Procédures modérées

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée une plaie cutanée qu'on infecte par des bactéries avant de poser un pansement au chitosane, avec un suivi par imagerie sous anesthésie pendant cinq à quatorze jours. Le porteur indique que l'infection peut provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie. Il présente l'étude comme une preuve de concept préalable à des tests sur "gros animal" puis à un essai clinique humain.

Objectifs

Les infections de plaies traumatiques et chirurgicales sont un problème majeur dans le domaine médical. L’émergence de bactéries multi-résistantes aux antibiotiques est un phénomène inquiétant. La notion de «bon usage » des antibiotiques doit être élargie à la notion de « moindre usage ». Dès lors, il existe un besoin croissant d’utilisation de produits antimicrobiens topiques (application directement sur le site d'infection) pouvant être appliqués sur des plaies potentiellement infectées. Le chitosane est utilisé pour de nombreuses applications médicales et pharmaceutiques. Les préparations de chitosane ont beaucoup attiré l’attention en raison de leurs propriétés biologiques potentiellement bénéfiques. Ces propriétés incluent notamment l'hémostase (la coagulation), l'activité antimicrobienne et la stimulation de la guérison. L'activité antimicrobienne à large spectre du chitosane a suggéré qu'il pourrait être utilisé comme pansement pour plaie.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de montrer qu’un pansement guérit une plaie cutanée infectée sans traitement antibiotique : c’est une alternative à la thérapie actuelle, lourde et source de résistance aux antibiotiques. Cette preuve de concept sera un préalable à une étude de confirmation sur gros animal et ensuite un essai clinique chez des patients humains.

Procédures

Les souris subiront une intervention chirurgicale sur la peau (création de la plaie + traitement, 30 minutes en tout) puis seront suivies 5 jours (18 souris, 5 suivis) ou jusqu'à 14 jours (24 souris, 8 suivis) par imagerie PhotoImageur. Chaque procédure PhotonImageur dure 5 minutes (les souris seront anesthésiées).

Impact sur les animaux

L’expérimentation implique l'anesthésie, la réalisation de la plaie, l’inoculation des bactéries, la pose du pansement avec une suture, puis la réalisation d’imagerie. L’infection provoquée pourra provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie cutanée.

Devenir

Suite à l’euthanasie, la plaie sera observée : - Signes inflammatoires locaux - Présence d’abcès - Taille de la plaie. Une analyse bactériologique et histologique sera réalisée sur chaque plaie avec les tissus adjacents.

Remplacement

En raison des interactions complexes entre l'hôte et l'agent pathogène, les systèmes in vitro ne peuvent pas reproduire fidèlement les conditions d'infection et de guérison des tissus. Il est donc nécessaire de disposer de modèles animaux qui reflètent l'infection des tissus pour évaluer les stratégies d'ingénierie tissulaire.

Réduction

Un suivi par photonimagerie diminue le nombre de souris nécessaires à l’étude en permettant un suivi bactérien longitudinal et en évitant les sacrifices aux temps intermédiaires. L’étude sera réalisée sur 6 souris par groupe et les résultats seront analysés avec les tests statistiques adaptés.

Raffinement

- Un personnel qualifié sera mobilisé autour des animaux avant, après et pendant les interventions. Le chirurgien est chevronné. - Les conditions expérimentales ne provoquent pas de contraintes pouvant affecter le bien-être des animaux : pas de diminution de l’enrichissement ni de la socialisation, accès normal à l’eau et à l’aliment et respect des comportements normaux. L’hébergement est réalisé en cages ventilées individuellement. Elles sont stérilisées par autoclavage. L’enrichissement est adapté. - Des protocoles précis de prémédications, d’analgésie, d’anesthésie et de mise à mort sont mis en place. - Plusieurs points limites éthiques généraux et spécifiques seront suivis tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les résultats de cette étude préclinique serviront pour la prise en charge de plaies infectées avec la mise en place d’un nouveau pansement. Cette étude ne peut en effet être réalisée directement chez le patient mais détient un potentiel translationnel car elle est réalisée chez le mammifère. La souris est un modèle couramment utilisé dans les études sur la cicatrisation de la peau et l’effet de différentes modalités de traitement. La région dorsale sera utilisée pour l’évaluation des pansements pour la réduction des possibilités de grattade par la souris et la facilité d’évaluation quotidienne. L’utilisation des souris permet de répondre à un certain nombre de questions et d’être prédictif des résultats chez l’homme car il tient compte de la biologie tissulaire. En effet, le modèle animal cherche à répliquer l’environnement biologique et la réponse biologique face aux bactéries. Les souris seront âgées de 7 semaines et pèseront environ 20-25gr. Des souris âgées de plus de 6 semaines sont choisies afin qu'elles aient atteint une taille adulte pour diminuer les risques anesthésiques et pour faciliter l'intervention chirurgicale. Toutes les souris auront le même âge pour une meilleur comparaison des résultats mais également pour que la taille de la plaie soit proportionnelle à la taille de la souris.

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une laparotomie d'environ deux heures sous anesthésie, des injections d'antibiotique et une inoculation d'Enterococcus faecalis, avant d'être tué pour prélèvements. Le porteur indique que les douleurs post-opératoires constituent l'effet indésirable majeur et prévoit une analgésie associée. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne peut remplacer ce modèle intégrant le dialogue entre microbiote, organisme et pathogène.

Objectifs

Le microbiote intestinal forme un écosystème en équilibre composé de plusieurs milliards de bactéries représentant des milliers d’espèces. Si son effet bénéfique en santé humaine a été démontrée, il est également considéré comme un réservoir de pathogènes opportunistes souvent résistants aux antibiotiques. Par exemple, les entérocoques sont des bactéries inoffensives du tractus digestif de l'homme et des animaux. Bien qu’habituellement inoffensives chez l'homme en bonne santé, certaines souches de Enterococcus faecalis en particulier celles résistantes à la vancomycine sont à l'origine d'infections opportunistes chez des patients fragilisés. Nous cherchons à comprendre les mécanismes qui permettent à E. faecalis de proliférer au niveau intestinal et de disséminer dans l’organisme après avoir franchi la barrière intestinale. L’ensemble de ces recherches vise à générer des connaissances pour développer de nouvelles stratégies pour contrôler les agents pathogènes multi-résistants. E. faecalis est une bactérie qui possède autour d’elle une enveloppe constituée d'une membrane et d'une épaisse paroi. Le peptidoglycane (PG) est un composant majeur de cette paroi bactérienne. Le métabolisme du PG joue un rôle crucial dans la structure et la forme de la cellule bactérienne, et la résistance aux antibiotiques et aux anti-microbiens. La formation du PG et son renouvellement au cours de la vie de la bactérie nécessite des enzymes spécifiques c’est-à-dire des protéines dont le rôle est de réaliser des réactions chimiques assurant la synthèse et le recyclage du PG. L’objet de cette demande vise à comparer la susceptibilité de E. faecalis à des antibiotiques ciblant la paroi au moment de sa prolifération intestinale. Afin de comprendre les mécanismes de résistance aux antibiotiques, plusieurs souches de E. faecalis seront testées en fonction de leur capacité à synthétiser ou recycler leur paroi. Enfin, nous testerons si la présence d’un autre type d’anti-microbien dirigé contre E. faecalis peut augmenter l’effet des antibiotiques. Ces travaux permettront de mieux comprendre la sensibilité de E. faecalis aux agents anti-microbiens qui ciblent le PG et les mécanismes de résistance qui y sont associés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettta de produire de nouvelles connaissances fondamentales sur une voie métabolique essentielle et partagée par plusieurs espèces bactériennes dont des espèces pathogènes. Les résultats générés permettront d'améliorer notre compréhension globale de la synthèse de la paroi bactérienne, une cible courante des antibiotiques que nous consommons et pour lequels des résistances apparaissent au cours du temps. Nous apporterons de nouveaux éléments pour le développement de stratégies antibactériennes innovantes, comme celles visant à potentialiser l’action d’un antibiotique par une autre molécule présentant une activité anti microbienne comme les bactériocines. Ceci est d’un intérêt majeur dans la mesure où les médicaments ciblant la biogénèse des parois bactériennes sont parmi les antibiotiques les plus efficaces. Ce projet représente donc un fort potentiel pour leur exploitation ultérieure dans des stratégies antibactériennes, telles que le ciblage des enzymes impliquées dans la synthèse et le recyclage de l’enveloppe des bactéries.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à environ 2h de chirurgie et à 24h de soins post-opératoires. Ils seronts mis à jeun la nuit précédent l’intervention chirurgicale. Ces interventions nécessiteront de réaliser sur le même animal et sur tous les animaux mentionnés dans la demande : - Des Injections sur animaux vigiles o 3 fois un antibiotique, 1 fois par jour, 3 jours consécutifs o 1 fois un analgésique le jour de la chirurgie avant l’anesthésie o 1 fois pour l’anesthésie généréale o 1 fois un analgésique en fin de journée pour prévenir les douleurs post-opératoires o 1 fois d’une solution saline pour la réhydradation - Une Laparotomie sous anesthésie générale pendant 2h

Impact sur les animaux

L’inoculation par E. faecalis ne sera pas à l’origine de symptômes sévères car nous utiliserons des doses faibles de E. faecalis bien tolérés par les souris. L’absence d’effets indésirables sera néanmoins contrôlée au cours de l’expérience. Le poids, le poil ébouriffé (ou hérissé), les yeux clos, la léthargie et le dos courbé seront surveillés comme des indicateurs d’effets indésirables. L’utilisation d’un antibiotique pendant 3 jours pourra générer un inconfort digestif qui disparaitra après l’arrêt du traitement. Les effets indésirables de l’anesthésie sont l’hypothermie et l’abolition des reflexes comme pour avaler ou cligner des yeux. Les effets indésirables majeurs sont les douleurs post-opératoires. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et avec une analgésie associée pour limiter les douleurs et souffrances pré et postopératoires.

Devenir

Les souris seront mises à mort à l’issue des protocoles pour des prélèvements d’échantillons en raison de leur infection par un agent pathogène.

Remplacement

Les approches expérimentales chez la souris permettent d’intégrer la complexité des interactions entre le microbiote intestinal, l’organisme et le pathogène. A ce jour, aucune approche in vitro n’est disponible pour remplacer ce type de modèle et « mimer » ces interactions complexes. En effet, les approches in vitro bien que complémentaires ne peuvent pas remplacer un modèle intégrant des interactions in vivo. L’utilisation d’animaux vivants est par conséquent un outil essentiel à la caractérisation des mécanismes pour la découverte de nouveaux antimicrobiens.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux euthanasiés nous porterons une attention particulière à la reproductibilité des expériences. Nous réaliserons des expériences préliminaires pour déterminer les concentrations optimales des molécules d’intérêt. Nous veillerons également à diminuer le nombre de groupes contrôles en comparant plusieurs mutants pour une seule souche sauvage. Pour calculer le nombre d’individus à utiliser par groupe, nous avons estimé sur la base de nos précédents travaux que le nombre total d’animaux par groupe nécessaire est égale à 15 pour obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées en petit nombre, ne seront pas soumises à de longues périodes de jeûne pendant la durée de l’expérience. Une évaluation préopératoire pour contrôler le bon état général de l’animal sera réalisée avant la chirurgie. Seuls les animaux en parfait état de santé seront utilisés. Une prémédication avec un dérivé morphinique sera effectuée pour réduire le stress des animaux, faciliter leur contention et potentialer l’effet des anesthésiques. Les 4 qualités requises pour une anesthésie générale (narcose, analgésie, myorelaxation et sécurité) seront respectées. Un anesthésique local sera utilisé au site d’incision pendant la chirurgie et un anti-inflammatoire sera utilisé pour prévenir les douleurs post-opératoires pendant la nuit. Une solution saline sera aussi utilisée pendant le temps de la chirurgie pour prévenir l’assèchement des tissus. Pour palier les effets négatifs de l’anesthésie : i) les souris seront maintenues sur un matelas chauffant ii) leurs yeux seront protégés de la dessiccation par l’application d’une compresse imbibée d’eau, iii) un fluide de remplacement sera injecté pour palier les pertes de fluide pendant l’intervention, iv) un environnement calme et un approvisionnement en nourriture molle sera proposé pendant les 24h qui suivront la procédure chirurgicale. Un matelas chauffant sera aussi utilisé pour lutter contre l’hypothermie pendant la phase de réveil. Pour la surveillance post-opératoire, un personne responsable bien-être veillera à ce que toutes les souris se réveillent. L’aire de réveil sera confortable dans une zone calme et sombre. Puis les souris réveillées seront remises au fur et à mesure dans leur cage d’origine sur une litière propre. Le milieu sera enrichi avec des « maisons » en carton et du sopalin. Enfin, pour prévenir les douleurs post-opératoires, les animaux seront médicamentés avec un anti-inflammatoire non stéroidien sous réserve de l’absence d’interaction potentielle avec l’infection par E. faecalis.

Choix des espèces

Le modèle murin présente, en plus de qualités propres en terme d'expérimentation, plusieurs avantages pour l’étude des infections par des bactéries pathogènes car les pathologies sont similaires à celles que l’on peut observer chez l’homme. E. faecalis est capable de coloniser le tractus gastro-intestinal des souris, de proliférer et de disséminer via la circulation sanguine à la suite d’une dysbiose post-antibiotique comme cela est observé chez l’homme. Notre organisme modèle est un pathogène opportuniste issu du microbiote intestinal. Des modulations du microbiote intestinal des souris femelles peuvent se produire au cours de leur cycle menstruel. Afin de limiter ce facteur potentiel de variation, nous utiliserons des souris mâles pour les expérimentations. Dans cette étude conformément à nos travaux antérieurs, des souris « jeunes adultes mâles » âgées au minimum de 8-10 semaines seront donc utilisées. Leur poids devra être supérieur ou égal à 18 g.

36 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie stéréotaxique au cerveau sous anesthésie, puis, vigiles et contenus, une stimulation des vibrisses avec perfusion de substrats marqués et prélèvement sanguin. Le porteur indique que l'anesthésie peut entraîner des troubles cardiorespiratoires, une déshydratation et une infection de la plaie. Il écarte les co-cultures de cellules parce qu'elles "s'affranchissent de la physiologie de l'organisme entier", et rattache l'intérêt du projet à des maladies comme Alzheimer au conditionnel.

Objectifs

Au cours des 20 dernières années des preuves se sont accumulées et montrent que le lactate provenant des astrocytes (cellules de soutien du système nerveux central) servirait de carburant énergétique pour les neurones. Les résultats les plus convaincants ont été obtenus par spectroscopie de résonance magnétique du carbone 13, montrant tout le potentiel de cette méthode pour les études métaboliques. Cependant, la majorité de ces études ont été réalisées soit in vitro, sur des cultures primaires, soit ex vivo sur des extraits de tissu cérébraux ; les résultats de ces études ne reflètent donc pas forcément les processus sur l'organisme entier. Il est désormais possible dans notre laboratoire d'éliminer ces inconvénients grâce à l'utilisation soit de la spectroscopie de résonance magnétique à haute résolution, qui permet d'obtenir directement sur un échantillon tissulaire un spectre de très haute résolution soit de la spectroscopie de résonance magnétique sur l'animal vivant, in vivo. La résonance magnétique nucléaire est une technique non invasive qui permet donc un suivi des animaux. L'objectif du projet est d'étudier in vivo le métabolisme énergétique cérébral de rongeurs, éveillés et stimulés, par spectroscopie de résonance magnétique du proton et du carbone 13 et d'obtenir une réponse claire sur l'utilisation préférentielle du glucose ou du lactate par les neurones lors de l'activation cérébrale. Une analyse ex vivo par spectroscopie à haute résolution permettra d'approfondir les voies métaboliques mises en jeu. Par ces techniques, nous pourrons montrer une préférence des neurones pour la consommation directe de glucose ou de lactate provenant des cellules de soutien du système nerveux, en réponse à la demande énergétique liée à l'activation cérébrale. Ainsi la comparaison des résultats obtenus entre zones activées/non activées pour des rats contrôles et également des rats ne pouvant plus métaboliser le glucose permettra de démontrer les voies métaboliques impliquées lors de l'activation cérébrale. Connaître le carburant énergétique (glucose ou lactate) des neurones, à l'échelle de l'organisme, pourrait permettre de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des maladies où le métabolisme énergétique cérébral est dérégulé (ex : maladie d'Alzheimer).

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes impliqués dans le métabolisme énergétique cérébrale et des interactions cellulaires qui en découlent est cruciale d'un point de vue fondamental, mais pourrait aussi avoir une implication dans la compréhension de certains processus pathologiques dans lesquels ce métabolisme énergétique est dérégulé (hypoxie-ischémie néonatale, AVC, Alzheimer, …).

Procédures

- chirurgie stéréotaxique : insertion d'une aiguille sans injection, puis retrait (témoin). Nombre : 1. Durée : 20 min. - contention, stimulation des vibrisses sur animaux vigiles et perfusion de substrats marqués + prélèvement sanguin (200 ml). Nombre : 1. Durée : 1 h.

Impact sur les animaux

Les modèles de KD utilisés dans ce projet sont bien connus des membres de l’équipe. La modification génétique n’entraîne pas de modifications au niveau pondéral, qualité du poil, appétit des animaux, activité et mobilité. Cependant, l'induction du modèle nécessite une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale à l'isoflurane. Durant la chirurgie, des changements du rythme cardiaque (200-400 bpm) ou du rythme respiratoire (30-60 bpm), mesurés grâce à un capteur placé sous l'animal, peuvent subvenir, du fait de la variabilité de la sensibilité aux anesthésiques. De même, une anesthésie prolongée peut mener à la déshydratation de l'animal. Suite à l'opération, la plaie suturée peut s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser.

Devenir

A l'issue de la procédure correspondant à la fin de l'étude, les animaux seront mis à mort. Les stucures cérébrales seront rélevées et analysées.

Remplacement

Des modèles de co-culture (lignées de neurones et d'astrocytes, cellulels de soutien du système nerveux) existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure intégrative : décrypter le métabolisme énergétique cérébral. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de définir quelle est la source énergétique qui permet l’activation neuronale (glucose ou lactate). En effet, l'activité cérébrale est modulée par l'ensemble de l'organisme. Les données scientifiques obtenues à partir de cultutes de cellules ne reflètent donc pas forcément la réalité des processus et des mécanismes mis en jeu chez l'organisme. Il n'existe donc pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Nous utiliserons une technique d’analyse de pointe,spectroscopie de résonance magnétique à haute résolution, qui permet de travailler sur des petites quantités de tissu cérébral et permettent donc de limiter le nombre d’animaux.Pour la partie in vivo, l'utilisation de la résonance magnétique nucléaire qui est une technique non invasive est un atout car elle permet de pouvoir tester plusieurs fois les animaux sans que la procédure ne soit délétère. De plus, nos travaux précédant nous permettent de savoir qu'un nombre minimum de 12 rats par groupe permettra de lisser la variabilité interindividuelle et de mettre en évidence des différences significatives entre les individus dont le transporteur au glucose aura été réprimé et les autres groupes (tests statistiques).

Raffinement

Les modèles modifiés génétiquement utilisés dans ce projet sont bien connus des membres de l’équipe. La modification génétique n’entraîne pas de modifications au niveau pondéral, qualité du poil, appétit des animaux, activité et mobilité. Lors de la chirurgie, les rythmes cardiaques et respiratoires seront monitorés. Du gel oculaire sera appliqué pour éviter toute sècheresse oculaire. La récupération post-opératoire sera réalisée sous lampe chauffante jusqu’au réveil complet des animaux et une réhydratation systématique avec sérum physiologique sera réalisée. Après leur retour en cage collective, les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et ou la personne en charge de l'expérimentation. Lors de ces observations, la capacité de l’animal à s’alimenter, le comportement et sa vivacité et l’état du pelage seront vérifiés. Les animaux seront pesés 1 fois/semaine afin de détecter les pertes de poids . Un échange quotidien entre le zootechnicien et l’expérimentateur permettra une intervention et une prise de décision rapide en cas de souffrance constatée.

Choix des espèces

Le rat Wistar sont utilisés depuis plusieurs années pour les études du métabolisme dans notre laboratoire, ainsi nous disposons déjà de nombreux groupes témoins permettant les comparaisons et limitant ainsi le nombre d’animaux témoins à refaire. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, le métabolisme énergétique cérébral étant différent à des stades plus précoces.

5 940 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie sert à créer des lignées génétiquement modifiées, l'autre subit des variations rapides de température, de salinité, de pH ou d'oxygène, ou la destruction de neurones par un antibiotique. Le porteur indique que ces modifications peuvent altérer la croissance ou la reproduction, et que les reproducteurs sont tués à deux ans quand leurs capacités déclinent. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité d'étudier un "organisme entier", ce système caudal n'ayant selon lui pas d'équivalent chez les mammifères.

Objectifs

Notre projet est d’étudier les fonctions d’un organe neuroendocrinien situé dans la queue du poisson et appelé système neurosécréteur caudal. Ce système est formé de neurones situés à l’extrémité caudale de la moelle épinière des poissons. Ces cellules produisent différentes hormones qui sont libérées dans la circulation sanguine. Sans doute parce que ce système ne semble pas avoir d’équivalent chez les mammifères, ses fonctions restent très peu connues. Les quelques études disponibles suggèrent une implication dans l’adaptation des poissons aux variations de certains paramètres de leur environnement (température de l’eau, salinité, pH, niveau d’oxygène dissous). Pour notre projet, nous allons utiliser l’organisme modèle poisson-zèbre (Danio rerio). Nos objectifs sont de : 1) Décrire précisément comment ce système est organisé et se met en place au cours du développement du poisson. 2) Déterminer précisément les fonctions de ce système. En particulier, nous allons chercher à identifier quelles hormones sont produites par ce système lorsque le poisson fait face à des variations de son environnement. Puis, nous testerons l’importance de ces hormones dans la réponse physiologique du poisson à ces variations de l’environnement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre le développement et les fonctions du système neurosécréteur caudal, un organe peu connu des poissons. Les quelques données disponibles suggèrent que cet organe est impliqué dans l’adaptation physiologique des poissons aux variations de leur environnement. Les poissons représentent non seulement une part importante de la diversité des vertébrés mais aussi un élément essentiel pour la biodiversité des écosystèmes aquatiques ainsi qu’une source de nourriture importante pour l’humanité. Les changements climatiques liés à l’activité humaine vont impacter particulièrement les environnements aquatiques en affectant notamment la salinité, le pH, l’oxygène et la température et vont impacter l’ensemble des composantes de ces écosystèmes, en particulier les poissons. Nous pensons que mieux comprendre la physiologie de ces animaux, notamment leurs mécanismes d’adaptation à des variations environnementales, sera utile pour comprendre et anticiper l’influence de ces bouleversements climatiques sur ces animaux. Ceci devrait avoir des implications pour définir les stratégies pour la préservation de ces animaux et de ces écosystèmes ainsi que pour l’élevage et l’aquaculture.

Procédures

Quatre types d’interventions sont utilisés dans ce projet : 1. Création de lignée d’animaux génétiquement modifiés. Des œufs sont obtenus par accouplement naturel de poisson-zèbre reproducteurs élevés et maintenus au laboratoire dans une animalerie confinée et agrémentée. Ces œufs sont injectés à l’aide d’une micro-aiguille contenant les éléments permettant l’ajout d’un gène ou l’introduction d’une mutation inactivant un gène). Les animaux issus de ces œufs sont élevés et utilisés comme reproducteurs. 2. Production d’animaux dépourvus de certaines hormones ou du récepteur à ces hormones. Des reproducteurs génétiquement modifiés sont utilisés pour produire des poisson-zèbre dont le gène permettant la production d’une hormone d’intérêt, ou son récepteur, est inactivé et qui sont donc incapables de les produire. 3. Des expériences consistant à faire subir à des poissons des variations d’un paramètre de l’eau (température, salinité, pH ou niveau d’oxygène dissous). Ces variations sont contenues dans des gammes que l’animal peut rencontrer dans son environnement naturel et durent de quelques heures à quelques jours. 4. Suppressions neurones du système neurosécréteur caudal. Des poissons génétiquement modifiés, dont les neurones du système neurosécréteur caudal sont sensibles à un antibiotique, sont traités avec cet antibiotique ce qui entraîne la mort de ces cellules.

Impact sur les animaux

- La création de lignée OGM est généralement sans effet car les modifications du génomes obtenues sont maintenu à l’état hétérozygote (un seul des deux chromosomes parentaux est affecté). Néanmoins, elle est susceptible d’entraîner des malformations congénitales non souhaitées. De telles malformations sont détectées dès les stades embryonnaires et seuls des animaux ne présentant pas de malformation sont mis en élevage. - Les expériences de variations rapides des paramètres de l’eau sont susceptibles d’entraîner un stress ponctuel des animaux, mais ces variations étant contenues dans des gammes proches de celles pouvant être rencontrées dans le milieu naturel, les stress induits devraient être modérés. - L’inactivation des gènes codant pour les hormones produites par les neurones du système neurosécréteur caudal ou de leurs récepteurs, et la suppression de ces cellules, pourraient entraîner des modifications de la physiologie des animaux engendrant une modification de leur croissance ou de leur capacité à se reproduire. Cela devrait également impacter leurs capacités à s’adapter à des variations des paramètres de l’eau, et pourrait entraîner des stress plus forts ou prolongés lors des challenges.

Devenir

Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Ces animaux sont euthanasiés à 2 ans, car à cet âge les capacités de reproduction diminuent fortement. Dans le cadre des challenges et de la production d’animaux dépourvus de SNSC ou de certaines hormones et récepteurs, les animaux sont euthanasiés à l’issu du challenge pour pouvoir prélever les différents tissus qui feront l’objet d’analyses histologique et moléculaire.

Remplacement

Les processus développementaux et physiologiques tel que ceux étudiés dans ce projet sont complexes et impliquent des interactions entre différents organes et parties du corps. Pour étudier ces processus, il est nécessaire de recourir à des organismes entiers. Des alternatives ont été envisagées, notamment la culture in vitro des neurones du système neurosécréteur caudal étudiés. Néanmoins, l’objectif de ce projet et de pouvoir étudier les fonctions des hormones produites par ces neurones sur l’organisme ce qui n’est pas possible avec les alternatives envisagées.

Réduction

Une partie des animaux utilisés dans ce projet permettra la création de lignées génétiquement modifiées et l’autre partie subira des challenges (variations rapides des paramètres de l’eau) afin de déterminer le rôle du système neurosécréteur caudal et des hormones qu’il produit. Le nombre d’animaux envisagé pour la création des lignées génétiquement modifiées est basé sur notre expérience de ce type d’approche. L’optimisation des protocoles nous permet d’utiliser le moins d’animaux possible. En particulier l’utilisation d’un marqueur visible nous permet de sélectionner les œufs porteurs d’un transgène d’intérêt. Pour notre projet, 16 lignées génétiquement modifiés seront nécessaires. Pour chacune, 50 animaux seront utilisés. Ce nombre est nécessaire et suffisant pour garantir l’obtention des lignées souhaitées. Pour les expériences de variations des paramètres de l’eau, 10 animaux seront utilisés pour chaque paramètre de l’eau étudié (4 paramètres en tout), à 3 valeurs différentes, pendant 3 durées différentes et à 3 stades différents. Ces expériences seront réalisées sur des animaux sauvages (non génétiquement modifiés) et des animaux génétiquement modifiés. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour pouvoir prélever les tissus d’intérêt afin de réaliser des analyses moléculaire ou histologique. Notre expérience de ce type d’analyse montre qu’un nombre de 10 animaux par condition est nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats qui soient statistiquement significatifs. Pour chaque expérience de variations des paramètres de l’eau, des contrôles adaptés ont été prévus et les données obtenues seront analysées à l’aide de tests statistiques adaptés. De plus, pour chaque animal euthanasié, différents tissus seront prélevés et les échantillons seront conservés afin de pouvoir être utilisés pour différentes analyses sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. D’une façon générale, ce projet a été conçu et organisé de façon à pouvoir, à chaque étape, sélectionner rigoureusement les lignées à produire et les expériences à mettre en œuvre afin de répondre à nos objectifs. Le nombre de lignées et d’expériences prévus, et donc le nombre d’animaux, ont été optimisés afin de répondre au mieux aux objectifs de ce projet, notamment en termes de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans une animalerie confinée et agrémentée, dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Les embryons et larves sont maintenus dans un milieu d’élevage et les adultes dans de l’eau dont les paramètres sont surveillés très régulièrement. Les animaux sont nourris avec de la nourriture sèche pour assurer une croissance optimale ainsi que de la nourriture vivante (larves d’artémia, rotifères) pour permettre un enrichissement du milieu et sont maintenus à une densité adaptée, y compris pendant les expériences de variations des paramètres de l’eau, afin d’éviter tout stress dû à une surpopulation ou un isolement. Pour la création des lignées génétiquement modifiées la sélection des embryons concernés se fait sans avoir recours à des biopsies. De plus, l’observation attentive de ces embryons permet de n’élever que des animaux dépourvus de malformation. Dans le cadre des expériences de variations des paramètres de l’eau et de la production d’animaux dépourvus de système neurosécréteur caudal ou de certaines hormones, les animaux font l’objet d’un suivi particulier (horaire ou quotidien) par du personnel formé afin de surveiller l’éventuelle apparition d’un trouble locomoteur ou comportemental. Des points limites, définis à l’avance, permettent d’interrompre l’expérience de variations des paramètres de l’eau si nécessaire.

Choix des espèces

L’étude dynamique des processus développementaux et physiologiques n’a de sens qu’à l’échelle d’un organisme entier. Ces processus ne peuvent être reproduits totalement in vitro et nécessitent de recourir à des organismes modèles animaux. Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude génétique. Sa relative facilitée d’élevage, son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités d’édition du génome (production de lignées génétiquement modifiées porteuses d’un transgène ou d’une mutation d’intérêt) en font un modèle de choix pour la recherche. Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Les animaux sont donc utilisés de la fécondation jusqu'à l'âge adulte. Les études physiologiques sur les animaux dépourvus de système neurosécréteur caudal ou de certaines hormones seront réalisées sur de jeunes larves (2 semaines), des juvéniles (8-10 semaines) et des adultes (4-6 mois) afin d’en tester l’impact en fonction de l’âge des animaux.

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de cancer colorectal, puis des traitements répétés par voie orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale pendant plusieurs semaines. Le porteur indique que les tumeurs peuvent s'accompagner d'infections cutanées, de plaies ou de nécroses, et prévoit un score clinique déclenchant soulagement ou mise à mort. Il utilise des souris immunodéprimées et affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" au modèle animal pour reproduire le dialogue entre tumeur et environnement.

Objectifs

Le cancer colorectal figure au troisième rang des cancers les plus diagnostiqués dans le monde. Il représente la quatrième cause de décès dont l’incidence continue à augmenter. Malgré l’ampleur de cette pathologie les origines moléculaires de cette maladie restent encore mal comprises. En conséquence, un grand nombre de patients ne peuvent être efficacement soignés. Au cours de la progression tumorale, les cellules cancéreuses acquièrent des propriétés spécifiques, dont la capacité à envahir les tissus environnants pour métastaser vers des sites distants. L’acquisition de ces propriétés malignes reflète des perturbations dans les voies de signalisation cellulaires qui contrôlent la prolifération, la motilité et à la survie cellulaire. Notre recherche vise à comprendre comment la dérégulation de ces voies de siganlisation conduit à l’agressivité des cancers et à découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques asociées. Les modèles souris de greffes sous-cutanées de cellules de cancer colorectaux constituent des outils importants pour étudier et comprendre le développement du cancer colorectal et permettent aussi d’évaluer la réponse tumorale à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Notre programme de recherche qui se déroulera en 5 ans permettra de mieux comprendre le processus relié à la formation des métastases et de proposer de nouvelles thérapies ciblées dans le cancer colorectal.

Procédures

Des greffes sous-cutanées de cellules cancéreuses seront réalisées sur l’ensemble des animaux (une seule injection en sous-cutanée sur souris vigile, durée du geste

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une infection cutanée, des plaies, ou des tumeurs nécrosées. L’examen quotidien des souris permettra également la détection des premiers signes comportementaux liés à la douleur (isolement, absence de mobilité et de réponse aux stimuli, étirements, absence de toilettage, pilo-érection, absence de prise de boisson…). Les signes relatifs à la dégradation de l’apparence physique et aux troubles du comportement seront scorés et des mesures de soulagement ou la mise à mort de l’animal seront envisagées en fonction du score.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement et à l’analyse fine des tumeurs.

Remplacement

Nous utiliserons des modèles in vitro de tumoroïdes issus de cellules en culture pour étudier les effets des protéines étudiées et des traitements proposés dans les cellules épithéliales intestinales. Par contre, Il n’existe pas d’alternative autre que l’utilisation des modèles animaux pour évaluer avec précision et pertinence, le rôle de ces protéines et l’effet de ces traitements dans un contexte mimant la physiopathologie et prenant en compte le dialogue entre les cellules tumorales et l’environnement de la tumeur, notamment avec la matrice extracellulaire et le système immunitaire.

Réduction

Grace aux données de la littérature et à l’utilisation de tests statistiques nous pouvons définir avec précision le nombre de souris suffisant par groupe pour chaque procédure.

Raffinement

Toutes les dispositions ont été prises pour le raffinement les conditions d’expérimentation. Le bien-être animal est évalué quotidiennement. Une attention particulière est portée à la formation de l’expérimentateur afin de limiter la durée de la procédure expérimentale et ainsi réduire la douleur et limiter les variations expérimentales. Une fiche de suivi est établie pour chaque animal de la procédure expérimentale. Les souris seront observées régulièrement et les signes cliniques seront recherchés : perte de poids, isolement, dos vouté… A l’apparition d’un de ces signes, des stratégies seront mises en place pour mettre fin à la douleur et au stress de l’animal.

Choix des espèces

La souris nude immunodéprimée est le modèle utilisé internationalement pour étudier la croissance tumorale des cellules humaines. Ne possédant pas de thymus, elle accepte la greffe de cellules tumorales humaines sans présenter de phénomène de rejet. Les souris immunocompétentes sont un modèle de référence pour étudier la croissance tumorale des cellules murines qui permet de prendre en compte l’implication du système immunitaire de l’hôte. Nous utiliserons des souris de 6-7 semaines, âge où l’on observe une bonne prise de greffe et des femelles, en raison de leur caractère moins agressif entre-individus.

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes ou d'ARNm et des prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever leurs organes lymphoïdes, afin de produire des anticorps monoclonaux destinés aux programmes d'une société. Le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer une détresse modérée, des réactions inflammatoires et, en intramusculaire, une nécrose musculaire ou une inflammation des nerfs. Il revendique une qualité "souvent supérieure" des anticorps dérivés d'animaux et affirme qu'aucune méthode alternative n'est possible pour les hybridomes murins.

Objectifs

Le projet a pour objectif d’immuniser des souris avec un antigène et/ou de l’ARNm afin d’obtenir des anticorps monoclonaux qui pourront potentiellement être sélectionnés au sein des programmes de la société. Ces anticorps pourront devenir des candidats médicaments pour de la thérapie humaine ou des outils pour développer les méthodes analytiques nécessaires à un projet scientifique.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, les anticorps monoclonaux sont devenus de plus en plus importants dans de nombreux domaines et particulièrement dans celui de la thérapie humaine. Ces molécules émergent de plus en plus dans le domaine de l’immuno-oncologie afin de traiter les patients atteints de nombreux types de cancer différents. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont la génération d’outils de développement de méthodes analytiques, nécessaires à un projet scientifique ainsi celle de potentiels candidats médicaments pour de la thérapie humaine.

Procédures

Ce projet comporte 3 procédures expérimentales correspondant chacune à une stratégie d’immunisation spécifique. Un même animal ne pourra pas être impliqué dans plusieurs procédures. Les animaux seront, donc, soumis à une seule procédure comportant plusieurs étapes/interventions. Des échantillons de sang seront prélevés, sous anesthésie gazeuse associée à une analgésie locale, au cours de chacune des procédures. Les animaux recevront également un nombre d’injection variables d’antigène et/ou d’ARNm, en fonction de la stratégie sélectionnée. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever différents organes lymphoïdes. Typiquement, les interventions seront réalisées entre 1 et 2 fois toutes les 2 semaines pendant 4 ou 8 semaines. Cependant, la durée maximale de chacune des procédures est de 6 mois pour permettre la réalisation d’un protocole « retardé ». Chacune des interventions réalisées est de courte durée (≤10 minutes).

Impact sur les animaux

La majorité des souris subiront des injections répétées pouvant générer une légère douleur lors de leur réalisation. Cependant, celles-ci étant répétées, il y aura des effets cumulatifs, ce qui pourrait entraîner une détresse modérée chez ces souris. L’injection d’antigène ou d’ARNm peut provoquer des réactions inflammatoires importantes, notamment, durant les 2-5 jours suivant l’injection. Ces dernières peuvent, dans certains cas, se traduire par une perte de poids, une diminution de la mobilité, une réduction de la réactivité aux stimuli verbaux et sensoriels et/ou un pelage ébouriffé. De par la faible masse musculaire de la souris, l’injection intramusculaire peut, parfois, causer une nécrose musculaire ou une inflammation des nerfs.

Devenir

À la fin de l’étude, les animaux présentant la meilleure activité contre l’antigène d’intérêt seront euthanasiés pour la collecte d’organes lymphoïdes. Ces derniers permettront, par la suite, la génération des anticorps monoclonaux. Les animaux non-prélevés seront, quant à eux, euthanasiés afin de limiter les nuisances sur leur bien-être et éviter tout effet indésirable à long-terme.

Remplacement

In vivo, les anticorps monoclonaux sont des molécules complexes qui font intervenir de multiples étapes permettant une sélection des plus efficaces. Le principal avantage des anticorps dérivés d’animaux par immunisation est donc leur qualité, souvent supérieure à ceux non-dérivés d'animaux (ex : phage display). Ces derniers nécessitent, également, des coûts et des délais de génération beaucoup plus importants. De plus, leur qualité pour les phases de développement non clinique d’anticorps thérapeutiques peut poser des difficultés supplémentaires. Par ailleurs, dans le cas où la production d’anticorps nécessite le développement d’hybridomes murins, il n’est pas possible d’utiliser de méthode alternative.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux qui seront utilisés a été calculé afin d’optimiser les chances d’obtenir au minimum un anticorps d’intérêt, par stratégie d’immunisation. Dans le cas où les technologies, réalisées à partir des organes lymphoïdes des souris sélectionnées, ne permettront pas d’obtenir d’anticorps de qualité ou possédant les caractéristiques désirées, un protocole retardé pourra être réalisé sur les animaux immunisés restant. Les animaux utilisés seront généralement issus de lignées consanguines.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 5 jours sera respectée à la réception des animaux. Les animaux seront hébergés de 2 à 5 par cage avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où un animal devrait être maintenu seul dans sa cage, un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse) associée à un analgésique local et les volumes ainsi que les fréquences de prélèvement suivront les recommandations du CEEA et de la SBEA. L’utilisation d’aiguilles de diamètre adapté au type d’injection à réaliser et le plus petit possible seront utilisées afin de limiter la douleur lors des injections. L’évolution pondérale, l’aspect général et le comportement des animaux (apparence, plaie/traumatisme, excrétion) seront suivis une fois par semaine. En post-injection d’antigène ou d’ARNm, période durant laquelle l’animal peut perdre du poids ou présenter des signes physiologiques marqués de détresse, les animaux seront pesés quotidiennement. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que le poids de l’animal ne diminue plus sur 2 pesées successives et que celui-ci ne présente plus d’éventuels signes physiologiques de détresse aiguë (hypomobilité/hyporéactivité, respiration accélérée/ralentie, etc.). Pour limiter l’impact de l’injection et faciliter la récupération des animaux, un gel aqueux enrichi en nutriments sera, également, mis en place en pré et post-injection durant la totalité de cette période. Dans le cas d’injection intramusculaire, une surveillance accrue du site d’injection et de la motricité du membre de l’animal sera, également, effectuée. Après cette période, la fréquence d’observation et de pesée des animaux sera de nouveau réduite à 1 fois/semaine. Elle pourra, cependant, être augmentée en cas de nouvelle dégradation de l’état de l’animal. Des points limites spécifiques relatifs à une perte de poids trop importante et/ou un aspect général/comportement très dégradé seront des critères pouvant justifier l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme animal est basé sur la bonne connaissance de son système immunitaire et sa capacité à générer des réponses antigéniques efficaces permettant d’obtenir des lymphocytes B exprimant des anticorps spécifiques de haute affinité. De plus, sa petite taille, sa grande fécondité et son coût de production et d’entretien relativement peu élevés en font un animal de choix. Le développement de nombreuses souches consanguines a, également, permis d’obtenir des lots d’animaux génétiquement très similaires, facilitant ainsi les études comparatives. Les animaux utilisés auront préférentiellement un âge compris entre 6 et 8 semaines. En effet, il a été décrit que la souris développait une réponse immunitaire plus forte contre les antigènes externes à cet âge.

26 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un paludisme murin (Plasmodium berghei), reçoivent des composés par gavage et subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue puis un prélèvement rétro-orbitaire terminal, pour tester des molécules dérivées des Phenmiazines. Le porteur indique qu'une parasitémie élevée peut provoquer une anémie, une perte de mobilité et une perte de poids. Les retombées en clinique humaine restent renvoyées au conditionnel, et le remplacement est écarté au motif qu'il n'existerait "pas de solution viable" hors modèle animal.

Objectifs

importantes dans le fonctionnement du parasite responsable du paludisme. Ces iinhibiteurs appartiennent à la famille des Phenmiazine[1-3].Le projet comprant également l’évaluation de la cytotoxicité dans le but d’un essai préclinique. Les tests visant à évaluer l’efficacité antipaludique in vitro contre Plasmdium spp ont permis d’isoler les composés ayant les meilleures activités. L’ensemble de ces démarches prises ensemble nous amènent à analyser l’efficacité antipaludique de ces molécules dans un système de paludisme murin qui est la base des essais pré-clinique dans la recherche de thérapie expérimentale. Les données collectées permettront de déterminer si des tests cliniques plus poussés peuvent être poursuivis. Par ailleurs les Phenmiazines seraient un atout dans la lutte antipaludique en raison de la diminution des thérapies efficaces et de la résistance croissante aux antipaludiques de la part de Plasmodium falciparum. Elles seraient également un atout chimique car elles n'appartiennent à aucune des familles chimiques antipaludiques déjà recommandées par l'OMS

Bénéfices attendus

A court termes, les bénéfices attendus résident dans la confirmation des résultats in vitro. Une évaluation de la quantité de molécules candidates restantes dans le sang après injection totale est un point important de l'évaluation in vivo pour savoir si ces molécules sont plus ou moins éliminées pendant l'infection. Ce projet permettrait également de mettre en évidence l'efficacité de nouvelles molécules dans la thérapeutique antipaludique. A plus long terme, ceci apporterait une nouvelle famille chimique antipaludique dont le mécanisme reste à approfondir. Si les résultats venaient à se confirmer, ce serait l’opportunité de développer un principe actif sur la base structurale de ces molécules, et un potentiel médicament avec des paramètres pharmacocinétiques compatibles Le but étant de mettre au point des composés efficaces en clinique humaine contre le paludisme, alors que l’arsenal des thérapies utiles et efficaces diminue rapidement.

Procédures

Procédure [1] 2 souris : prélèvement veineux à la queue - tous les 3 jours pendant 10 jours+ A 7% de parasitémie, 1 anesthésie et 1 prélèvement rétro orbitaire - totalité du sang prélevé et euthanasie (durée 30 minutes) - Procédure [2] 24 souris : prélèvement veineux à la queue - tous les 2 jours à compter de J2 (post infection) pendant 30 jours + pesée tous les 2 jours à compter de J1 (post infection) pendant 30 jours - Jour de l'euthanasie injection de bleu Evans en ip 50 µL à 50mg/kg, incubation 1h maximum puis anesthésie et dislocation cervicale. Cocktail kétamine xylasine pour des souris de 18g : 100 mg/kg de Kétamine et 10 mg/kg de xylazine. Les nuisances correspondent à des contentions, des piqures au niveau de la queue pour prélèvement, des injections intrapéritonéales et l’ingestion (per os) de médicaments candidats pour l’expérience. Dans le modèle de paludisme murin, les souris auront des parasitémies qui à taux élevé (>75%) peuvent entrainer une anémie donc une perte de mobilité et une perte de poids transitoire

Impact sur les animaux

Les molécules évaluées sont des molécules qui ont déjà été testées sur des souris pour la cytotoxicité. Les doses utilisées sont en dessous du seuil de toxicité obtenues lors de notre étude in vivo. L'infection par Plasmodium berghei conduit à la mort chez les BALB/c pour des parasitémies supérieures à 80% néanmoins le choix de ce modèle réside également sur le fait que ces souris résistent très bien à des parasitémies élevées en affichant un tableau clinique facile à suivre.

Devenir

Procédure [1] 2 souris euthanasiées par dislocation cervicale après réalisation du prélèvement rétro orbitaire sous anesthésie. La récupération de la totalité du sang infecté ne permet pas de maintenir la souris en vie. Ce sang est important pour infecter les souris de la procédure 2 et maintenir notre souche de paludisme murin. Procédure [2] 24 souris euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie. L'euthanasie des souris permet de récupérer rapidement les organes (cerveau, cœur, foie, poumons, reins, rate) des souris et le sang afin de doser les médicaments présents dans les tissus, mener les études de protéomique et d'histologie nécessaires à l'étude des dommages tissulaires liées à l'infection. Les souris ayant été déjà traitées et infectées, il est difficile de les réinfecter en raison d'une résistance à la réinfection manuelle et une réactivité du système immunitaire. Il est difficile de les réutiliser pour un essai similaire de pharmacothérapie, les souris ayant pris du poids et de l’âge ce qui limite également la possibilité de réinfection [16-19]

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de solution viable de remplacement pour le moment. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée par la complexité de la pathologie étudiée, le paludisme. Cette infection parasitaire touche les hématies et l’augmentation de la parasitémie entraine un tableau clinique complexe au niveau des différents organes en raison de l’anémie progressive et l’inflammation croissante liées à l’infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être d’étudié dans des systèmes in vitro, ou des bioréacteurs élaborés.

Réduction

La réduction fait partie de notre stratégie d'étude. Elle repose sur une étude bibliographique pour connaitre les dernières études pharmacologiques et antipaludiques en paludisme simple. Le calcul du nombre de sujets dans des groupes de même effectif est donné par une formule mathématique, pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les deux groupes avec un risque de première espèce alpha égal à 5% et une puissance de 80% est donné par la formule suivante, dans le cadre d’un test bilatéral et avec des effectifs égaux dans les deux groupes.

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet puisqu’ il est évalué dans notre grille de score. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (l’enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Les animaux seront hébergés en conditions standard d’animalerie, avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Ils bénéficieront d’une période de stabulation de 5 jours post livraison dans l’animalerie de l’IHU, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués

Choix des espèces

Le modèle murin (Mus musculus) est choisi car il est un support idéal pour l'infection par Plasmodium berghei. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris BALB/C pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 60 à 70%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. La simplicité et l'efficacité du modèle BALB/c+Plasmodium berghei en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique. Les souris BALB/c seront des individus adultes âgés de 8 à 9 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 10 à 11 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond également à la maturité sexuelle (adulte) mais aussi au début de maturité du système immunitaire.

421 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une à deux greffes tumorales, quatre injections de médicaments, des prises de sang et une séance d'imagerie sous anesthésie pouvant durer deux heures. Le porteur indique qu'il n'est pas possible de traduire in vitro la réponse aux immunomodulateurs et travaille sur des souris immunocompétentes porteuses de tumeurs. Le projet évalue l'injection locale d'un anticorps anticancéreux et met en avant une dose dix fois moindre qu'en voie systémique.

Objectifs

L'immunothérapie a modifié de façon considérable la prise en charge thérapeutique de plusieurs types de cancers. Cependant le taux de réponse reste majoritairement inférieur à 25-30% en monothérapie. Des résultats obtenus lors d'une expérience in vivo précédente mettent en évidence cette variabilité interindividuelle chez la souris. L’administration loco-régionale d’agents immunomodulateurs permet la diminution des toxicités, l’augmentation des taux de réponse du fait d’une meilleure pénétration des anticorps au sein de la tumeur et de son microenvironnement. Enfin, la dose efficace en administration locale est d'environ 10 fois inférieure à celle injectée par voie systémique ce qui représente un avantage économique non négligeable. Plusieurs études évaluant l’administration intratumorale d’agents immunomodulateurs (virus oncolytiques, anticorps ou protéines activatrices de l’immunité, inhibiteurs des checkpoint immunitaires) sont en cours avec des résultats attendus dans les mois à venir, et déjà des observations encourageantes rapportées.

Bénéfices attendus

L’administration loco-régionale d’agents immunomodulateurs permet la diminution des toxicités, l’augmentation des taux de réponse du fait d’une meilleure pénétration des anticorps au sein de la tumeur et de son microenvironnement. Enfin, la dose efficace en administration locale est d'environ 10 fois inférieure à celle injectée par voie systémique ce qui représente un avantage non négligeable.

Procédures

Greffes de tumeurs (1 ou 2 par souris, suivant les procédures, durée 15 minutes), injections de médicaments (4 par souris, durée 1-3 minutes), prises de sang (n=3, durée 5-10 minutes). Séances d'imagerie confocale sous anesthésie: 1 par animal, durée de 30 à 120 minutes.

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la présence de tumeurs en sous-cutanée, injections de produits en intra-veineuse et séances d'imagerie sous anesthésie.

Devenir

La mise à mort des animaux greffés et traités permettra de faire des analyses post-mortem sur de nombreux tissus.

Remplacement

Le traitement par immunothérapie implique une interaction forte entre cellules tumorales et cellules immunitaires. Actuellement, il n'est pas possible de traduire complètement la réponse aux immunomodulateurs in vitro. Afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines, nous explorerons l'activité de nos formulations chez des souris immunocompétentes et porteuses de tumeurs murines.

Réduction

Pour étudier l'efficacité des différents traitement anti-tumoraux, la croissance tumorale sera suivie après implantation des cellules. Les critères d’analyse de l’activité anti-tumorale seront le pourcentage d’inhibition tumorale à un temps défini, le délai de croissance tumorale comparé au groupe contrôle, le nombre de régression partielle ou complète et le nombre de survivants sans tumeur. Chaque expérimentation reposera sur une randomisation des souris afin d'homogénéiser les groupes et d’éviter l'impact environnemental, s'assurant ainsi de la fiabilité des résultats. Un pourcentage d'inhibition de la croissance tumorale (comparé au control) supérieur à 40% sera considéré comme efficace (risque alpha 0,1-puissance 0,8). Le nombre d'animaux a été déterminé statistiquement.

Raffinement

Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie générale ou locale. Les points limite seront strictement appliqués. Si des signes de stress ou de douleur étaient observés un analgésique sera administré et/ou un enrichissement différent sera ajouté dans la cage.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches dont le système immunitaire a été très largement caractérisé. D'après notre expérience passée, nous avons pu observer que nos lignées de cellules tumorales murines se développent bien chez la souris et de nombreuses études en immunothérapie ont montré de très bons résultats dans ce modèle. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte correspondant à un développement optimal du système immunitaire.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie obstruant complètement le canal biliaire pour induire une fibrose hépatique, puis des injections quotidiennes pendant trois semaines. Le porteur indique des douleurs de laparotomie et des risques d'infection ou de rupture de suture. Il affirme qu'il est impossible de reproduire in vitro les effets de la fibrose hépatique sur l'organisme et retient la souris comme le modèle dont la génétique est la mieux connue.

Objectifs

La fibrose hépatique est définie comme la production et l'accumulation excessive de la matrice extracellulaire (ECM) dans le foie. La fibrose hépatique peut être causée par une multitude de différents stimuli et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la fibrose impliquent un programme très orchestré de changements moléculaires et cellulaires. En particulier, les modifications anatomiques et fonctionnelles de l'intégrité des tissus du foie sont consécutives à l’amplification des signaux inflammatoires. La fibrogènese hépatique est un problème clinique dans le monde entier. L’objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition d’une protéine, impliquée dans le métabolisme des acides gras et libérée par le foie, peut prévenir la fibrose hépatique induite par la cholestase obstructive.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à la fibrose hépatique, qui impact la fonction hépatique et qui est un problème clinique majeur car peut être causée par une multitude de différents stimuli toxiques.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant l'obstruction complète du canal biliaire (durée environ 30 minutes/souris). L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie et analgésie (avec un suivi analgésique post-opératoire de 2 jours). Tous les animaux recevront des injections (quelques secondes) sous-cutanées (animal vigile). L’expérience n’excédera pas 3 semaines (à partir de la chirurgie). Tous les traitements seront administrés par voie intra-péritonéale (au maximum 1 fois par jour, tous les jours, quelques secondes).

Impact sur les animaux

La procédure de ce projet n’excédera pas 3 semaines. Tous les animaux du projet seront soumis à une chirurgie induisant l'obstruction complète du canal biliaire. Aucun autre effet indésirable n’est attendu en dehors de ceux connus et causés par cette induction. Une douleur due à la laparotomie pourra apparaitre chez la souris. Des infections ou des ruptures de sutures pourraient survenir. La fibrose sera induite mais à ce stade les douleurs seront modérées. Le mouvement des souris et leur respiration ne seront pas impactés. Les injections n’induisent pas de douleurs à l’animal autre que la piqûre de l’aiguille et peuvent induire un stress dû à la contention.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la fibrose hépatique vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 600 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour les analyses pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de tapis et lampes chauffantes, ...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.