Procédures modérées

Pour mener en cinq ans 330 études précliniques de candidats médicaments sur des tumeurs greffées, 10 000 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude. Une partie des souris porte un système immunitaire ou un foie humanisé, et les procédures comprennent l'injection sous la peau de cellules tumorales sous anesthésie, des administrations par injection ou par gavage et des prises de sang dont la fréquence dépend du poids. Ni les composés testés ni les cancers visés ne sont nommés, et le porteur qualifie la souris de "modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable". Une souris est tuée dès que son score clinique atteint 7, qu'elle perd plus de 20 % de son poids ou que sa tumeur dépasse 1 000 millimètres cubes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de réaliser des études précliniques sur des souris afin d’évaluer l’effet d’un composé au potentiel thérapeutique sur des tumeurs en condition in vivo.

Bénéfices attendus

En utilisant un modèle in vivo, nous pouvons étudier les interactions pouvant exister entre des organes fonctionnels et les pathologies cancéreuses qui les impliquent, tout en évaluant l’efficacité et la toxicité de candidats thérapeutiques dans un contexte préclinique.

Procédures

Prélèvements sanguins : la fréquence et les volumes seront déterminés sur base du poids de la souris. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. Administration de composés à visées thérapeutiques, par injection ou administration orale (gavage). La durée est de 10 à 15 secondes par administration. Injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale, la durée de la procédure est de 2 à 3 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par : les injections intraveineuses, les prélèvements sanguins et l'injection et les effets potentiellement toxiques de composes a visées thérapeutiques dans un contexte préclinique.

Devenir

Le modèle impliquant la greffe d'une tumeur, les souris seront mises à mort en fin d'étude.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire ou le système hépatique, et de mimer leurs interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de traitements innovants pour des pathologies cancéreuses.

Réduction

Un total de 10000 souris adultes seront utilisées, couvrant une période 5 ans, permettant de réaliser 330 études précliniques. Le nombre de souris par étude sera de 5 à 10 individus par groupe, avec un minimum de 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés sur base de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposes. A leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées a la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle cumulative de scores (donnés entre parenthèse) prenant en compte : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel. Les souris seront évaluées quotidiennement et l’échelle sera appliquée dès que nécessaire. Une souris avec un score clinique ≥ à 7 sera euthanasiée pour raison éthique. Le poids sera monitoré 3 fois par semaine. Le suivi de l’évolution pondérale pourra être adapté au stade de l’étude. Une perte de plus de 20%, calculée à partir du poids mesuré le jour de la première manipulation inhérente à l'étude sera considérée comme une raison de mise à mort. Un volume tumoral supérieur à 1000mm3 sera également considéré comme une raison de mise à mort. Le vétérinaire d'établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur si elle/il le juge nécessaire.

Choix des espèces

Nous maîtrisons l’humanisation du système immunitaire et l'humanisation du foie sur différentes souches de souris en se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre sur cette espèce. Les animaux seront intégrés aux études à l’âge de 7-8 semaines pour les animaux non humanisés, afin d'utiliser des animaux adultes, et à partir de 15-18 semaines pour ceux humanisés, afin que le système immunitaire humanisé ou le foie humanisé se soit développé. Les animaux d'une même étude auront un âge homogène.

4 776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections quotidiennes de molécules anticancéreuses pendant trois semaines, avec un suivi de la tumeur trois fois par semaine. Le porteur indique que les traitements peuvent provoquer perte de poids, diarrhée et cachexie, et que la croissance tumorale peut entraîner des métastases. Il affirme que le recours à des animaux vivants est "indispensable" parce que la réponse immunitaire à la chimiothérapie ne serait pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les lysosomes sont des compartiments cellulaires impliqués dans la dégradation et le recyclage du matériel de la cellule. Les lysosomes ont un rôle important dans le bon fonctionnement des cellules mais une fois endommagés ils peuvent déclencher la mort des cellules. Depuis quelques années, un intéret important est porte en médecine sur les composés qui ont la capacité d’endommager les lysosomes et provoquer la mort des cellules cancéreuses en induisant la perméabilisation de la membrane lysosomale. Nous avons sélectionné in vitro plusieurs nouveaux composés capables d’induire la mort des cellules cancéreuses via la perturbation des lysosomes. Ce projet vise a tester le potentiel anti-cancéreux de ces molécules dans des modèles murins de croissance et vaccination anti-tumorale. Nos objectifs sont : i) déterminer les molécules les plus efficaces dans les modèles tumoraux; ii) étudier la réponse de l’immunité tumorale; iii) explorer l’effet thérapeutique des molécules en monothérapie ou en combinaison avec d’autres thérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique des nouvelles molécules anti-tumorales efficaces dans plusieurs types de cancer en monothérapie et/ou en association avec d’autres thérapies.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront injectées via sous-cutanée (1 fois) avec des cellules tumorales afin d’induire la croissance d’une tumeur. Les injections s.c. seront effectuées sur l’animal anesthésié (via anesthésie gazeuse) pour une durée maximale de 2 minutes. Les traitements anti-tumoraux seront administrés (maximum 1 fois par jour sur 3 semaines) via des injections intra-péritonéales, qui ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectuées sur l’animal vigile pour une durée maximale de 30 secondes. La mesure des tumeurs s’effectuera sur souris vigiles au moins 3 fois par semaine avec une durée maximale d’une minute à l’aide d’un pied à coulisse.

Impact sur les animaux

Les traitement anti-tumoraux peuvent induire une perte de poids/d’appetit et de la diarrée. Le site des injections pourrait s’infecter. L’induction de la croissance tumorale peut conduire à des effets indésirables (apparition de métastases, cachexie).

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, la réponse du système immunitaire à la chimiothérapie vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 4776 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, tapis chauffants,). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Pour nos études, nous utilisons principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé́).

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime gras, à des mises à jeun de vingt-quatre heures avec suivi de la température rectale, à des tests de tolérance au glucose et à l'insuline et à des échographies sous anesthésie, avant d'être mises à mort pour prélever leurs tissus, pour étudier le rôle de la protéine PTPIP51 dans l'adipocyte au cours de l'obésité. Le porteur indique que le régime gras entraîne une prise de poids et une insulinorésistance, l'effet de la délétion du gène restant inconnu. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" après des tests menés sur lignées cellulaires.

Objectifs

L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que la dysfonction adipocytaire joue un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. Notre équipe s’intéresse à différents facteurs qui contrôlent l’homéostasie de l’adipocyte. Des travaux récents de notre équipe ont démontré que les points de contact entre deux structures cellulaires, le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries sont des éléments importants de la bonne santé de l'adipocyte. Ces points de contacts sont appelés les MAM. Dans le foie, il a été montré que ces MAM contrôlaient la santé métabolique. Dans le tissu adipeux, le rôle physiologique de ces MAM n’a pas été exploré. Les MAM correspondent à des rapprochements des membranes de du RE et de celles des mitochondries. Ces rapprochements sont notamment permis par la présence de protéines de rapprochement comme la protéine tyrosine phosphatase-interacting protein 51 (PTPIP51). Le but du présent projet est de supprimer la présence de cette protéine (PTPIP51) de rapprochement dans l'adipocyte, chez la souris, pour tester l'effet que celà aura sur la santé du tissu adipeux et sur la santé métabolique globale de l'animal.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de démontrer le rôle des MAMs dans le développement des complications métaboliques associées à l’obésité. Si ce travail s’avère concluant, les MAMs du tissu adipeux pourraient être considérées comme une cible thérapeutique contre les complications cardiométaboliques du surpoids.

Procédures

A l’âge de 8 semaines, les souris sont mises sous régime gras. La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. La mise à jeun se traduit par une privation de nourriture pendant 24 heures et un suivi de la température (sonde rectale + vaseline), de la glycémie (5 prélèvements de 3 microlitres) et des corps cétoniques (5 prélèvements de 3 microlitres) Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les procédures expérimentales, les nuisances principales sont liées aux injections, aux gavages et aux prélèvements à la queue. La mise sous régimes gras entrainnera une prise de poids et le développement d'une insulinorésistance. L'effet de la délétion de PTPIP51 est inconnue. Nous émettons l'hypothèse qu'elle accélrera le développement d'une insulinorésistance.

Devenir

Les animaux sont mis à mort et les tissus d'intéret sont prélevés.

Remplacement

Le but de notre projet est de valider l’importance des MAMs dans l’homéostasie du tissu adipeux. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement testée dans des lignées cellulaires et nous avons démontré que la déficience en PTPIP51 réduisait drastiquement les MAMS. Dans la continuité, une validation in vivo est indispensable pour étudier les conséquences de l’altération des MAMs du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et/ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 720 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Le modèle adipoPTPIP51 est spécifique de l’adipocyte et nous avons déjà la démonstration que la déficience en PTPIP51 altère les MAMs. La mise sous régime gras permet de reproduire les conditions de surnutrition relative à l’étude du surpoids et de l’obésité. Ce modèle permettra d’étudier si la dérégulation des MAMs entraîne une dysfonction adipocytaire et si la dysfonction adipocytaire altère d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Nous utiliserons des souris de 8 semaines au moment de la mise sous régime gras et donc du démarrage de l’expérience.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection d'un virus et implantation d'une fibre optique, puis des enregistrements en champ ouvert après administration de cocaïne pendant cinq jours, avant leur mise à mort pour analyses post-mortem, pour étudier le rôle du transporteur PMAT dans les effets de la cocaïne. Le porteur indique que la chirurgie peut causer un œdème et une douleur post-opératoire, prises en charge sous anesthésie et analgésie. Il affirme que les effets des drogues d'abus se produisent à l'échelle de l'"organisme entier" et ne peuvent être évalués que sur l'animal entier.

Objectifs

Les transporteurs de recapture des neurotransmetteurs exercent un contrôle étroit de la transmission synaptique dans le cerveau en assurant l'élimination des transmetteurs libérés dans la fente synaptique et leur recyclage dans les terminaisons des neurones. A ce titre, ils interviennent dans des processus importants pour les comportements liés à l’humeur et certaines maladies psychiatriques, comme la dépression et l’addiction. PMAT (Plasma Membrane monoAmine Transporter) est un transporteur atypique, dont le rôle dans le cerveau est encore mal connu. In vitro, il transporte préférentiellement la dopamine et la sérotonine. Il est exprimé dans le cerveau des humains et des rongeurs dans diverses régions et divers catégories de neurones, tels que des neurones glutamatergiques, GABAergiques et cholinergiques. Il module des comportements reflétant le niveau d'anxiété, l'activité locomotrice et les effets des drogues d'abus. Des anomalies importantes des taux des neurotransmetteurs aminergiques dans le cerveau ont été mises en évidence dans plusieurs régions cérébrales chez les souris mutantes pour le gène correspondant. Le projet présenté ici vise à préciser le rôle de ce transporteur dans l'activité de certains circuits cérébraux à l'aide d'une technique de photométrie par fibre.

Bénéfices attendus

Les addictions sont des désordres psychiatriques caractérisés par la dépendance physique et/ou psychologique à une substance ou une activité, avec des répercussions délétères sur l’individu. Les informations récoltées par ces expériences précliniques devraient clarifier le rôle d’un transporteur peu connu, PMAT (Plasma membrane monoAmine Transporter), dans les effets d’une drogue d'abus, la cocaïne. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour décrypter les conséquences fonctionnelles de cette drogue sur des circuits neuronaux intacts. Les modèles de souris invalidées pour certains gènes (tels que PMAT ici) permettent également d’étudier la fonction de ceux-ci in vivo chez l’animal, une approche irremplaçable pour aborder des comportements complexes. Les approches utilisées dans le projet permettent d’étudier les mécanismes et circuits cérébraux dans un contexte intégré, et rester le plus proche possible des conditions d’administration de ces drogues chez l’homme. Ces résultats obtenus grâce aux animaux sont complémentaires de ceux obtenus chez les humains, auxquels ils sont confrontés et comparés. Ces connaissances pourront permettront d’approfondir les mécanismes qui sous-tendent les processus addictifs, afin d’élaborer à terme des thérapies plus efficaces pour traiter ces troubles psychiatriques. Ces travaux sont originaux et les expériences ne sont pas réalisées par d'autres laboratoires.

Procédures

Toutes les souris subiront 3 étapes séquentielles: 1- Une chirurgie stéréotaxique (classe modérée; durée 30-40 min). 2- Des enregistrements par fibre optique dans un champ ouvert, à l'état basal ou après administration de cocaine (classe légère; durée 1h30 min par session sur 5 jours consécutifs). 3- Une euthanasie, afin de valider les expériences (classe sans réveil; durée 20 min). La chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour injecter le virus dans le cerveau et implanter la fibre optique peut causer un œdème localisé associé à une douleur post-opératoire passagère. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie. Il existe un risque faible d'infection suite à la chirurgie et l'implantation de la fibre optique. La manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau lors du test comportemental peuvent engendrer un léger stress chez les souris. L'administration par injection intra-péritonéale de cocaïne ou de saline n'engendre pas d'effets secondaires et n'altère pas les poids des animaux. Les souris sont surveillées pendant toute la procédure. L’effet hyperlocomoteur de la cocaïne est très rapide et dure 20 min. La cocaïne n’est pas associée à des effets secondaires indésirables notables. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. Nous n'envisageons pas d'autres nuisances possibles lors des expériences proposées.

Devenir

A la fin de la procédure tous les 80 animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements et analyses post-mortem nécessaires au projet (immunofluorescence et analyse anatomique).

Remplacement

De manière générale, les effets à court ou long terme des drogues d’abus se produisent à l’échelle de l’organisme entier et donc ne peuvent être évalués de manière définitive qu’in vivo, sur l’animal entier. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour décrypter les conséquences fonctionnelles de ces drogues sur des circuits neuronaux intacts. Les modèles de souris mutées pour des transporteurs de neurotransmetteurs permettent également d’étudier la fonction de ceux-ci in vivo chez l’animal, une approche irremplaçable pour aborder des comportements complexes. Cette approche permet d’étudier les mécanismes et circuits cérébraux dans un contexte intégré, et rester le plus proche possible des conditions d’administration de ces drogues chez l’homme. Ces aspects intégrés ne sont pas reproduits dans des modèles de substitution, comme des cellules en culture, et il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. Ces résultats obtenus grâce aux animaux sont complémentaires de ceux obtenus chez les humains, auxquels ils sont confrontés et comparés.

Réduction

Afin d’en limiter le nombre, tous les animaux (80 en tout) sont soumis aux enregistrements en photométrie par fibre, puis ces mêmes animaux en bonne santé sont euthanasiés en vue des études anatomiques ou immunohistochimiques. Des groupes de 10 minimum doivent être utilisés afin d’obtenir des résultats statistiquement concluants sur les effets biologiques. La taille de ces effectifs est déterminée sur la base des études antérieures et de calculs de sensibilité.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les procédures sont optimisées pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. L’injection stéréotaxique et l’implantation de la fibre optique sont réalisées simultanément sous anesthésie totale et locale pendant la chirurgie et un analgésique est administré en péri-opératoire. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance selon des points limites préétablis, est exclue du protocole et euthanasiée. Les souris (4 par cage) sont hébergées dans une animalerie de stabulation ventilée (température 19-21 degrés C, cycle jour-nuit 12h-12h) avec accès à l’eau et croquettes ad libitum, et la litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Les animaux d’origine extérieure sont acclimatés pendant au moins une semaine avant le début des procédures. Nous travaillons en étroit lien avec l’équipe vétérinaire pour s’assurer que l’animal ne souffre pas face à une gêne, une détresse, une douleur ou une blessure. Si un animal est en souffrance, il est rapidement euthanasié.

Choix des espèces

L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine, et son système nerveux présente de multiples analogies avec celui des humains. Ceci nous permet d’identifier des processus transposables en physiologie humaine et médecine, y compris en ce qui concerne les mécanismes qui sous-tendent l'addiction. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé, avec une histoire fournie d’études pharmacologiques et comportementales en rapport avec l’addiction, ce qui permet de construire des hypothèses valides et pertinentes. Enfin, l'utilisation de la souris comme modèle autorise l'application de techniques moléculaires sophistiquées très informatives, telles celles mises en oeuvre dans ce projet (recombinaison homologue, transfert de gènes au moyen de virus), permettant d’aborder la fonction des gènes de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (âge entre 10 et 20 semaines). Il s’agit du stade pertinent pour évaluer l'effet des drogues addictives, les études chez les juvéniles sortant du cadre de ce projet de recherche.

5 568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales pour développer des tumeurs pédiatriques, puis des traitements par voie orale et par injection pendant une quinzaine de jours, avant d'être mises à mort pour prélever leurs organes et leurs tumeurs, dans une étude de molécules inhibitrices d'épissage contre les cancers de l'enfant. Le porteur limite la description des effets indésirables aux tumeurs sous-cutanées du flanc et aux traitements. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du comportement tumoral dans toute sa complexité.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer l’impact de modificateurs de la traduction des protéines comme immunomodulateurs sur la réponse anticancéreuse dans les cancers pédiatriques. Après plusieurs tests in vitro, nous avons isolé huit molécules candidates et ce, sur plusieurs lignées de cellules murines à l’origine cancers très graves de l'enfant.

Bénéfices attendus

Ces résultats démontreront les composants biologiques importants dans la traduction des protéines ont un potentiel dans les cancers pédiatriques avec comme objectif final l’identification de potentielles combinaisons médicamenteuses capables d’augmenter ultérieurement la survie des patients.

Procédures

Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée pour le developpement des tumeurs pédiatriques (durée 5 minutes). Dans le cas de la voie d'administration per os, les souris seront administrées 2 à 4 fois par semaine pendant 2 semaines (durée 30 secondes). Un prélevement de sang unique, sera réalisé sous anesthésie générale. Les traitements par injection seront faits toutes les 24h, 48h ou 72h et ce durant 15 jours (durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels seront ceux liés à la présence de tumeurs uniques sur le flanc, sous la peau, ainsi que ceux liés aux traitements par injection ou administration orale.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’évaluer les interactions entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi, la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique a recours à un modèle animal. Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d'appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents système au sein de l'organisme (systeme vasculaire, immunitaire...), l'utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l'efficacité de nos molécules et leurs liens avec les mécanismes oncogéniques et metastiques des cancers mais également explorer et valider l'efficacitté de thérapies susceptibles d'être utilisées chez les patients.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été menée avant d’initier ce projet pour s’assurer de l’absence de résultats publiés s’approchant des objectifs de notre étude. Le nombre d’animaux utilisé lors des expériences sera établi de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux utilisé tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d'utiliser un nombre suffisant d'animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan statistique. Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant des tests non-paramétriques dont l'application ne requiert pas la vérification préalable de la normalité incompatible avec les petits échantillons.

Raffinement

Les animaux sont surveillés chaque jour afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de detecter précocement un developpement de la tumeur. Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée. Pour la limiter, nous avons établie une grille d’observation visant à définir des points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et cadrant les mesures prises à l’apparition des premiers signes de contrainte/ douleur. Si nous détectons des signes de stress ou de douleur anormaux, nous donnerions un antalgique morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d'une anesthésie locale. Les animaux seront stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement du milieu est également apporté par des sizzlenests et de maisons en cartons.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus utilisés pour étudier l’effet des médicaments sur la croissance tumorale. Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunocompétentes ce qui nous permettra d’évaluer au mieux les coopérations entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales. Nous utiliserons des souris jeunes (animaux âgés entre 4 et 6 semaines au début de protocole) au moment de l’injection des cellules tumorales. Nous utiliserons des souris jeunes afin de pouvoir etudier nos molécules sur des cancers pédiatriques.

1 862 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de paclitaxel, un agent de chimiothérapie, puis subissent des tests comportementaux de douleur mécanique ou thermique sur trente-cinq jours, pour mettre au point un modèle de neuropathie chimio-induite. Le porteur indique s'attendre à une perte de poids, de la constipation, de l'alopécie et une piloérection, et rester vigilant aux signes d'anémie et de déshydratation. Il présente ce modèle comme une offre commerciale destinée à ses clients pour développer des candidats médicaments, et affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit la douleur.

Objectifs

Ce projet porte sur le développement d’un modèle de neuropathie chimioinduite, causé par des administrations répétées de paclitaxel chez la souris. Cet agent chimio-thérapeutiques est utilisé dans le traitement des cancers colo-rectaux, pulmonaires, ovarien, ainsi que dans le traitement du cancer du sein. Toutefois, il induit des douleurs neuropathiques chez 40 à 92% des patients conduisant à la limitation ou l’arrêt du traitement. Le nombre de procédures, ainsi que le nombre d’études au sein de ces procédures et le nombre d’animaux sont basés sur l’expérience du laboratoire dans le développement de modèles de douleur chez le rongeur et sur l’expérience acquise dans le même modèle chez le rat . Le laboratoire souhaite mettre en place des modèles au plus proche de la clinique afin de permettre le screening de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre au laboratoire de mettre au point un nouveau modèle au plus près des conditions cliniques. Le laboratoire peut ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs neuropathiques causées par l’administration de paclitaxel, actuellement seul des antidépresseurs et des opiacés sont prescrits pour soulager les patients. Ceci va ainsi permettre une meilleure prise en charge de neuropathie due à l’administration de paclitaxel chez les patients atteints de cancer.

Procédures

Les animaux auront 4 ou 5 injections intrapéritonéale de paclitaxel (tous les jours pendant cinq jours ou tous les deux jours pendant 7jours) et auront un test comportementale de douleur (mécanique ou thermique) Les procédures feront des cinétiques de test sur du long terme pour voir l'induction (tous les 3 à 4 jours pendant 35jours un seul point de mesure) ou un seul jour de test (selon résultats des premières procédures) sera testé mais avec une cinétique de cinq points de mesures le même jour.

Impact sur les animaux

Suite à nos recherches bibliographiques, peu d’informations sont données sur des effets secondaires de ce modèle. Malgré tout, un article nous permet de nous attendre à une non prise de poids, de la constipation, de l’alopécie et de la piloérection. Ces observations seront incluses dans nos points limites. Nous serons aussi vigilants aux signes d’anémies et de déshydratation, signes que nous avons pu observer dans ce modèle chez le rat. Le cadre de ce projet est de travailler sur un modèle de neuropathie, les animaux subissent donc des tests de douleur aiguë (thermique ou mécanique). Les animaux peuvent être isolés pendant la durée des tests. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets secondaires tel que la constipation, la baisse de tonus… Ces effets secondaires disparaissent quelques heures après administrations. Les injections répétées de paclitaxel peuvent créer un hématome dans la zone d’injection. Les animaux sont injectés en alternance de chaque côté de l’abdomen.

Devenir

Le modèle de neuropathie chimioinduite par administration de paclitaxel semble être un modèle stable dans le temps. Il n’est donc pas cohérant de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De plus, les processus biologiques causés par l’administration de paclitaxel pourraient interférer avec d’autres modèles. L’âge de ces animaux à la fin des procédures sera bien plus important que pour l’ensemble de nos modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement d’un modèle permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » (https://www.iasp-pain.org/terminology). L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=12 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat

Raffinement

Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Nous limitons les doses et les injections au minimum afin de ne pas induire de douleurs supplémentaires. Les tests comportent pour la majorité des valeurs maximales (cut-off, ou temps d’application maximale, intensité lumineuse maximale, température la plus basse possible) à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance supplémentaire. Ces mises au point ont pour objectif de raffiner au maximum les conditions expérimentales.permettant de montrer une allodynie/hyperalgésie. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement (tunnel et matériel pour nidifier) et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein ddu laboratoire. Chez ces espèces la démonstration de leur capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore dévelopés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) les médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente chez la souris (ex. : duloxetine) ce qui permet la validation des modèles et suggère l’existence de mécanismes biologiques communs. Les sujets jeunes sont à favoriser pour le développement d’une neuropathie périphérique après administration répétée de paclitaxel. Cet article met en évidence des marqueurs physiologiques et des tests comportementaux (similaire à ce que nous réaliserons ici)

430 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte du kaolin ou du liquide cérébrospinal dans la grande citerne pour provoquer une hydrocéphalie, puis ils subissent des chirurgies intrathécales répétées, jusqu'à cinq IRM sous anesthésie et une perfusion intracardiaque terminale, pour évaluer la toxicité d'oligonucléotides antisens administrés dans le système nerveux central. Le porteur indique que le modèle kaolin peut entraîner des sécrétions nasales et orbitales de sang et une euthanasie dans les cinq jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité des mécanismes en jeu et qu'il est "indispensable" d'évaluer cette toxicité avant les études cliniques.

Objectifs

L'hydrocéphalie est une pathologie neurologique dans laquelle une quantité excessive de liquide cérébrospinal (LCS) s'accumule dans le cerveau (au niveau des ventricules, cavités naturelles de cet organe). Il se produit alors une dilatation et les tissus environnants sont compressés entravant le bon fonctionnement cérébral. Les causes d’hydrocéphalie sont multiples : elles peuvent être congénitales, infectieuses, hémorragiques tumorales ou médicamenteuses. L’hydrocéphalie est souvent diagnostiquée avec des tests d’imagerie tels que l’imagerie par résonance magnétique (IRM) qui est devenue l’examen de référence pour ce type de pathologie. En clinique, de nouvelles thérapies utilisant l’administration de molécules appelées oligonucléotides antisens (ASO) sont actuellement proposées. Il s’agit de petites molécules d’acide nucléique qui vont venir réprimer l’expression protéique d’un gène d’intérêt. Ces composés ne franchissent pas aisément la barrière hématoencéphalique; d’où la nécessité, dans le cadre du traitement des atteintes du système nerveux central, d’administrer les candidats-médicaments par voie intrathécale (dans l’espace où circule le LCS). Or, quelques cas d’hydrocéphalie ont été rapportés suite à des injections réalisées par voie intrathécale de ce genre de composés. Dans ce contexte, il apparaît important d’évaluer le profil sécurité des candidats-médicaments en préclinique sur ce point de vigilance. Dans ce contexte, nous proposons d’évaluer en IRM, chez le rat, le risque d’hydrocéphalie associé à l’injection intrathécale d’ASO amenés à être proposés au développement clinique chez l’humain, pour le traitement d’atteintes cérébrales spécifiques. Ce projet se décompose en deux parties. Dans un premier temps, nous chercherons à reproduire, chez le rat, un modèle d’hydrocéphalie déjà bien caractérisé de façon à optimiser l’acquisition et le traitement des données imagerie IRM pour la détection d’anomalies cérébrales associées à cette pathologie. Puis, nous chercherons ensuite à évaluer l’effet de différents ASO administrés par voie intrathécale sur les paramètres volumétriques tels que le volume des ventricules cérébraux, la taille globale du cerveau, et/ou déformations des différentes structures cérébrales. Ce projet permettra de sécuriser l’approche en développement clinique de ces produits qui pourraient être proposés comme traitement de maladies invalidantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de valider les méthodologies pour la sélection des meilleurs candidats médicaments nécessitant une injection par voie intrathécale pour le passage en développement clinique.

Procédures

• Imagerie IRM sur animal anesthésié : jusqu’à 5 sessions d’imagerie/animal espacées au moins d’une semaine d’intervalle sur une durée maximale de 5 mois. Durée maximale d’une session IRM/animal : 1 heure • Injection unique (CSF ou kaolin) au niveau de la grande citerne. La durée de la procédure n’excèdera pas 20min • Chirurgie intrathécale pour administration des ASO : 3 administrations à une semaine d’intervalle. C’est ce qu’on appelle le « bolus de charge » et qui sera la méthodologie préconisée chez l’humain. La procédure chirurgicale n’excèdera pas 30min • Prélèvements sanguins et de LCS chez animal anesthésié juste au moment du sacrifice (stade terminal sans réveil) • Perfusion intra-cardiaque PFA 4% pour permettre l’analyse histologique post-mortem des tissus cérébraux. La durée de la procédure n’excèdera pas 15min

Impact sur les animaux

Ce projet permettra justement de définir quels peuvent être les effets indésirables associés à l’administration répétée par voie intrathécale (dans l’espace où circule le liquide cérébrospinal) d’un traitement par oligonucléotides antisens (ASO) destiné à traiter des atteintes du système nerveux central ; voie d’administration préconisée chez l’humain. Effets indésirables liés à l’apparition d’une hydrocéphalie chez le rat. Possibilité de sécrétions nasales et orbitales de sang et de liquide clair dans les quelques jours suivant l’induction. Selon la littérature, ces évènements n’ont pas été rapportés dans le modèle kaolin (euthanasie dans les 5 jours suivants l’injection) que nous souhaitons évaluer en imagerie IRM. Effets indésirables liés à l’administration intrathécale de composés. Paralysie des membres postérieurs, inflammation locale au niveau du site d’injection, paralysie motricité vésicale ou digestive. L’administration des composés est réalisée en conditions d’aseptie optimale de façon à limiter la survenue d’effets indésirables associés à cette voie d’administration. Effets indésirables liés aux anesthésies successives Anesthésie gazeuse (isoflurane) durant les examens IRM et procédure chirurgicale. Aucun effet indésirable n’est attendu. Surveillance des paramètres physiologiques (température, respiration) durant toute la session d’acquisition des données imagerie ou chirurgie. Surveillance des animaux (en chambre thermostatée) jusqu’à leur réveil avant réintroduction dans leur cage.

Devenir

Pour chaque procédure les animaux doivent être euthanasiés pour analyse post-mortem (analyse immuno-histochimiques et dosages biochimiques) et corrélation avec les données d’imagerie acquises in vivo.

Remplacement

Il est indispensable de pouvoir évaluer la toxicité de candidats médicaments et définir la marge sécurité pour les futures études cliniques. Actuellement les études in vitro permettent de sélectionner une grande partie des composés et de restreindre drastiquement le nombre de produits qui seront testés in vivo. Cependant, il n’existe aucun modèle in vitro ou synthétique qui récapitulerait la complexité des mécanismes déclenchés par l’administration d’un candidat médicament dans un organisme ; Le recours à l’animal reste donc obligatoire et nécessaire pour envisager les études réglementaires qui permettront de poursuivre le développement du produit jusqu’à l’autorisation de mise sur le marché.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour garder une puissance statistique raisonnable et s’assurer que les résultats puissent être exploitables en vue de la variabilité inter-individuelle. Généralement, un minimum de n=10 animaux/groupe est nécessaire quand nous cherchons à mesurer des paramètres en imagerie pour lesquels nous n’avons pas d’expérience au préalable. Le fait d’envisager un suivi continu en imagerie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les études en limitant l'euthanasie à différents temps.

Raffinement

Les composantes physiologiques seront surveillées durant les examens d’imagerie : respiration, température corporelle. Le réveil de l’animal se fera en chambre thermostatée avant sa réintroduction dans sa cage L’alimentation et l’eau de boisson seront disponibles à volonté Les procédures de chirurgie intrathécale seront accompagnées par des injections d’analgésiques (avant et après la chirurgie) Les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt tout signe d’inconfort ou de douleur qui pourraient survenir, et administrer le soin correspondant

Choix des espèces

La réglementation impose que les études de toxicologie soient effectuées sur une espèce de rongeur au minimum. Dans ce projet, le choix du rat est privilégié du fait que l’injection intrathécale des composés est possible chez cette espèce, à la différence de la souris. Les volumes des prélèvements (sang, LCS) pour l’identification de biomarqueurs sont potentiellement également plus importants chez le rat que chez la souris; ce qui facilite les dosages sans à priori. L’évaluation de la tolérance chez le rat de l’administration intrathécale de candidats médicaments préalablement sélectionnés (criblage in vitro/études chez la souris) aidera aux choix des doses à évaluer sur une espèce non rongeur avant le début des essais cliniques où la voie d’administration intrathécale est celle qui sera préconisé chez l’humain. Dans ce projet, nous utiliserons des rats Wistar pour lesquels nous disposons déjà de données historiques concernant les analyses biochimiques et de formulation sanguine. Dans ce ce projet, nous utiliserons des rats jeunes ou adultes, conformément aux requis réglementaires