Procédures modérées

20 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une destruction par radiofréquence de trois zones du foie et l'injection d'un gel immunostimulant, puis des prélèvements sanguins tous les trois jours sur deux semaines, pour vérifier la tolérance d'un traitement avant un essai clinique humain. Le porteur indique que le gel pourrait migrer et provoquer une embolie pulmonaire menant à une mise à mort précoce, tout en jugeant ce risque improbable. Il affirme que l'expérimentation animale n'est pas "substituable" et retient le porc pour son foie proche de celui de l'humain.

Objectifs

Des métastases hépatiques compliquent l’évolution de 50% des cancers colorectaux (CCR), dont le traitement chirurgical ne peut être réalisé que dans moins de 20% des cas. Après chirurgie complète la moitié des malades développent une récidive dans le foie, évolution de métastases non visibles au moment de la chirurgie. L’efficacité des traitements est limitée par une toxicité non sélective de la chimiothérapie, par la sélection de cellules tumorales résistantes au traitement et par l’insensibilité des cancers digestifs à l’immunothérapie classique. Les objectifs de notre projet d’essai clinique sont de démontrer que la destruction thermique par radiofréquence (RFA) d’une tumeur associée à une injection intra tumorale d’un vaccin, peut, sans complication, induire une réponse immune suffisante pour inhiber la croissance de métastases à distance. Cette stratégie a été validée chez la souris mais sa faisabilité et la toxicité de la procédure n’ont pas été validées chez le gros animal avant réalisation d’un essai clinique prévu en 2022-23. Dans cet essai, l’immunité sera stimulée par l’injection dans le site de RFA, d’un gel contenant 2 immunostimulants. La validation de la faisabilité et de l’innocuité d’un traitement locorégional par l’association RFA-gel-vaccin chez l’animal est un prérequis avant le développement d’un essai clinique chez l’homme. L’objectif principal du projet est de déterminer, dans un modèle gros animal, la tolérance de l’organisme à ce traitement. Cette phase demeure indispensable à la protection des patients.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie in situ après radiofréquence permettra le traitement et le contrôle à distance et dans le temps d’un cancer digestif métastatique, non accessible au traitement chirurgical. Les objectifs du projet d’essai clinique sont de démontrer que la destruction thermique par radiofréquence d’une tumeur associée à une modulation pharmacologique in situ, peut, sans complication, induire une réponse immune suffisante pour inhiber la croissance de tumeurs à distance. Cette stratégie s’intégrera dans le traitement standard et sera probablement synergique avec les thérapeutiques validées et factuelles des cancers digestifs de stade IV en particulier chimiothérapies et thérapies ciblées. Elle pourrait permettre de rétablir l’efficacité de l’immunothérapie des cancers digestifs actuellement insensibles à ces traitements.

Procédures

Radiofréquence hépatique et injection du gel : Répétion de la technique opératoire sur 3 segments du foie les plus distants possible l’un de l’autre : - Même procédure pour tous les animaux - Sous anesthésie générale et controle échographique ponction percutanée du foie par un trocard coaxial - Placement de la sonde de RFA sous contrôle échographique - 2 cycles de RFA par site, dont la durée dépend de l’impédence calculée par la machine avec arrêt automatique, puis retrait de la sonde de RFA - Injection de 10ml de gel au centre de la thermo-lésion avec contrôle échographique de la cinétique d’injection - Retrait du trocard coaxial toujours sous contrôle échographique - Vérification échographique de l’absence de complication - Durée : 15 mn par cycle x 3 / animal Prélévements : Les animaux subiront de prises de sang à des fins de suivi de la fonction hépatique, de pharmacocinétique du produit injecté et de traçabilité de sa libération. Il est prévu au maximum des prélèvements de 20ml de sang toutes les 72 heures sur 14 jours de surveillance à des fins de suivi de la fonction hépatique, de pharmacocinétique du produit injecté. .Après euthanasie : Prélévement multi-organes à visée anatomo-pathologique.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de douleur, d’altération de l’état général de trouble digestif, d’altération de la fonction hépatique ou d’effet indésirable significatif après RFA hépatique chez l’homme. Les mêmes suites opératoires sont attendues chez l’animal. Les effets loco-regionaux du gel en administration hépatique ne sont pas connus (but de l’étude). La procédure est une combinaison de 2 traitements, RFA et immunothérapie intratumorale déjà largements validés chez l’homme et utilisés pour diminuer le risque de complication du traitement des cancers, en particulier métastases et carcinome hépatocellulaire. Les 2 risques cliniquement décelables chez l’animal seront : - La migration per-opératoire du gel, monitoré par echographie, dans le système sanguin et pouvant être à l’origine d’une embolie pulmonaire : risque improbable en raison du caractère thermosensible du gel qui gélifie instantanément à 37°C. La traduction clinique pourrait être des difficultés respiratoires. Cet effet pourrait nécessiter une oxygénation prolongée. Ce risque pourrait conduire au point limite le moins improbable : difficulté d’extubation et nécessité d’euthanasie précoce - Le risque d’activation d’une réponse immunitaire disproportionnée : risque improbable de traduction clinique car l’immunothérapie locale chez l’homme n’entraine pas de complication systémique et que la traduction clinique du risque le plus important qui serait une hépatite autoimmune ne se declenchera pas en une semaine. Un autre organe touché pourrait être le colon avec apparition d’une diarrhée. - Les effets immunitaires seront infra-cliniques et surtout visibles sur la biologie et l’anatomo-pathologie

Devenir

Mise à mort pour prélèvements anatomo-pathologique (étude de toxicité).

Remplacement

Malgré un important travail in vitro sur culture cellulaire pour exploration de facteurs influençant la réponse immune anti-tumorale, l’expérimentation animale n’est pas substituable pour la détermination des effets thérapeutiques de la réaction immune car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les études physico-chimiques, d’immunologie, d’efficacité et de toxicité cette stratégie d’immunothérapie anti tumorale ont été validées in vitro sur culture cellulaire et chez la souris femelle. Le risque de complication le moins improbable est la migration extra-hépatique per-opératoire du gel dans les 5 premières minutes qui suivent l’injection. Ce risque, non évaluable in vitro et chez le petit animal, doit-être évalué dans des conditions de volumétrie, de température, d’hémodynamique et de perfusion hépatique voisine de l’homme. Pour établir la sécurité du geste le porc procure la meilleure conficuration anatomique et physiologique.

Réduction

Nous avons préalablement évalué et publié par des expériences in vitro : - plusieurs gels afin de ne tester chez l’animal que celui qui s’est avéré le plus efficace. - les caractéristiques rhéologiques, d’adhésion et de gélification permettant de controler la cinétique et la stabilité du gel injecté. La stabilité du gel in vivo a été évaluée et publiée chez le petit animal par imagerie non invasive et imagerie par résonnance magnétique. Le faible nombre d’animaux sera compensé par : - Les données pharmacologiques exhaustives chez l’animal et chez l’homme des 2 adjuvants avec AMM qui sont utilisés en routine et du gel testés dans de nombreuses etudes cliniques. Pas de toxicité spécifique attendue des 3 composants. - Le nombre de sites traités /animal et de prélèvement post mortem afin d’obtenir des résultats robustes. Par exemple, le nombre maximal de 3 sites traités par animal permettant de mimer 3 lésions tumorales chez l’animal sain correspondra à la dose maximale utilisée chez l’homme De multiples prélèvements hépatiques, pulmonaires ou d’organes cibles de la réponse immune seront réalisés pour évaluer la présence ou non du gel et les effets secondaires immunitaires. Plusieurs centaines d’études cliniques ont été réalisées et certaines stratégies d’injection intratumorale sont réglementairement validées pour utilisation chez l’homme (virus oncolytiques, thérapie cellulaire…). Ces études confirment l’abscence de complication grave de l’injection intratumorale. L’étude sera considérée comme positive si des complications per ou post-opératoire, une diffusion extra-hépatique du gel ou des complications immunologiques graves surviennent chez 2 ou moins animaux sur 5. Ce curseur est établi parallélement a la phase de safety (2 ou moins complications graves /4 premiers patients /12) décrite dans le protocole de l’essai clinique de phase I chez l’homme. Si comme attendu aucune complication n’est décelée l’étude se limitera à 5 animaux. L'objectif de ce travail est l'étude des complications immédiates de l'injection du gel. Le critère d'analyse va être le nombre de complications peropératoires ou postopératoires immédiates par site traité donc n : 3X5 =15. Dans une optique de statistique non paramétrique le seuil de siginificavité est n=5. L'étude des complications immunologiques est un objectif secondaire donc en situation non réelle (immunité différente chez l'humain et pas de cible tumorale) pas de nécessité statistique.

Raffinement

Il n’y a pas de douleur, d’altération de l’état général, de trouble digestif, d’altération de la fonction hépatique ou d’effet indésirable significatif après RFA hépatique chez l’homme qui est le plus souvent réalisée sous anesthésie locale + sédation. Les mêmes suites opératoires sont attendues chez l’animal Le risque d’effets indésirables de la radiofréquence, largement utilisée chez l’homme est faible comme démontré dans la littérature. Contrairement à l’immunothérapie systémique, les effets à distance de l’immunothérapie locale, liés à l’activation immunitaire et en particullier les effets sur des organes à distance devraient être indétectables ce qui a été démontré par les nombreuses publications et les essais cliniques chez l’homme. La procédure est une combinaison de 2 traitements, RFA et immunothérapie intratumorale déjà largements validés chez l’homme et utilisés pour diminuer le risque de complication du traitement des cancers. Séparément les 4 composants du traiement, RFA, Hydrogel, GMCSF et vaccin, sont largement utilisés chez l’homme en pratique clinique Nous mettrons tout en oeuvre pour respecter le principe des 3R : - Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale lors de l’application de la radiofréquence et du gel, avec anesthésie locale concomittante du trajet de ponction per-cutanée et administration d’antalgiques puissants, tout au long de la procédure - Les porcs seront observés tous les jours par le personnel qualifié. Pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des porcs des mesures seront ajoutées afin de limiter leur stress. Les paramètres vitaux seront contrôlés pendant toute la durée des procédures. Des médications pré et post chirurgie seront administrées. - Un examen clinique quotidien permettra d’évaluer la douleur post-opératoire - Les animaux seront hébergés dans des boxes individuels avec la possibilité de se voir et de se toucher. L’environnement sera enrichi avec des jouets en plastique ou des balles accrochées au mur. Un fond musical est prévu dans la salle d'hébergement pendant la journée.

Choix des espèces

Malgré un important travail de physico-chimie, in vitro sur culture cellulaire d’exploration de facteurs influençant la réponse immune anti-tumorale, l’expérimentation animale n’est pas substituable pour la détermination des effets thérapeutiques de la réaction immune car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les études d’immunologie et de cette stratégie d’immunothérapie anti tumorale ont été validées chez la souris femelle. Le transfert à l’homme nécessite une étude de faisabilité et de toxicité chez le gros animal dans des conditions expérimentales se rapprochant de l’utilisation humaine. Le choix du modèle est centré sur le porc une espèce animale permettant en terme de taille et de physiologie, de reproduire le protocole de radiofréquence per-cutanée avec injection intra-lésionnelle d’un gel immunomodulateur sous contrôle échographique qui sera réalisé chez l’homme dans un essai de phase I. Les conditions anatomiques et physiologiques, proches de l’homme, permettront de détecter les risques de la procédure, d’en caractériser les effets locaux et à distance puis de suivre l’activation immunitaire et d’en décrire les effets eventuels sur des organes à distance. Nous avons besoin de porcs jeunes adultes d’environ 50 kg afin d’avoir un foie de dimensions similaires à celles de l’Homme et d’avoir des animaux facilement manipulables quand ils sont vigiles.

33 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse histologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une craniotomie puis une injection stéréotaxique dans le thalamus, avant deux semaines de surveillance, pour valider la diffusion d'un virus thérapeutique. Le porteur prévoit une couverture analgésique et une mise à mort en cas de perte de 20 % du poids. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative expérimentale à ce modèle murin.

Objectifs

Le but du projet est de définir la propagation d'un virus à visée thérapeutique ainsi que son intégration dans les cellules cibles du système nerveux central. Pour cela, nous allons procéder à trois étapes. La première consistera à valider les coordonnées d'injection d'un colorant dans une zone du cerveau de Souris, le Thalamus. Cela nous permettra de nous assurer de la validité et de la reproductibilité du geste technique. Une fois cette étape validée, nous procéderons à l'injection du virus de type adénovirus. Celui-ci s'incorporera dans les cellules du tissu cible et déclenchera l'expression d'une protéine fluorescente que nous pourrons ensuite analyser par histologie. Nous ciblons dans cette étude le thalamus qui n'a jusqu'à présent jamais été ciblé dans notre institut, mais nous maitrisons cette voie d'injection pour d'autres structures. Par ailleurs, ce virus a déjà fait l'objet d'injections dans d'autres structures mais son intégration n'était pas satisfaisante étant donné les populations de cellules atteintes qui ne correspondaient pas au type cellulaire efficace pour permettre l'expression du code génétique véhiculé par ce virus. Finalement, si ces étapes sont validées, nous utiliserons le virus candidat médicament dans une dernière étude afin de valider l'expression du matériel génétique apporté par le virus.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de poursuivre le développement d'un virus candidat médicament dont le but est de traiter les pathologies d'origine génétique du système nerveux central, dans les populations neuronales. Nous prévoyons en effet ensuite d'appliquer le vecteur thérapeutique sur des lignées de souris porteuses d'une mutation génétique, modèles d'une pathologie humaine (Syndrome de l'X fragile). Ce projet consiste donc à une des étapes indispensables du développement d'un candidat médicament.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés durant environ 60 minutes avec une mélange injecté par voie intra-péritonéale. Pour éviter toute douleur durant l'injection cérébrale, un injection sous-cutané d'antalgique sera aussi pratiquée (le geste dure quelques secondes et la couverture antalgique plusieurs heures).

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront une injection stéréotaxique. Celle-ci se réalise sous anesthésie par voie intra-péritonéale et dure environ 1 heure. Durant ce geste, une craniotomie est réalisée suivie d'une injection dans le cerveau. Trente minutes avant l'injection du virus, les animaux recevront une injection de buprénorphine (10 secondes). La zone est ensuite nettoyée et suturée. Les animaux seront ensuite surveillés durant deux semaines puis mis à mort.

Devenir

Tous les animaux doivent être analysés au niveau histologique, ce qui nécessite leur mise à mort.

Remplacement

ce projet s'inscrit dans la mise en place d'un candidat médicament chez l'Homme dont le modèle d'étude principal est une lignée de souris génétiquement modifiées. Il n'existe actuellement pas d'alternative expérimentale.

Réduction

Les effectifs dans les groupes expérimentaux sont réduits mais suffisants pour les analyses histologique ou génétiques planifiées. Il n'est pas possible de les réduire sans impacter la robustesse de l'analyse finale.

Raffinement

Les injections seront effectuées sous anesthésie (Kétamine/Xylazine) avec une couverture antalgique (Buprénorphine)), les animaux maintenus à température à l'aide d'un matelas chauffant et une surveillance étroite post-injection du site d'injection et de l'état des animaux sera réalisée pour réagir à tout signe de souffrance. Un suivi de poids sera mis en place pour les protocoles étalés sur 2 semaines afin de mettre en évidence une baisse de l'état général des animaux le cas échéant. En cas d'une baisse de 20% du poids initial sur une semaine, les animaux seraient euthanasiés immédiatement pour éviter toute souffrance.Des points limites ont été mis en place pour éviter toute souffrance aux animaux.

Choix des espèces

La souris constitue le meilleur modèle d'étude car il existe une lignée Fmr1 KO qui est un bon modèle d'étude de la pathologie ciblée (syndrome de l'X fragile) Les animaux seront agés de 5-6 semaines, correspondant au stade cible pour l'étude de la pathologie dans le projet utilisant les animaux génétiquement modifiés.

974 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection du parasite du paludisme puis subissent des prélèvements sanguins quotidiens pendant sept à dix jours, pour évaluer l'effet d'une mutation sur la résistance à la sulfadoxine. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une hyperparasitémie, une anémie et un neuropaludisme, et précise qu'aucun analgésique ne sera administré pour ne pas fausser les résultats. Il affirme que les tests in vitro se sont révélés non reproductibles et qualifie le modèle murin d'"indispensable".

Objectifs

La combinaison sulfadoxine/pyriméthamine est le traitement prophylactique recommandé pour la prévention du paludisme chez la femme enceinte et l’enfant de moins de 5 ans. Cependant, la résistance à cette combinaison thérapeutique est due à l’émergence de mutations sur les gènes dhfr et dhps de Plasmodium falciparum. La mutation I431V de DHPS chez P. falciparum fut identifiée pour la première fois au Nigéria en 2006 et des quintuples mutants de DHPS furent décrits en Afrique Centrale. Cette nouvelle mutation semble être une mutation émergente dans ces pays. A ce jour il n’existe aucune donnée phénotypique de ce génotype. Les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciparum n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. La forte homologie entre les enzymes DHPS de P. falciparum et de P. berghei fait du parasite murin un bon modèle d’études du niveau de résistance à la sulfadoxine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir les premières données phénotypiques dues à la nouvelle mutation I431V de DHPS décrite en Afrique Centrale. L’évaluation de l’effet de cette mutation sur la résistance à la sulfadoxine est primordiale et indispensable pour prédire de l’efficacité du traitement préventif intermittent par sulfadoxine/pyriméthamine utilisé chez les femmes enceintes et les enfants de moins de 5 ans. Ce travail sera une première étape qui permettra d’évaluer la nécessité de la mise en place d’études à grande échelle sur le terrain afin d’actualiser les recommandations mondiales.

Procédures

Injection par voie intra-péritonéale (1 injection, durée estimée 10 secondes). Induction d'une maladie expérimentale : paludisme pendant 7 à 10 jours. Prélèvement sanguin quotidien pendant 7 à 10 jours (durée estimée 10 secondes).

Impact sur les animaux

La souris peut développer une hyperparasitémie accompagnée d’anémie et/ou un neuropaludisme. La surveillance et le suivi quotidiens de la parasitémie permettront de s’affranchir de ces risques.

Devenir

Procédure 1 : Souris et rat euthanasiés au CO2 pour réalisation d'exsanguination. Procédures 2 et 3 : Mise à mort par dislocation cervicale avant apparition des signes de gravité du paludisme (hyperparasitémie et/ou neuropaludisme).

Remplacement

Pour étudier la résistance des parasites aux différents antipaludiques, des tests in vitro peuvent être réalisés. Cependant, les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciaprum menées au laboratoire n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. Ces variabilités techniques majeures sont décrites dans la littérature. Un modèle murin in vivo est donc indispensable pour obtenir des données phénotypiques des différents génotypes de DHPS.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée (test de Student). Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Dans un objectif de réduction, des rats seront utilisés à certaines étapes de la procédure 1 afin de recueillir la quantité de parasites nécessaire à l’expérimentation.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est aussi un facteur de variabilité expérimentale. Les animaux seront hébergés en cage de 2 rats ou de 5 souris, conformément aux recommandations de l'établissement utilisateur. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement de l’habitat. Aucun traitement analgésique ne pourra être administré sous peine d'interférer avec les paramètres étudiés. Nous effectuerons une surveillance quotidienne des souris (état général, prise de nourriture, toilette, mouvements), afin de détecter le plus précocement les signes de souffrance. L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des hôtes intermédiaires de Plasmodium berghei et constitue un modèle animal reconnu Des souris âgées de 6 semaines et des rats âgés de 9 semaines seront utilisés puisqu’ils auront terminé leur croissance.

2 bovins vont être utilisés puis rendus au troupeau après récupération, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux chirurgies sous anesthésie générale pour poser puis retirer une canule dans le rumen, ainsi que jusqu'à vingt-six prélèvements sanguins, pour mettre au point une canule temporaire présentée comme moins invasive que les canules permanentes. Le porteur indique une possible gêne mécanique pendant la cicatrisation et un léger écoulement au retrait. Il revendique un "besoin constant d'animaux" pour la recherche agronomique et affirme ne pas pouvoir remplacer le bovin par un fermenteur artificiel.

Objectifs

L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche. Auparavant orientée vers l'augmentation des performances et l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande, aujourd'hui elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des GES, pollution des sols...) ou les attentes sociétales (bien-être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants, les animaux modèles utilisés sont ici des bovins. C'est un modèle animal de référence pour établir les valeurs de digestibilité et d’ingestibilité des aliments pour ruminants, et pour comprendre les processus digestifs afin de les modéliser. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (ovins, caprins, brebis et agneaux). Pour certaines études, en particulier pour la compréhension des mécanismes de digestion et de mesure de la cinétique de dégradation des aliments, le recours à des animaux porteurs de canules est indispensable. L’objectif de ce projet est de trouver une alternative à certaines méthodes invasives sur animaux en particulier les canules permanentes sur ruminants. Ici, il s’agit premièrement de concevoir une canule ruminale temporaire pour bovin avec un diamètre d’insertion dans le rumen le plus étroit possible (= 3 cm, diamètre interne = 1.5 cm, réalisé en plastique afin d’être peu dense et donc le plus léger possible pour éviter une gêne de l’animal) et pouvant être retirée quelques semaines après (max : 24 semaines). La pose de la canule se fera par chirurgie mais le retrait devra être réalisé sans chirurgie supplémentaire. Le but est que ces dispositifs ne soient positionnés sur l’animal que pour la durée de l’expérimentation et non sur la carrière de l’animal tout en permettant d'étudier les mécanismes fins de la digestion.

Bénéfices attendus

Pouvoir étudier les mécanismes fins de la digestion en utilisant des animaux porteurs de canules. Les animaux ne seront équipés de ces canules que pour la durée des procédures, soit quelques semaines. Les animaux ne seront plus équipés de canules permanentes durant toute leur carrière.

Procédures

Les deux animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale : la pose de la canule durera environ 30 minutes et le retrait de la canule durera moins de 10 minutes. Des prélévements sanguins par voie caudale (13, si besoin au maxium 26) seront réalisés sur les deux bovins vigiles et chacun durera moins d'une minute entre la contention et la réalisation de la procédure.

Impact sur les animaux

Il est possible d’avoir une possible gêne mécanique de la canule au niveau des faisceaux musculaires le temps de la cicatrisation des tissus. Par conséquent la gêne occasionnée est temporaire. De plus, au moment du retrait de la canule, un léger écoulement pourrait survenir pendant quelques heures, le temps que l'orifice ne se ferme naturellement de manière mécanique.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, les 2 vaches retourneront dans le troupeau après avoir complétement récupérées.

Remplacement

Dans certains cas de figure, notamment pour l'étude des mécanismes fin de la digestion, nous ne pouvons pas utiliser de méthodes alternatives (fermenteurs artificiels). C'est pour cela que nous avons recours à des bovins dans ce projet.

Réduction

Nous avons réduit au maximum les effectifs avec seulement deux animaux utilisés. Pour vérifier toutes les étapes, nous devons les confirmer avec au moins une répétition. Il serait vraiment très difficile de tirer des conclusions robustes avec seulement un seul animal.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour le raffinement notamment les conditions d'hébergement qui seront réduites au maximum individuellement et les surfaces par animal respectent les normes en expérimentation. De plus, lors de la pose et du retrait le protocole médicamenteux est adapté afin que l'animal souffre le moins possible, pour cela des antiinflammatoires ainsi que des antalgiques sont administrés sur 9 jours post opératoires pour permettre à l'animal de se remettre dans de bonnes conditions. Pour vérifier que son bien être n'est pas impacté, des grilles comportementales seront mises en oeuvre (au moment de la pose et du retrait de la canule temporaire) deux fois par jour de J-1, J0, J1, à J2, puis une fois par jour à J3, J6, J8, J10 et J13, ce qui permettra d'adapter si besoin le protocole de prise en charge de la douleur (analgésie et/ou anti-inflammatoire). Elles comportent des critères relatifs aux comportements (changements de comportements, postures antalgiques, etc.), des paramètres zootechniques (ingestion, etc.) et physiologiques (température rectale, fréquences cardiaque et respiratoire, etc.), et à l’aspect des cicatrices. Des prises de sang sont réalisées en parallèle des grilles comportementales pour vérifier l'évolution d'une hormone indicatrice du stress (cortisol sanguin) et des protéines de l’inflammation (Haptoglobine et interleukines) pour déceler si l'animal souffre des procédures réalisées.

Choix des espèces

Nous étudions la digestion des ruminants et le bovin est l'un des modèles d'études de ces mécanismes. C'est pour cela que nous avons choisi l'espèce bovine. Il s’agit de mettre au point de nouvelles approches chirurgicales moins invasives que la pose de canules permanentes ruminales, pour pouvoir étudier in vivo la digestion et le métabolisme des nutriments absorbés par l’animal et les réponses de l’animal. Nous étudions les mécanismes de digestion d'animaux qui peuvent être utilisées à différents stades physiologiques : vaches en production ou taries. Le stade de lactation important peu pour cet essai.

Âgés de deux jours, des souriceaux sont anesthésiés par refroidissement sur la glace, reçoivent dans le cerveau une injection de vecteur viral ou de solution saline, puis retrouvent leur mère au réveil. 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'expérience pour prélever leur cerveau. Le porteur attend des pertes lors des injections et des rejets de portée par les mères, et injecte des souriceaux dont le génotype reste inconnu à ce stade, pour tester une thérapie génique sur une lignée porteuse d'une mutation à l'origine d'une forme familiale sévère de SLA. Le comportement moteur doit révéler l'effet du traitement, avec un minimum de 18 souris pour "le test comportemental", sans que le résumé précise lequel.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L'incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d'environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L'une d'elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent un phénotype moteur associé à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de leur stabilité à long terme dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l'expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L'objectif de ce projet est de réaliser des injections avec des AAV dans un modèle de souris SLA, afin de valider leur effet thérapeutique. Dans un second temps, le comportement moteur des animaux sera analysé afin de valider l'effet de la thérapie génique.

Bénéfices attendus

Cette étude nous apportera une meilleure compréhension de la SLA et des traitements possibles. Le modèle de souris SLA permettra de tester des approches thérapeutiques permettant de reverser les symptômes de ces souris et d’améliorer leur survie. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. La prise en charge des patients repose majoritairement sur des traitements améliorant leur qualité de vie et une thérapie pluridisciplinaire prodiguées par des professionnels de santé. La compréhension de la physiopathologie de la maladie est donc indispensable à la conception d’un traitement adapté à chaque forme de SLA. Cette étude chez un modèle de souris SLA est un prérequis pour tester ces traitements chez l’Homme ensuite.

Procédures

Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec un vecteur AAV ou une solution véhicule (NaCl) chez chaque souris à l'âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d'endormissement de l'animal (état d'inconscience) et la préparation à l'injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec

Impact sur les animaux

Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin d'effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable. De plus, on ne sait pas modéliser aujourd’hui la distribution d’un traitement de thérapie génique dans un organisme sans le tester dans un organisme vivant tel que la souris.

Réduction

Les effectifs ont été mis en place suite aux prérequis statistiques et aux résulats de notre étude pilote, permettant tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés d'obtenir une réponse statistiquement significative et exploitable, en prenant en compte la variabilité interindividuelle. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies d’analyses comportementales nous ont permis de démontrer qu'un nombre de minimum de 18 souris pour le test comportemental est nécessaire. Notre étude pilote nous a montré qu’un taux de 70% de réussite au niveau du site d’injection était obtenu après les injections intracérébrales. Nous avons ainsi défini le nombre d’animaux nécessaires en prenant en compte ces paramètres ainsi que le fait que le génotype sera inconnu au moment de l’injection, les pertes des animaux lors des chirurgies ainsi que le potentiel rejet des mères après les injections. En fonction de la normalité des données (répartition en cloche) les tests statistiques paramétriques ou non paramétriques seront utilisés afin de comparer les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Lors des chirurgies les mères seront isolées de leur portée. Les souriceaux seront injectés et après le réveil ils seront réintroduits dans leur cage initiale. Ils seront marqués avec leur propre urine afin de masquer toutes odeurs liées à la procédure chirurgicales. Cela évitera un rejet de la mère. Les mères seront réintroduites dans leurs cages une fois la portée injectée et réveillée. Les cages ne seront pas changées lors de la période post-opératoire (48h minimum). Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Cette couverture possédant une sonde thermique elle nous permettra de réaliser un retour progressif à 37°de la température corporelle du souriceau. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure. Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s'agit d'une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l'âge de 7 jours lors d'interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l'environnement). L'hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l'animal.

Choix des espèces

Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, à un stade précoce du développement cérébral, pour permettre une expression optimale du matériel génétique.

4 200 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et environ 200 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un candidat médicament par différentes voies, parfois sous chirurgie, puis subissent des prélèvements sanguins répétés et des ponctions de liquide céphalorachidien, pour mesurer la pharmacocinétique de molécules en développement. Le porteur indique que les effets indésirables des produits ne sont pas prévisibles au départ et seront gérés au cas par cas. Il affirme que les méthodes in vitro ou in silico n'existent pas ou ne suffisent pas, sans autre justification.

Objectifs

Chaque étude de ce projet a pour objectif principal d’étudier le devenir d’une molécule, candidat-médicament, chez la souris, lorsque cette espèce est utilisée au cours du développement préclinique de cette molécule (pharmacocinétique). Pour cela, au cours de chaque étude, des prélèvements sanguins répétés et/ou un prélèvement de liquide céphalorachidien (LCR) sont réalisés chez l’animal vigile ou transitoirement anesthésié après l’administration par différentes voies du candidat-médicament comparé ou non à une autre molécule. Ces prélèvements sont utilisés pour mesurer dans le temps la concentration du candidat médicament administré et éventuellement la concentration de différents autres marqueurs biologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris seront généralement soumises à une ou des administrations du candidat-médicament en vigile (quelques secondes à 1-2 min), sous anesthésie (1 à 5 min) ou au cours d’une chirurgie (10 à 30 min). L’administration du candidat-médicament nécessitant une chirurgie ne sera réalisée qu’une seule fois. Les autres voies pourront être utilisées plusieurs fois en suivant les recommandations éthiques. Puis, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins répétés et/ou de LCR (Liquide Céphalo Rachidien). Concernant les prélèvements, les volumes prélevés, la fréquence de prélèvement et les temps de récupération suivent les recommandations éthiques. En général, la durée du prélèvement sanguin (contention et prélèvement) n’excède pas 2 min.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échanges avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Dans ce projet, les administrations nécessitant une chirurgie est composée d'un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d'un suivi post-opératoire adapté, ce qui permet de limiter au maximum l'impact négatif sur l'animal. Après récupération, les animaux seront maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies.

Devenir

Les animaux seront généralement mis à mort à la suite de l’étude pour la réalisation de prélèvements terminaux (sang, tissus). En l’absence de prélèvements terminaux, certains animaux pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée, si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés et après l’avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique qui sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu par : - le recours à des procédures les moins invasives possibles - le suivi d’éventuel signes cliniques - la recherche des points limites - le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire - la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse .

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’étude de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir du produit testé lorsque ces rongeurs sont utilisés au cours du développement préclinique de ce produit. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

585 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules ou sont suivies dix à douze mois pour laisser survenir une leucémie qui se manifeste par des tumeurs palpables, pour analyser quatre facteurs de la leucémogenèse B. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements et prévoit une mise à mort avant que la tumeur ne dépasse une taille définie. Il affirme que ces processus ne peuvent être étudiés dans des lignées cellulaires et conclut que la génétique connue de la souris "impose" son choix.

Objectifs

Les cellules B jouent un rôle crucial dans notre système immunitaire grâce notamment à leur capacité à produire des anticorps. Dans certains contextes encore mal compris, de rares cellules B peuvent devenir cancéreuses. Ce processus pathologique peut survenir à différents stades du développement des cellules B. En général, la leucémie touche des cellules B aux stades précoces ou immatures de leur développement, alors que les lymphomes ou myélome ciblent des cellules B plus matures. Malgré d’intenses efforts et d’importantes avancées, les mécanismes et les facteurs qui déclenchent le processus tumoral à des stades déterminés du développement des cellules B et favorisent l’expansion des rares cellules cancéreuses initiales, ou au contraire leur blocage, restent obscurs. Ceci est en grande partie dû à l’absence de modèles animaux appropriés qui miment la situation chez l’Humain. Notre projet est à visée biomédicale et a pour objectif d’analyser le rôle de 4 facteurs, connus pour jouer un rôle important dans le développement des cellules B, dans la survenue de la leucémie. Ces 4 facteurs seront étudiés dans un modèle de leucémie chez la souris. Nos travaux relèvent de la recherche publique et sont réalisés au sein d'une unité mixte de recherche.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de comprendre le rôle de 4 facteurs dans la prolifération tumorale, ou au contraire dans son inhibition, au cours de la leucémie B. A court et moyen termes, la réalisation du projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes en jeu lors de la prolifération tumorale. Mais au-delà de cet aspect fondamental, le projet a des implications pour la santé humaine dans la mesure où la leucémie B reste un problème de santé majeur, en particulier en raison des problèmes récurrents de rémission observés chez les patients, chez qui les conséquences sont souvent fatales. Cette étude devrait donc apporter une contribution originale et importante aux efforts déployés par différentes équipes pour la compréhension des mécanismes de la leucémogenèse en particulier et des différents cancers touchant les cellules B en général (lymphome, myélome, etc). A plus long terme, les résultats obtenus devraient ouvrir la voie à des approches thérapeutiques, notamment par des criblages pharmacologiques et des essais d’immunothérapie, ciblant les facteurs qui se révéleront les plus prometteurs.

Procédures

Dans une procédure, les souris subiront une injection de cellules et d’un suivi de la survenue de la leucémie. A la fin de la procédure, les souris seront mises à mort et certains de leurs organes prélevés pour analyse. Dans une deuxième procédure, aucune intervention n’est prévue. Les souris seront suivies pendant 10-12 mois pour vérifier la survenue de la leucémie, qui se manifeste par l’apparition de tumeurs d’abord palpables à la main lors des examens réguliers, puis visibles à l’œil nu. A la fin de la procédure, les souris seront euthanasiées et certains de leurs organes prélevés pour analyse.

Impact sur les animaux

Deux types de nuisance ou d’effets indésirables sont attendus dans le cas du protocole rapide : l’injection intraveineuse est relativement douloureuse pour les souris. L’injection se fera au niveau des queues des souris. Les souris seront d’abord mises sous anesthésie gazeuse (anesthésie générale). Une anesthésie locale sera en plus réalisée en appliquant une pommade sur la zone de piqure. Par ailleurs, en cas de survenue de leucémie, l’apparition de tumeurs peut gêner le mouvement des souris (voir point 3 : Raffinement). Dans le protocole standard, aucune injection n’est prévue et les nuisances ou effets indésirables sont ceux liés à l’apparition des tumeurs, i.e., mobilité réduite. Dans tous les cas, nous adopterons en plus des critères généraux d’arrêt par rapport à la souffrance (arrêt d’alimentation, amaigrissement, poil hérissé, prostration durable) un critère lié à la taille de la tumeur (< 5 mm). Avant ce point limite, les souris seront mises à mort pour analyse.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyse.

Remplacement

La nature des travaux que nous menons, et qui concernent la physio-pathologie du développement des cellules B, impose le choix de la souris dans la mesure où sa génétique est bien connue. En effet, les processus développementaux que nous étudions ne peuvent être abordés dans leur complexité physio-pathologique (développement, interactions avec d’autres molécules et cellules, vieillissement, etc) dans des lignées cellulaires ou d’autres systèmes in vitro. Néanmoins, aussi souvent que possible, dans le respect du principe de remplacement, nous utilisons des lignées cellulaires ou d’autres systèmes de culture cellulaire. Enfin, notre démarche inclut également la responsabilisation de tous les membres de l’équipe amenés à faire de l’expérimentation animale grâce notamment à des formations spécifiques et au strict respect des règles en vigueur.

Réduction

Dans toute notre démarche, de l’hébergement des souris à l’expérimentation, nous nous faisons un devoir de respecter la règle des 3R (Réduction, Remplacement, Raffinement). En étroite interaction avec les animalier(e)s, le nombre des souris est réduit au strict nécessaire permettant de réaliser nos expériences en tenant compte de la reproductibilité et de la significativité statistique. Ci-dessous, nous présentons le nombre de souris prévues dans les 2 cas de figures : 1) succès du protocole rapide, 2) échec du protocole rapide, impliquant le recours au protocole standard. A noter que les nombres totaux de souris sont donnés pour la durée globale du projet. En pratique, les expériences seront échelonnées dans le temps et conditionnées par les résultats de l’étude pilote. 1. Succès du protocole rapide : Dans un premier temps, nous procèderons à une étude pilote dans laquelle nous nous focaliserons sur un seul facteur (sur la base des données de la littérature). Nous utiliserons donc 3 lignées de souris : une pouvant développer à terme la leucémie, une correspond au facteur cible (et contrôle négatif), et une qui permettra l’étude de l’effet du facteur étudié sur la survenue de la leucémie (amplification ou inhibition) (45 souris au total). En cas de succès de l’étude pilote, l’étude défintive, réalisée une fois, sera étendue aux 4 facteurs. Dans ce cas le nombre de souris prévu (incluant tous les contrôles) est de 540 souris. 2. échec du protocole rapide : En cas d’échec de l’étude pilote, nous adopterons une procédure consistant en un suivi à long terme des lignées. Dans ce cas, le nombre total de souris est de 360 souris, dont la moitié sera hébérgée en zone stérile et l’autre moitié en quarantaine.

Raffinement

Le raffinement inclut d’un côté les conditions d’élevage et d’hébergement qui sont optimisées par les animalier(e)s (nombre de souris ne dépassant pas 5/cage, inclusion de différents objets dans les cages, nourriture au sol en cas de mobilité réduite, etc), et d’un autre côté le choix des méthodologies induisant le moins de souffrance. Notre souci premier dans ce contexte est la prévention de souffrances inutiles, incluant notamment l’observation régulière tous les 2 jours, grille de scoring (établie par la SBEA, structure du bien-être animal), respect des nouvelles règlementations mises en place, etc. Pour ce qui est de la grille de scoring, elle est basée sur 3 critères majeurs : I. Aspect (état corporel, état du pelage et de la peau, écoulement, yeux, bouche) II. Fonctions corporelles (surtout respiration) III. Comportement (interaction sociale, posture et mobilité, comportements indésirables) La grille comporte une échelle de 0 à 3 à renseigner pour chaque souris à chaque observation : 0 (normal), 1 (légère altération), 2 (altération forte), 3 (altération très forte). Le score final se décline comme suit : Score total de 0-3: Normal Score total de 4-7: Observer attentivement, envisager l'utilisation d'un antalgique Score total de 8-11: Souffrance, prévoir un mode de soulagement et observer régulièrement. Demander un 2ème avis. Considérer l'euthanasie Score total de 12-15: Souffrance sévère. Fin de la procèdure par l'euthanasie de l'animal (sachant que la procédure est impérativement arrêtée lorque le total de point atteint 12).

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle d'étude est justifié à plusieurs titres : 1) sa génétique est bien connue permettant une certaine souplesse dans le choix du fond génétique approprié aux questions posées, 2) il existe de nombreuses lignées mutantes permettant des analyses génétiques fines, 3) le fonctionnement de son système immunitaire est relativement bien connu, 4) son ontogénie est bien connue de sorte que les lymphocytes B peuvent être prélevés à des stades précis du développement, 5) il existe une grande panoplie d'anticorps spécifiques et de banques de séquences très utiles à nos travaux et projets.

8 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation intestinale leur est induite par un agent chimique, une bactérie ou des cellules, puis des composés leur sont administrés jusqu'à six semaines, parfois via une minipompe implantée sous la peau, pour évaluer des candidats médicaments contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur indique que les animaux développeront diarrhée, sang dans les selles et perte de poids. Il qualifie le recours au modèle animal d'"indispensable" pour une vue globale de la maladie que les modèles in vitro ne donneraient pas.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des troubles caractérisés par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, source de lésions destructrices. Ces maladies sont caractérisées par une forte migration de cellules inflammatoires de types granulocytes au niveau de la paroi du tube digestif. L’augmentation et la dérégulation du recrutement des granulocytes et leur sur-activation contribuent à la chronicité et à l’amplification de la maladie. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de MICI. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et approuvées in vitro. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de MICI.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat et la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Ces modèles seront induits par un agent chimique ou par le gavage d’une bactérie ou par l’injection de cellules inflammatoires une à deux fois par étude. Certains de ces modèles utiliseront des souris génétiquement modifiées ne présentant pas de phénotype dommageable. Les composés seront administrés pendant 6 semaines maximum. Un prélévement sanguin sera également effectué une fois pendant l'étude pour suivre la pharmacocinétique des composés testés. Une minipompe pourra être implantée en sous cutané pour une administration continue pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont les signes cliniques des MICI qui se caractérisent par une diahrrée, du sang dans les fèces et de la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro. L'utilisation de modèles animals est indispensable pour avoir une vue globale de la physiopathologie de la maladie ainsi que la pharmacocinétique des composées sur l'ensemble des organes ce que ne permet pas les modèles in vitro.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analgésie sera envisagé. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature

184 souris vont être utilisées, 120 tuées à l'issue et 64 réutilisées ou écartées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par un régime riche en graisses, elles subissent des gavages quotidiens pendant quatre semaines et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec coupure de la queue et injections, pour évaluer des bactéries et un métabolite comme futur complément alimentaire. Le porteur indique un stress lié à l'isolement en cage individuelle et aux contentions répétées, et fixe une perte de poids de 20 % comme point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule les interactions entre organes et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de souches bactériennes commensales du groupe Streptococcus salivarius inactivées par la chaleur, et d’un métabolite dérivé de la sérine (sécrété par les bactéries et les plantes) dans un modèle murin de prédiabète (définit pas une glycémie à jeun > 1.26g/L) induit par un régime riche en graisse. L’objectif de notre projet est de déterminer les mécanismes par lesquels ces souches bactériennes naturellement présentes dans l’intestin et ce métabolite exercent cet effet anti-hyperglycémiant dans un modèle de souris pré-diabètique . Le prédiabète désigne une glycémie, c'est-à-dire un taux de sucre dans le sang, plus élevée que la normale. Il est réversible s’il est traité avant son évolution vers le diabète qui lui est un état irréversible. Pour ce faire, plusieurs souches bactériennes ainsi que ce métabolite dérivé de la sérine seront administrées à un modèle de souris rendues prédiabétiques via un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

L’objectif final de ces recherches est de déterminer si les bactéries commensales étudiées et le métabolite bactérien dérivé de la sérine permettent la réversion du prédiabète c’est à dire de réduire l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance induites par des régimes déséquilibrés. Si tel est le cas, ceux-ci pourraient servir de traitements pour prévenir le développement du diabète de type 2 chez l’homme. En effet, ce projet de maturation vise à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir des bactéries et/ou de ce métabolite.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention régulière nécessaire lors des gavages quotidiens (quelques secondes) sur une période de 4 semaines et au cours des tests de tolérance au glucose et de tolérance à l’insuline. Pour ces deux tests (réalisés deux fois sur chaque animaux) les souris subiront une petite coupure à l’extrémité de la queue (incision : 1 seconde) et massage de la queue pour récupérer la goutte de sang (quelques secondes) et à une piqûre (5 secondes) lors de l’injection de l’insuline en intrapéritonéal . Un prélèvement de sang à la veine submandibulaire sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure 2 avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 10-15 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress de par leur placement en cage individuelle tout au long de la procédure et à un stress au cours de la contention nécessaire lors des gavages, des prélèvements et des injections quotidiens sur une période de 4 semaines D’après les résultats préliminaires du laboratoire, le gavage des souris avec ces différents composés tests, n’induit pas de perte de poids ni d’effets négatifs sur les souris. La prise de poids associée au régime riche en graisses et la période de jeune necessaire au test de tolérance oral au glucose (OGTT) et au test de tolérance à l'insuline (ITT) génèreront des stress faibles à modérés.

Devenir

En procédure 1 environ 64 souris non répondeuses au régime seront euthanasiées ou mutualisées et 120 souris seront utilisées pour la procédure 2. A la fin de la procédure 2 les 120 souris seront euthanasiées pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus endocrines (stimulation de la sécrétion d’insuline) et intestinaux (tissus producteurs d’incrétine) ainsi que des organes impliqués dans la régulation de cette homéostasie glucidique (foie et muscle).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, nous estimons que ce nombre est nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés deux fois par semaine (surveillance visuelle) au moment de la mesure du poids et le prise alimenaire mesurée (par pesée de l’aliment) une fois par semaine. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de trois jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie . Au moment du test de tolérance oral au glucose (OGTT) et du test de tolérance à l'insuline (ITT), les animaux seront placés dans la salle d’expérimentation (differente de celle d’élevage) 1h avant le test afin de limiter le stress dû à un environnement nouveau.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal et ce travail fait suite à des travaux conduits depuis 2018 sur ce modèle. Nous avons choisi de travailler sur des animauxde 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.