Procédures modérées
Etude de pharmacocinétique et évaluation de la tolérance locale chez le chat aprés administration d’éléments d’essai différents par voie sous cutanée
- Recherche appliquée
- Maladies animales
24 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés en vie. Chaque animal reçoit une injection sous-cutanée et subit une quinzaine de prises de sang sur cinq jours, avec évaluation répétée de la douleur, du gonflement et de l'érythème au site d'injection. Le porteur indique observer grattage et vocalisations dans les minutes suivant l'injection, et vise la mise au point d'un médicament vétérinaire anti-vomitif. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la tolérance locale et juge le recours à "l'animal entier" indispensable.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de trois produits tests différents versus un produit référence aprés une simple administration sous cutanée et d'évaluer la tolérance locale au site d'injection.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer que les paramètres pharmacocinétiques de la molécule testée dans les 3 formulations tests différentes sont similaires à ceux de la référence et que ces formulations tests sont également bien tolérées par l'animal. Dans ce projet, le chat est l'espèce cible. Le bénéfice est de générer un nouveau médicament aux propriétés anti vomitives.
Procédures
Les animaux auront une seule administration en sous cutanée volume administré d'environ 0.1 mL/kg. Temps estimé pour une administration : environ une trentaine de secondes. Pendant l'administration et les 5 minutes suivantes, les mouvements de tête, le grattage, les vocalisations, le comportement et la notion d'inconfort seront particulièrement observés chez tous les animaux. Des prélèvements sanguins seront réalisés. Les prélèvements de sang se feront avant administration (jour -3), 15min, 30min, 1h, 2h, 4h, 6h, 9h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h, 96h et 120h pour les groupes 1à 3 et avant administration (jour -3), 15min, 30min, 45 min, 1h, 2h, 3h, 4h, 6h, 9h, 12h, 24h, 36h, 48h et 72h pour le groupe 4. Un volume de 1.2 mL sera prélevé à chaque temps pour chaque animal. Temps estimé pour un prélèvement de sang : environ une trentaine de secondes. Une évaluation de la tolérance locale sera effectuée à 1h, 4h, 8h aprés l'injection au jour 1 puis une fois par jour jusqu'au jour 7. Le gonflement, la douleur, la chaleur, l'induration, l'érythème, le grattage seront particulièrement observés et évalués via un système de scoring. Une contention trés légère pour faciliter l'observation du site sera faite à l'animal. Temps des observations de l'ordre de la minute, peut être plus longue en fontion des réactions aux sites d'injections. Les observations et les manipulations des animaux seront faites par un personnel formé pour éviter tout stress à l'animal.
Impact sur les animaux
Ce projet est divisé en 2 phases. Dans la phase 1, 8 animaux seront administrés. En fonction de la tolérance locale observée il sera décidé d'administrer les 16 animaux suivants ou pas. Il n'y a pas de différence entre la phase 1 et 2, les animaux seront soumis à la même procédure. Il est possible d'observer des gonflements, de la douleur à la palpation, de l'induration, de la chaleur , de l'érythème, du grattage au niveau du site d'injection. Une évaluation de la tolérance locale sera effectuée à 1h, 4h, 8h aprés l'injection au jour 1 puis une fois par jour jusqu'au jour 7. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (par exemple: hypersalivation, vomis, comportement anormal, anorexie ...). Si besoin les vétérinaires présents sur sites pourront avoir recours de la médication (analgésie, anesthésie par exemple).
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, ni de mimer la tolérance locale des produits administrés, il est indispensable de recourir à l’animal entier.
Réduction
Dans la phase 1: 2 animaux par groupe soit 8 animaux au total seront inclus. Dans la phase 2: 4 animaux par groupe soit 16 animaux seront inclus Il est donc prévu d'inclure un total de 24 animaux dans ce projet. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables.
Raffinement
Les chats seront hébergés par groupe de 2 (2 males et 2 femelles si possible par groupe pendant la periode d'acclimatation de 7 jours) mais seront en condition individuelle pendant la période de prélèvement sanguins suivant l'administration c'est à dire pendant 5 jours au maximum. Durant cette période les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible.
Choix des espèces
Espèce cible pour ce produit vétérinaire Adulte, age supérieur à 1 an. Animaux de poids supérieur à 2.5 Kg. Nécessaire pour avoir des doses homogènes entre les groupes
Etude du couplage neuromécanique par imagerie ultrasonore
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
107 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, la plupart menées sous anesthésie sans réveil. Ils subissent une chirurgie puis environ trois heures d'imagerie cérébrale, et 15 d'entre eux reçoivent cinq injections destinées à induire des crises de migraine. Le porteur reconnaît qu'il "n'est pas possible" de soulager les animaux pendant ces crises, la douleur faisant l'objet de l'étude, et applique un test de sensibilité par pression d'un poil sur la face. Il affirme qu'étudier le cerveau "entier et fonctionnel" rend impossible tout recours à l'in vitro ou l'in silico.
Objectifs
Le cerveau, comme les autres organes, nécessite un apport en énergie pour maintenir son activité. Ainsi, lors de l’exécution d’une tâche, l’activation neuronale résultante s’accompagne d’une augmentation locale du flux sanguin, permettant un approvisionnement des neurones en oxygène et nutriments. Ce phénomène physiologique, appelé couplage neurovasculaire, est à la base de plusieurs techniques d’imagerie fonctionnelle. En plus d’une augmentation de la désoxygénation locale, puis de l’afflux sanguin induits par l’activité cérébrale au cours d’une tâche qui sont les éléments clés mesurés dans de nombreux types d’imagerie, cette activité cérébrale pourrait s’accompagner de changements locaux de dureté des tissus. Ce phénomène est appelé couplage neuromécanique, par analogie au couplage neurovasculaire. Le but de ce projet est : 1) de mettre au point une méthode permettant d’étudier l’existence de ce couplage neuromécanique dans le cerveau, puis 2) de l’appliquer à l’étude d’une pathologie vasculaire cérébrale : la migraine. Ces travaux seront réalisés chez le rat anesthésié. Dans la première partie du projet, nous souhaitons développer cette technique de mesure combinée de l’activité neuronale (par suivi du débit sanguin local) et de la dureté du tissu (élastographie). Cette première partie méthodologique définira et optimisera les éléments essentiels expérimentaux de ces expérimentations, c’est-à-dire les paramètres physiques d’imagerie à utiliser pour mesurer ces deux composantes de la réponse cérébrale, mais également les conditions expérimentales permettant une activation optimale. Ces travaux reposent sur une expertise reconnue de notre laboratoire dans l’étude fonctionnelle des zones cérébrales chez le rongeur. Ainsi, 4 grands types d’éléments clefs à optimiser ont été identifiés et chacun d’entre eux sera l’objet d’une étude sur deux types de stimulations. La deuxième partie de ce projet a pour but d’utiliser cette méthologie mise au point et de l’appliquer à l’étude du couplage neuromécanique dans un modèle animal de migraine chez le rat. Nous avons choisi le modèle le moins invalidant et le plus court possible. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérience d’imagerie. Cette séance d’imagerie durera environ 3h. Aucune douleur , ni souffrance n’est attendue du fait des mesures mises en place et de l’anesthésie de l’animal au cours de la procédure.
Bénéfices attendus
Le couplage neuromécanique est un sujet qui n’a jusqu’à présent pas fait l’objet de nombreuses recherches et dont l’existence reste encore controversée dans la littérature. Les quelques études faisant état de ce phénomène physiologique utilisent la technique d’élastographie par résonnance magnétique, qui est moins précise temporellement que la technique que nous souhaitons mettre en place et nécessite un plus grand nombre d’acquisitions pour obtenir un signal exploitable. Par conséquent, le projet décrit ici pourrait permettre une observation plus fine du phénomène, sur un plus grand nombre de mesures, et comprendre ainsi le lien fondamental entre activation neuronale et élasticité des vaisseaux. Si la thématique de cette étude est très fondamentale, ce projet est aussi translationnel. En effet, le couplage neuromécanique pourrait, à plus long terme, permettre de diagnostiquer certaines pathologies vasculaires, telles que la HHT (Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia), caractérisée par l’absence de capillaires entre les veines et les artères, ou encore CADASIL, une maladie génétique qui atteint les petits vaisseaux dans le cerveau. La mesure combinée des variations de flux sanguin et de la rigidité dans le cerveau pourrait permettre de discriminer ces pathologies et d’en établir un diagnostic plus complet et plus fiable en clinique.
Procédures
Sous anesthésie générale, les animaux subiront une opération chirurgicale, pendant environ 1h. Cette anesthésie sera ensuite maintenue pour réaliser les mesures d’imagerie (les acquisitions en imagerie dureront environ 3 heures). Au cours des expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. L’anesthésie prolongée des animaux pour ces séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront suivies au cours du temps grâce au suivi des fréquences cardique et respiratoire (Labchart). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’isoflurane pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal). Comme nous voulons étudier les mécanismes neuromécaniques cérébraux associés aux douleurs migraineuses, nous devrons induire ce modèle chez 15 animaux et pour cela, réaliser 5 injections intrapéritonéales (une par jour sur 5 jours). Il est possible que certaines de ces injections induisent une douleur aiguë orofaciale transitoire. La crise migraineuse elle-même aura lieu sous anesthésie à la 5ème injection. Les animaux du groupe contrôle recevront une injection de sérum physiologique avec la meme fréquence. Il ne nous est malheuresement pas possible de soulager les animaux pendant les crises migraineuses qui pourraient se mettre en place suite aux 4 premières injections d’ISDN. Cet effet devrait être modéré cependant car il a été montré qu’il fallait attendre la 5ème injection pour observer l’induction d’une crise migraineuse. Un suivi étroit de la sensibilité orofaciale des animaux sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal si la souffrance devenait incontrôlable). Ce test de sensibilité, qui dure moins d’une heure, sera réalisé avant le développement du modèle, puis au 4ème jour d’induction du modèle. Il implique de laisser les animaux libres de leurs mouvements, seuls dans une cage ouverte. Après une phase d’habituation, l’expérimentateur appliquera un poil calibré sur la face de l’animal afin de réaliser une pression douce de ce poil. Les animaux seront directement mis à mort à la fin de la séance d’imagerie.
Impact sur les animaux
- Au cours des expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. - Les seules nuisances envisagées sont celles causées par le modèle de migraine. Comme nous voulons étudier les mécanismes cérébraux associés aux douleurs migraineuses, il ne nous est pas possible de soulager les animaux pendant les crises migraineuses qui pourraient se mettre en place suite aux 4 premières injections de la molécule induisant la migraine. La douleur associée aux crises migraineuses se mettra en place progressivement suite aux injections de la molécule induisant la migraine et correspond à une douleur modérée. Un suivi étroit de la sensibilité orofaciale des animaux sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure). Les animaux seront directement mis à mort après la dernière séance d’imagerie. Notons que la plupart de nos analyses en imagerie se feront sur animal anesthésié, limitant ainsi la perception douloureuse de l’animal. Néanmois, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront suivies au cours du temps grâce au suivi des fréquences cardiaques et respiratoires (Labchart). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’isoflurane pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal).
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront mis à mort car ils auront subi une ouverture de leur boîte crânienne donc ne pourront pas être réveillés.
Remplacement
Notre étude s’intéresse aux propritétés hémodynamiques et mécaniques du cerveau en activité, entier et fonctionnel ; il est par conséquent impossible de réaliser ces manipulations ex vivo, in vitro ou in silico. Par ailleurs, les ultrasons n’ont jamais été utilisés pour étudier parallèlement le flux sanguin et la rigidité. Aucune donnée n’a donc été collectée à ce sujet, d’où la nécessité de réaliser les manipulations décrites dans ce projet
Réduction
Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à notre projet, nous avons utilisé un logiciel de statistiques. Le nombre d’animaux ainsi estimé est de N = 10 par groupe pour la première procédure. La mise au point réalisée en manipulation préliminaire permettra de réduire le nombre d’animaux utilisé dans la suite du projet. Pour la seconde procédure, en tenant compte du fait que la différence d’effet entre nos deux groupes expérimentaux (rats migraineux et contrôles) n’est pas connue et, de plus, que 20% des animaux injectés avec le donneur de monoxyde d’azote étaient non-répondeurs, il sera nécessaire d’inclure N =12 animaux contrôles et N =15 animaux injectés avec le donneur de monoxyde d’azote. Au total, le nombre d’animaux nécessaire au projet est de 107.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Ils seront hébergés deux par deux dans une cage contenant un enrichissement (tube en carton, bois à ronger). Un suivi quotidien sera assuré, contrôlant leur comportement général, leur apparence et la présence d’eau et de nourriture (échelle de suivi de la douleur). Nous avons déterminé des points limites anticipés, liés à l’état général de santé et de bien-être et liés au modèle expérimental et aux procédures détaillées. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous définirons un score décisionnel en fonction des observations quotidiennes permettant de modifier la procédure en cours avec administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou de mettre à mort par administration d’une dose létale d’Euthasol sous anesthésie. Application d’Ocrygel sur les yeux au cours de la chirurgie pour éviter que les yeux ne se dessèchent. Pendant les acquisitions, monitoring des paramètres physiologiques (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température) pour surveiller le maintien du niveau d’anesthésie. Pendant toute la durée des actes sous anesthésie, les constantes vitales seront suivies : température corporelle, et fréquences cardiaque et respiratoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement la mise à mort de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’Euthasol.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour l’étude des bases physiologiques du cerveau car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionelle transposables à l’Homme. Du fait du développement et de la grande caractérisation morpho-fonctionnelle du cortex chez le rat et la souris, ces deux espèces de rongeurs sont – dans l’absolu – deux espèces de choix pour notre étude fonctionnelle neuromécanique. Cependant, la souris ayant une taille de cerveau significativement plus petite que celle du rat complique grandement la mise au point et l’application à court terme de la technique. En effet, une surface de cortex, ainsi que des distances de transmission de ces ondes de cisaillementvgf sont nécessaire afin de mesurer de façon reproductible ce mécanisme. Ainsi, bien que nous souhaitions à plus long terme étudier ce couplage chez la souris, ce premier projet utilise exclusivement des rats. Les mises au point seront plus faciles car le cortex étant plus grand, il y aura une plus grande place pour la propagation des ondes de cisaillement et leur mesure. Les animaux utilisés dans cette étude seront des rats adultes (7 semaines et plus) car leur cerveau est pleinement développé et d’un grand volume, adapté pour des acquisitions en imagerie.
Etude de pharmacocinétique chez le chat aprés administration de trois éléments d’essai différents par voie orale
- Recherche appliquée
- Maladies animales
12 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés en vie pour d'éventuelles procédures ultérieures. Chaque animal reçoit trois administrations orales, subit treize prises de sang sur 24 heures, un jeûne d'environ 16 heures et un hébergement individuel pendant une journée. Le porteur n'attend pas d'effet indésirable et vise à mettre sur le marché un antibiotique vétérinaire sous forme liquide. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la diffusion d'un produit dans "l'organisme entier" et juge le recours à "l'animal entier" indispensable.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de trois produits tests différents aprés une simple administration orale et de les comparer entre eux. Les trois produits tests sont le produit référent (forme galénique: comprimé), un contrôle positif (forme galénique: comprimé) et un produit test ( forme galénique : liquide)
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer que les paramètres pharmacocinétiques de l'élément test sous forme liquide sont équivalents à ceux de l'élément sous forme solide (comprimé) et similaires à ceux de l'élément contrôle positif. L'intêret est de pouvoir générer un antibiotique en administration orale sous forme liquide chez le chat.
Procédures
Les animaux auront trois administrations orales, deux sous forme d'un comprimé par animal et une administration sous forme liquide. Temps estimé par administration de l'ordre de la minute. Les prélèvements de sang seront au nombre de 13 sur 24h. Temps estimé par prélèvement: inférieur à la minute. Les animaux seront à jeun avant chaque administration et seront ré alimentés 4h aprés (durée du jeune environ 16h). Les animaux seront hébergés de manière individuelle pendant les premières 24h qui suivront l'administration. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Durée de l'hebergement en individuel: 24h maximum
Impact sur les animaux
Le produit test fait partie de la classe thérapeutique antibiotique. Il n'y a pas d'effets indésirables attendus. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation particulière par rapport aux éventuels vomissements, observation des sites de prélèvement...). Il y a 13 temps de prélèvements sur 24h par animal et par période, des précautions seront prises lors des prélèvements sanguins comme point de compression suffisament long aprés chaque prélèvement , alternance des sites de prélèvements autant que possible...
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure. Suite à cette procédure, les animaux auront une période de repos suffisament longue et pourront réintégrer une future procédure en accord avec la décision du vétérinaire responsable.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.
Réduction
12 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront répartis en 3 groupes de 4 animaux. Chaque groupe recevra chacun des éléments testés sur 3 périodes différentes. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables.
Raffinement
Les chats seront hébergés par groupe de 2 (2 males et 2 femelles par groupe) mais seront en condition individuelle pendant les premières 24h suivant l'administration pour chacune des périodes. Durant cette période les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible.
Choix des espèces
Espèce cible pour ce produit vétérinaire Adulte, age supérieur à 1 an. Animaux compris entre 2.5 et 4.5 Kg. Nécessaire pour avoir des doses homogènes entre les groupes
Étude des mécanismes de néphropathies et de lésions musculaires de la drépanocytose chez la souris et approche thérapeutique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent des prises de sang sur animal vigile et des injections, 880 sont placées en cage métabolique jusqu'à 18 heures dont une période sans eau, et d'autres portent un modèle de drépanocytose provoquant des crises douloureuses. Le porteur indique anesthésier les gestes les plus invasifs et surveiller la douleur par une grille de score. Il affirme que la souris est "le seul modèle" permettant d'étudier à la fois les atteintes rénales et musculaires de la maladie.
Objectifs
La drépanocytose est la maladie génétique du sang la plus fréquente au monde. Cette maladie se manifeste par une déformation et une rigidification des globules rouges. Ces globules rouges déformés sont plus fragiles et sont la source de l’anémie hémolytique décrite chez les patients drépanocytaires. La forme en faucille de ces globules rouges favorise leur agglomération, l’interruption du flux sanguin et par conséquent, des crises vaso-occlusives, très douloureuses, au niveau de tous les organes du corps. La répétition de ces ischémies (un arrêt ou insuffisance de la circulation sanguine dans une partie du corps ou un organe, qui prive les cellules d'apport d'oxygène) induit des lésions sévères, notamment des organes les plus vascularisés et donc une réduction de la qualité et de l’espérance de vie des patients.Notre projet se concentre sur deux complications chroniques majeures de la drépanocytose : la maladie rénale et la fonte musculaire en s'intéressant aussi le point sur d’autres atteintes tel que la cardiomyopathie et la rétinopathie associée a la drépanocytose. Ainsi, les objectifs de notre projet sont de comprendre : 1- comment telles altérations multi-organes se produisent 2- si le muscle altéré peut avoir des effets déletèrent sur le rein ou vice-versa 3- comment pourrait on les prévenir ou les traiter
Bénéfices attendus
Cette étude pourra révéler une voie commune jusqu'alors non reconnue affectant à la fois le rein et les muscles dans la drépanocytose et éventuellement d'autres maladies hématologiques hypoxémiques. Elle pourra apporter une stratégie thérapeutique puissante pour la progression de la maladie rénale chronique et la fonte musculaire chez les patients atteints de cette maladie. En outre, l'exploration d'une interférence potentielle entre le néphropathie et la sarcopénie associées à la drépanocytose ouvre un nouveau domaine de recherche.
Procédures
Tous les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang de 20 microlitres a sur souris vigile maintenue en contention manuelle. 160 souris subiront une injection deux fois par semaine pour six semaines sur souris vigile. 160 souris subiront une injection pour 5 jours consécutifs sur souris vigile. 160 souris subiront une injections de la patte postérieure aprés anésthésie gazeuse. 160 souris subiront deux injections séparées de 56 jours, de la patte, postérieure aprés anésthésie à l'isoflurane. 80 souris subiront une injection aprés anésthésie gazeuse. Tout les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang aprés anésthésie à l'isoflurane et avant mis à mort. 880 souris seront mises en cages metaboliques, pour deux fois, séparées de 24 heures. La premier confinement en cages metaboliques sera pour 18 heures, le second sera pour 6 heures. 880 souris subiront deux mesures de pressions de 20 minutes non ivasives sur souris vigiles sur deux jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Les souris subiront le stress d'être isolées pendant 20 minutes pour les mesures de pressions. Elles subiront aussi le stress d'être isolées pendant 6 heures allant jusqu'à 18 heures en cages metaboliques. Elles resteront sans eau pour 18 heures lors du confinement en cage metabolique. Elles subiront une douleur minime lors de certains prélèvements et injections. Cependant, lors des procédures plus invasives les souris seront anésthésiées à l'isoflurane et analgésiées.
Devenir
Etant donné que les organes de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.
Remplacement
Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concernent l'étude des maladies glomérulaires et musculaire car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés à la taille de nos échantillons. Pour chaque animal, un maximum d'organes et de prélèvement biologique sera fait afin de ne pas avoir à refaire des experiences sur de nouveaux animaux.
Raffinement
Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises : 1) Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bihebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie. 3)Les procédures invasives tel que certaines injections seront réalisées aussi sous anesthésie et les souris recevront un traitement analgésique qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère et d'utiliser la recombinaison homologue ou l'excision allélique dirigée afin de connaitre la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. A partir de 4 semaines, une fois que le sevrage physiologique est effectif et jusqu'à 6 mois pour ne pas observer une potentielle fibrose rénale liée au vieillissement. En effet, l'âge est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop âgées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.
Implication du PEDF (Pigment Epithelial Derived Factor) sur la vascularisation osseuse et les ostéoprogéniteurs dans la formation osseuse chez la souris adulte.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes de tériparatide pendant trois semaines, une chirurgie mettant le tibia à nu pour y appliquer une sonde laser sous anesthésie sans réveil, un passage au micro-scanner et une injection de nanobilles par voie rétro-orbitaire. Le porteur situe l'intérêt dans une meilleure compréhension, "sur le long terme", des traitements de l'ostéoporose, alors que le prélèvement des os après la mort est immédiat. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser in vitro la moelle osseuse, jugée trop complexe.
Objectifs
Avec l'âge, on constate une diminution de la formation osseuse qui peut entraîner des maladies osseuses comme l'ostéoporose qui se caractérise par une fragilisation de l'os qui induit une augmentation du risque de chute et donc de fracture. Différents traitements contre cette maladie existent comme l'injection intermittente de tériparatide (fragment de l'hormone para-tyroïdienne) qui stimule la formation osseuse. Il a été montré récemment que le tériparatide stimule l'expression de gènes impliqués dans l'inhibition de l'angiogénèse (formation des vaisseaux sanguins) comme le PEDF (Pigment Epithelial-Derived Factor) par les ostéoblastes. Il semble donc avoir un lien entre la formation osseuse et la vascularisation et que cette relation serait médiée par le PEDF. Ce projet consiste donc à évaluer l'effet du tériparatide sur la formation osseuse dans un modèle de souris déficiente en PEDF (KO PEDF). Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre l’implication du PEDF dans la formation osseuse et de mieux appréhender les mécanismes moléculaires qui régissent le détachement des cellules ostéoprogénitrices des vaisseaux et de leur migration vers les surfaces osseuses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication du PEDF dans la formation osseuse et d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui régissent le détachement des cellules ostéoprogénitrices des vaisseaux et leur migration vers les surfaces osseuses. Sur le long terme, cela nous permettra de mieux comprendre le mode d’action de certains traitements contre les maladies osseuses comme l’ostéoporose.
Procédures
Injection sous-cutanée journalière de tériparatide à 100 µg/Kg ou solution saline pendant 3 semaines. La perfusion sanguine osseuse se fait in vivo par technique LASER Doppler développée par notre laboratoire. Elle se fait sur animaux sous anesthésie gazeuse (Isoflurane), placés sur une couverture thermique avec une sonde rectale rétro-contrôlant leur température corporelle. Une incision cutanée est effectuée sur la face antérieure du tibia sous loupe grossissante. Le muscle tibial antérieur est récliné pour mettre à nu la face antéro interne du tibia. La sonde Laser est alors placée au contact de l’os. La patte est immobilisée dans une boule d’alginate pour empêcher tout mouvement. La mesure se fait sur 3 zones : au métaphyse haute, métaphyse basse et diaphyse pendant 30s et sont répétées 4 fois. La pression artérielle est mesurée avant et après la perfusion pour s’assurer de la stabilité hémodynamique de la souris. L’analyse par micro-tomodensitométrie de la masse et architecture osseuse se fait in vivo sur animaux sous anesthésie gazeuse (Isoflurane). Pour analyser de façon longitudinale l’évolution des paramètres osseux, une mesure est réalisée à l’inclusion et 3 semaines après l’injection quotidienne de tériparatide ou de solution saline. Les animaux sont préalablement anesthésiés puis immobilisés par bandes adhésives sur un support et placés à l’intérieur du scanner pour faire la mesure. Celle-ci se fait par émission de rayons X par une source qui tourne à 360° autour de l’échantillon, ce qui permet de faire une reconstruction 3D des structures minéralisées. La mesure dure 20min. L’injection de nanobilles fluorescentes se fait par voie retro orbitaire chez l’animal anesthésié. Les billes sont en suspension dans une solution aqueuse. Les souris sont sacrifiées après l’injection des billes.
Impact sur les animaux
L’injection de tériparatide se fait par voie sous-cutanée et celle de tetracycline se fait par voie intrapéritonéale. Ces procédures sont donc de classe modérée. On s’attend à un léger stress après les manipulations. Les mesures de masse osseuse par mCT ainsi que les injections retro orbitaires se font sous anesthésie gazeuse générale (Isoflurane). Cette procédure est donc de classe legère. La mesure de perfusion et la chirurgie qui s’y rapporte se fait également sous anesthésie gazeuse (Isoflurane) sans réveil.
Devenir
Mise à mort car il faut prélever les os des pattes pour pouvoir analyser les paramètres osseux par istomorphométrie et faire des marquages immunohistochimiques.
Remplacement
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Compte tenu du fait que la moelle osseuse est un tissu complexe constitué de très nombreux types cellulaires, il est impossible de modéliser ces expérimentations in vitro.
Réduction
En accord avec le pourcentage des variations observées dans les mesures des paramètres biologiques et pour réaliser une étude statistique solide, il faut au total 72 souris KO-PEDF et 112 souris sauvages (Roche et al 2013). Les souris de chaque génotype seront séparées en 2 groupes : 1 traité par tériparatide pendant 3 semaines (n=36) et un groupe contrôle traité par solution saline (n=36) sauf 40 sauvages utilisées pour les mises au point. - n=40 souris sauvages seront utilisées pour la mise au point de la technique de tri cellulaire et la mesure de la perméabilité vasculaire. Dix souris seront utilisées pour la mise au point du tri cellulaire. Trente souris seront utilisées pour la mise au point de la mesure de perméabilité. Sur chaque groupe : - 10 souris auront leur perfusion sanguine mesurée par LASER Doppler sous anesthésie gazeuse (Isoflurane). Afin de réduire le nombre de souris, les os de ces souris sont, après mise a mort, utilisés pour mesurer les paramètres osseux par histomorphométrie et pour l’immunohistochimie. - n=9 seront utilisées, à cause de la grande variabilité interindividuelle, pour l’analyse de transcriptome par Nanostring. - n=8 seront utilisées pour l’étude ex vivo de la migration des cellules LepR+. L’étude sera d’abord faite uniquement sur des souris sauvages pour vérifier la faisabilité de l’expérience. - n=9 seront utilisées pour l’analyse de la perméabilité vasculaire médullaire par injection de nanobilles fluorescentes.
Raffinement
Les animaux seront manipulés en limitant le stress au maximum, par des personnes compétentes en expérimentation animale, un temps d’acclimatation sera prévu avant toute manipulation et une définition précise des points limites conduisant à l’arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des souris. Une surveillance adaptée (observation des animaux) permettra de limiter au maximum la souffrance. L’injection de tériparatide se fait par voie sous-cutanée et celle de tétracycline se fait par voie intrapéritonéale. Ces procédures sont donc de classe modérée. On s’attend à un léger stress après les manipulations. Les mesures de masse osseuse par mCT ainsi que les injections retro orbitaires se font sous anesthésie gazeuse générale (Isoflurane). Cette procédure est donc de classe légère. La mesure de perfusion et la chirurgie qui s’y rapporte se fait également sous anesthésie gazeuse (Isoflurane) sans réveil.
Choix des espèces
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la micro vascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués, ce qui est impossible à faire in vitro. Nous avons, de plus, validé toutes nos mesures chez des souris et le travail sera effectué chez des souris dont le gène du PEDF a été invalidé. Le mutant KO-PEDF chez la souris est une souche robuste sur laquelle des études ont déjà été faites, c’est donc actuellement le meilleur modèle. On utilise des souris adultes de 4 mois car on cherche à évaluer l’implication du PEDF dans un os mature.
Exploration de la pression arterielle chez la souris in vivo
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
1 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, une large part étant menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections et des mesures de pression artérielle par brassard à la queue, et 530 d'entre elles portent un modèle de sclérose latérale amyotrophique entraînant une paralysie progressive des membres. Le porteur indique adapter les cages avec des tétines allongées pour les animaux affaiblis, et affirme qu'"il n'existe pas de modèle de remplacement" pour cette maladie. Il présente les retombées thérapeutiques au conditionnel et à terme, alors que la mise à mort des animaux est certaine.
Objectifs
L'ensemble des grandes fonctions de notre organisme (digestion, respiration, régulations cardiovasculaires...) est sous le contrôle du système nerveux autonome. Celui-ci se divise en deux grandes branches : le système nerveux autonome sympathique (SNAS) et le système nerveux autonome parasympathique. Nous menons actuellement au laboratoire deux projets de recherche qui utilisent la même procédure expérimentale afin de savoir (1) si certains neurones thoraciques de la moelle épinière qui présentent des propriétés de senseur chimique font partie du SNAS et (2) si lors de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), le SNAS est altéré et contribue à la physiopathologie de cette maladie. Afin de répondre à nos questions, nous regarderons l'effet de molécules, connues pour activer le SNAS, sur la pression artérielle. Celle-ci sera mesurée au niveau de la queue chez l'animal avec un système de brassard comme utilisé chez l’homme. Deux types de modèles murins seront utilisés dont un est un modèle murin de la SLA qui récapitule la maladie humaine (dégénérescence progressive des motoneurones entrainant progressivement une paralysie). Nous faisons l'hypothèse que les modifications génétiques portées par les souris modifient le fonctionnement du SNAS et que sa stimulation induira des effets différents entre souris sauvages et génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet éthique fait partie d'un nouvel axe de recherche développé depuis deux ans au laboratoire qui vise à comprendre l'organisation et le fonctionnement du SNAS en situations physiologique et physiopathologique. Dans le contexte de la SLA, les données sur le SNAS sont parcellaires. Des données récentes montrent que le SNAS exerce un contrôle extrêmement puissant à tous les étages de la communication entre motoneurones et muscles. Nous espérons donc que cette étude permettra de démontrer l'implication du SANS dans la SLA et donc potentiellement à terme de développer de nouveaux outils thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle encore aujourd'hui aucun traitement même partiel n'existe.
Procédures
1320 animaux recevront une à deux injections sous anesthésie générale sans autre procédure invasive. 50 mâles seront utilisés comme reproducteurs mais euthanasiés avant tous développement de signes cliniques liés à la maladie.
Impact sur les animaux
530 animaux présenteront un phénotype dommageable similaire aux symptômes de la SLA (sclérose latéral amyotrophique) avec diminution de la motricité des membres postérieurs. L'ensemble des animaux (1370) subiront une mise en contention, 2 à 3 injections sous cutanées, une anesthésie sans réveil ainsi que des mesures de pression artérielle répétées au niveau de la queue
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés dès la fin des manipulations.
Remplacement
Il n'existe pas de modéle de remplacement pour aborder la physiologie et la physiopathologie du système nerveux et de la maladie étudiée (SLA ou Sclérose Latérale Amyotrophique)
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous proposons d'injecter deux molécules d'interet par animal. Il n'est neanmoins pas possible d'augmenter le nombre de ces injections afin de limiter les effets croisés entre composés actifs. Le nombre d'animaux par lots à été déterminé grâce à un logiciel de statistiques en estimant qu'une différence est significative à partir de 5mmHg entre les groupes. Les analyses seront faites avec des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le système de mesure de pression artérielle externe permet de n'être absolument pas invasif puisqu'il consiste en la pose d'un ballonnet sur la queue, similaire à ce qui est utilisé sur les bras des patients humains lors de consultations médicales. Les animaux présentant un phénotype dommageable seront suivis quotidiennement avec une grille de scoring validée. Des dispositifs d'adaptation de la vie des animaux commençant à présenter des faiblesses au niveau des membres seront mis en place comme des tétines de biberon plus longues et de la nourriture dans la cage pour un accès à l'alimentation et à l'eau facilité.
Choix des espèces
La souris est un modele le dont le genome est parfaitement connu. Le choix de l'espece souris est motivé par la présence de modeles genetiquement modifiés extremement pertinents pour les questions scientifiques posées. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Les souris présentant un déficit d'un gène codant pour un canal calcique seront utilisées lorsqu'elle auront entre 8 et 10 semaines (l'expression visible de l'absence du canal ne changeant pas avec l'âge) . Les souris présentant la maladie SLA (sclérose latéral amyotrophique) seront analysées à différents stades de la maladie et donc à différents âges (pré et postsymptomatiques): 21 jours, 40 jours, 60 jours, 75 jours, 90 jours, 105 jours et 110 jours d'âge).
Effet d’un traitement par exposition au plasma froid sur un modèle de carcinogenèse prostatique murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Des souris ont l'abdomen ouvert pour que leur prostate soit exposée à une torche à plasma froid ou à un simple jet d'hélium, puis vivent sept jours avant d'être tuées pour l'analyse du tissu traité. 96 souris transgéniques, privées du gène suppresseur de tumeur PTEN et atteintes d'un cancer de la prostate, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour préparer l'emploi de la torche lors des ablations de la prostate chez des patients. Le porteur attend des effets indésirables "plutôt mineures", et écrit aussi que ce traitement "reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir". Les souris sont hébergées en cage individuelle, ce que le résumé range sous un "enrichissement renforcé".
Objectifs
Le projet est basé sur l’intérêt de l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale (ablation de la prostate) chez des patients présentant un cancer localisé. Il existe aujourd’hui plusieurs appareillages pour le traitement focalisé d’une tumeur mais sans prostatectomie (Ultrasons, lasers, radiothérapie etc.). En revanche, l’utilisation de module spécifique pour le traitement des marges chirurgicales au cours de la prostatectomie est très limitée et encore exploratoire. De plus, la très large majorité des prostatectomies sont aujourd’hui réalisées par assistance robotisée sous coelioscopie. Cette technologie connaît un essor exponentiel et constitue une aire de développement technologique de premier plan dans la chirurgie de la prostate. L’opportunité de traiter avec une source plasma constitue donc une approche nouvelle qui nécessite d’être évaluer in vivo avant tout transfert technologique vers la clinique. La torche à plasma froid est constitué́ de deux électrodes entourant un tube de quartz dans lequel est injecté de l'hélium. Des pics de tension sont appliqués, transformant l'hélium et l'air environnant en plasma (mélange d'ions, de radicaux et d'électrons). Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par plasma sur un modèle de cancer de la prostate induit chez des souris transgéniques. Une étude pilote sur un modèle de souris ayant subi une greffe de cellules tumorales dans la prostate nous a permis d'identifier les paramètres de fonctionnement de la torche à plasma in vivo. Ainsi, deux paramètres seront étudiés, i) l’effet spécifique du plasma comparé à de l’hélium non excité et ii) l'impact du milieu d’imprégnation du tissu pendant son exposition au plasma. Les zones de traitement seront analysées par des approches histologiques et moléculaires. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude pilote sera conduite permettant de vérifier la pertinence du traitement par plasma froid.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à caractériser in vivo l'effet d'une exposition d'un tissu tumoral à une source de plasma froid. Nous souhaitons ainsi obtenir, sur ce modèle préclinique, des informations sur le type de lésions engendré: apoptose? nécrose? inflammation? et la profondeur tissulaire atteinte. Ces résultats ont une valeur importante et capitale pour envisager un transfert vers la clinique humaine. Un projet vient d'être accepté dont l'exploration fonctionnelle sur ce modèle vivo fait parti. Par ailleurs, nous avons montré, ex vivo, que le milieu d'imprégnation des cellules tumorales est un paramètre important. Nous allons donc testé 2 milieux caractéritique pour tester l'efficacité de la torche in vivo : un milieu phosphate buffer saline (PBS 1X) de formulation très simple et un milieu de culture plus complexe adapté à la croissance des cellules tumorales prostatiques (RPMI1640).
Procédures
Les animaux subiront une laparotomie et un traitement par plasma froid de la prostate antérieure ou un traitement control (expostion jet Helium). L'ensemble de la procédure opératoire dure en moyenne 10 minutes +/- 2minutes. Les animaux seront maintenus en hébergement pendant 7 jours avant leur mise à mort et le prélèvement des tissus d'interêt. Les animaux pourront être pris en charge par un traitement anti-inflammatoire AINS le cas échéant par injection intraperitonéale. Cette injection, contention de l'animal comprise, durera environ 15 secondes.
Impact sur les animaux
Les potentiels effets indésirables sont attendus comme plutôt mineures puisque que le traitement est localisé à la prostate antérieure qui ne constitue pas un organe essentiel à la survie de l'animal. Par ailleurs, la procédure de traitement de la prostate par laparotomie est une procédure exécutée en routine par l'équipe et dont les suites post-opératoires sont completement connues et maitrisées. Toutefois, il est possible que le traitement par le plasma conduisent à une réponse inflammatoire du tissus prostatique. Grâce au suivi renforcé, nous surveillerons les points limites en terme de mal être ou de souffrance qui conduiraient à l'utilisation d'un traitement anti-inflamatoire si cela s'avérait nécessaire.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés et prélevés pour analyse du tissu prostatique traité.
Remplacement
La caractérisation des effets du plasma sur les tissus tumoraux sera complétée par des expositions sur des organoïdes et des tumoroïdes permettant ainsi de ne pas recourir à l'expérimentation animale. Ces experiences conduites in vitro permettent de calibrer des paramètres critiques (tension, débit helium, temps d'exposition...) du jet plasma sur des modèles intermédiaire entre culture 2D et modèle vivo. Cette approche permet dans une certaine mesure d'anticiper la réponse in vivo. Pour autant, l'utilisation sur le modèle souris est indispensable pour valider cette technologie sur organisme mammifère entier et envisager un transfert vers la clinique humaine.
Réduction
Ce projet d'exposition au plasma froid fait suite, d'une part, à des travaux réalisés en culture cellulaire qui ont permis de caractériser les paramètres d'utilisation de la torche à plasma froid, et d'autre part, à une expérimentation pilote sur un modèle de greffes orthotopiques intra-prostatiques. Ainsi, toute une partie du projet a été réalisé sur des modèles cellulaires en remplacement du modèle vivo et permet de limiter l'utilsation de l'animal à des conditions expérimentales que nous avons définies au préalable ex vivo. Concernant le nombre d'animaux utilisés pour l'étude, il est justifié pour assurer une puissance statistique suffisante pour l'exploitation des résultats et paramètres biologiques.
Raffinement
Le traitement par plasma froid d'un tissu vivant reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir. Ainsi l'emergence potentielle de mal être ou souffrance de l'animal sera étudiée grâce à un suivi renforcer (visites 2x par jour). Si nécessaire les animaux pourront recevoir un traitement anti-inflammatoire. Enfin, les cages seront soumis à un enrichissement renforcé : cage individuelle avec tube carton et pad-fibre.
Choix des espèces
Modèle de souris transgénique invalidé pour l'oncosuppresseur PTEN. pas d'équivalent dans d'autres espèces adaptées à l'étude. Nous utiliserons de souris agées au moins de 6 mois qui permettront de traiter un carcinome de prostate installé. (Cinétique de carcinogenèse très largement décrite dans la littérature et maitrisée par l'équipe de recherche).
Suivi de la mobilité de la lamproie de Planer, de la truite et du chabot en rivière et de l’efficacité des mesures de restauration de la continuité écologique
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres poissons : 700
1 000 poissons, 700 lamproies et chabots et 300 salmonidés, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés dans leur rivière. Chaque individu est capturé, anesthésié, mesuré, pesé, puis reçoit un transpondeur implanté par une incision ventrale, en restant hors de l'eau entre 30 secondes et une minute. Le porteur affirme que la cicatrisation est "généralement très bonne" et que l'implantation a "peu d'impact" sur le bien-être des animaux non-humains, tout en signalant une mortalité post-opératoire possible et une perte de puce chez certains individus. Il justifie l'étude par l'évaluation, en milieu naturel, de dispositifs de franchissement destinés à restaurer la continuité écologique.
Objectifs
L’objectif principal est de mesurer la mobilité des lamproies de Planer avant leur reproduction, dans deux cours d’eau présentant des obstacles à la continuité écologique, puis d’évaluer ensuite le bénéfice de l'installation de dispositifs de franchissement (passes) aménagés pour les lamproies. Les deux cours d’eau étudiés abritent également des populations de truite et de chabot, deux espèces pouvant bénéficier des actions mises en œuvre pour la lamproie, et qui seront également intégrées à l’étude. Les déplacements individuels des trois espèces seront analysés en utilisant des marquages à l'aide de puces électroniques et de dispositifs de détection fixes et mobiles.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’acquérir des informations sur les déplacements des lamproies de Planer en milieu naturel et leurs capacités à emprunter des dispositifs de franchissement existants (passes à poissons) ainsi que des dispositifs expérimentaux spécifiquement conçus pour cette espèce (rampes à rugosité). Le bénéfice de ces aménagements pour les autres espèces à enjeu (truite et chabot) sera également analysé. Cette étude servira de retour d’expériences en vue de proposer des adaptations dans le cadre des futurs projets de restauration de la continuité écologique.
Procédures
Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur sera implanté manuellement sur 1000 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.
Impact sur les animaux
La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des puces est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel. L'implantation n'a pas ou peu d'impact sur le bien-être animal ou la reproduction, car la puce utilisée présente une taille minimale adaptée à la taille de l'individu. En outre, la taille de l'incision est faible, de l'ordre de 2-3 mm.
Devenir
Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.
Remplacement
Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire de l’espèce considérée, dans le cas présent la lamproie de Planer, la truite de rivière et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.
Réduction
Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si report des marquages en cas de conditions environnementales très défavorables). L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux dans les deux rivières, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité des ouvrages aménagés (2 aménagements visés / rivière). Il est adapté au gabarit des cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la lamproie, il peut être attendu un taux de montaison de 30%, taux moyen constaté dans une précédente étude en milieu naturel. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des puces ne génère en principe pas (ou très peu,
Raffinement
Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront stockés dans un vivier placé dans la rivière. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et pour éviter l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie. Les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. L’expérience du personnel permet de réduire le temps global de manipulation à moins d’une minute. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal (marquage des lamproies > 120 mm à l’aide de tags de 12 mm). Les individus seront placés sur une éponge imbibée d’eau au moment du marquage. Pour les truites, un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée après marquage au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par le vétérinaire référent).
Choix des espèces
L’espèce cible prioritaire est la lamproie de Planer (Lampetra planeri), espèce abondante dans les deux cours d’eau concernés et impactée par la présence d’ouvrages limitant sa migration. A notre connaissance il existe très peu d’études sur la migration de l’espèce, ses capacités de franchissement d’obstacles et le bénéfice réel des passes à rugosité. Les autres espèces cibles sont la truite commune (Salmo trutta) et le chabot (Cottus gobio) qui peuvent également bénéficier des aménagements réalisés (passes) au cours de ce projet. Pour les lamproies, le stade adulte (après métamorphose) sera ciblé, puisqu’il s’agit d’une étude sur le comportement avant reproduction. Toutefois, la métamorphose pouvant intervenir durant l’hiver donc après les opérations de marquage, les ammocètes de grande taille (> 120 mm) seront également marquées si l’effectif d’adultes escompté n’est pas atteint. Pour les truites, les juvéniles seront marqués dès 80 mm, à l’aide de puces de 13 mm ; les sub-adultes et adultes dès 120 mm à l’aide de puces de 23 mm. Pour les chabots, seuls les individus sub-adultes et adultes > 80 mm seront marqués à l’aide de puces de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2% (
Effet de molécules inhibitrices d’épissage et du complexe spliceosome/histone désacétylase (HDAC) dans des modèles PDX pédiatriques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des traitements par voie orale et par injections répétées pendant quinze jours, sur des modèles de cancers pédiatriques dérivés de patients. Le porteur situe les retombées dans l'objectif "final" d'augmenter la survie des patients, alors que le prélèvement des tumeurs et des organes après la mort des animaux est immédiat. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le comportement tumoral et conclut que le modèle in vivo reste "indispensable".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : i) D’évaluer l’impact des inhibiteurs d’épissage connus ii) Et des nouvelles molécules duales inhibitrices du complexe spliceosome et et histone désacétylase comme immunomodulatrices sur la réponse anticancéreuse dans les cancers pédiatriques. Après plusieurs tests in vitro, nous avons isolé plusieurs molécules candidates et ce, sur plusieurs lignées de cellules murines à l’origine du neuroblastome (8 molécules), d’ostéosarcome (8 molécules), et de rhabdomyosarcome (8 molécules). Dans une première étape nous testerons ces molécules sur des modèles de tumeurs sous cutané ectopique dans des souris immunocompétentes afin de sélectionner les molécules efficaces et les voies d’injections des molécules. Ceci nous permettra d’utiliser un nombre minimal de souris dans ce projet de modèles PDX. Pour cela, nous utiliserons les méthodes et modèles expérimentaux suivants : i) Des souris NSG qui serviront de modèles de souris PDX. Pour cela des biopsies de patients seront utilisés. Nous utiliserons deux neuroblastomes, deux ostéosarcomes, deux sarcomes d’Ewing et deux rhabdomyosarcomes
Bénéfices attendus
Les résultats du projet démontreront si le spliceosome peut être une cible thérapeutique dans les cancers pédiatriques avec comme objectif final l’identification de potentielles combinaisons médicamenteuses capables d’augmenter ultérieurement la survie des patients.Ce projet apportera les éléments précliniques permettant d’évaluer l’effet thérapeutique de nos molécules et de mieux comprendre les mécanismes liés à ces molécules. Afin de modéliser ces modèles tumoraux pédiatriques, nous utiliserons des modèles dérivés des patients (PDX) dont deux neuroblastomes, deux ostéosarcomes, deux sarcomes d’Ewing et deux rhabdomyosarcomes
Procédures
Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée pour le developpement des tumeurs pédiatriques (durée 5 minutes). Dans le cas de la voie d'administration per os, les souris seront administrées 2 à 4 fois par semaine pendant 2 semaines (durée 30 secondes). Un prélevement de sang unique, sera réalisé sous anesthésie générale. Les traitements par injection seront faits toutes les 24h, 48h ou 72h et ce durant 15 jours (durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels seront ceux liés à la présence de tumeurs uniques sur le flanc, sous la peau, ainsi que ceux liés aux traitements par injection ou administration orale..
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem.
Remplacement
Il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’évaluer les interactions entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi, la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique a recours à un modèle animal. Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d'appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents système au sein de l'organisme (systeme vasculaire, immunitaire...), l'utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l'efficacité de nos molécules et leurs liens avec les mécanismes oncogéniques et metastiques des cancers mais également explorer et valider l'efficacitté de thérapies susceptibles d'être utilisées chez les patients.
Réduction
Une étude approfondie de la littérature a été menée avant d’initier ce projet pour s’assurer de l’absence de résultats publiés s’approchant des objectifs de notre étude. Le nombre d’animaux utilisé lors des expériences sera établi de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux utilisé tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d'utiliser un nombre suffisant d'animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan statistique. Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant des tests non-paramétriques dont l'application ne requiert pas la vérification préalable de la normalité incompatible avec les petits échantillons.
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de detecter précocement un developpement de la tumeur. Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée. Pour la limiter, nous avons établie une grille d’observation visant à définir des points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et cadrant les mesures prises à l’apparition des premiers signes de contrainte/ douleur. Si nous détectons des signes de stress ou de douleur anormaux, nous donnerions un antalgique morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d'une anesthésie locale. Les animaux seront stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement du milieu est également apporté par des sizzlenests et de maisons en cartons.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches immunodéprimées qui permettent le développement de tumeur d'origine humaine. Nous utiliserons des souris jeunes (animaux âgés entre 4 et 6 semaines au début de protocole) au moment de l'injection des cellules tumorales. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance et l'adolescence. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des jeunes animaux âgés de 4 semaines à 6 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement
Etude de la réponse immunitaire induite par la radiothérapie interne vectorisée du mélanome seule et associée à des inhibiteurs de checkpoints immunitaires
- Recherche appliquée
- Cancers
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées par voies intraveineuse, sous-cutanée, intra-tumorale et intra-péritonéale, portent une tumeur de mélanome et subissent une radiothérapie interne associée à des immunothérapies. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer perte de poids, nécrose ou infection de la tumeur, et qu'une étude de survie ne permet pas de garder les animaux en vie. Il conclut qu'un "modèle syngénique" est indispensable pour étudier la réponse immunitaire, ce qui "impose" selon lui le recours à la souris.
Objectifs
Au cours de ce projet préclinique évaluant différents schémas d’associations de la radiothérapie interne vectorisée (RIV) par le radioligand de la mélanine avec des inhibiteurs de checkpoints immunitaires (ICI), nous chercherons à déterminer quelle séquence de traitement (concomitant ou séquentiel) et quelles modalités (1 ou plusieurs injections de RIV) donnent les meilleurs résultats en terme de survie, de croissance tumorale et de synergie, dans des modèle in vivo de mélanome.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de compléter nos connaissances sur les modifications de laréponse immunitaire antitumorale induite par la RIV et de déterminer la meilleure séquence thérapeutique d’association de la RIV avec l’immunothérapie pour le mélanome métastatique.
Procédures
Sur animal vigile : - Injection intraveineuse veine caudale (1 à 3 injections par animal en fonction des études, 1 minute par injection) Sur animal anesthésié - Injection sous-cutanée (1 injection par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection) - Injection intra-tumorale (1 injection par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection) - Injection intra-péritonéale (4 injections par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus dans cette étude sont principalement liés à la croissance tumorale (perte de poids, altération de l’état général de l’animal, nécrose ou infection de la tumeur, difficulté de mobilisation).
Devenir
Les procédures prévus pour ces études (prélèvement des tumeurs, étude de survie) ne permettent pas de maintenir les animaux en vie à la fin de la procédure.
Remplacement
Les études de l’impact d’un traitement ou d’une combinaison de traitements sur le système immunitaire requièrent des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant. Notamment, la mise au point de nouvelles stratégies de combinaisons de traitements anticancéreux demande des études précliniques sur des modèles animaux. Les immunothérapies anticancéreuses requièrent de plus la présence du système immunitaire, imposant donc le recours à un modèle syngénique.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. Dans la procédure 1, des groupes contrôle communs à différents modèles ont également été prévus. De plus, la procédure 2 permet également de réduire le nombre d’animaux en ne testant qu’une seule hypothèse en procédure 3. Le nombre total d’animaux est de 736 souris maximum sur une période de 5 ans.
Raffinement
Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisés afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20% du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection……). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle souris est adapté pour les études fondamentales et appliquées de développement et traitements des cancers. Un modèle syngénique est indispensable pour étudier in vivo une réponse immunitaire. Les animaux utilisés seront des adultes de 4-5 semaines ayant atteint leur maturité sexuelle afin d'éviter l'influence des variations hormonales liées à la puberté.
Impact des fongicides sur l’établissement de l’unité neurovasculaire au cours du développement cérébral
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
3 678 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nouveau-nés reçoivent des injections sous-cutanées, 2 400 subissent une perfusion intracardiaque sous anesthésie sans réveil, et les géniteurs comme leur descendance sont exposés à des fongicides via l'eau de boisson jusqu'à des stades allant de 5 à 60 jours. Le porteur relie ce travail à la hausse des troubles du spectre autistique, mais situe les retombées thérapeutiques dans l'espoir d'identifier de nouvelles cibles, alors que les prélèvements de cerveaux, eux, sont certains. Sur le remplacement, il affirme que le modèle murin est "essentiel" et qu'"il n'existe pas non plus d'autres modèles" pour répondre à ses questions.
Objectifs
Depuis quelques années, une augmentation du risque du trouble du spectre de l'autisme (TSA) est retrouvée chez les enfants. Si la plupart des gènes responsables du TSA sont identifiés, l'implication de la composante environnementale reste peu étudiée. Pourtant les femmes enceintes et qui allaitent consomment quotidiennement des pesticides (dont font partie les fongicides); et les effets d'une expostion prénatale à ces produits sur le neurodéveloppement restent à déterminer. La recrudescence de cas de TSA pose la question de l'impact de ces fongicides dans la prédisposition au TSA et le développement cérébral. Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de neurones mais également de cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers permettent la communication entre le sang et les neurones. La majorité des études sur le TSA se focalisent sur les neurones, cependant le rôle des astrocytes et de leur interface avec les vaisseaux sanguins cérébraux sont importants et largement méconnus. C'est pourquoi notre étude portera sur ces deux composantes. La prévalence au TSA, ainsi que les symptômes, se trouvent être différents entre les femmes et les hommes. Nous réaliserons donc cette étude dans des modèles murins chez les deux sexes, afin d’évaluer l’impact des fongicides dans le développement cérébral selon le sexe. Notre étude permettra de mieux comprendre le mode d’action des fongicides sur le développement cérébral et plus particulièrement sur la composante vasculaire et gliale grâce à des techniques de biologie moléculaire et biochimique (PCR, western-blot, RNA Seq) et des techniques d’imageries (microscopie confocale, à feuille de lumière). Pour cette étude un nombre total de 3678 animaux.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de mieux comprendre le mode d’action des fongicides sur le développement cérébral de souriceaux nouveau-nés sains et prédisposés génétiquement aux TSA, dans l’espoir d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter au plus tôt contre les malformations cérébrales induites par les pesticides, même à faibles doses.
Procédures
Trois interventions seront utilisés dans ce projet. 1) Injection sous-cutanée chez des nouveau-nés de 1 jour et dure 1 minute au maximum (temps d'injection et délai avant de retirer l'aiguille pour que la solution ne sorte pas). Elle est sans douleur et ne nécessite pas d'anesthésie. Nombre d'animaux concernés : 600 animaux. 2) Perfusion intracardiaque : réalisée sous anesthésie générale est sans réveil. Cette procédure dure 20 minutes maximum entre l'induction (anesthésique/analgésie) et la perfusion. Nombre d'animaux concernés : 2400 animaux. 3) Exposition aux fongicides des géniteurs et de leur descendance : exposition via l'eau de boisson. Cette procédure dure 4 mois pour les femelles génitrices, 2 mois pour les mâles géniteurs. Nombres d'animaux concernés : 198 animaux. Pour la descendance, les animaux sont exposés jusqu'au stade de devéloppement d'étude souhaité (5, 15, 30 ou 60 jours). Nombre d'animaux concernés : 3000 animaux.
Impact sur les animaux
Certains lots de souris subiront des interventions (injection de tamoxifen) qui peuvent entraîner des effets modérés (irritation au site d'injection). Les lots d'animaux traités avec les fongicides seront exposés à des doses retrouvées dans l'eau potable et autorisées par l'UE (directive 80-778-EEC) et considérées comme non nuisibles pour la santé. Le but de notre étude est de déterminer les effets nocifs qui peuvent découler de cette exposition.
Devenir
Les animaux utilisés pour les accouplements seront mis à mort par lorsque qu'ils seront trop âgés pour continuer la reproduction. Les animaux utilisés pour les différentes études (histologiques, biochimiques, transcriptomiques, de contractilité des vaisseaux) seront mis à mort afin de prélever les cerveaux et de faire nos analyses.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. En raison de l’ignorance de l’impact des fongicides sur la fertilité, le nombre de couple reproducteur a été volontairement surestimé par rapport à une situation sans fongicide, mais qu’il sera revu autant que possible à la baisse. Pour l’ensemble des questions il faut obtenir les observations sur au minimum 5 réplicas biologiques pour chaque génotype, à chaque stade et pour chaque condition de traitement. Ce nombre de 5 est un minimum pour intégrer dans notre étude la variabilité entre les animaux. C’est un prérequis dans l’ensemble des publications de travaux scientifiques.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les nouveau-nés subissant une injection feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux sera mise en place évitant la mise à mort des animaux. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront co-administrés pour limiter toute souffrance à l’animal. En plus du mix kétamine/xylazine, de la buprénorphine est injectée aux animaux subissant une thoracotomie ‘perfusion intracardiaque). Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Pour les accouplements, les animaux seront utilisés à partir de P60. Pour répondre aux différentes problématiques posées dans ce projet, les animaux exposés in utero/post-natal aux fongicides, seront utilisés à 5 stades de développement : P3, P7, P21, P60 et P120.
Développement d’un modèle de défaillance hépatique et multiorganes chez la souris cirrhotique. Application à l’évaluation de molécules dans cette pathologie.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
3 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent pendant dix semaines des injections d'un composé toxique pour le foie, puis un empoisonnement à l'acétaminophène associé à une inflammation, pour développer un modèle de défaillance hépatique aiguë et y tester des médicaments. Le porteur indique s'attendre à des animaux "en état de choc et de détresse cardio-respiratoire", certains devant être mis à mort par anticipation. Il revendique de reproduire une gravité "sévère" tout en maintenant les animaux dans un état jugé acceptable, et affirme qu'aucune expérience in vitro ne peut remplacer cette évaluation.
Objectifs
Développer un modèle pertinent pour tester des médicaments destinés aux soins des patients lors de décompensation aigue de la cirrhose du foie, ce besoin clinique n’est pas satisfait aujourd’hui. Le malade chronique du foie (origine alcoolique ou non, virale ou médicamenteuse) peut sous l’effet d’un agent déclenchant décompenser, le fragile équilibre qui préservait une fonction à ses organes majeurs est rompu. Une cascade d'événements tels que septicémie, ou défaillance multiviscérale peut entrainer la mort. Un modèle expérimental qui imite l'évolution de la décompensation cirrhotique est crucial pour la découverte de traitements pour ces patients. L’installation et évolution de cette maladie sont lente chez l’homme, elles résultent d’une agression et d’un stress continu des cellules hépatiques, auquel vient subitement s’ajouter un événement aigu qui précite la décompensation. La modèle CALPS reproduit chez la souris rapidement cet enchainement d’évènement, il associe une agression lente du foie par un agent toxique pour le foie, puis un stress oxydatif puissant et une inflammation massive. • C : CCl4 : le tetrachlorure de carbone est toxique pour le foie son métabolisme produit des radicaux libres, oxydants et toxiques pour les cellules du foie. • A : l’Acétaminophène (Doliprane) peut produire s’il est ingéré massivement un stress oxydatif violent qui peut engendrer la mort par empoisonnement. • LPS : le LipoPolySaccharide un constituant de la paroi de bactéries déclenche la réaction inflammatoire défense contre l’infection. L’administration régulière prolongée du CCl4 pendant 10 semaines produit l’altération de la fonction hépatique. L’empoisonnement à l’acétaminophène associé à une inflammation massive déclenche la défaillance aigue, et une rupture progressive des fonctions des organes (foie, reins, atteinte cardio-respiratoire, troubles de l’hémostase, et troubles centraux) qui se manifeste par des augmentations de biomarqueurs spécifiques (enzyme hépatiques, cytokines, ionogrammes, paramètres hématologiques), cela pouvant entrainer la mort. Ce modèle expérimental permettra d’évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments par les dosages des biomarqueurs. C’est le défi que nous nous fixons.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible. Aujourd’hui on va adresser les traitements qui vont agir sur la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent à agir simultanément sur les différentes voies qui sont à l’origine des défaillances multiples. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme)
Procédures
Au cours des procédures expérimentales décrites dans ce dossier, nous ne procéderons qu'à 3 gestes techniques différents : 1/ l'injection par voie intrapéritonéale. Elle sera pratiquée 2 fois par semaine pendant la première phase de 10 semaines d'induction de la fibrose. Les volumes injectés seront de 2mL/kg dans un véhicule gras (huile) , soit 20 injections IP 2/ l'administration de composé par voie orale à l'aide de sonde d'intubation orogastrique. Leur durée n'excèdera pas 14 jours à raison d'un gavage quotidien de 10ml/Kg à l'aide d'un véhicule aqueurx et physiologique, soit 14 gavages. 3/ ou à la place de l'administration orale : l'injection par voie intrapéritonéale. Elle sera pratiquée 1 fois par jour pendant la phase de 14 jours max d'évaluation des composé à tester . Les volumes injectés seront de 10mL/kg dans un véhicule aqueux. Soit 14 injection IP 4/ le prélèvement sanguin intermédiaire ou terminal. Dans les 2 cas ils seront pratiqués sous anesthésie générale à l'isoflurane. Cahque animal ne subira qu'un seul prélèvement sanguin intermédiaire d'un volume maximal de 150µL de sang total. Le prélèvement terminal sera lui plus abondant (vol max) , mais l'animal ne sera pas réveillé avant se mise à mort.
Impact sur les animaux
L’ACLF représente un évènement grave chez un patient, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez la souris présente lors de l’induction de l’ACLF des signes clini ques d’inconfort manifestes. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et poumons) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Etant donné la complexité de l’évènement étudié qui produit le dysfonctionnement de plusieurs organes, il nous est impossible de remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro. L’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste nécessaire. L’administration des composés dans le contexte d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global».
Réduction
Une première phase de sélection des meilleurs composés est effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires simples et complexes de type organoïdes, ce qui permet d’ajouter un filtre pour n’engager des études in vivo qu’avec les produits les plus pertinents et prometteurs.
Raffinement
L'ACLF qui par définition est chez l'homme une pathologie qui entraine le décès à 28 jours de 20 à 70% des patients hospitalisés. Le modèle d'étude expérimental est lui aussi sévère, la précipitation de la décompensation est subite, nous avons établi des grilles de scoring et une surveillance accrue des animaux de manière à ne pas conserver un animal qui aurait atteint les points d'arrêt anticipés.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce souris a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Les animaux seront des jeunes adultes matures qui seront immunocompétents