Procédures modérées

80 souris juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime pauvre en protéines qui restreint leur croissance, elles subissent une calorimétrie avec 72 heures d'isolement, un test de tolérance à l'insuline avec sept prélèvements sanguins à la queue, puis une laparotomie sous anesthésie pour prélèvement en veine porte avant la mise à mort. Le projet évalue les effets d'un probiotique dans un contexte de malnutrition, cibles thérapeutiques annoncées au conditionnel et à long terme. Le remplacement tient en une phrase, le porteur affirmant que la réponse "intégrée" de l'organisme "nécessite une étude chez l'animal".

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté. De plus, une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permet de compenser partiellement le retard de croissance observé dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits, un déficit en protéines pendant l'enfance entraîne des perturbations métaboliques qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique juvénile, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique sont encore mal connus. De précédentes études portant sur les hormones de l'intestin ont permis d’identifier une population de cellules productrices d'hormones impactée par la malnutrition protéique juvénile. Dans ces conditions, une diminution du nombre de cellules produisant du Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), une hormone contrôlant la sécrétion d’insuline par le pancréas et donc le métabolisme énergétique, a été observée. De plus, les fonctions du GLP-1 étaient également impactées. Il est donc intéressant d'explorer de façon détailléé le métabolisme énergétique dans ces conditions. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique juvénile, permettant une approche de physiologie intégrée, l'objectif de ce projet est de caractériser finement les altérations métaboliques induites par une carence protéique ainsi que le potentiels effets bénéfiques d'une bactérie probiotique.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets bénéfiques pour la santé au-delà des effets nutritionnels classiques). De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants soufrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi qu’à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. Les animaux seront soumis une fois à une mesure de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire. La mesure s’effectue sous contention et dure quelques minutes. Les animaux seront soumis à une expérience de calorimétrie indirecte impliquant un isolement des animaux pendant 72h. Un test de tolérance à l’insuline sera réalisé sur les animaux vigiles (injection intra-péritonéale) et 7 prélèvements sanguins (2-3 μL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé 15 minutes après un gavage au glucose. Pour cela, après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 80 animaux appartenant à 4 groupes expérimentaux (10 mâles et 10 femelles par groupe).

Impact sur les animaux

Cette procédure devrait entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de cette procédure a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’aggressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poid et leur taille seront mesurés chaque semaine et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière régulière. Les expériences de Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN) et de calorimétrie indirecte peuvent induire un stress chez les animaux en raison du bruit environnant et de l’isolement. La mesure de RMN s'effectue sous contention dans un tube adapté et dure 2 minutes maximum. Pour limiter ce stress, les expériences de calorimétrie indriecte sont réduites en temps au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables. De plus, une période d’acclimatation est prévue avant l’expérience pour limiter le stress lors de l’expérience et l’enrichissement sera accru dans les cages suite à la période d’isolement pour limiter le stress post-expérience. Le test de tolérance à l’insuline implique une injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection intrapéritonéale peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée.

Devenir

L'ensemble de animaux mis en procédure seront mis à mort après le prélèvement en veine porte en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Le nombre de 10 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité, la différence de moyenne attendue entre les groupes ainsi l’écart-type attendu des données au vu de nos résultats précédents. Le test statistique réalisé sera une analyse de variance à trois voies. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agrée. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie légère à l'isoflurane 3%) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Les animaux seront ensuite progressivement habitués à la nourriture en mangeoire en vue de la procédure de calorimétrie indirecte. Afin de limiter le stress lié au transport, une période d’acclimatation est prévue après le transport et avant le début des procédures expérimentales. Pour la procédure de calorimétrie indirecte, pendant laquelle les souris seront isolées pour une période de 72h, les animaux conserveront une partie de leur litière afin de limiter le stress. Lors du test de tolérance à l'insuline, l'état général des animaux sera surveillé et l'expérience sera stoppée s'il vient à se dégrader. De plus, si la glycémie des animaux descend sous un certain seuil au-delà duquel ils risquent une hypoglycémie, ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose. A la suite du test de tolérance à l’insuline, l’apparition d’un oedème ou d’un gonflement au point d’injection intrapéritonéale ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés quotidiennement et pourront donner lieu à l’application locale d’antispetiques le cas échéant. Des points limites suffisament prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). Ce stade est choisi car l'objectif du projet est de connaître les effets d'une malnutrition juvénile sur le métabolisme.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies stéréotaxiques cérébrales, la pose de pompes osmotiques, des régimes hyperlipidiques provoquant obésité et résistance à l'insuline, et des tests métaboliques répétés avec prélèvements sanguins sur animaux vigiles. Le projet vise à comprendre le rôle des céramides dans le diabète de type 2, retombées thérapeutiques renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il est "très difficile" de reproduire ces interactions entre organes in vitro et conclut que le modèle animal reste "nécessaire".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche sur le diabète, pathologie définie par une élévation anormale du taux de glucose dans le sang, et qui touche plus de 300 millions de personnes dans le monde. Le diabète de type 2 concerne plus de 90% des patients diabétiques et se caractérise par une résistance des tissus cibles à l'insuline, hormone clef dans la régulation de la glycémie, associée à un défaut de sécrétion de cette hormone par les cellules beta du pancréas. Il est maintenant bien établi qu'un régime riche en graisses peut induire la survenue d'un diabète de type 2, via un phénomène appelé la lipotoxicité. Ce dernier est défini par une accumulation délétère de lipides dans différents tissus. Parmi les différents lipides, les céramides apparaissent comme particulièrement délétères. Ainsi, il a été décrit qu'un excès de céramides perturbe la voie de signalisation insuline dans les tissus cibles de cette hormone. Les céramides peuvent également être à l'origine de l'inflammation des cellules B pancréatique, conduisant à une diminution de la sécrétion à l'insuline. Tous les mécanismes d'actions des céramides (qui diffère selon les types de tissus) ne sont cependant pas élucidés et davantage d'études doivent être menées afin d'évaluer la pertinence de l'inhibition de la synthèse des céramides comme cible thérapeutique dans le traitement du diabète. L'objectif de ce projet est donc de mieux comprendre, par des études in vivo, le rôle du métabolisme des céramides sur l'homéostasie glucidique et l'inflammation dans différents tissus cibles de l'insuline (foie et cerveau) ou dans les cellules beta chez la souris. Dans ce projet, nous allons particulièrement cibler la sérine palmitoyltransférase 2 (SPT2), une sous-unité de la SPT, enzyme clef de la voie de synthèse des céramides.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'implication du métabolisme des céramides dans l'homéostasie glucidique, dans différents types cellulaires. Ces études permettront également d'élucider les mécanismes d'actions des céramides dans production hépatique de glucose, l'insulino-résistance ou dans la sécrétion de l'insuline. Ce projet vise aussi à comprendre l'implication des céramides dans l'inflammation et la mort des cellules beta. Enfin, une approche utilisant un inhibiteur d'une enzyme qui produit des céramides, la sphingomyélinase neutre 2, nous aidera à investiguer les mécanismes de régulation de la synthèse des céramides dans les cellules du foie. Les résultats attendus pourraient ouvrir de nouvelles perspectives pour la prévention et le traitement du diabète de type 2, à plus long terme.

Procédures

Prélèvements sur animaux vigiles : 312 souris; chirurgie stéréotaxique pour injection de la protéine Tat-Cre : 72 souris; chirurgie stéréotaxique pour injection de la protéine Tat-Cre + pose d'une canule et pompe Alzet pour perfusion icv de résistine : 96 souris. Détail par procédures : -Proc 1 : injection intrapéritonéale quotidienne pendant 15j puis réalisation de trois tests fin d 'évaluer l'homéostasie glucidique. Ces tests consistent à un suivi de la glycémie (prélèvements sur animaux vigiles) après soit une administration orale de glucose, soit une injection intrapéritonéale de pyruvate ou de glycérol, ces différents tests seront réalisés avec au minimum deux jours d'intervalles. - Procédure 2 : régime hyperlipidique puis tests de mesure de l'homéostasie glucidique espacés de 2 jours minimum avec prélèvements sur animaux vigiles, identiques à ceux de la procédure 1. - procédure 3 : injections stéréotaxiques et insertion d'une pompe osmotique, puis réalisation de tests espacés de 2 jours avec prélèvements sur animaux vigiles (idem procédure 1). - procédure 4 : injections stéréotaxiques et insertion d'une pompe osmotique, puis réalisation d'enregistrements nerveux sur animal anesthésié. - ¨Procédure 5 : injections stéréotaxiques, régime hyperlipidiques puis réalisation de tests espacés de 2 jours minimum avec prélèvements sur animaux vigiles (idem Procédure 1).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des régimes provoquant l'obésité et/ou des désordres métaboliques de type réistance à l'insuline. Le protocole sera arrêté si les animaux présentent différents signes de souffrance (infections suite aux chirurgies,œdème, absence de mobilité dans la cage, poils ébouriffés, mauvaise prise alimentaire, perte de poids). Ces paramètres seront évalués par le chercheur chaque jour dans la semaine suivant la mise sous régime, injections, tests métaboliques ou chirurgies.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus et du plasma en vue de mesures biochimiques.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire. Cependant, nous avons entamé une réflexion sur le développement d'approches in vitro du type organ on chips qui permettent de mimer quelques interactions entre organe. Certains des travaux réalisés in vitro auront pour but de remplacer, au moins en partie, les approches in vivo

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons effectué un travail en amont qui nous a permis d'identifier un gène cible particulièrement intéressant (SPT2). L'inhibition de son expression dans différents tissus a déjà montré des résultats très prometteurs. Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiable et robuste, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des milieux enrichis ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement et un suivi du poids et de la prise alimentaire seront réalisés 2 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance.

Choix des espèces

Les modèles précliniques de rats et de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. De plus, la souris est un modèle de choix pour les études génétiques car de nombreuses lignées de souris transgéniques sont disponibles. Ces souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de deux mois. Dans le cadre de l'utilisation du régime cétogène, une partie des souris seront mises sous régime cétogène dès le sevrage pour qu'elles n'aient pas accès à une alimentation riche en glucide.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de thioglycolate qui provoque une inflammation du péritoine, puis sont tuées quatre jours plus tard pour un lavage péritonéal et un prélèvement d'organes. L'objectif relève de l'enseignement, fournir des cellules immunitaires à des travaux pratiques d'étudiants. Le porteur invoque la "stricte nécessité" réglementaire et affirme que ces objectifs ne peuvent être atteints sans recours à un "animal modèle de l'Homme".

Objectifs

Le projet s’inscrit dans une démarche pédagogique visant à former des étudiants sur les approches en biologie. Ce projet a pour but de récolter des cellules immunitaires pour mettre en culture primaire. Donc pour améliorer la production il est indispensable d'augmenter le nombre de cellules immunitaires prélevables par animal suite à une injection intrapéritonéale d'un activateur de la production de cellules immunitaires. Les cellules prélevées permettront de réaliser des cultures primaires afin de montrer aux étudiants les différentes approches de biologie cellulaire réalisables pour étudier les réponses immunitaires. Il n'existe à ce jour pas de bon modèle de cellules issues de lignées pour étudier les réponses immunitaires sans avoir recours aux prélèvements chez les animaux. Le but de ces travaux pratiques est également de le démontrer en comparant les réponses immunitaires obtenues sur lignées et sur les cellules issues des animaux.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier de cette expérimentation est de de former les étudiants en leurs présentant des techniques qui permettent de limiter le nombre d'animaux mais également que les lignées cellulaires peuvent ne pas suffire pour étudier certains domaines de la biologie Cette technique d'induction nous permettra d 'utiliser moins de souris et d'avoir suffisement de cellules circulantes de la réponse immunitaire (macrophages) pour mettre à la disposition des travaux pratiques. En effet, les prélèvements sanguins chez la souris ne permettent pas d'obtenir suffisamment de cellules pour réaliser des expériences ex vivo sur cellules isolées, et surtout, les cellules visées ne sont pas des cellules circulantes (macrophages). Selon les données de la littérature et nos observations depuis que nous utilisons ce protocole pour les travaux pratiques l'injection intrapéritonéale de milieu thioglycolate à 3% stérile permet d'augmenter le rendement des cellules collectées.

Procédures

les souris seront soumiess à une seule injection (une minute environ) et euthanasiées 4 jours plus tard.

Impact sur les animaux

La procédure a été classée en "modérée" car l'injection de milieu au thioglycolate vise à induire un recrutement de macrophages en provoquant une inflammation péritonéale modérée, qui est cependant à différencier d’une péritonite aigüe en raison de l’absence d'agent infectieux et d’un profil d'activation des cellules recrutées différent (selon les données de la littérature).Les effets indésirables potentiels décrits dans la littérature sont les suivants: léthargie, perte de poids, perforation intestin ou vessie, péritonite, dommages aux organes internes. Ces 3 derniers points étant dus à une mauvaise injection , l'injection ne se fera que par un manipulateur chevronné et expert dans ce geste.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser un lavage intrapéritonéal pour collecter les cellules recrutées suite à l'injection et prélever les organes nécessaires aux expériences réalisées en TP sur 2 jours.

Remplacement

En conformité avec l’article R214-104 du code rural et de la pêche maritime, « les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information ». Le projet s’inscrit en effet dans le cadre d'activités d'enseignement visant à démontrer l'intérêt des études pré-cliniques dans un contexte de prévention de pathologies humaines et nécessite pour cela, l'utilisation de cellules immunitaires non isolables sans technique invasive. Les objectifs du projet ne peuvent donc être atteints sans recours à un animal modèle de l’Homme, en particulier pour des analyses sur des organes et cellules cibles.

Réduction

L'injection intrapéritonéale de milieu thioglycolate permet d'augmenter la quantité de cellules d'intérêt collectées et ainsi de réduire le nombre de souris utlisées. La procédure expérimentale est conçue pour être favorable sur le plan statistique en mettant en commun les suspensions cellulaires de cellules intrapéritonéales obtenues par séance de TP, ce qui permet de réaliser des triplicats avec un même nombre de cellules à partir d'un nombre limité d'animaux (6 par séance de TP soit 1 animal par étudiant pour l'intérêt pédagogique de la procédure).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions favorables à leur bien être en cage collective répondant aux normes en vigueur ( 6 animaux par cage ) . L'enrichissement sera réalisé avec des cachettes en plexiglass rouges (nid et tunnel) et des bâtons en cellulose à ronger.

Choix des espèces

La souris est un modèle universellement reconnu en immunologie. De nombreux outils et réactifs permettant d'étudier les réponses immunitaires spécifiques et fonctionnelles ainsi que pour caractériser les cellules sont disponibles pour la souris. Nous avons une bonne connaissance pratique de ces animaux et particulièrement de la souche de souris utilisée (C57/BL6) compte-tenu de leur utilisation fréquente au laboratoire pour nos études nutritionnelles. Age jeune adulte : 6 semaines (5 semaines à reception). Fenêtre d’âge de référence utilisée dans la plupart des études où la réalisation d'isolement de cellules immunitaires est effectuée.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras et sucré pendant 28 semaines induisant obésité et maladie du foie, une injection d'un virus AAV dans la veine de la queue, des prélèvements sanguins à la joue et à la veine porte, avant mise à mort par dislocation cervicale. Le projet étudie le rôle d'une protéine hépatique dans la stéato-hépatite non alcoolique, avec des stratégies thérapeutiques annoncées pour l'humain. Le porteur affirme que l'étude de l'axe intestin-foie nécessite un "organisme entier" et des souris génétiquement modifiées.

Objectifs

Le syndrome métabolique touche actuellement 18% des habitants en France. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans l'organe, puis peuvent évoluer vers des stades plus avancés d'inflammation, de fibrose et de dysfonction du foie. Ces maladies représentent maintenant la deuxième cause de transplantation de foie et il n'existe pas de traitement de référence contre ces maladies. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle d'une protéine (le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor)) dans le développement de ces maladies chroniques du foie. Ce recepteur est impliqué dans le maintien des fonctions de détoxification et de métabolisme lipidique du foie et des études préliminaires montrent que son expression est très diminuée dans les maladies métaboliques du foie. Cependant, son rôle dans l'avancée de la maladie est inconnu. Ainsi pour cette étude nous utiliserons des souris dont le gène CAR a été supprimé et nous les nourrirons avec un régime induisant une obésité et une maladie hépatique mimant celle observée chez l'Homme. Nous étudierons le rôle de la protéine CAR dans le dialogue entre l’intestin et le foie lors de ce régime. Les institutions internationales recommandent de prendre en compte l’effet du sexe dans le métabolisme énergétique puisqu’il existe chez l’Homme une grande différence entre les hommes et les femmes. Nous étudierons donc le rôle de CAR dans les 2 sexes.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle hépatique de CAR dans le développement des maladies chroniques métaboliques du foie, pour pouvoir par la suite proposer des stratégies thérapeutiques chez l'Homme. En effet, il n'existe à ce jour aucun traitement de référence pour les patients atteints de ces maladies, qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie dans le monde. Ainsi, nos études permettront de mieux cibler les médicaments nécessaires à chaque sous-catégorie de patients, notamment en fonction de leur sexe.

Procédures

Après les 2 semaines d'acclimatation, les animaux seront placés sous régime (WD). Dans la même semaine, nous injecterons un volume 100 microlitres de solution contenant les AAV à chaque animal au niveau de la veine de la queue. L'AAV est un virus qui va véhiculer une séquence d'ADN qui code pour une protéine d'intérêt et qui permet de restaurer l'expression de cette protéine d'intérêt dans un organe cible chez des individus où la protéine a été supprimée par génie génétique dans tout l'organisme. Après 14 semaines de régime, nous exposerons aussi les animaux à 1 prélèvement de sang à la joue (représentant moins de 5% de leur volume de sang total), le geste durera moins de 1 minute par animal. Après les 28 semaines de régime nous procèderons à 1 prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale. Ainsi, les animaux transgéniques seront exposés à un régime riche en graisse pendant 28 semaines.

Impact sur les animaux

Le régime WD, qui est un régime enrichi en graisse, en sucre et en cholestérol, mime le régime consommé par les populations occidentales dans lesquelles l'incidence de l'obésité atteint 30% de la population, ce régime induit donc une obésité chez les animaux, ainsi que les perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité: intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. L'AAV quant à lui est un virus qui va véhiculer une séquence d'ADN qui code pour une protéine d'intérêt et qui permet de restaurer l'expression de cette protéine d'intérêt dans un organe cible chez des individus où la protéine a été supprimée par génie génétique dans tout l'organisme. L'injection de l'AAV au niveau de la veine de la queue demandera une contention de l’animal qui peut entraîner un stress. Enfin, le prélèvement sanguin à la joue demandera une contention et peut entrainer un épanchement au niveau de la joue.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Remplacement

L’utilisation d’animaux de laboratoire est nécessaire car le projet implique le dialogue entre organes, en particulier entre le foie et l'intestin. Pour étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies moléculaires impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. L'étude spécifique de l'axe intestin-foie justifie l'utilisation d'expériences in vivo car l'étude in vitro de lignées cellulaires clonales ne permet pas d'examiner les interactions complexes entre les différents compartiments et organes qui composent l'axe intestin-foie intact.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires.

Raffinement

Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les heures le premier jour puis 2 fois par jours pendant 1 semaine) après le prélèvement de sang à la joue et après l'injection au niveau de la queue. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local la queue avant l'injection au niveau de la veine de la queue. Pour le prélèvement à la veine porte et à la veine cave on réalise une pré-médication par voie intra-péritonéale afin d’induire l’analgésie des animaux. Ensuite après 2 minutes, l'anesthésie débute dans une cage à induction volatile. Le contrôle de l’efficacité de l’anesthésie est fait par vérification du réflexe de retrait à la patte. Pour l'évaluation de la souffrance, de la détresse et de l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de cinq aspects de l'état de l’animal: variation du poids de l'animal; apparence physique externe; signes cliniques mesurables; changement dans les comportements non provoqués; et, réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) est proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacune des catégories indique supérieur ou égal à 3, le critère d’arrêt sera atteint et l’animal sera retiré de l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, pathologie qui met en jeu le dialogue entre plusieurs organes (tissus adipeux, intestin et foie notamment) ainsi il est impossible d'étudier cette pathologie via l'utilisation de modèles cellulaires. C'est la raison pour laquelle nos études nécessitent un organisme entier. De plus, afin d’étudier spécifiquement le rôle de la protéine CAR dans cette pathologie systémique, la souris est actuellement le meilleur modèle expérimental car il existe des modèles transgéniques dans lesquels cette protéine a été supprimée au niveau de tout l’organisme (modèle knock-out KO). Enfin, nous utilisons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hepatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (souris âgées de 7 semaines minimum)

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sevrées, elles reçoivent un régime pauvre en protéines modélisant la malnutrition, un probiotique ou un placebo dans la joue, subissent une calorimétrie avec isolement de 72 heures et un test de tolérance à l'insuline avec prélèvements au bout de la queue, puis une laparotomie pour prélever le sang de la veine porte avant mise à mort. Le projet évalue l'effet d'un probiotique sur les troubles métaboliques de la malnutrition infantile, cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur affirme que la réponse intégrée de l'organisme à l'alimentation impose l'étude chez l'animal.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté. De plus, une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permet de compenser partiellement le retard de croissance observé dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits, un déficit en protéines pendant l'enfance entraîne des perturbations métaboliques qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique juvénile, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique sont encore mal connus. De précédentes études portant sur les hormones de l'intestin ont permis d’identifier une population de cellules productrices d'hormones impactée par la malnutrition protéique juvénile. Dans ces conditions, une diminution du nombre de cellules produisant du Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), une hormone contrôlant la sécrétion d’insuline par le pancréas et donc le métabolisme énergétique, a été observée. De plus, les fonctions du GLP-1 étaient également impactées. Il est donc intéressant d'explorer de façon détailléé le métabolisme énergétique dans ces conditions. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique juvénile, permettant une approche de physiologie intégrée, l'objectif de ce projet est de caractériser finement les altérations métaboliques induites par une carence protéique ainsi que le potentiels effets bénéfiques d'une bactérie probiotique.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique. De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi qu’à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. Les animaux seront soumis une fois à une mesure de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire. La mesure s’effectue sous contention et dure quelques minutes. Les animaux seront soumis à une expérience de calorimétrie indirecte impliquant un isolement des animaux pendant 72h. Un test de tolérance à l’insuline sera réalisé sur les animaux vigiles (injection intra-péritonéale) et 7 prélèvements sanguins (2-3 μL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé 15 minutes après un gavage au glucose. Pour cela, après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 80 animaux appartenant à 4 groupes expérimentaux (10 mâles et 10 femelles par groupe).

Impact sur les animaux

Cette procédure devrait entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de cette procédure a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’aggressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poid et leur taille seront mesurés chaque semaine et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière régulière. Les expériences de Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN) et de calorimétrie indirecte peuvent induire un stress chez les animaux en raison du bruit environnant et de l’isolement. La mesure de RMN s'effectue sous contention dans un tube adapté et dure 2 minutes maximum. Pour limiter ce stress, les expériences de calorimétrie indriecte sont réduites en temps au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables. De plus, une période d’acclimatation est prévue avant l’expérience pour limiter le stress lors de l’expérience et l’enrichissement sera accru dans les cages suite à la période d’isolement pour limiter le stress post-expérience. Le test de tolérance à l’insuline implique une injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection intrapéritonéale peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée.

Devenir

L'ensemble de animaux mis en procédure seront mis à mort après le prélèvement en veine porte en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Le nombre de 10 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité, la différence de moyenne attendue entre les groupes ainsi l’écart-type attendu des données au vu de nos résultats précédents. Le test statistique réalisé sera une analyse de variance à trois voies. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agrée. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie légère à l'isoflurane 3%) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Les animaux seront ensuite progressivement habitués à la nourriture en mangeoire en vue de la procédure de calorimétrie indirecte. Afin de limiter le stress lié au transport, une période d’acclimatation est prévue après le transport et avant le début des procédures expérimentales. Pour la procédure de calorimétrie indirecte, pendant laquelle les souris seront isolées pour une période de 72h, les animaux conserveront une partie de leur litière afin de limiter le stress. Lors du test de tolérance à l'insuline, l'état général des animaux sera surveillé et l'expérience sera stoppée s'il vient à se dégrader. De plus, si la glycémie des animaux descend sous un certain seuil au-delà duquel ils risquent une hypoglycémie, ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose. A la suite du test de tolérance à l’insuline, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection intrapéritonéale ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés quotidiennement et pourront donner lieu à l’application locale d’antispetiques le cas échéant. Des points limites suffisament prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). Ce stade est choisi car l'objectif du projet est de connaître les effets d'une malnutrition juvénile sur le métabolisme.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime hyperlipidique ou contrôle pendant cinq à quinze semaines, à des tests de tolérance au glucose et à l'insuline pouvant provoquer des signes d'hypoglycémie, puis à une échocardiographie avant euthanasie et collecte d'organes. Le projet vise surtout à tester la reproductibilité entre laboratoires européens de données sur le cœur des souris obèses. Le porteur affirme que les systèmes cellulaires ne reproduisent pas les régulations neuro-hormonales et conclut qu'un modèle animal est "indispensable".

Objectifs

Le projet consiste en une analyse de modèles murins avec études histologiques de divers tissus d'intérêt (cœur, rein, foie, tissu adipeux) visant à : 1/ Comparer la reproductibilité entre différents laboratoires européens des données à l'aide d'un protocole standardisé et unique sur des modèles murins de diabète de type 2 induit par l'obésité, et 2/ Mettre en place une biobanque d'échantillons sanguins et tissulaires pour réaliser des analyses multi-omiques

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester la reproductibilité de ces données en comparant dans différents laboratoires en Europe l'impact d'un régime hyperlipidique chez les souris mâles et femelles sauvages sur la structure et la fonction cardiaques, ainsi que l'évaluation métabolique et l'impact sur d'autres organes (foie, rein, tissu adipeux).

Procédures

La moitié des animaux du projet sera soumise à un régime contrôle de 5 semaines ou de 15 semaines. L'autre moitié des animaux sera soumise à un régime hyperlipidique de 5 semaines ou de 15 semaines. A la fin du protocole expérimental, tous les animaux seront soumis à des tests métaboliques (tests de tolérance au glucose et à l'insuline) ainsi qu'à des analyses échocardiographiques, avant euthanasie et collecte de sang et d'organes. Les tests métaboliques seront réalisés une fois au début du régime et une fois à la fin du protocole. Les mesures seront réalisées à différents temps post-injection : t0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes pour une durée de quelques secondes chacune. Les échocardiographies seront réalisées une fois à la fin du protocole expérimental (environ 15 min par animal).

Impact sur les animaux

Certains animaux sont susceptibles de présenter des signes cliniques d’hypoglycémie durant les tests métaboliques (ex. inactivité, yeux fermés, posture prostrée, tremblements, froid au toucher) ou encore une glycémie ≤ 3 mmol/l.

Devenir

A la fin du protocole expérimental, les animaux seront euthanasiés afin de procéder à une collecte multi-organes.

Remplacement

Pour ce type de projet visant à étudier l'impact de troubles métaboliques sur le remodelage et la dysfonction cardiaque, l'utilisation de modèles animaux est indispensable. Des modèles cellulaires seront utilisés en complément (cardiomyocytes de rats nouveau-nés, lignée cellulaire H9C2) afin de valider certaines cibles/voies métaboliques. En revanche, ces systèmes simplifiés ne récapitulent pas toutes les régulations neuro-hormonales d'un organisme complet, dont le rôle dans les régulations métaboliques est bien connu. En ce sens, un modèle animal est indispensable.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en prenant en compte de l’apparition d'altérations et de la mortalité liée au vieillissement des animaux et suite à la mise sous régime HFD selon les données de la littérature. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur une même souris (sang, urine, fécès, organes). Avant sacrifice, des méthodes non invasives seront réalisées (tests cognitifs, échocardiographies, mise en cage métabolique) pour obtenir des informations sur plusieurs thématiques et disciplines (cardiaque, métabolique, physiologique, etc.). Après sacrifice, le sang sera prélevé à la veine cave et un grand nombre d’organes seront récupérés. Ce protocole permettra ainsi d’extraire un maximum de données sur le même animal et d’en réduire leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et pris en charge selon la règlementation en vigueur. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 4 fois par mois. Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les souris seront au nombre de 5 par cage, et suivies quotidiennement afin d'identifier le plus précocement possible tout signe de souffrance ou de stress : apathie, prostration, perte de poids >20% (les souris seront pesées à leur arrivée puis toutes les semaines), agressivité, difficultés de déplacements. Pour améliorer le quotidien des souris, des matériaux de litière ou des structures de repos adaptés seront installés dans les cages (mouchoirs en papier, rouleaux en cartons, …).

Choix des espèces

Le développement de pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, la mise en place de pathologies cardiaques fait intervenir des systèmes hormonaux, neuro-hormonaux, des adaptations circulatoires, centrales, métaboliques, etc., si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. En outre, l'obésité étant un facteur de risque connu de dysfonction cardiaque chez l'Homme, il est intéressant de mettre en place des conditions expérimentales (facilement réalisables chez l’animal) pour étudier ces processus chez l’animal. Le modèle "souris" permet d’étudier ce phénomène dans un laps de temps court (quelques mois) et il permet l’utilisation de conditions expérimentales simples à mettre en place (régime HFD) afin d'induire ce processus, permettant des analyses précises. Les souris auront 5 mois au début de l'étude, âge auquel le développement cardiaque est terminé.

Pendant les quatre semaines du test TouchScreen, des souris mutantes reçoivent une eau acidifiée progressivement jusqu'à un pH de 2,3, et pour un autre test elles sont enfermées environ 45 minutes dans un cylindre, exposées à des sons allant jusqu'à 110 dB. 60 souris issues de trois lignées mutantes et de deux groupes témoins vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort en fin de projet pour des analyses histologiques et moléculaires. Elles subissent aussi l'implantation d'une puce sous la peau, puis, sous anesthésie, une tomographie par cohérence optique et une électromyographie par aiguilles avec stimulation électrique de 8 mA, ainsi qu'un suivi dans l'arène du Live Mouse Tracker. Les mutations étudiées sont celles du syndrome BBSOA, une maladie génétique rare de l'enfant, et le porteur renvoie les pistes thérapeutiques "à long terme". Il écrit avoir défini "des points limites éthiques", sans dire lesquels.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux (NDD) sont des maladies complexes et hétérogènes présentant des symptômes associés à un développement anormal du cerveau pouvant entraîner plusieurs déficits comportementaux, tels des troubles de l'attention/hyperactivité, les troubles du spectre autistique, une déficience intellectuelle, l'épilepsie ou encore les troubles d'apprentissage. Les NDD englobent plusieurs dysfonctionnements cérébraux développementaux, qui se manifesteront par des troubles neuropsychiatriques ou une altération de la fonction motrice, de l'apprentissage, du langage ou de la communication non verbale avec une grande variabilité et différents degrés de gravité. Des études récentes ont révélé un rôle essentiel du développement cortical embryonnaire dans la physiopathologie des NDD, mais la génétique et les mécanismes sous-jacents sont encore méconnus. En particulier, un gène joue un rôle crucial dans le développement du cerveau. Des mutations sur ce gène entraine l’apparition du syndrome Bosch-Boonstra-Schaaf optic atrophy (BBSOA), qui est une maladie génétique rare, décrite pour la première fois en 2014. Les patients présentent une multitude de symptômes neuronaux et comportementaux, y compris, un retard développemental, une déficience intellectuelle, un trouble du spectre autistique, un trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité, des convulsions, une déficience visuelle et auditive. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les mutations de ce gène peuvent causer le syndrome BBSOA. Certains des symptômes observés chez les patients BBSOA fournissent déjà des indices importants sur le rôle de ce gène dans le développement du cerveau. En outre, des corrélations entre la génétique et le comportement commencent à être caractérisées chez les patients atteints de BBSOA. Néanmoins il est nécessaire d’étudier de façon approfondie des modèles animaux qui permettront de reproduire les mutations génétiques décrites chez l’Homme. Au cours de ce projet nous caractériserons le comportement de 3 lignées de souris présentant des différentes mutations sur ce gène. Cela nous permettra de mieux comprendre comment les mutations contribuent aux différentes anomalies du développement neurologique chez les patients atteints du syndrome BBSOA.

Bénéfices attendus

Les troubles neurologiques du développement sont des maladies neuro-développementales qui impliquent un dysfonctionnement de l’apprentissage, la mémoire, la perception, le langage, la résolution de problèmes et/ou l’interaction sociale. Ces troubles sont principalement d’origine génétique et se manifestent au cours de la petite enfance. Ce projet de recherche expérimentale se focalise sur un gène dont le rôle clé pendant le développement cortical est bien connu et dont plusieurs mutations conduisent au syndrome appelé BBSOA. Les enfants atteints de cette maladie présentent des déficits cognitifs et comportementaux, des crises d’épilepsie au jeune âge et montrent des retards dans l’apprentissage et dans le langage. La majorité des patients (>80%) diagnostiquée présente des troubles du spectre autistique (TSA). Les études récentes à ce sujet ont permis de mettre en évidence des anomalies cérébrales, notamment dans les régions du cerveau impliquées dans le langage et l’abstraction. Pour approfondir la compréhension de l’impact fonctionnel des mutations de ce gène, le projet global vise à mieux caractériser les mécanismes dans le cerveau qui sous-tendent les déficits cognitifs des enfants malades. En particulier, cette étude comportementale qui sera comparée avec celle clinique permettra d’étudier l’impact fonctionnel des mutations du gène dans le contexte des TSA avec le but à long terme de déboucher sur des pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation sous-cutanée d'une puce sera faite sur les animaux. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes) - Injection intra-péritonéale d'anesthésique (durée = 5 secondes) (deux fois)*. -Tomographie par Cohérence Optique (durée = 10 minutes). - Electromyographie permettant la mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes), insertion d'électrodes à aiguille + stimulation électrique (0,1 ms, 8mA). Les aiguilles sont insérées à travers la peau de l'animal à une profondeur de 1 à 2 mm. - Injection sous-cutanée d'antidote de l'anesthésique (durée = 5 secondes). -Consommation d'eau acidifiée lors du test TouchScreen (4 semaines). - Contention des animaux dans un cylindre fermé lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information. Dans ce test des sons de 110 dB pour une durée de 40 msec et d'autres plus faibles (65-70-75-85-90 dB ; durant 10 msec) sont présentés à l'animal. Chaque type de stimulus est présenté 10 fois aléatoirement durant le test. Un intervalle de 20 sec sépare 2 stimuli. Avec 11 types de stimuli présentés 10 fois, une session dure environ 45 min.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une implantation d'une puce d'identification par radiofréquence en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Lors des périodes d'analyse du test Live Mouse Tracker, ils seront simplement transférés dans une arène de 50 cm de côté qui disposera de sciure, boisson et aliment qu'ils pourront explorer. Lors de la Tomographie par Cohérence Optique et de l'électromyographie ils auront une anesthésie chimique avec une injection intrapéritonéale. Pour le test du Touchscreen, l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test. . Il y une acidification progressive de l’eau (acide citrique 1,5%) de pH 7 à pH 2,3. Lors de la période précédant le test l’animal subit une habituation au lait fraise (12% de sucre) dans biberon pendant 15 min par jour ainsi qu’une variation du pH de 7 à 3 (semaine 1). Puis lors du test le pH varie de 2,8 à 2,3 (semaines 2 à 4). Pour le test d'altérations des capacités de filtrage de l’information, l’animal est placé dans un cylindre fermé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude comportementale sera complémentaire d'études in vitro sur des cellules de patients BBSOA porteurs des différentes mutations. Ceci permettra de décrypter les anomalies cellulaires et moléculaires à la base du trouble du développement BBSOA. Néanmoins, la présence d’anomalies comportementales des patients ne pourra pas être reproduite in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux pour mieux comprendre l’impact/ le lien des mutations sur le phénotype neurodéveloppementale.

Réduction

Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, et les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux seulement 2 groupes contrôles seront utilisés pour 3 groupes expérimentaux présentant des mutations.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test, afin de réduire le stress auquel seront exposés les animaux. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. De la même manière lors de l'Electromyographie et de la Tomographie par Cohérence Optique une anesthésie sera faite pour éviter tout stress. Les animaux seront injectés en sous-cutané avec un antagoniste de l'anesthésique après les tests et placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu’à leur réveil. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage d’hébergement et surveillés quotidiennement.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations génétiques chez la souris et modéliser donc une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 6 à 9 semaines. Cet âge a été choisi car le développement du cortex est terminé, mais ce dernier est encore plastique. De plus les systèmes visuels et auditifs sont aussi matures.

70 cochons Yucatan, dont une partie génétiquement modifiée pour développer une hypercholestérolémie, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les survivants étant tués en fin de protocole pour l'étude histologique de leur valve. Chacun subit le remplacement de sa valve aortique par une bioprothèse, sous circulation extracorporelle : six heures d'anesthésie, une dizaine d'heures sous sédation et ventilation, 48 à 72 heures de soins intensifs, puis des prises de sang et des échographies à un, trois et six mois, sous contention physique ou, si elle échoue, sous anxiolytique. L'équipe cherche pourquoi ces prothèses dégénèrent chez les patients humains au bout de 10 à 15 ans, et dit tenir compte d'une perte pouvant atteindre 50 %, faute de redémarrage du cœur, classique selon elle dans ces chirurgies chez le porc. Le porteur range la douleur, l'infection de la plaie thoracique et la pleurésie parmi les "Complications mineures pouvant être minimisées par des mesures préventives et thérapeutiques".

Objectifs

Aucun traitement médical n’est à l’heure actuelle disponible pour traiter les pathologies valvulaires cardiaques. La seule option offerte aux patients est le remplacement valvulaire par une nouvelle prothèse lors d’une chirurgie à cœur ouvert. Ces dernières années, l’utilisation de prothèses biologiques a pris le pas sur les prothèses mécaniques, principalement à cause de leur meilleure performence hémodynamique et du développment de techniques moins invasives (remplacement par transcatherter des valves). Par contre, ces prothèses ont une durabilité réduite : en effet, la dégénerescence de ces bioprothèses est observée 10 à 15 ans post implantation. Cette dégénrescence a une implication importante d’un point de vue clinique, pouvant entraîner des symptomes chez les patients, un besoin d’une ré-intervention valvulaire et peut aussi entrainer le décès. Cependant, à ce jour, les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ce processus dégénératif sont inconnus. L’objectif de notre projet de recherche est d’étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la survenue de cette dégénérescence des bioprothèses. Ce projet s’appuie sur un modèle de chirurgie de remplacement valvulaire cardique chez le cochon. L’étude portera sur le rôle de l’hypercholestérolémie et de la thrombose dans le processus de dégénérescence des bioprothèses. Des cochons contrôles (Yucatan WT) et modifiés génétiquement (Yucatan avec gain de fonction de PCSK9), recevant ou non un traitement anticoagulant seront étudiés dans cette étude, qui permettra donc d’étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la dégénrescence des bioprothèse et l’effet synergique de l’hypercholestérolémie et/ou de la thrombose prosthétique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le processus de dégénérescence des bioprothèses, et ainsi aboutir à des modifications de prise en charge des patients subissant un remplacement valvulaire avec une bioprothèse, mais aussi modifier la préparation des bioprothèses (préparation et confection des matrices utilisées par exemple). L’un des avantages majeurs de l’étude est que nous pourrons identifier les processus précoces impliqués dans le dévelopement de la pathologie, dès l’implantation de la prothèse et donc proposer des interventions chez l’homme tôt, en per ou post chirurgie.

Procédures

Chirurgie de prothèse valvulaire avec circulation extracorporelle sous anesthésie générale (anesthésie durant 6 heures puis maintien sous sédation et ventilation pendant une dizaine d'heures), Soins intensifs post-opératoires sur 48 à 72 heures, Prélèvements sanguins intra et post-opératoires pendant la semaine de soins intensifs par aspiration de sang au niveau du cathéter veineux central (aucune contention de l'animal et aucune douleur), Prélèvement sanguin et échographie transthoracique à un mois, 3 mois et 6 mois jusu'à la fin du protocole sur animal vigile ou sous sédation selon la tolérance de l'animal (utilisation d'une contention physique minimale et si échec, utilisation d'une contention chimique anxiolytique à base de benzodiazépines), Anesthésie générale finale avant euthanasie

Impact sur les animaux

Complications mineures pouvant être minimisées par des mesures préventives et thérapeutiques : Douleur intra et post-opératoire (immobilité, perte d’appétit, agressivité, état de mal-être) Infection du site chirurgical (plaie thoracique, pleurésie); Complications graves susceptibles d’entrainer le décès de l’animal ou la prise de décision euthanasique : Complication per-opératoire (arythmies venticulaires ne répondant pas aux traitements médicamenteux ni aux chocs électriques de défibrillation, rupture de l’aorte et hémorragie massive incontrollable, réaction anaphylactique à la protamine ou à un autre médicment, défaillance cardiaque droite avec hypertension pulmonaire et œdème pulmonaire); Complications post CEC (syndrome inflammatoire systémique, coagulation intravasculaire disséminée, dysfonctionnement multiorganique, syndrome de détresse respiratoire); Hémorragie, dissection/rupture de l’aorte au niveau de la prothèse valvulaire avec potentiel choc hémorragique; Dysfonctionnement de la prothèse avec insuffisance cardiaque décompensée

Devenir

Euthanasie en fin de protocole pour prélèvement et étude histologique de la prothèse valvulaire

Remplacement

II n’existe pas de méthode in vitro ou in silico permettant de reproduire les phénomènes physiologiques et pathophysiologiques liés au fonctionnement et à la dégénérescence de la prothèse valvulaire. Les prothèses sont testées pour leur tolérance tissulaire sur des animaux de laboratoire plus petits (rats) avec une mise en place du tissue en sous-cutané. Cette méthode n’est pas adaptée à l’étude de la dégénérecence du tissu valvulaire, qui est implanté chez l’homme dans la circulation et fait face a des contrainte liées au flux sanguin et au pressions/tensions observées au niveau du système circulatoire central.

Réduction

Compte-tenu des connaissances sur les modèles de chirurgie intracardiaque avec circulation extracorporelle chez le porc et de la nécessité d’avoir un nombre d’animaux minimum pour avoir une significativité statistique, le nombre d’animaux comprend des animaux pour la mise au point et la standardisation du modèle chirugical de remplacement valvulaire aortique ainsi que 8 à 15 animaux par groupe pour chaque condition d’évaluation de la dégénérescence prosthétique (perte maximale classiquement attendue pour des protocoles de chirurgie cardiaque chez le porc de 50% par défaut de redémarrage du coeur). Au vu des résultats préliminaires obtenus, le nombre d’animaux pourra être réduit pour chaque groupe d’expérimentation et conditions.

Raffinement

En plus du raffinement des conditions d’hébergement et de manipulation des animaux, les procédures de préparation, d’induction de l’anesthésie, de mise en place de l’analgésie répondent aux exigences de l’analgésie multimodale pré-emptive et sont confiées à des anesthésistes/réanimateurs spécialistes. Une attention identique est portée au suivi des animaux pendant les interventions chirurgicales et le suivi postopératoire grâce à l’ensemble des moyens de monitorage du plateau technique. Les données de monitorage sont enregistrées fréquemment afin de relever à posteriori d’éventuelles réponses physiologiques chez les différents animaux. Des échantillons sanguins sont prélevés avant la chirurgie (après anesthésie), pendant la chirurgie et après la chirurgie (pendant le suivi post-opératoire) afin de collecter le maximum de données. Les besoins en données sont anticipés et ouverts aux analyses exploratoires afin de pouvoir effectuer des analyses sur des paramètres qui n’auraient pas été anticipés. Les chirurgies cardiaques avec CEC sont réalisées par des chirurgiens cardiaques humains, avec le support d’un perfusionniste, permettant de rafiner le protocole chirurgical selon les standards cliniques.

Choix des espèces

Le choix du mini-porc est fondé sur plusieurs critères : - Modèle animal bien décrit et largement utilisé pour la chirurgie intracardiaque avec CEC avec des aspects anatomiques et un fonctionnement physiologique proche de l’homme ; des paramètres hémato-biochimiques comparables et dont les variations sont accessibles par des techniques de dosages similaires à celle utilisées en médecine humaine, afin d’assurer la prédictivité des résultats. - Existence d’une lignée modifiée génétique (gain de fonction de PCSK9) présentant une hypercholestérolémie l’un des facteurs de risque de la dégénrescence des bioprothèses - Taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie, ainsi que l’utilisation d’instruments et de matériels identiques à ceux utilisés chez l’Homme. - Le mini-porc à l’âge adulte atteint un poids minimum de 40 kg et reste maitrisé par le rationnement (environ 50-60 kg) ce qui représente un avantage lors des manipulations comparativement au porc charcutier qui peut doubler de poids sur la même période et à âge égal. Animaux adultes afin d’avoir une taille de thorax et d’aorte compatible avec l’intervention chirurgicale

960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et une partie d'entre elles reçoit un gavage chaque jour pendant un mois, précédé pour certaines de trois semaines de nourriture au tamoxifène et de cinq jours d'injections dans l'abdomen. Les glucocorticoïdes administrés, dexaméthasone pendant trois jours ou prednisone pendant un mois, doivent provoquer une fonte musculaire qui peut atteindre 20 % du poids du muscle, pour étudier le rôle de deux co-régulateurs du récepteur de ces hormones, supprimés dans le muscle d'une partie des souris. Le gavage peut provoquer des fausses routes, les injections des infections, et le porteur écrit : "Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques." Un test d'agrippement clôt les traitements, et l'espoir de réduire les effets indésirables des corticoïdes chez les patients reste au conditionnel, cette modulation "ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques" selon lui.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés dans le muscle squelettique.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.

Procédures

Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités au Tamoxifène par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en tripicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .

Impact sur les animaux

L’injection de tamoxifène et de dexaméthasone peut causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. Le gavage peut conduire à des fausses routes. Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.

200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie créant un défaut osseux dans la boîte crânienne, où sont implantés des biomatériaux, puis des scanners répétés sous anesthésie avant une mise à mort au CO2 pour analyses histologiques. Le projet teste des biomatériaux à base de verre bioactif censés favoriser la réparation osseuse et visibles par imagerie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour ce modèle de défaut osseux du crâne chez le rat.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de confirmer la biocompatibilité, l’ostéoinduction/conduction et le potentiel de réparation de ces nouveaux biomatériaux in-vivo, et d'établir l’impact de la minéralisation sur les particules à luminescence persistante. Ce projet nous permettra d’établir le temps de survie des particules, mais aussi d’en analyser la potentielle migration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer des biomatériaux qui présenteront des compétences ostéogéniques par la présence de verre bioactif et qui pourront être visualisables directement par imagerie.

Procédures

Procédure chirurgicale : 10 min, tous les animaux. Scanner Haute résolution sous anesthésie Isoflurane (Induction 3%, maintien 1.5%) : 15 min, J0 (200 animaux), J15 (160 animaux), J30 (120 animaux), J60 (80 animaux), J90 (40 animaux). Mise à mort par inhalation progressive au CO2 dans un système dédié : 10 min, tous les animaux, 40 animaux à chaque temps histologiques.

Impact sur les animaux

L'estimation de la souffrance de cette procédure est estimée "modérée" mais brève et bien tolérée. Au sein de cette procédure, seul l'acte chirurgicale peut mener à des suites douloureuses avec la présence d'hématome, oedeme ou désunions des sutures. Le CT-scan et la mise à mort n'ayant pas d'actions iatrogènes douloureuses. Le nombre d'animaux par groupe et par temps (10) est justifié en fonction des effets observés et permet d'envisager une étude adéquate sur le plan statistique.

Devenir

Mise à mort pour analyses histologiques

Remplacement

La régénération osseuse présente une biologie complexe impliquant la participation et l’intéraction de différents types cellulaires. Ces processus complexes ne peuvent être mimés en utilisant uniquement des cultures in vitro ou des modèles informatiques. Ces biomatériaux ont été préalablement étudiés in vitro et in vivo et ne présente aucune toxicité. Le modèle de défaut osseux de calvaria chez le rat est un modèle in vivo classiquement utilisé et il n’existe à ce jour aucune méthode alternative. A terme, ces travaux permettront de mettre au point des matériaux utilisables en clinique pour la réparation de défauts osseux de la sphère cranio-faciale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux (ici 10 animaux par groupe et par temps dû à l'implantation bilatérale des matériaux). Sur 3 ans un nombre maximum de 200 rats seront utilisés, des études par imagerie longitudinale seront effectuées à différents temps afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par temps d’analyse. Tous les matériaux sont préalablement sélectionnés sur leurs propriétés ostéogéniques démontrées in vitro et une veille bibliographique sera systématiquement effectuée pour éviter toute expérience redondante. Si nous n’observons pas de différence entre les groupes à la moitié du nombre requis d’animaux, l’expérience sera arrêtée et les matériaux repensés.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’anesthésie et d’analgésique adaptée durant les procédures avec une médication anti-douleur systématique en per et également post-opératoire, et l’établissement de points limites adéquats. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée. Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de plusieurs individus, avant et après les procédures.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de laboratoire appropriée et classiquement utilisée pour l’étude de l’inflammation et du tissu osseux. Elle permet une faisabilité technique et la biologie du tissu est proche de celle de l’homme. Notre laboratoire possède une expertise sur cette procédure. Les animaux seront âgés de 8 semaines, les animaux étant alors des jeunes adultes. Les adultes jeunes supportant mieux les chirurgies et ayant un potentiel de cicatrisation/régénération plus important. A 8 semaines, ils ont la taille minimale requise pour pouvoir créer chez le rat des défauts critique de 5mm bilatéral dans la calvaria.