Procédures modérées

13 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules ou de fragments tumoraux en sous-cutané, puis des administrations répétées de substances, pour tester l'efficacité d'anticancéreux pour le compte de clients industriels ou de laboratoires. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer perte de poids, hypothermie, épanchement abdominal et difficultés respiratoires. Il décrit une activité de prestation commerciale et affirme que ce modèle ne peut "pas être remplacé" par des méthodes in vitro.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé publique majeure et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles animaux de cancer humain et murin demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments et la compréhension des mécanismes de résistance. Le modèle d’injection de cellules en sous-cutané, dit hétérotopique, permet d’examiner de larges cohortes de tumeurs dont la croissance et la réponse aux médicaments peuvent facilement être évaluées grâce à un suivi cinétique de la croissance tumorale par des mesures au pied à coulisse. Bien que la greffe de cellules ou de tissu cancéreux n’est pas réalisée dans l’organe d’origine dont est issue la tumeur, ce type de modèle a pu montrer un caractère prédictif satisfaisant afin d’identifier des molécules à activité thérapeutique pour la clinique humaine, qui en fait un modèle standard de la recherche en oncologie. La procédure décrite dans ce projet correspond à la création de différents modèles de tumeurs chez le rongeur (souris ou rat). L’objectif est d’administrer des cellules tumorales issues de différents types de tumeurs et de mesurer différents critères (taille de la tumeur, survie...) afin d’évaluer l'efficacité ou la toxicité de molécules aux propriétés anticancéreuses décrites ou potentielles. La création de ce type de modèle dans ce projet ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Bénéfices attendus

Le projet consistera à développer des modèles de tumeur chez le rongeur pour les différentes indications en oncologie, qui permettra de tester l'efficacité d'anticancéreux pour des clients du secteur industriel privé ou des laboratoires de recherche publique ou dans un contexte de recherche interne. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux pour des procédures de test dans un autre laboratoire dans le cas de collaboration. Dans ces buts, la procédure consistera à injecter des lignées cellulaires humaines (xénogreffes) ou murines (allogreffes), des cellules primaires obtenues à partir biopsies de patients ou d’explants tissulaires en sous cutané chez des animaux immunocompétents (souris ou rats), immunodéprimés (souris ou rats), transgéniques ou humanisés dépendant du modèle. Un suivi de la croissance du volume tumoral sera réalisé avec un pied à coulisse ou d’autres modalités d’imagerie par bioluminescence ou fluorescence (utilisant des cellules reportrices adaptées à ce type de modalité) mais aussi par rayons X ou échographie. De plus, le poids et l'état général des animaux seront suivis au cours du temps. Cependant les modèles de mélanome, aussi injectés en sous cutanés, ne seront pas considérés dans ce projet car induisent la formation de métastases agressives. Les animaux présentant une immunodéficience nécessitant un cloisonnement ou certains animaux transgéniques seront hébergés en condition Biosafety level 2 (BSL2) afin de maintenir leur statut Specific and Opportunistic Pathogen Free (SOPF) et éviter toutes contaminations chez ces animaux plus sensibles.

Procédures

Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 à 10 min pendant laquelle ils seront tatoués dans la pulpe de leurs doigts en utilisant une aiguille imbibée d’encre de tatouage pour animaux. Toujours sous anesthésie, les animaux subiront une injection rapide (

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables inhérents au développement tumoral pourront apparaître pendant une étude. - Une perte de poids corporel - Un comportement amorphe marqué pendant les périodes de vigilance. - Une hypothermie persistante - Une distension anormale de l’abdomen pouvant être le signe d’un épanchement - Des problèmes de respiration pour l’animal - Une incapacité de se nourrir ou boire L’ensemble de ces symptômes sera monitoré pendant l’étude afin d’appliquer des mesures pouvant amener à l'euthanasie de l’animal avant la fin de l’étude pour raison éthique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs et ne permettent pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.

Réduction

Des analyses in-vitro pourront être réaliser en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, …), permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères.... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclue une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie si nécessaire.

Choix des espèces

Les tumeurs présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale, une prolifération et des métastases des cellules. Des études de ces aberrations et la compréhension de leur contribution à la physiopathologie du cancer sont nécessaires pour améliorer le diagnostic et la thérapie. Aujourd’hui encore, les rongeurs rats et souris demeurent essentiel à étudier les tumeurs in vivo et à comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. Tous les animaux utilisés seront utilisés à partir de 5 semaines développement que ce soit des rats ou des souris.

Une souris dont le score de souffrance atteint 21 est mise à mort, tout comme celle qui reste entre 14 et 20 sans évolution 24 heures après la prise en charge de sa douleur. 200 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post mortem. Un vecteur viral injecté dans un muscle de la patte y supprime une protéine, et la contraction de ce muscle diminue puis disparaît, ce qui affecte la mobilité de la souris. Selon les groupes, les souris reçoivent ensuite un peptide dans la veine sous anesthésie, ou dans le ventre sous contention, puis une petite chirurgie sous anesthésie expose le muscle EDL pour mesurer sa contraction, et elles sont tuées sans réveil. Le porteur présente ce travail comme la "première preuve de concept" de ce peptide, une démonstration qui, selon lui, "ouvrirait la possibilité" de l'utiliser dans différentes maladies.

Objectifs

La contraction des muscles squelettiques nécessite une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium qui est contrôlée par l’interaction de deux protéines, A et B. L’interaction de ces deux protéines permet le déclenchement de la contraction musculaire et le dérèglement de cette interaction entraine des troubles graves de la contraction musculaire. L’objectif de ce projet est de tester la capacité d’un peptide d’intérêt à restaurer la contraction lorsque l’interaction entre ces deux protéines est perturbée par l’absence de l’une d’entre elles. L’absence dans tous les muscles de l’une ou l’autre de ces deux protéines entrainant la mort de l’animal, nous supprimerons l’expression de la protéine A dans un seul muscle de la patte. Une fois constatée une diminution significative de la contraction de ce muscle nous injecterons le peptide d’intérêt dans le muscle et observerons le retour de la contraction. Cette étude permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes qui commande le couplage excitation-contraction du muscle squelettique. Différentes myopathies humaines ont pour origine un dérèglement des mécanismes de contrôle du déclenchement de la contraction. La caractérisation de molécules permettant de contrôler les différentes étapes de ce processus revêt donc une importance majeure non seulement au niveau fondamental mais également dans la mise au point de traitement de ces pathologies. Cette étude représente la première preuve de concept de l’utilisation « in vivo » de peptides capables de moduler au niveau intracellulaire les acteurs du déclenchement de la contraction.

Bénéfices attendus

Bénéfices attendus du projet. Ce projet devrait permettre : 1) De démontrer in vivo la capacité du peptide d’intérêt à rétablir le couplage entre l’excitation et la contraction des cellules musculaire squelettiques lorsque la protéine située à la surface de la cellule fait défaut. 2) D’établir la preuve de concept que le peptide d’intérêt est capable in vivo d’interagir avec sa cible et d’en contrôler l’activité. Cette démonstration ouvrirait la possibilité d’utiliser ce peptide dans différentes situations pathologiques causées par une déstabilisation de l’interaction entre les protéines A et B (RYR1 et CACNA1S).

Procédures

Les souris recevront une injection unique dans le muscle tibial crânial avec 30 µl de PBS ou d’un vecteur viral de type AAV (Adeno Associated Virus). La durée totale d’intervention est d’environ 10 mn. Selon les groupes, les souris recevront une injection unique du peptide soit en Intra Veineuse, qui sera réalisée au niveau de la veine caudale sous anesthésie gazeuse (environ 5 mn) soit en IP qui sera réalisée sous contention en moins d’une minute. Pour les mesures de contraction du muscle, les animaux seront anesthésiés. Après une petite chirurgie pour atteindre le muscle squelettique EDL, celui-ci sera soumis à un protocole de contraction musculaire afin d'évaluer les propriétés contractiles de ce muscle d'intérêt. À la fin de ces mesures et afin de réaliser des analyses post mortem, les animaux seront immédiatement mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour les injections en intramusculaire (IM) et en intraveineuse (IV), les souris seront sous anesthésie gazeuse. Une légère douleur au point de ponction pourrait être ressenti après le réveil. L’injection en intra péritonéale (IP) sera réalisée sur animaux vigiles. Elle engendre une légère douleur au moment de la piqure. Une fois le muscle tibial crânial injecté avec le vecteur, les animaux subiront de façon progressive une diminution puis la disparition de la contraction de ce muscle. La mobilité en sera donc affectée, et cela, dans un temps qui sera défini lors de la Phase 1 du projet. C’est sur la base de cette nuisance que le choix d’injecté qu’un seul membre a été décidé. Pour les mesures contractiles du muscle, les animaux seront anesthésiés puis mis à mort (acte expérimental sans réveil).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post mortem.

Remplacement

La capacité du peptide d’intérêt à rétablir la contraction du muscle a été testé sur des cellules musculaires en culture. Cependant les modèles cellulaires ne permettent pas d’obtenir des cellules musculaires totalement matures et donc d’approcher la complexité des interactions entre protéines en place dans la cellule musculaire adulte. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres physiologiques de la contraction musculaire et l’effet du peptide d’intérêt sur ces différents paramètres.

Réduction

Dans le contexte de cette étude, et en se basant sur notre expérience des données d’expression après injection d’un vecteur AAV dans le muscle chez la souris, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum. Ainsi, un maximum de 200 souris réparties sur 3 phases sera utilisé afin d’avoir suffisamment de données pour déterminer dans un premier temps, la fenêtre d’injection possible du peptide, dans un second temps la voie d’administration et le temps de pénétration dans le muscle de ce peptide et dans un dernier temps, son efficacité ou non, in vivo. Selon les paramètres analysés, des tests statistiques de type non paramétriques (Mann & Whitney) pourront être utilisés pour comparer les souris traitées et non traitées.

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.) En cas d’observation d’un mal être de la part de l’animal, un examen clinique sera réalisé à l’aide d’une grille de score afin d’évaluer le degré de souffrance de l’animal. Ainsi, sera observé l’aspect physique global (poil, morphologie général, pertes de poids), l’aspect physique du facies (Paupières, Aspect des larmes, colorations des muqueuses/oreilles), l’aspect comportemental (agressivité, comportement, activité) et la respiration. Pour ce projet, l’observation se portera également sur les capacités motrices de l’animal ainsi que sa capacité à pouvoir se nourrir. Cette grille d’évaluation décisionnaire est générique et mis à disposition par notre SBEA. Selon le score enregistré, certaines actions seront mises en place selon le schéma suivant : score de 0, aucune action ; de 1 à 6, signes cliniques légers, réflexion sur l’environnement (milieu, social). Si un animal présente 3 signes associés, utilisation d'AINS ou analgésique faible ou anesthésique local ou opioïdes dose faible; de 7 à 13, signes cliniques modérés, utilisation d’opioïdes dose faible à moyenne, réflexion sur l’environnement (milieu, social…) et observation régulière (min 1f/j) ; de 14-20 signes cliniques sévère, observation (min 2f/j) et utilisation d’opioïde de dose moyenne à forte, s’il n’y a pas d’évolution dans les 24h malgré la prise en charge de la douleur, alors l’animal sera euthanasié ; ≥ 21, euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire. En effets, les modèles « in vitro » ne peuvent reproduire la complexité du mécanisme qui commande le couplage excitation-contraction du muscle squelettique. Les vecteurs AAV sont fréquemment utilisés avec succès chez la souris. Ainsi nous allons utiliser ce modèle afin de pouvoir mimer grâce au vecteur AAV le dérèglement du couplage excitation-contraction et faire preuve de concept de la capacité d’un peptide à rétablir le déclenchement de la contraction « in vivo ». Afin de pouvoir réaliser notre étude sur des muscles tibiaux et EDL homogènes et de tailles adultes, des souris adultes d’environ 14 semaines seront utilisées.

12 porcs Landrace d'environ 28 kg vont être utilisés, et chacun subit en quatorze jours trois anesthésies générales, une laparotomie avec création de stomies sur l'intestin, sept prises de sang, trois IRM, trois biopsies et la pose d'un dispositif médical changé toutes les 72 heures sous sédation. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et tous les porcs sont tués à J14, après la dernière IRM. Le porteur écrit que chaque porc "sera nutritionnellement affaibli par la mise en stomie puis bénéficiera de notre dispositif", ce qui fait de lui son propre témoin. Le but est de lever "les derniers risques" d'un appareil de réinstillation du chyme destiné aux patients porteurs d'une double entérostomie, avant une demande d'essai clinique puis la mise sur le marché.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la sécurité et l’efficacité d’un nouveau dispositif médical intestinal. Cette étude sur le gros animal permettra de lever les derniers risques liés au dispositif et de confirmer son fonctionnement en conditions physiologiques. Les performances de l’appareil seront objectivées par l’évaluation des bénéfices nutritionnels et l’étude de la morphologie intestinale. Les conclusions de cet essai permettront également d’optimiser l’appareil afin de proposer aux patients un produit fini, sécurisé et adapté à leurs besoins.

Bénéfices attendus

Cet essai nous permettra de confirmer les bénéfices nutritionnels de la réinstillation sur un gros animal. Des données microscopiques (Biopsies intestinales) et macroscopiques (poids, selles, prise de sang) seront collectées afin d'observer le changement morphologique de la muqueuse intestinale et l'évolution d'état nutritionnel de l'animal. Nous confirmerons que l'hypothèse de la réinstillation est efficace pour corriger l'insuffisance intestinale en augmentant la capacité d'absorption intestinale. Cet essai sera également une opportunité de confirmer la tenue du dispositif médical en conditions physiologiques ainsi que ses performances.

Procédures

Tous les animaux subiront : - 3 anesthésies générales (J0, J7, J14) - La pose d’un cathéter lors du premier bloc opératoire (J0) - Prélèvements sanguins (7 prélèvements : J0, J2, J4, J7, J10, J12, J14) - 1 laparotomie avec mise en stomie et création d’une jéjunostomie d’alimentation (J0) qui resteront en place pendant tout l’essai -1 radiographie d’opacification (J7) -Pose du DM sous anesthésie générale (J7) et changement sous sédation -3 IRM (J0, J7, J14) -3 biopsies, pendant l'opération sous Anasthésie Genérale (J0, J7, J14)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables correspondent aux points limites nécessitant l’euthanasie de l’animal, c’est-à-dire : L’observation simultanée de 3 points limites, qui persisteraient au-delà des 2 jours suivant l’intervention du vétérinaire ou du chirurgien. La présence d’une blessure OU d’une stomie bouchée, enflammée, gonflée OU un saignement au niveau de la muqueuse OU une température corporelle élevée qui persisterait au-delà des 2 jours suivant l’intervention du vétérinaire ou du chirurgien. Une respiration pénible nécessitant l’euthanasie immédiate de l’animal.

Devenir

Les procédures 1 et 3 seront réalisées dans le même temps opératoire. A l’issu de l’intervention, l’animal sera gardé en vie. La simulation du grêle court d’amont impose de maintenir l’animal en vie tout au long de l’expérience. Les procédures 4 et 5 regroupent la pose du DM et le changement toutes les 72h. L’animal doit rester en vie tout au long de la pose du DM afin d’observer l’évolution des différents paramètres nutritionnels, physiologiques et morphologiques. L’animal sera euthanasié à l’issu de la dernière IRM de masse graisseuse réalisée à J14 avant sacrifice (procédure 2).

Remplacement

Ce nouveau dispositif propose une nouvelle prise en charge thérapeutique qui doit être scrupuleusement validée. La mise à disposition d’une nouvelle technologie impose de rassembler des données pré-cliniques solides en termes de sécurité et de performances, notamment en vue d’une demande d’autorisation d’essai clinique sur l’Homme puis la mise sur marché. Ainsi, il est essentiel de réaliser des essais sur l’animal afin de valider le fonctionnement du dispositif en conditions physiopathologiques.

Réduction

Depuis le début du projet, aucun animal n’a été utilisé. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons réalisé un ensemble de tests sur banc d’essai (mannequin en plastique avec fabrication artisanale d’un système digestif). Aussi l’animal sera son propre témoin. Il sera nutritionnellement affaibli par la mise en stomie puis bénéficiera de notre dispositif. Les résultats obtenus dans les deux situations seront comparés. Cette stratégie nous évitera de construire un groupe témoin et un groupe de test. Enfin, nous reproduirons scrupuleusement les conditions d’un intestin interrompu avec carences nutritionnelles partielles selon un modèle déjà validé et publié par une équipe de chercheurs allemands. La mise en œuvre de ce protocole nous évitera une étape de validation préalable sur un modèle animal.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 11 jours est prévue à l’arrivée du porc afin de réduire le stress de l’animal. En postopératoire, le porc sera extubé dès lors qu’il aura commencé à respirer spontanément. Les étapes chirurgicales seront réalisées sous lampe chauffante. Le porc sera ramené dans la cage lorsque la température corporelle physiologique sera atteinte (39–39.5°C). Les animaux auront un accès immédiat à l’eau et à la nourriture dès le premier jour postopératoire. Une voie veineuse centrale sera conservée en postopératoire à des fins de prélèvements sanguins. Pour éviter d'endommager le cathéter central, les animaux seront gardés dans des cages séparées, dans la même pièce. La voie centrale sera protégée par un pansement pour éviter toute blessure de l’animal. L'ensemble des procédures sera fait par du personnel formé, les animaux traités avec soin (traitement de la douleur lors du suivi, anesthésie) et dans un hébergement répondant à leurs besoins physiologiques (température, cycle de lumière 12h-12h, ...) et éthologiques (enrichissements, dimension des boxes...).

Choix des espèces

Pour une approche de recherche ciblée et spécifique d'un syndrôme de grêle court d'amont, un modèle animal approprié est nécessaire. Nous considérons les avantages et les inconvénients de chaque modèle afin de sélectionner le modèle le plus adapté. A cet effet, à la fois un petit modèle animal, tel que le rat, ou un grand modèle animal, tel que le porc, conviendraient. Nous considérons également la taille de notre dispositif. Les porcs ont de nombreuses similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains. Le modèle porcin constitue le modèle expérimental le plus approprié pour la recherche sur le syndrôme du grêle court d'amont et utile pour tester l’efficacité et la sécurité de ce dispositif destiné à l’utilisation humaine. Ainsi, des porcs Landrace pédiatriques pesant environ 28-29 kg seront utilisés pour la réalisation de ce projet.

Capturés dans un cours d'eau salmonicole, 800 truites communes et 400 chabots, soit 1 200 poissons sauvages, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque poisson est mesuré, pesé, puis incisé sur le ventre pour l'implantation d'un transpondeur, et reste entre 30 secondes et une minute hors de l'eau. Tous sont remis à l'eau vivants, pour vérifier si les ouvrages aménagés sur la rivière, dont une passe à poissons, leur permettent de circuler. Le porteur compte jusqu'à 5 à 10 % de truites qui perdent leur transpondeur dans les semaines suivantes et jusqu'à 20 % de femelles qui l'expulsent lors de la fraie, et affirme que "Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale".

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce à la technologie RFID (Radio Frequency Identification) la franchissabilité des ouvrages et des aménagements réalisés pour rétablir la continuité écologique dans un cours d'eau salmonicole. Dans cette rivière, de nombreuses actions de restauration de la continuité écologique ont été réalisées sur un secteur long de 6.7 km, sur lequel 8 seuils ont être arrasés ou modifiés pour faciliter la mobilité piscicole mais aussi sédimentaire. En 2022, le dernier des seuils de ce secteur a été aménagé pour permettre aux poissons de franchir un obstacle considéré jusqu’ici comme infranchissable (création d’une rivière de contournement). Dans la suite des efforts réalisés par le syndicat gestionnaire pour améliorer la continuité écologique sur ce secteur dit « renaturé », une étude écologique pluriannuelle, par la technologie RIFD devra confirmer que la mobilité piscicole et sédimentaire y est à nouveau assurée. Cette étude devrait aussi permettre d’identifier les zones de déplacements des poissons en tenant compte des contraintes physiques et morphologiques du milieu (thermie, disponibilité en habitat).

Bénéfices attendus

Les projets permettront de mettre en lumière la « transparence » des ouvrages à la migration des espèces cibles, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1'200 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval des ouvrages étudiés. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l'ouvrage. Ils ont été adaptés au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 80mm ; 23 mm au-dessus. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par E. Meunier, vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible principale est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. En complément, une petite espèce d’accompagnement de la truite, le chabot (Cottus gobio), sera également intégrée dans le suivi en raison de son abondance sur certains secteurs et de sa faible capacité de nage. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués à l’aide de PIT tags 23 mm. Pour les chabots, les stades sub-adultes et adultes seront visés, avec une longueur minimale de 80 mm. Ces individus seront marqués par PIT tag de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent une injection intracérébrale de vecteurs viraux ou la pose chirurgicale d'un implant dans le cerveau, suivies de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, pour étudier le rôle de la dopamine dans la peur et l'anxiété. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent provoquer une perte de poids, un détachement de l'implant ou des troubles du comportement. Il affirme que la souris est le "seul organisme modèle" permettant ce type d'étude, d'éventuelles approches thérapeutiques restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Le cerveau possède des systèmes dits de récompense qui évaluent les effets bénéfiques de certaines actions et facilitent leur apprentissage. Ils attribuent ainsi une valeur plus ou moins grande à des signaux annonçant une « récompense » et règlent leur valeur motivationnelle. Symétriquement des valeurs motivationnelles sont attribuées à des signaux prédictifs de situations « menaçantes ». Les neurones produisant la dopamine jouent un rôle important dans ces phénomènes et la libération de dopamine module la force de la valeur motivationnelle. Le dérèglement de ces systèmes intervient dans l’addiction aux drogues (valeur motivationnelle excessive) ou dans les troubles anxieux généralisés (valeur « menaçante » excessive). De multiples facteurs participent au contrôle de la libération de dopamine. Parmi eux, les récepteurs de la dopamine appelés autorécepteurs D2 exercent un rétrocontrôle négatif empêchant ainsi une libération excessive de dopamine. Une faible expression de ces récepteurs est un facteur de risque d’addiction chez les humains. Dans ce projet, nous émettons l’hypothèse que le même type d’anomalie favorise l’apparition de troubles anxieux en exacerbant la valeur motivationnelle attribuée à certains signaux prédisant une situation « menaçante ». Nous testerons cette hypothèse en manipulant sélectivement les autoD2R au sein de populations de neurones dopaminergiques spécifiques. Nous utiliserons une combinaison d’approches allant de la génétique moléculaire à la mesure de l’activité des neurones, le tout couplé à des études comportementales.

Bénéfices attendus

Cette étude s’inscrit dans le cadre d’une meilleure compréhension des circuits neuronaux contrôlant les réponses émotionnelles associées à des stimuli aversifs (réponse de peur). Les résultats de ce projet permettront de préciser certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l’apparition de troubles anxieux observés dans différentes affections psychiatriques et à terme de proposer des approches thérapeutiques innovantes

Procédures

600 animaux subiront une injection dans la cavité abdominale pour induire des mutations de nos gènes d’intérêts (durée : >1min). 2100 animaux auront une chirurgie pour injecter dans des régions précises du cerveau des vecteurs (virus recombinant non pathogène) pour induire des mutations spécifiques de certains neurones (Durée >45min). 1200 animaux subiront une chirurgie pour poser un implant (fibre photométrique) pour révéler l’activité de certains neurones dans le cerveau (Durée >45min). Tous les animaux auront des tests de comportement.

Impact sur les animaux

La procédure prévoit des injections stéréotaxique. Ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques (voir annexe). D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

La réalisation de notre projet repose sur l'utilisation de nombreuses lignées transgéniques exprimant la protéine fluorescente GFP et l'enzyme Cre recombinase nous permettant ainsi d'identifier les neurones et d'invalider par recombinason homologue (système Cre/Lox) notre protéine d'intérêt. La souris est le seul organisme modèle permettant ce genre d'étude. L'utilisation d'animaux demeure donc la seule option à ce jour pour évaluer avec précision et pertinence les liens de causalité entre l'identité moléculaire et cellulaire des neurones dopaminergiques et le controle des réponses émotionnelles dans notre projet de recherche.

Réduction

Ce nombre a été déterminé de manière à reduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Sample size determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité : p=0.05). Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Dans le but d'une exploitation maximale des données obtenues, plusieurs régions cérébrales seront systématiquement analysées.

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies sont faites avec des anesthésiques et analgésiques adaptés. Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.

Choix des espèces

L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles pour l'évaluation du rôle des recepteurs D2R , au cœur de notre projet. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Les animaux seront utilisésentre 3 et 8 mois ce qui permettra de travailler sur une système cérébral stable, mature, qui n'évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs semaines.

300 truites sauvages vont être capturées et relâchées après marquage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après anesthésie, chaque poisson reçoit un transpondeur implanté par incision ventrale, avec un maintien hors de l'eau de trente secondes à une minute, pour évaluer le franchissement d'une passe à poissons récemment aménagée. Le porteur indique que la capture et le marquage induisent un stress et décrit une cicatrisation qu'il juge généralement bonne. Il affirme que cette étude comportementale ne peut se faire que sur des individus vivants relâchés dans leur milieu naturel.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce à la technologie RFID (Radio Frequency Identification) la franchissabilité par les poissons d’un ouvrage de franchissement (passe à poissons) récemment réalisé pour rétablir la continuité écologique dans un cours d'eau jurassien. Un seuil constituait un obstacle à la montaison des truites au niveau de la tête du bassin versant, connu pour proposer historiquement des habitats piscicoles de qualité. Le gestionnaire local a décidé d’équiper ce seuil d’une passe à ralentisseurs plans afin de rétablir la montaison des truites et autres espèces accompagnatrices. En 2022, cette passe a été réalisée et doit maintenant faire l’objet d’une étude de franchissabilité piscicole par RFID.

Bénéfices attendus

Les projets permettront de mettre en lumière la « transparence » de l’ouvrage à la migration des truites, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à cette espèce de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 300 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire de l’espèce considérée, dans le cas présent la truite de rivière. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval de l’ouvrage étudié. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 120 mm à l’aide de tags de 23 mm). Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par E. Meunier, vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués, à l’aide de PIT tags 23 mm. Cette taille minimale assure un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

2 000 poissons sauvages, truites, chabots et blageons, vont être capturés et relâchés après marquage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après anesthésie, 1 950 individus reçoivent un transpondeur implanté par incision ventrale et 50 truites une seconde incision de deux centimètres pour un émetteur radio suturé, afin d'évaluer le franchissement de deux passes à poissons. Le porteur indique que la capture et le marquage induisent un stress et évoque une mortalité post-opératoire qu'il estime très faible. Il affirme que l'étude comportementale in situ ne peut se faire que sur des individus vivants dans leur milieu naturel.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce aux technologies RFID (Radio Frequency IDentification) et radiotélémétrie, la franchissabilité de 2 aménagements réalisés au niveau de 2 seuils infranchissables (ponts routiers) pour rétablir la continuité écologique un grand cours d'eau alpin. Sur ce cours d'eau, de nombreuses améliorations ont été réalisées ces dernières années, notamment sur la continuité écologique : les deux seuils visés ont été aménagés pour le franchissement piscicole il y a 9 ans. Ces aménagements permettent une circulation (montaison et dévalaison) a priori facilitée qu’il convient de vérifier en combinant deux technologies au regard du gabarit du cours d’eau : la RFID et la radiotélémétrie. La radiotélémétrie est utilisée en complément de la RFID car cette technologie permet d'envoyer un signal à longue portée (100-200m), permettant de travailler dans des grands milieux et de caractériser des comportements / franchissements au niveau de voies de passages qu'on ne peut pas équiper par RFID.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en lumière la « transparence » des deux seuils éuipés de passes à poissons à la migration des espèces cibles, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1'950 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau. Pour 50 individus, un double-marquage sera réalisé et un émetteur radio sera implanté manuellement en plus du PIT tag, impliquant une incision ventrale de 2 cm, qui sera suturée. La procédure durera au total 2 à 3 minutes, pendant lesquelles les individus seront maintenus sous sédation dans un bain d’anesthésiant

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux.

Devenir

Remise à l'eau après marquage

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière, le chabot et le blageon. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval des ouvrages étudiés. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité des ouvrages. Ils ont été adaptés au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Pour la RFID : Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 80mm ; 23 mm au-dessus. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Pour la radiotélémétrie : après anesthésie, les poissons seront placés dans un bac rectangulaire de 10L contenant une concentration plus légère de benzocaïne (30 mg/L) pour maintenir les conditions d’anesthésie sur toute la durée de l’opération. Seule la tête sera maintenue dans l’eau et une canule introduite dans la bouche et reliée à une pompe d’aquarium pour assurer une irrigation permanente des branchies. Un champ stérile sera placé sur l’animal, la zone d’incision sera nettoyée à la vétidine, et un scalpel stérile sera utilisé. L’opérateur portera des gants stériles. Tout le matériel chirurgical sera désinfecté au steranios, ainsi que l’émetteur, puis rincés à l’eau purifiée. La taille de l’émetteur F1170 sera adapté et toujours < 2% du poids de l’animal (Annexe 1). Pour la suture, une aiguille pointe ronde diamant, 3/8 cercle 26mm, sera utilisée avec un fil monofilament résorbable Monosyn en glyconate. La pommade iodée sera ensuite appliquée. Le réveil sera contrôlé dans un bac oxygéné et refroidi, avant transfert dans un vivier placé dans la rivière.

Choix des espèces

L’espèce cible principale est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. En complément, le blageon (Telestes souffia), petit cyprinidé rhéophile, sera étudié car jugé caractéristiques du secteur d’étude. Enfin, une petite espèce d’accompagnement de la truite, le chabot (Cottus gobio), sera également intégrée dans le suivi en raison de son abondance sur certains secteurs et de sa faible capacité de nage et de migration. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués à l’aide de PIT tags 23 mm. 50 truites adultes de plus de 200g, soit environ 25 cm, seront également marquées à l’aide d’un émetteur radio (double marquage). Pour les blageons et chabots, les stades sub-adultes et adultes seront visés, avec une longueur minimale de 80 mm. Ces individus seront marqués par PIT tag de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous anesthésie quatre injections sous-cutanées dorsales, dont une de LPS destinée à déclencher une inflammation, pour évaluer un hydrogel chargé en lipoxine A4. Le porteur indique que le dispositif peut gêner les mouvements des animaux et prévoit une mise à mort par dislocation cervicale afin de prélever la membrane. Il affirme qu'il est "nécessaire" de travailler sur des systèmes biologiques complexes, les applications en dentisterie restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Le contexte clinique du projet est celui de maladies inflammatoires orales (inflammation pulpaire = pulpite et inflammation parodontale = parodontite). Les parodontites et les pulpites sont des maladies respectivement du parodonte (tissu de soutien de la dent) et de l’endodonte (tissu conjonctif situé à l’intérieur de la dent). Ces deux affections sont très fréquentes, génèrent des douleurs, des pertes dentaires, une altération de la qualité de vie et des coûts pour les individus et la société. Dans ces deux situations, des microorganismes sont à l’origine d’une inflammation des tissus conjonctifs constitués par le parodonte et par l’endodonte. Cette réaction inflammatoire est au départ normale et a pour objectif un retour à la normale appelée « homéostasie ». L’homéostasie fait intervenir des médiateurs spécialisés appelés « médiateurs lipidiques pro-résolutifs » tels que les « lipoxines ». Ces dernières ont été étudiées in vitro et in vivo, et ont montré́ une action efficace à différents niveaux de la réponse immunitaire.De plus, les lipoxines ont été étudiées dans différents contexte inflammatoire (maladies auto-immunes, cancers, parodontites...) sur des modèles animaux. Pour répondre à ces besoins, nous avons créé un dispositif (hydrogels) permettant la libération in situ des LXA4. L’objectif du projet est donc d’évaluer le caractère anti-inflammatoire de notre proposition thérapeutique. Pour cela, nous utiliserons le modèle murin de poche d’air sous-cutané (air pouch). Nous induirons la formation d’une cavité en injectant de l’air stérile en sous-cutané au niveau dorsal puis nous procèderons à l’injection de nos hydrogels plus ou moins chargés en LXA4 avant de simuler une inflammation. Ce modèle est pertinent car il permet d’étudier les composants de l'inflammation, la résolution de la réponse inflammatoire, la réponse au stress oxydatif et par conséquent les cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'inflammation.

Bénéfices attendus

Ce modèle nous permettra d’induire une inflammation dans un système global ce qui n’est malheureusement pas possible avec les expérimentations in vitro. Nous pourrons alors évaluer l’effet anti-inflammatoire de nos hydrogels chargés en LXA4. Les médicaments anti-inflammatoires actuellement disponibles, ont pour objectif d'atténuer une inflammation excessive sans compromettre la défense de l'hôte. Les nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des LXA4, qui améliorent la résolution de l’inflammation pourraient avoir un meilleur rapport bénéfice/risque. A court terme ce protocole nous permettra de répondre à plusieurs questions. Tout d’abord, nous pourrons choisir une formulation d’hydrogel, la plus efficace pour favoriser la résolution de l’inflammation. Nous pourrons également valider l’effet de la LXA4 in vivo dans un système complexe et non seulement in vitro sur les macrophages. Notre proposition peut également être avantageuse par rapport à d'autres systèmes d'administration de médicaments (tels que des nanoparticules synthétiques) qui ont des effets toxiques indésirables potentiels. A plus long terme, ce protocole marquera une avancée dans l’élaboration d’un système complexe permettant de relarguer des molécules anti-inflammatoires telles que la LXA4 de manière contrôlée dans le temps. En clinique, l’objectif final sera d’apporter une alternative supérieure en termes de cicatrisation et de régénération des tissus concernés dans le cadre des pulpites et parodontites. Bien que notre perspective se concentre sur le domaine de la dentisterie, l'utilisation de notre proposition thérapeutique pourrait être déployée afin de traiter de multiples maladies inflammatoires et/ou des défauts osseux.

Procédures

Injections sous cutanées sur animaux anesthésiés sous isoflurane : 4 injections / souris (2 injections d’air + 1 injection hydrogel / contrôle + 1 injection LPS). Chaque injection prendra quelques secondes. Les animaux seront observés après chaque injection pour s'assurer de leur bonne santé.

Impact sur les animaux

Ce modèle bien décrit, entrainera une inflammation contrôlée du tissu sous cutané au niveau de la poche dorsale. Ce protocole de classe modérée ne devrait pas conduire à des effets indésirables ou douloureux pour les animaux bien qu’ils peuvent néanmoins entraîner une gêne dans les mouvements et déplacements des animaux. La lipoxine A4 n’est pas un produit irritant (information vérifiée dans la fiche de données de sécurité du produit fourni par Cayman). Nous resterons bien évidemment très attentifs sur tout comportement anormal des animaux de manière à soulager leur douleur si celle-ci venait à apparaître.

Devenir

Mise à mort par dislocation cervicale pour tous les animaux. Les animaux doivent être mis à mort afin de pouvoir récupérer la membrane de la poche créée et ainsi d'effectuer les analyses histologiques post mortem nécessaires à notre projet.

Remplacement

Cette étude prend en compte la règle des 3R. Les expériences in vitro ne permettent malheureusement pas de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs cellulaires (macrophages, neutrophiles, monocytes…) et les différents systèmes (immunitaires, vasculaires…). Il est donc nécessaire de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors de la réponse inflammatoire.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les formulations d’hydrogels ont été testées et sélectionnées en amont pour leur biocompatibilité et leur caractère anti-inflammatoire in vitro. Compte-tenu d’études comparables déjà effectuées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique (n=6). L’épaisseur de la membrane de la poche sera comparée dans les différents groupes par une analyse de variance puisqu’il s’agit de valeurs quantitatives indépendantes. Le même type de test sera utilisé pour la comparaison de la quantité de leucocytes présents dans l’exsudat. Le fait de répéter les expérimentations selon l’homogénéité des premiers résultats permettra d’étudier la reproductibilité des effets observés.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse, les animaux seront manipulés plusieurs jours avant l’expérimentation dans un but d’habituation et leur environnement sera enrichi (alpha-dri). Les souris seront hébergées à raison de 5 souris par cage. Nous raffinerons également en réduisant les éventuelles douleurs via des antalgiques (buprénorphine) lors des expérimentations afin d’améliorer la reproductibilité et la qualité des résultats obtenus. Les souris seront observées et pesées quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérimentation. Par ailleurs, des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en œuvre lors de l’atteinte de ces points limites ont été décrites. Enfin, les analyses menées sur chaque animal seront complètes : d’une part l’exsudat sera récupéré pour analyse des cytokines et de l’expression génique des cellules, et d’autre part la membrane sera récupérée pour analyses histologiques

Choix des espèces

L’utilisation de souris est justifiée puisque le modèle d’injection d’air stérile sous-cutané a été développé chez cet animal de manière rapide et reproductible. Ces modèles sont décrits et reconnus dans le domaine de l’inflammation. Les animaux reçus auront 6 semaines, ils auront une semaine d’acclimatation dans l’animalerie avant le début du protocole. Les souris auront donc 7 semaines au début du protocole et 8 semaines à la fin du protocole. Ce choix correspond à notre volonté de travailler sur de jeunes adultes afin d’éviter les effets liés à la sénescence, de plus cela correspond aux protocoles standards retrouvés dans la littérature concernant ce modèle d’inflammation.