Procédures modérées

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une greffe chirurgicale de cellules tumorales dans les poumons, puis reçoit dix-huit injections intrapéritonéales et plusieurs anesthésies, pour tester le repositionnement d'un médicament de cardiologie contre le cancer du poumon. Le porteur indique que la tumeur pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires et une perte de poids. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et qualifie le modèle murin d'"indispensable", les retombées pour les patients restant renvoyées à un éventuel repositionnement futur.

Objectifs

Le cancer du poumon est aujourd'hui la première cause de décès en France et dans le monde. Nos travaux ont montré que les tumeurs pulmonaires humaines présentent des voies métaboliques remaniées, permettant d’établir une nouvelle approche thérapeutique que nous proposons d’évaluer au stade préclinique. 50% des cancers du poumon produisent leur énergie à partir des lipides. L’inhibition de l’enzyme impliquée entraîne une forte inhibition de la croissance tumorale in vitro et in vivo. De plus, un médicament utilisé en cardiologie bloque cet enzyme et entraîne l’inhibition de la croissance tumorale. Afin de progresser vers le repositionnement de cette molécule dans le traitement ciblé du cancer du poumon nous devons apporter une preuve de concept in vivo et établir une preuve de mécanisme in vivo. Pour cela, un modèle murin de tumeur du poumon est indispensable.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'obtenir une preuve de concept dans le repositionnement d'une drogue, avec autorisation de mise sur le marché, dans le traitement du cancer du poumon.

Procédures

1_ Chaque animal subira une fois une procédure chirurgicale afin de greffer les cellules tumorales dans les poumons. L'animal sera anesthésié par de l'isoflurane pendant une très courte durée (

Impact sur les animaux

Les souris vont développer un cancer intra-pulmonaire, ce qui peut entrainer des difficultés respiratoires. Les injections quotidiennes en IP peuvent causer des irritations au niveau du site d'injection. La présence de la tumeur peut entrainer une perte de poids chez l'animal.

Devenir

A l'issue des 21 jours de suivi, tous les animaux sont euthanasiés, et les tumeurs, ganglions lymphatiques et rates sont prélévés.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologie observée chez l'Homme, peut apporter la réponse du système immunitaire. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo, qui ne reconstituent pas la complexité du système immunitaire.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots est de 10. Les expériences seront répétées à deux reprises. Un premier test statistique nous permettra de vérifier les différences significatives entre les groupes d’animaux. Il sera ensuite suivi d’un test de comparaisons multiples.

Raffinement

1.Hébergement: les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Anesthésie et Analgésie : durant la chirurgie, les animaux sont placés sous anesthésie et reçoivent des injections d’analgésique afin de limiter les douleurs et leurs stress lors de la procédure. 5. Points limites : Des points limites adaptés ont été définis afin de mettre fin à l’expérience si un animal dépasse ce seuil fixé.

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris. Ces souris sont utilisées dans la recherche sur le cancer du poumon en raison de leur capacité à développer le processus étudié (cancer du poumon) induit par les lignées tumorales pulmonaires. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'inoculation de cellules.

150 perches communes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 femelles tuées pour prélever leurs gonades, les autres gardées vivantes après cannulation ou stimulation manuelle de la ponte. Sur dix mois, elles sont anesthésiées pour un sexage par échographie, une puce leur est injectée, et huit prélèvements sont réalisés. Le projet cherche à savoir si la méthylation de l'ADN existe pendant l'ovogenèse de cette espèce, préalable annoncé à de futures études. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" cette expérimentation par des cellules en culture.

Objectifs

La reprogrammation de la méthylation de l’ADN pendant l’ovogenèse permet des réorganisations chromosomiques qui peuvent influencer l’expression des gènes dans la génération suivante. Ces modifications, souvent irréversibles, peuvent induire des modifications physiologiques, morphologiques ou biologiques et potentiellement conférer des avantages aux descendants qui deviennent alors des caractères héréditaires. Il est donc admis que ce mécanisme est un moteur de l’évolution. Chez les poissons, certaines espèces déclenchent cette reprogrammation et d’autres non. Dans ce dernier cas, les mécanismes adaptatifs ne sont pas encore compris mais semblent impliquer d’autres voies qui intégreraient à chaque génération les modifications épigénétiques et leurs conséquences sur l’expression génique. La compréhension des liens entre des modifications environnementales et les mécanismes évolutifs des espèces représente un enjeu important de nos connaissances, particulièrement pour des espèces très sensibles aux variations de leur environnement tels que les poissons. Les résultats obtenus à l’aide de diverses méthodes de biologie moléculaire nous permettront de mieux comprendre les mécanismes qui sont déclenchés dans des ovocytes à chaque étape de l’ovogenèse. Ainsi il nous sera possible de répondre à l’objectif principal de ce projet qui est de déterminer si la reprogrammation de la méthylation de l’ADN existe chez la perche commune et s’il existe un lien avec la dynamique d’expression des gènes pendant l’ovogenèse. Ce travail représente un préalable nécessaire à des études plus précises sur l’effet de variations de certains paramètres environnementaux sur le succès de reproduction chez la perche commune.

Bénéfices attendus

Les poissons sont très sensibles aux variations de leur environnement et ces dernières contrôlent plusieurs fonctions biologiques parmi lesquelles la reproduction. Ainsi, l’ovogenèse de la perche est contrôlée par des variations saisonnières de température et photopériode. D’autres paramètres environnementaux peuvent moduler la progression de ce processus. Par conséquent, il existe un lien avéré entre l’environnement et la reproduction ce qui pourrait, théoriquement, modifier les processus moléculaires impliqués dans l’adaptation des espèces aux variations de leur milieu de vie. Parmi ces processus, la méthylation de l’ADN est connue chez les mammifères mais ne semble pas exister chez toutes les espèces de poisson. Il s’agit ici de déterminer si ce processus existe pendant l’ovogenèse de la perche. Cela nous permettra, à l’avenir, d’étudier comment certains paramètres environnementaux ciblés influencent ces processus évolutifs. Cette étude constitue donc un préalable scientifique indispensable pour ouvrir ce nouveau champ d’investigation.

Procédures

Il y aura 5 expérimentations effectuées or de l’eau mises en place dans ce travail. Au début du cycle de reproduction, l’ensemble des 150 animaux seront anesthésiés avant d’être sexés par échographie (procédure 1, 2 et 3) car il n’y a pas de signe distinctif extérieur chez cette espèce (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Puis une puce électronique leur sera injectée pour nous permettre d’avoir un suivi personnalisé (procédures 1, 2 et 3) (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Ils seront alors répartis de manière homogène dans 2 bassins. L’ovogenèse sera induite en contrôlant les variations de température et de photopériode dans chaque bassin. Huit prélèvements réguliers seront effectués pendant les 10 mois d’ovogenèse. Au cours de chaque prélèvements 6 femelles (48 femelles en tout) seront anesthésiées pour effectuer une prise de sang (procédure 1) pour analyser des taux hormonaux (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Elles seront mises à mort pour effectuer une analyse approfondie des gonades par échographie et des prélèvements de gonades pour un suivi histologique classique. Un mois avant le début de la saison de ponte, toutes les femelles restantes (52 femelles) seront anesthésiées avant d’introduire une canule dans l’orifice urogénital (procédure 2) (Durée la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson) pour prélever quelques ovocytes. Ces derniers seront observés pour évaluer leur progression dans les phases finales de maturation. Ceci nous permettra de trier les femelles en fonction de cet avancement. Les femelles au même stade pondront en même temps, nous permettant de réduire le stress des animaux lors de la saison de ponte. Enfin, à cette dernière étape, les femelles prêtes à pondre (reconnaissable par l’observation d’une cloque sur l’orifice uro-génitale) seront stimulées manuellement pour déclencher la ponte (procédure 2) (Durée de l’intervention entre le moment de la capture et le retour dans le bassin de réveil : moins de 5 minutes par poisson). De la même manière, les mâles spermiants seront stimulés par pression abdominale pour collecter le sperme (procédure 3) (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil :

Impact sur les animaux

Trois manipulations (injection d’une puce électronique (procédure 1, 2, et 3), prise de sang (procédure 1) et cannulation (procédure 2)) impliquent l’injection d’une aiguille ou d’une canule chez l’animal. Elles pourraient induire des nuisances comme une douleur ou des infections. Pour y pallier, les animaux seront systématiquement anesthésiés pour éviter la douleur. Concernant les risques d’infection, le matériel utilisé est stérile ou désinfecté et une observation renforcée des animaux sera effectuée pendant la semaine qui suit les expérimentations. Si nécessaire un protocole de traitement sera mis en place.

Devenir

Seule la procédure 1 (prise de sang) sera suivie d’une mise à mort des animaux car les gonades devront être prélevées pour effectuer des analyses moléculaires et histologiques. Concernant les 2 autres procédures, les animaux seront gardés en vie après chaque expérience pour nous permettre de continuer la progression de l’étude

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer cette expérimentation animale qui a pour but de mettre en évidence des régulations moléculaires dans des ovocytes au cours de l’ovogenèse. Ces régulations si elles existent, dépendent certainement des variations de signaux moléculaires et/ou cellulaires (hormones, signaux nerveux etc…) jusqu’ici inconnus. Il n’est donc pas possible d’effectuer ce travail dans des cellules en culture qui ne permettraient pas de reproduire l’ensemble de ces signaux extracellulaires.

Réduction

Nous avons décidé de faire plusieurs expériences indépendantes (étude de la reprogrammation de la méthylation de l’ADN et analyse de la progression de l’ovogenèse par échographie) car ces dernières nécessitent les mêmes contrôles (histologie, taux hormonaux…) mais n’interfèrent pas en termes de prélèvement d’organes. Nous avons donc regroupé 2 expériences pour réduire le nombre d’animaux utilisé. D’autre part, la mise en point récente d’une méthode de sexage des perches par échographie, nous permet maintenant de focaliser nos études avec un nombre de femelles et mâles plus adapté à nos besoins au départ. En effet, par le passé nous devions équilibrer le sexe-ratio pour nous assurer d’avoir le bon nombre de femelles pour toute l’expérience. Grâce au système d’identification par puce et au sexage préalable par échographie, nous pouvons réduire le nombre de mâles utilisés et donc réduire le nombre total d’animaux étudiés. En effet, cette opération permet de réduire le nombre de mâles utilisés de moitié par rapport à nos expérimentations précédentes.

Raffinement

Les étapes de puçage, de sexage, de cannulation ou de prise de sang peuvent engendrer soit un stress du fait d’une manipulation prolongée hors de l’eau (cannulation ou sexage) ou d’une douleur correspondant à l’introduction d’une aiguille (puçage et prise de sang). De ce fait les animaux seront préalablement anesthésiés pour éviter le stress des animaux. Les étapes de prélèvement de sperme ou de stripping (stimulation des pontes ou de la collecte du sperme) sont rapides (inférieur à 2 minutes) et seuls les animaux spermiants ou ayant ovulés seront stimulés. Cette stimulation correspond à une légère pression sur l’abdomen des poissons qui déclenche la ponte ou la libération de sperme. Une fois enclenchés ces processus ne nécessitent pas de pression abdominale prolongée et la récolte se fait rapidement. Si ces étapes risquent de stresser les animaux du fait de la pêche et de la vérification quotidienne des femelles, la rapidité de la procédure nous permet de ne pas les anesthésier. Pour éviter les stress répétés, nous avons décidé de regrouper les femelles en fonction de leur stade de maturation ovocytaire lors d’une évaluation globale un mois avant le début de la saison de ponte. Ceci nous permet de concentrer les pêches de poissons dans un bassin à quelques jours (4-5 j/par bassin) ce qui diminue le stress des poissons dans chaque bassin tout en nous permettant une meilleure efficacité dans notre gestion de la saison de pontes. Les mâles seront également isolés dans un bassin pour éviter qu’ils soient trop stressés. Chaque mâle sera stimulé au maximum 3 jours de suite puis isolés du groupe pour récupérer et éviter le stress répété.

Choix des espèces

La perche commune est une espèce groupe synchrone pour laquelle tous les ovocytes se développent simultanément, il sera plus facile de déterminer si cette synchronicité existe également à l’échelle moléculaire. D’autre part, cette espèce pond ses œufs enrobés dans une gangue. Cette caractéristique présente l’avantage de nous permettre de déterminer si les éventuelles variations des régulations étudiées peuvent être en lien avec la localisation des ovocytes dans l’ovaire jusqu’à la ponte. En d’autres termes nous voulons savoir si le microenvironnement des cellules influence ces régulations dans un ovocyte donné. La ponte d’un ruban d’œufs nous permet en fin de cycle de déterminer la localisation antéro-postérieure des ovules dans la gonade et donc pouvoir suivre cette évolution tout au long du cycle de reproduction. Les animaux utilisés seront des adultes matures et primipares. Nous choisissons de travailler avec des animaux primipares car ils sont plus jeunes et proviennent le plus souvent d’un même groupe d’animaux ayant été élevés en même temps dans les mêmes conditions. Au contraire, des animaux ayant déjà pondus pourraient provenir de lots différents. Nous réduisons ainsi le risque que les animaux aient des histoires différentes ce qui pourrait éventuellement affecter le processus épigénétique étudié et donc augmenter les variations individuelles qui pourraient interférer avec nos résultats. Nous pensons que le travail avec des primipares nous permettra de diminuer cette variabilité individuelle sans pour autant l’éviter complètement.

235 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une à deux chirurgies cérébrales pouvant durer quatre heures, des injections répétées et des enregistrements tête fixée qui les immobilisent, certaines étant isolées. Le projet étudie le rôle de neurones du cervelet dans l'apprentissage spatial, bénéfices thérapeutiques renvoyés au long terme. Le porteur affirme qu'analyser en parallèle le comportement et l'activité neuronale est "indispensable" et possible seulement chez l'animal vivant.

Objectifs

Le but de ce projet est d'examiner la fonction de neurones du cervelet dans l’apprentissage d’une tâche cognitive complexe de navigation spatiale orientée vers la récompense. Il a été montré chez l'Homme et la souris que ce type de tâche met à contribution le cervelet. Ces neurones participent à l'activité que le cervelet exerce sur le reste du cerveau. Nous mettrons au point des outils génétiques afin d’interférer avec leur activité, et modifier l'influence du cervelet pendant un apprentissage. L’efficacité d’expression des outils sera validée in vitro puis in vivo. L'évolution des performances d'apprentissage sera comparée entre les souris exposées à la stimulation et contrôles. En parallèle à l’étude comportementale, nous étudierons le rôle des neurones dans les mécanismes de plasticité synaptique dans le cortex cérébelleux in vitro. Cette étude nous permettra de mieux comprendre le rôle du cervelet et les mécanismes cellulaires de l’apprentissage in vivo et in vitro. Les protocoles seront optimisés afin de respecter les devoirs de Réduction et Raffinement et pour assurer l'absence de douleur. La surveillance continue de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale lorsque l'animal montre des signes d’anxiété. Les procédures visent à optimiser le confort des animaux et réduire le nombre d'animaux utilisés. L'optimisation des soins aux animaux nous permettra d'utiliser certains animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement.

Bénéfices attendus

Comprendre les mécanismes neuronaux qui sous-tendent des fonctions cognitives complexes telles que la navigation est un des enjeux majeurs de la recherche en neuroscience. Il contribue à appréhender le fonctionnement du cerveau en conditions normales et par conséquent, il aide à mieux cibler les altérations qui se présentent en conditions pathologiques et à long terme développer des thérapeutiques.

Procédures

Un lot de souris sera soumis à une chirurgie qui durera 2h, un deuxième lot sera soumis à deux chirurgies de 2h et neuf injections intrapéritonétales (une injection par jour) et un troisième lot sera soumis à une chirurgie de 2h puis une chirurgie de 4 h et douze injections intraperitonéales (1 injection par jour).

Impact sur les animaux

Les souris subiront plusieurs chirurgies. Elles sont donc susceptibles de ressentir de la douleur postopératoire. Certaines seront utilisées pour des enregistrements avec tête fixée ce qui peut engendrer un stress car elles ne sont alors pas libres de leurs mouvements. D’autre part, il sera parfois nécessaire d’isoler un animal, ce qui peut aussi engendrer du stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit pour prélèvement du cervelet, soit pour analyser l'expression des outils génétiques dans le cervelet et l'implantation des électrodes.

Remplacement

Afin de comprendre le rôle des interneurones dans le comportement moteur il est indispensable d'analyser le comportement et l'activité des neurones en parallèle. Ceci est possible exclusivement chez un animal vivant. Les études in vitro et les animaux invertébrés ne permettent pas l'étude des comportements complexes ; la souris est donc l'espèce la plus appropriée pour ce type d'études.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu est inspiré du nombre d’animaux utilisé dans des travaux précédents de l’équipe et est réduit au minimum pour nous permettre de générer des données statistiques solides

Raffinement

Les procédures tiennent compte des temps de récupération et du nombre de tests pour réduire le stress et la fatigue des animaux. Les animaux sont placés dans des cages au format réglementaire, en communauté de 2 à 5, dans des conditions d’hébergement contrôlées (12:12 h cycle jour/nuit, 22°C ± 2°C, humidité de 50%). L’eau, la nourriture et du matériel de nidification, seront placés dans chacune des cages. Lorsque la procédure nécessite l’isolement d’un animal, un jouet d'exploration supplémentaire (cube, tunnel ou abri) est placé dans la cages de manière à lui offrir plus d’enrichissement. Les animaux sont suivis quotidiennement par les mêmes manipulateurs afin de réduire leur stress au maximum. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur de l’animal (anesthésie, analgésie, suivi post-opératoire). Des points limites sont définis et un suivi régulier des souris par un personnel qualifié sera réalisé après chirurgie à l’aide de grilles d’évaluation (étude du comportement, du poids et de l’apparence). Des méthodes seront mises en place pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour trois raisons : - la taille de l’animal qui permet son installation sur le poste d’observation dont le laboratoire dispose et sur les postes de travail. - la disponibilité de souches de souris transgéniques nécessaires à ce projet. - nos études comportementales ont été validées sur des souris. Par soucis de reproductibilité nous souhaitons poursuivre avec la même espèce. Le projet porte sur l'étude des réseaux neuronaux à l'âge adulte. Les animaux seront utilisés à partir de P30 afin de préparer l'expérimentation et jusqu'à 3 mois.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime riche en graisse induisant l'obésité, isolées en cage individuelle pour la calorimétrie, puis testées pour la tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins avant la mise à mort. Le projet étudie le rôle d'une enzyme dans les troubles métaboliques liés à l'obésité, applications thérapeutiques annoncées au conditionnel. Le porteur affirme qu'il faut étudier ces mécanismes "dans un organisme vivant" et qu'"aucune méthode alternative" n'existe.

Objectifs

L’obésité́ et le diabète de type 2 sont des problèmes majeurs de santé publique. Au cours des dernières décennies, de nombreuses études ont montré́ que les cellules immunitaires dans le tissu adipeux viscéral (TAV) des patients obèses sont responsables d’une inflammation chronique. Celle-ci serait largement impliquée dans le développement des désordres métaboliques et cardio-vasculaires compliquant l’obésité́. En particulier, la transformation de cellules immunitaire anti-inflammatoires, abondants dans la TAV maigre, en cellules immunitaires pro-inflammatoires dans le TAV obèse, conduirait à la production de médiateurs de l’inflammation et jouerait un rôle majeur dans cette inflammation chronique. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsable de cette inflammation sont encore méconnus. Les identifier permettrait de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre les syndromes métaboliques et l’obésité́. Nous avons observé́ que la déficience en une enzyme impliqué dans la dégradation de l’ADN libéré́ par les cellules mortes rend les souris plus susceptibles au développement du syndrome métabolique induit par l’obésité́. L’absence de cette enzyme augmente la capacité́ de l’ADN libéré́ par les cellules mortes, qui s’accumule au cours de l’obésité́, à activer les réponses inflammatoires causant le syndrome métabolique. Notre objectif est d’évaluer le métabolisme énergétique des souris déficientes en cette enzyme.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mettre en évidence comment la DNase1L3 contribue aux troubles métaboliques induits par l’obésité. Ainsi notre projet pourra conduire aux développements de nouvelles approches thérapeutique basées sur la supplémentation en DNase1L3 afin de limiter l’inflammation chronique induite par l’obésité mais aussi aux troubles métaboliques induite par celle-ci.

Procédures

Déroulement de la procédure : • Acclimatation/habituation (semaine 1) • 1ère séance de calorimétrie (semaine 2-4) • 1ère analyse de la composition corporelle (semaine 4, l’analyse dure environ 3 min par souris) • Exposition au régime riche en graisse (semaine 4-14) • 2ème séance de calorimétrie (semaine 15-16) • 2ème analyse de la composition corporelle (semaine 15) • Test de tolérance au glucose (semaine 16) • Test de tolérance à l’insuline (semaine 17) Nous réaliserons un seul test de tolérance au glucose et un seul test de tolérance à l’insuline. Pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, nous réalisons des prélèvements sanguins au niveau de la queue des souris. Le volume de sang nécessaire est limité (inférieur à 1% du volume sanguin total). Un délai d’une semaine minimum est respecté entre chaque test.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte. Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal et réaliser les mesures de calorimetrie indirecte. Afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Afin de réduire au maximum le stress ressenti par les animaux nous réalisons une période d’habituation de 2 semaines des animaux aux expérimentateurs. De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement ou de façon hebdomadaire (période d’induction de l’obésité), nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale. Les souris exposées au régime riche en graisse peuvent développer des dermatites, bien que cela soit très rares chez la souche de souris utilisée dans cette étude.

Devenir

Toutes les souris utilisées dans ce projet seront mises à mort à la fin de l'expérience pour récupérer du sang et des tissus afin de réaliser des études biochimiques et moléculaires complémentaires.

Remplacement

Le but de ce projet de physiologie intégrée est de comprendre les bases biologiques de la régulation de la balance énergétique et les mécanismes physiopathologiques menant aux désordres métaboliques, en particulier l’obésité. Dans ce contexte, de nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent, non seulement entre elles, mais aussi avec les organes périphériques (foie, muscles, tissu adipeux…). Il est donc nécessaire d’étudier ces phénomènes dans un organisme vivant. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive permettant de répondre à ce type de question par un remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquements (21 animaux par groupe).

Raffinement

1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 9 semaines. Ils seront manipulés pendant 2 semaines. Cette habituation, permettra de diminuer le stress des animaux en réponse aux expérimentateurs. 2) L’évaluation de la prise alimentaire et des paramètres de calorimétrie indirecte nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement se compose de frisure de papier kraft et de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et d’un tunnel en carton pour se cacher et réaliser le transfert et la manipulation des animaux. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, les attitudes, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant) et de décider si l'animal peut être maintenu dans l'étude ou s'il doit être mis à mort afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et de la balance énergétique fait de la souris un bon modèle prédictif. Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte, âge qui correspond à un stade où les circuits neuronaux contrôlant la prise alimentaire sont matures.

360 souris et 360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie cérébrale leur implante des canules profondes, suivie de sessions de prélèvement de trois à quatre heures reliées par des câbles et d'un isolement post-opératoire. Le projet mesure l'effet de candidats médicaments sur l'activité cérébrale, le porteur qualifiant la technique de "translationnelle". Il affirme que les cultures de neurones ne suffisent pas et que le retrait de la canule laisserait des lésions "non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions".

Objectifs

La concentration de molécules (e.g. neurotransmetteurs) spécifiques dans des régions cérébrales précises est modifiée dans certaines conditions psychiatriques ou neurologiques ; étudier ces facteurs peut informer sur l'efficacité de candidats traitements dans le traitement de ces pathologies, ou sur leur mécanisme d'action. Le projet consiste à évaluer l'effet de nouveaux candidats médicaments sur l'activité métabolique cérébrale chez le rongeur. La méthode de microdialyse cérébrale peut être réalisée sur animal anesthésié ou vigile. Cette méthode consiste à recueillir et à analyser certaines substances chimiques présentes dans le milieu extra cellulaire interstitiel du parenchyme cérébral. Outre l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapies, la microdialyse cérébrale peut aider à la compréhension d’événements neurologiques.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurologiques. La technique de microdialyse est une méthode translationnelle qui permet d'évaluer l'effet de nouvelles substances pharmacologiques sur les concentrations de substrats cérébraux telles que des neurotransmetteurs ou des acides aminés sans avoir recours à une extraction tissulaire. Cette méthode permet de mieux comprendre les relations entre neurotransmission et modifications comportementales chez le petit animal.

Procédures

La collecte de dialysats cérébraux nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (entre 1h et 1h30) afin de placer la ou les canules dans des régions cérébrales situées en profondeur. Lors de la collecte des microéchantillons ou dialysats, les animaux sont reliés à une seringue et un collecteur de fraction par l'intermédiaire de câbles/cathéters en polyéthylène (les durées de sessions de perfusion/prélèvement sont en général de l'ordre de 3 à 4 h). Les animaux recevront des administrations de candidats traitements en général par bolus (durée de l'ordre de la seconde), de manière aigue ou chronique.

Impact sur les animaux

Des douleurs peuvent être liées à l'implantation d'électrodes au niveau cérébral (ces animaux seront placés sous traitement analgésique qui sera adapté sous contrôle vétérinaire). Suite à la chirurgie, les animaux sont isolés pour protéger la canule de microdialyse (cependant, ils gardent un contact visuel, sonore et auditif avec leurs congénères). Les animaux peuvent perdre du poids ou une plaie peut se former au niveau de la zone d'implant en raison d'une infection post-chirurgicale. Lors du test, les animaux sont connectés pendant plusieurs heures à des cables pendant la diffusion du perfusat et la collecte du dialysat suite à l'administration d'une substance pharmacologique.

Devenir

Les rongeurs seront euthanasiés à la fin des expériences car des prélèvements de tissu (cerveau) seront réalisées, pour dosage de biomarqueurs ou pour vérifier le placement de la sonde. De même, le retrait de la canule implantée pourrait entraîner des lésions non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, des modèles alternatifs ont été développés au laboratoire mais ne permettent de mesurer que la présence de certaines molécules secrétées par des cultures primaires de neurones. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi d'évaluer l'effet de substances pharmacologiques sur l'activité métabolique cérébrale.

Réduction

Les analyses statistiques seront affinées pour utiliser le nombre minimum d'animaux; les tests qui seront appliqués ne sont pas encore connus (mise en place de la technique), des études de variabilité et d'homogénéité seront réalisées pour déterminer les analyses les plus pertinentes (paramétriques ou non paramétriques). Des prélèvements de sang ou d'organes peuvent être également ajoutés à la fin des expériences pour compléter les analyses et éviter l'utilisation d'autres animaux.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Les animaux reçoivent un traitement analgésique général au début de la chirurgie puis pendant 48 h et un traitement analgésique local supplémentaire pendant la chirurgie. Lors de la chirurgie, l'implantation d'une canule peut induire une hémorragie. Si cette dernière ne peut être maitrisée, l'animal sera euthanasié. Suite à la chirurgie, les animaux vont être pesés quotidiennement pendant 48 heures pour évaluer leur récupération. Un rat montrant une perte de poids supérieure à 15%, des signes de souffrance (poil hérissé, manque de toilettage) ou une atteinte locomotrice (démarche anormale, chutes...) sera euthanasié. Les conditions d'hébergement sont également optimisées avec la présence d'un enrichissement adapté (bois à ronger par exemple). Les animaux isolés sont hébergés dans des cages transparentes leur permettant de voir, sentir et entendre leurs congénères. Dans certains modèles, l'activité métabolique permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle. Il arrive que l’animal se gratte au niveau de l’implant, endommageant les tissus autour de l’implant. Dans ce cas, l’animal est désinfecté quotidiennement avec une solution antiseptique. Un antibiotique peut être administré, le cas échéant.

Choix des espèces

Les études de mesure de l'activité métabolique cérébrale sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études préalablement réalisées (études de pharmacocinétique par exemple) et à la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Le choix de l'espèce peut aussi être lié au modèle expérimental choisi. Par exemple, certains modèles mimant la maladie de Parkinson ont été préférentiellement développés chez le rat. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique).

135 flets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés en estuaire par pêche électrique, ils sont exposés un mois à un cocktail de pesticides par balnéation, puis tués pour prélever leur foie. Le projet vise à valider des biomarqueurs de la qualité des eaux estuariennes. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à des poissons vivants et qu'il n'a "pas d'autre alternative".

Objectifs

Le projet présenté vise à évaluer l’impact d’un mélange de pesticides sur le flet un poisson plat communément trouvé dans les estuaires. Le poisson sera exposé pendant un mois à des doses sublétales de pesticides reflétant les concentrations classiquement retrouvées dans un estuaire dont le bassin-versant est soumis à une forte pression agricole. La procédure expérimentale développée, incluant deux niveaux d’exposition et un groupe témoin non exposé, permettra d’isoler les effets des pesticides des différents stress naturellement subis par le poisson dans la nature. L’objectif est d’identifier les modifications métaboliques du flet en réponse à cette exposition aux pesticides. Les résultats obtenus permettront de valider des biomarqueurs dont la dérégulation, chez des poissons prélevés dans la nature, est le signe de la présence de pesticides. Ce projet permettra donc, à terme, d’améliorer les procédures d’évaluation de la qualité des eaux estuariennes.

Bénéfices attendus

La procédure expérimentale proposée permettra de décrypter les mécanismes moléculaires de la réponse, et les réorientations métaboliques mises en place par les poissons face à une contamination à des pesticides, à des concentrations classiquement observées dans des estuaires présentant des bassins versants dominés par les activités agricoles. La connaissance fine de ces mécanismes permettra de mieux comprendre les impacts des pesticides sur les espèces vivant en estuaire, mais également de développer de nouveaux biomarqueurs qui, caractérisés dans des poissons prélevés in natura, permettront d'augmenter l'efficacité des procédures d’évaluation environnementales applicables à ces écosystèmes qui revêtent une importance sociétale, écologique et économique considérable.

Procédures

Les nuisances prévues au cours de cette procédure expérimentale sont : - une session de pêche électrique (narcose légère) de 2-3 heures pour capturer les poissons en milieu naturel, - le transport jusqu’au laboratoire (1h30 maximum) dans des bacs de 150L, - les biométries effectuées en début d’expérience sur les individus sédatés et anesthésiés (1h en tout), - l’exposition par balnéation d’un mois à 2 concentrations de mélange de pesticides, une faible et une forte. Les poissons seront placés dans des bacs de 20L d’eau de mer, avec un renouvèlement de l’eau et des pesticides tous les 2 jours pour la moitié du volume d’eau, soit 10L.

Impact sur les animaux

Les juvéniles de flets subiront un choc électrique afin de permettre leur capture en milieu naturel. Il s’agit d’une narcose légère, de faible intensité pendant une dizaine de seconde, qui permet d’attraper les poissons avec un haveneau sans causer de stress majeur chez les individus. De plus, les poissons subiront un léger stress lors de leur transport jusqu'au site expérimental, mais cela ne durera qu’au maximum 1h30. Enfin, les poissons seront soumis à un léger stress pendant 1 mois, dû à la contamination aux pesticides.

Devenir

A la fin de l’exposition aux pesticides, l’ensemble des poissons de la procédure (contaminés et témoins) seront mis à mort afin de prélever les organes nécessaires aux analyses pour mener à bien la présente étude.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’étudier les dérégulations métaboliques des poissons exposés à un mélange de pesticides qui s’approche des conditions naturelles. L’organe ciblé pour approfondir les réponses moléculaires du poisson par une approche de protéomique est le foie. Il est donc indispensable d’avoir recours à des animaux vivants, les poissons ne pouvant être remplacés par un modèle informatique, des invertébrés ou un tissu isolé. Par ailleurs cette procédure expérimentale au laboratoire sur poissons doit nous permettre d'affiner nos interprétations sur la réponse du poisson in natura aux stress environnementaux; nous n'avons donc pas d'autre alternative.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d’animaux prévu pour ce projet, le nombre de poissons utilisés et mis à mort pour cette procédure expérimentale est de 15 poissons par bacs, pour 9 bacs de 20L, soit 135 individus. Ainsi, la densité de poissons par bassin d’élevage sera inférieure à 10kg/m3 ce qui n’est pas considéré comme une densité génératrice de stress. De plus, cela correspond au minimum nécessaire à la robustesse des tests statistiques qui seront utilisés pour comparer les différentes conditions expérimentales et pour limiter la variabilité individuelle. En outre, le prélèvement en milieu naturel de 135 poissons constitue un nombre relativement faible d’individus, ce qui n’aura aucun impact sur la démographie de la population naturelle de flets de l’estuaire où seront échantillonnés les poissons.

Raffinement

Avant le début de la procédure, les flets seront maintenus une semaine dans des grands bacs de 300L pour acclimatation et traitements antibiotiques, si nécessaire. Les poissons seront ensuite placés dans les bacs expérimentaux de 20L, par lot de 15, pendant 1 semaine avant de lancer la procédure dans lesdits bacs. Ces bacs sont partiellement opaques et sont oxygénés en continu grâce à des pompes à air. Les poissons seront par la suite exposés aux pesticides par balnéation en introduisant directement les pesticides dans les bacs, à partir d’une solution mère liquide. Une surveillance quotidienne de l’état de santé sera également mise en place lors de l’expérience. Elle aura lieu le matin, lors du nourrissage des poissons, et en fin de journée. Les flets présentent des marqueurs de stress tels que le changement de couleur ou une altération du comportement pour la prise de nourriture, pouvant être utilisés comme points limites. Ainsi, si un individu présente de couleur sombre et des difficultés de nage, reste plaqué au fond du bac et ne s’alimente pas pendant 3 jours consécutifs, il sera considéré en état de souffrance, et de facto sorti du protocole expérimental et mis à mort. Cette décision sera prise en concertation avec le responsable du projet et la responsable(s) du bien-être des animaux. Une feuille de suivi des poissons sera complétée quotidiennement tout au long de la procédure. Cette fiche comportera un suivi des paramètres physico-chimiques (température, concentration en oxygène, pH, salinité) ainsi que l’état des poissons (problèmes de nage, position dans la colonne d’eau, prise alimentaire, changement de couleur, perte d’écaille, état des nageoires, lésions cutanées et parasites). Le nombre de poissons morts, moribonds, prélevés et restant dans les bacs d’exposition sera également relevé. Enfin, afin de limiter le plus possible le stress des poissons lors des manipulations, ils seront sédatés et anesthésiés un bac opaque avec couvercle prévu à cet effet et manipulés sur un linge humide pour protéger les écailles et la peau.

Choix des espèces

Le flet a été choisi pour cette procédure expérimentale car cette démarche s’intègre au sein d’un projet visant à optimiser des méthodes d’évaluation de la qualité des eaux estuariennes Le flet est une espèce sentinelle de la qualité des eaux estuariennes, particulièrement étudiée à l’échelle de l’Europe ; cette espèce est présente en abondance dans les estuaires de la côte Atlantique. Le flet est considéré comme un très bon enregistreur de son environnement, en milieu naturel comme au laboratoire.

804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur cérébrale leur est implantée, suivie d'une irradiation cérébrale fractionnée de 20 Gy, de gavages, d'injections et de prélèvements sanguins répétés, puis d'imageries sous anesthésie avant la mise à mort par perfusion intracardiaque. Le projet compare protonthérapie et rayons X combinés à l'immunothérapie, l'adaptation clinique restant annoncée au conditionnel. Le porteur affirme que ces expériences sont "absolument nécessaires" et qu'"on ne peut pas utiliser d'espèces moins évoluées que la souris".

Objectifs

La radiothérapie (RT) fait partie des traitements les plus utilisés chez les patients atteints de cancer. A l’heure actuelle, en France, 60% des patients diagnostiqués pour un cancer sont traités par RT. Pour les tumeurs cérébrales, tels que les gliomes, la RT fait partie du traitement standardisé. Nous avons précédement montré que l’irradiation aux RX pouvait modifier l’inflammation des tumeurs cérébrales, notamment en augmentant la proportion de macrophages pro-tumoraux. D’autres études ont montré l’impact de l’irradiation cérébrale sur la lymphopénie (diminution des lymphocytes sanguins). Contrairement à la RT conventionnelle qui utilise des photons de basse énergie (rayons X et γ), la protonthérapie utilise des particules chargées plus lourdes et de haute énergie. Parce qu’elle peut déposer de façon précise des doses d’irradiation dans le tissu, la protonthérapie peut être utilisée pour : i) limiter les risques de radiotoxicité en réduisant l’exposition du tissu sain, et ii) augmenter la dose déposée à la cible pour accroître la probabilité du contrôle tumoral tout en maintenant les doses pour le tissu sain environnant sous la limite du seuil de tolérance. Le premier objectif est d’appréhender si au-delà des avantages balistique/dosimétrique/radiobiologique, la protonthérapie pourrait présenter des avantages par rapport aux RX en termes d’inflammation anti-tumorale dans le cas d’une irradiation cérébrale. Le second objectif est de déterminer si la combinaison de la protonthérapie et de l’immunothérapie serait bénéfique pour le traitement des tumeurs cérébrales.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’améliorer les connaissances scientifiques sur les effets de la protonthérapie sur l’inflammation. De plus, cela permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant la protonthérapie et l’immunothérapie (dont les tumeurs cérébrales sont très résistantes). Le projet scientifique global présente également une partie clinique dont le CPP a été accepté en décembre 2021. Les résultats du projet ci présent pourront ainsi être comparés aux données cliniques. Ainsi, l’ensemble de ces résultats pourra rapidement être adapté à la clinique dans le but d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de tumeurs cérébrales. Plus généralement, ce projet permettra d’appréhender en détail les relations entre la protonthérapie et les immunothérapies.

Procédures

Les animaux subiront plusieurs types d’interventions (irradiations, prélèvements sanguins, …). -Implantation de cellules tumorales : Les souris sont induites à l’anesthésie et vont subir cette procédure une seule fois qui dure environ 15min. - L'irradiation cérébrale est réalisée après anesthésie des animaux. Les animaux sont anesthésiés et lors de l’irradiation cérébrale par RX ou protons, une dose totale de 20Gy sera délivrée de manière fractionnée comme en clinique : 2.5Gy/séance avec deux séances par jour (espacées de 6h) sur 4 jours consécutifs. Les souris vont subir cette procédure une fois qui dure environ 5 min. - Prélèvements sanguins sous-mandibulaires seront réalisés sur souris vigiles. Les souris vont subir cette procédure 6 fois, une fois par semaine qui dure environ 20 sec. -Administration par gavage sera réalisée sur souris vigiles. Les souris vont subir cette procédure tous les jours pendant deux semaines qui dure 10 secondes. -L’administration par injection ip sera réalisée sur souris vigile. Les souris vont subir cette procédure tous les 2-3 jours pendant un mois maximum qui dure environ 10sec. - Imagerie par IRM/TEP, les animaux sont anesthésiés et vont subir des IRM qui dure environ 15 min et les souris vont subir des TEP Fludarabine qui dure environ 20 min. -Mise à mort par perfusion intracardiaque. Après une injection de buprénorphine 15 min avant la procédure, les animaux seront profondément anésthésiés et maintenus pendant la chirurgie.

Impact sur les animaux

-Li'rradiation par elle-même n’induit pas de douleurs, les points limites pendant la procédure d’irradiation vont correspondre à une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations/min. - Les répétitions bijournalières et ce sur 4 jours consécutifs peuvent induire une perte de poids des animaux jusqu’à 10 jours après irradiation. Le poids de chaque animal sera mesuré avant, pendant et 15 jours après irradiation et si une perte de poids >10% est observée, la procédure sera arrêtée. Le prélèvement sanguin ou l’injection de traitements journalier et hebdomadaire en eux-même ne provoquent pas de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. - Les séances d’imageries (TEP et IRM) en elles-même n’induisent pas de douleurs, les points limites vont correspondre à une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations/min. Si tel est le cas, le pourcentage d’isoflurane sera légèrement diminué et si cette fréquence de réaugmente pas, la procédure sera arrêtée. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale peut induire des douleurs.

Devenir

En fin de protocole, les animaux seront mis à mort. Les organes seron ensuite prélevés pour réaliser à postériori des marquages immunohistologiques sur coupes de 20µm d'épaisseur. Les marquages permettront de suivre la quantité de macrophages et leur état d'activation ainsi que la quantité de cellules lymphocytaires et myéloides. Concernant la cytométrie en flux, elle nous permet de quantifier l'ensemble des cellules circulantes lymphoides (LT / LB / NK + les sous populations LT H; LT M; LT Reg ) et myéloides (Cellules dendritiques / monocytes / Myeloid derived Suppressor cells)

Remplacement

L’évolution du système immunitaire et ce en lien avec la circulation sanguine cérébrale après un traitement ainsi que la formation et l’évolution de l’inflammation tumorale ne peuvent pas être évaluées in vitro. Les expériences in vivo sont absolument nécessaires pour étudier l’impact d’un traitement et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient être transposées à la clinique, on ne peut pas utiliser d’espèces moins évoluées que la souris. La souris présente un système immunitaire similaire à l’homme et nous disposons d’un modèle in vivo de tumeur cérébrale bien maitrisé dans le laboratoire qui récapitule plusieurs caractéristiques retrouvées chez les patients.

Réduction

Afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour les analyses de cytométrie en flux, il sera nécessaire d’utiliser 10 animaux par groupes et ceci en prenant en compte la variabilité inter-individuelle basée sur notre expérience antérieure et de nos expériences antérieures. Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, à chaque fin de protocole, les tissus (cerveaux, rates et ganglions lymphatiques) seront prélevés pour des études histologiques. Pour les analyses d’imagerie et d’histologie à court terme, basé sur notre expérience antérieure, 6 animaux par groupe sera suffisant. L’imagerie nous permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en évitant des euthanasies à tous temps. Des tests statistiques adéquats seront utilisés.

Raffinement

Si chute de la respiration pendant l'irradiation : Si tel est le cas, le pourcentage d’isoflurane sera légèrement diminué et si cette fréquence ne réaugmente pas, la procédure sera arrêtée. Les animaux sont surveillés tous les jours pendant toute la durée du protocole, week-end compris. Le poids des souris est suivi tous les 2-3 jours avant, pendant et deux semaines après l’irradiation. Si perte de poids dues aux protocoles d'irradiation: Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement. Pour limiter cela, les souris disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire (DietGel Recovery) Pour le modèle de tumeur cérébrale, la procédure chirurgicale est détaillée en 4.2. Après la chirurgie, les animaux sont surveillés tous les jours pendant le protocol, week-end compris. Les souris sont hébergées dans des cages avec 5 souris/cage dans un environnement enrichi (roues/cartons). L'état général des animaux est utilisé comme reflet de son bien-être et des points spécifiques comme le poids ou une respiration anormale sont utilisés comme point limite. Pour toutes les procédures le nécessitant, une anesthésie générale volatile et une analgésie locale et générale sont appliquées.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux in vivo sont indispensables pour récapituler au mieux l’environnement inflammatoire des tumeurs qui se développent chez les patients. Nous utiliserons des souris immunocompétantes C57/Bl6 car ces souris présentent toutes les populations de cellules immunitaires et parce que le modèle de tumeur cérébral utilisé repose sur l’implantation de cellules de gliome GL261, cellules issues de souris femelles C57/Bl6, afin d’éviter toute inflammation abérante due au rejet de « greffe » par la souche de souris utilisée. De plus, pour cette espèce et pour les cellules étudiées, tous les outils de caractérisation en cytométrie en flux sont déjà validés dans la littérature et dans notre laboratoire. Animaux agés de 7 semaines. Ce stade correspond à de jeunes adultes et est parfaitement adapté en termes de physiologie aux pathologies ciblées. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expériementaux utilisés.