau-né. Les tests comportementaux seront non invasifs et non douloureux avec de l'exploration d'arène et des réactions aux stimuli sonores sur deux ou trois jours, pour un total de deux heures pour chaque test, soit six heures par animal pour réaliser tous les tests. Tous les animaux à la fin des expériences seront mis à mort par injection d’anesthésique suivie d’une perfusion pour fixer les tissus et récupérer le cerveau.

Impact sur les animaux

Cette étude utilisera des animaux non mutés ou ne possédant plus les protéines cibles. Ces déficiences n'induisent pas de douleurs chez l'animal. La chirurgie présente des risques de mort lors de l’anesthésie, ainsi que de gêne et de douleur suite à l’opération. Les modèles murins de schizophrénie seront mis en place par des injections répétées de psychotrope au stade adulte ou au stade nouveau-né. Outre la douleur des injections, ces modèles impliquent des difficultées de mobilité, de mémoire, et de sociabilisation (sans agressivité). D’après les données chez l'animal obtenues par nos collaborateurs, aucun signe de souffrance n’est attendu après unique injection d’un anticorps. Les anticorps qui seront évalués dans cette étude n'ont pas d'effets indésirables attendus après injection unique.

Devenir

Pour toutes les procédures, les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau pour des analyses sur les tissus.

Remplacement

Le remplacement de l’animal n’est pas possible pour cette étude. Les anticorps développés jusque-là ont une cible murine et, bien que leurs caractéristiques aient été décrites en laboratoire, les aspects les plus complexes (circulation dans le système, délai d’action, durée de l’effet) ne peuvent être reproduits. L'étude se concentre de plus sur un trouble psychique dont les mécanismes ne sont pas bien décrits, mais pour lesquels la littérature présente plusieurs modèles murins représentant bien différents symptômes de la maladie. L'aspect comportemental de ce projet, à l'heure actuelle, force l'utilisation de l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour l'étude a été déterminé afin de minimiser l'utilisation de l'animal tout en assurant la pertinence statistique des études réalisées par la suite, en prenant en compte des variabilités attendues car observées dans des travaux similaires et les risques de pertes liés à la chirurgie. Si, au cours du projet, les variabilités observées sont plus faibles, les groupes seront réduits en conséquence. Mâles et femelles seront utilisés, car les modèles murins de schizophrénie utilisés ne présentent pas de variabilité en fonction du sexe. Les nanobodies injectés auront déjà été sélectionnés pour leurs caractéristiques in vitro. Pour chaque étape, les nouveaux résultats permettront de réduire la sélection. Les mêmes animaux seront observés à travers différents tests comportementaux.

Raffinement

Cette étude utilisera des animaux non mutés ou ne possédant plus les protéines cibles. Ces déficiences n'induisent pas de douleurs chez l'animal. Tous les animaux suivront une période de cinq jours d’habituation à la manipulation et aux tests afin de réduire au maximum le stress lié au contact humain et à l’environnement d’étude. Des groupes d’animaux subiront des chirurgies et seront donc endormis profondément par l'utilisation d'anesthésiques appropriés et leur douleur sera traitée avec des anti-douleurs afin de minimiser la souffrance et la mortalité des animaux. Des mesures préventives aux impacts secondaires de la chirurgie (baisse de température, déshydratation, sécheresse des yeux) seront mises en place, avec une semaine de récupération sous surveillance quotidienne. Les résultats actuels ne permettent pas d’affirmer que nos anticorps entrent dans le cerveau d’eux même, mais une étude parallèle est prévue, et si l’injection directe est possible elle sera alors favorisée pour limiter la souffrance animale. Les injections de psychotropes, outre la douleur de la piqûre, induisent des déficits de mobilité et de mémoire qui seront surveillés en fonction de l'âge de l'animal pour identifier aussi tôt que possible toute souffrance non prévue par l'étude. Les données obtenues par nos précédents collaborateurs suite à un traitement aigu avec ces anticorps ne montrent pas de signe de souffrance supplémentaire à l’introduction de l’aiguille chez l’animal. Le comportement des animaux sera évalué via une grille de score de douleur à chaque étape pour intervenir au plus tôt en cas de signes de souffrance plus importants que prévus dans le cadre des manipulations. Un score élevé nous amènera a contacter la structure de bien être animal pour prendre la décision d'utiliser des anti-douleurs ou euthanasier l'animal.

Choix des espèces

Les anticorps produits jusque-là visent des cibles murines avec une forte spécificité et les modèles d'intérêt pour la schizophrénie sont particulièrement bien documentés chez la souris. Afin d’identifier rapidement les composés ayant un potentiel thérapeutique, nous avons décidé d’utiliser d'abord un modèle rapide pour évaluer un symptôme simple de la maladie. Les composés ayant montré une capacité à atténuer ce symptôme seront ensuite caractérisés plus en profondeur dans un modèle d’exposition précoce à un psychotrope. Ce modèle, impliquant une période d’expérimentation plus longue, se veut plus proche de la maladie. Les souches déficientes pour les cibles visées sont des contrôles essentiels pour confirmer que l’activité des anticorps est propre à leur action sur la cible. Ces souris ont déjà été étudiées, et ne montrent pas de souffrance par rapport aux souris non mutées.